Rodent global DNA methylation and epigenetic regulation during oogenesis

김환희 포천중문 의과대학교 생명과학전문대학원 2008 국내석사

반복서열은 genome의 많은 부분에 존재한다. 그 중 ID element는 short interspersed repetitive elements에 속하고, rat genome에 약 150,000개의 카피수가 존재한다. ID element에는 global한 rat의 methylation 상태를 측정할 수 있는 6개의 CpG dinucleotides가 포함되어 있다. 따라서 우리는 다양한 방법을 사용하여 ID element의 CpG methylation을 확인하였다. Pyrosequencing을 통하여 ID element 내부에 하나의 CpG site (CpG-3) 에서 methylation을 측정한 결과, rat의 6종류의 조직과 피에서는 평균적으로 53.6% methylation 되어 있었으나, rat pheochromocytoma 세포에서는 평균 24.6% methylation 되어 있었다. 그리고 CpG-3의 methylation 상태는 Whole genome amplification과 5'-Azacytidine에 의해서 변화하였다. 따라서 ID element는 신약처리에 대한 rat의 global methylation 변화를 분석하는데 좋은 도구가 될 것이고, 높은 정확성으로 기초적인 후성학 연구에 이용될 수 있을 것이다. 또한 우리는 쥐의 난자형성과정 중 GV와 MⅡ단계의 난자에서 methylation 전달효소인 DNMT1, DNMT3a, DNMT3b의 발현패턴을 역전사 사슬 연쇄중합반응으로 조사하였다. DNMT1, DNMT3a, DNMT3b는 단계별 특별한 패턴없이 GV와 MⅡ 단계에서 모두 발현하였다. DNMT1과 DNMT3a는 발현양상이 비슷했으나, DNMT3b는 낮은 레벨로 발현하였다. 따라서 우리의 결과는 DNMT1, DNMT3a, DNMT3b가 생식세포에서부터 발현됨을 알 수 있었고, 쥐의 난자형성과정 동안 DNA methylation이 설립되고 유지되는 과정에서 DNMT의 역할에 대한 이해를 도울 것 이다. A large portion of the genome represents repetitive elements. Identifier (ID) elements, the major elements of short interspersed repetitive elements, are widespread with about 150,000 copies in the rat genome. Each ID element contains six CpG dinucleotides, which might account for the global methylation status of rat. We validated the CpG methylation of the ID elements by various methods. The methylation of one CpG site (CpG-3) of the ID element was investigated by performing pyrosequencing. The methylation percentage of the CpG-3 site was 53.6% (SD=2.2) on average from six rat tissues with blood, but 24.6% (SD=1.0) in rat pheochromocytoma, PC-12, cell line. This CpG-3 methylation was further verified by whole genome amplification (WGA), 5-Azacytidine treatment. The ID elements may be good candidates for routine analysis of the global DNA methylation changes of rat for pharmaceutical treatment and their use can make basic epigenetic research possible with high accuracy. Also, we examined the expression patterns of the three DNA methyltransferase (DNMT), DNMT1, DNMT3a, and DNMT3b, during Germinal vesicle (GV) and Metaphase II (MⅡ) stages in mouse oogenesis by semi-quantitative RT-PCR. DNMT1, DNMT3a, and DNMT3b were all expressed during GV and MII stages without any stage specific pattern. DNMT1 and DNMT3a have similar expression profiles, but DNMT3b are expressed at low levels in both stages. Our data provided that DNMT1, DNMT3a, and DNMT3b may be originated from germ cell and a better understanding the role DNMT play in establishing and/or maintaining DNA methylation during mouse oogenesis

Biological Effects of Fucoidan Isolated from Fucus vesiculosus on Thrombosis and Vascular Cells

곽규원 포천중문 의과대학교 생명과학전문대학원 2009 국내석사

Fucoidan is a highly sulfated glycosaminoglycan, which has a similar molecular structure to that of heparin. The antithrombotic effects of fucoidan in vitro have been widely reported, but its antithrombotic effects in vivo as well as other biological properties of fucoidan in vitro have not been well investigated This study investigated the effects and mechanism of fucoidan from Fucus vesiculosus on thrombosis, both in vitro and in vivo. A ferric chloride-induced mouse carotid artery thrombosis model was used to determine the antithrombotic effects of fucoidan in vivo. Also, change of pro-inflammatory cytokines and chemokines in the vascular cells treated with fucoidan was examined. In vivo studies, employing a ferric chloride-induced mouse carotid artery thrombosis model, indicated that fucoidan had a stronger anti-thrombotic activity than that of heparin. And vascular cells treated with fucoidan demonstrated a decrease in pro-inflammatory cytokines and chemokines production as well as an inhibition of proliferation. That major findings of this study showed that fucoidan has a stronger anti-thrombotic effect than heparin in vivo, and that fucoidan has an inhibitory effect on pro-inflammatory cytokines production and proliferation of vascular cells. fucoidan은 다량의 황산기를 갖는 Glycosaminoglycan으로 heparin과 유사한 구조이다. fucoidna의 in vitro에서의 항혈전 효과는 이미 여러 보고 된 바가 있으나 in vivo에서의 항혈전 효과에 대해서는 경동맥 혈전 유도 방법에 의한 연구된 바가 없었다. 이 연구는 Fucus vesiculosus로부터 추출한 fucoidan으로 ferric chloride로 마우스의 경동맥에 혈전을 유도시킨 후 fucoidan의 항 혈전효과를 측정하였다. 그리고 HUVEC(인간혈관내피세포)에 fucoidan을 처리했을 때의 염증 유도 cytokine과 chemokine 양의 변화를 측정하였다. In vivo 연구에서 경동맥 혈전은 유도 마우스 모델에서 fucoidan이 heparin보다 더 강한 항혈전 활성을 보였다. 또한, fucoidan에 대한 혈관내피세포는 염증을 유발하는 cytokine과 chemokine의 양이 줄어들었다. fucoidan은 in vivo에서 heparin보다 더 강한 항 혈전 효과가 있고 혈관 염증을 유도하는 cytokine 및 chemokine 형성을 억제한다.

Development of Non-viral Systems for Delivery of Nucleic Acids

노상명 포천중문 의과대학교 생명과학전문대학원 2009 국내석사

지금 이 순간에도 유전자치료에 대한 수많은 연구들이 진행되고 있으며, 이러한 연구들을 통해 과거보다 더 우수한 새로운 유전자 전달체의 개발이 이루어지고 있다. 유전자 전달체 연구는 유전자 치료제의 개발에 있어서 치료유전자의 발현 벡터 시스템의 개발과 함께 가장 큰 축을 이루는 연구 분야 중의 하나이다. 본 연구의 목적은 플라스미드 DNA 및 작은 간섭리보핵산 등의 핵산의약들에 대한 전달체를 개발함에 있어 전달 효율이 우수하고 생체 적합성을 가지는 비바이러스성 수송체를 개발하고 이러한 수송체들의 효능을 in vitro와 in vivo의 측면에서 평가함에 있다. 이러한 연구 목적의 달성을 위해 본 연구에서는 플라스미드 핵산의약의 전달체를 개발함에 있어 양이온성 골드 나노입자를 사용하였으며, 양이온성 골드 나노입자와 플라스미드의 복합체를 제조하고 이러한 복합체의 결합비율에 따른 입자의 크기변화를 평가하였다. 또한, 양이온성 골드 나노입자와 플라스미드의 복합체의 결합비율에 따른 유전자의 전달효율의 비교 평가 하기위해 쥐의 근육세포주인 C2C12 세포주를 대상으로 DNA, RNA, Protein 발현 효율에 대한 연구를 수행하였으며, BALB/c 마우스를 대상으로 동물 실험을 진행하여 in vivo에서의 DNA 전달 효율과 RNA 발현율을 조사하였다. PGN을 이용한 플라스미드와 결합체 형성에 있어서, 결합 몰 비율을 증가시킨 경우 결합체의 입자 크기 또한 증가하였으며, 플라스미드의 입자크기가 200 나노미터인데 비해 PGN/플라스미드 결합체는 600 나노미터까지 증가된 입자 크기를 형성하였다. 또한 PGN과 플라스미드 결합체 형성에 있어서 결합 몰비율이 2400 대 1인 경우에 가장 우수한 플라스미드 전달 효율을 갖는 것으로 확인되었으며, 폴리에틸렌이민을 이용한 플라스미드 전달체와의 효율을 비교한 결과 PGN을 이용한 시스템이 더 우수한 효율을 보여주었으며, 세포 독성 측면에서도 더 낮은 독성을 갖는 것으로 확인되었다. 동물 실험결과에서는 PGN/플라스미드 결합체를 근육주사한 경우에 해당부위의 RNA 발현 효율이 매우 우수한 결과를 보여주었다. 한편, 작은간섭 리보핵산 전달체 개발을 위해서 본 연구에서는 키토산-폴리알기닌 유도체를 제조하였으며 이러한 전달체의 임상적용에 대한 가능성을 향상시키기 위해 혈액에서의 안정성을 부여하는 것으로 알려진 폴리에틸렌 글리콜을 도입한 폴리에틸렌-키토산-폴리알기닌 유도체도 제조하였으며, 이러한 전달체를 이용해 여러 가지 세포주를 대상으로 작은간섭리보핵산의 전달 효율을 평가하고, RNA 및 단백질 발현을 통해 해당 전달체의 효능을 평가하였다. 또한, 동물모델에서의 효능을 평가하기위해서 본 연구에서는 간섬유화 질환모델과 고형암 유발 동물 모델을 이용하였다. 키토산-폴리알기닌 유도체와 작은간섭 리보핵산의 결합체를 이용한 쥐의 간암 세포주를 대상으로 한 연구에서 키토산이나 폴리알기닌 만을 단독으로 사용한 경우에 비해 상당히 향상된 전달효율을 보여주었으며 이러한 전달효율은 비교군인 Lipofectamine의 효율과 비슷하였다. 작은간섭 리보핵산과의 결합체의 입자크기를 측정한 결과 키토산-폴리알기닌 유도체와 작은간섭 리보핵산의 결합체의 경우와 폴리에틸렌-키토산-폴리알기닌 유도체 모두 300 나노미터정도의 입자크기를 갖는 것으로 확인되었다. 또한, 폴리에틸렌-키토산-폴리알기닌 유도체와 작은간섭 리보핵산 결합체의 동물모델 실험 결과 간 섬유화 모델을 통한 실험에서 간 섬유화를 치료하기위한 목적의 작은간섭 리보핵산을 이용한 경우에 대조군에 비해 향상된 치료효능을 보여 주었다. 이러한 연구결과들을 통해 본 연구자는 키토산-폴리알기닌 유도체와 폴리에틸렌글리콜-키토산-폴리알기닌 유도체가 작은간섭 리보핵산의 전달체로서 우수한 효능을 가지며, 향후 결합체의 입자크기를 제어와 같은 추가 연구를 통해 보다 향상된 전달체의 제조가 가능할 것으로 예상된다.

HIDE (Hsp90 interacting deubiquitinating enzyme) as a protector of hTERT from proteolysis

구본희 포천중문 의과대학교 생명과학전문대학원 2009 국내석사

Most eukaryotes have telomerase structure to protect the ends of chromosomes. Human telomerase is constituted with subunits such as human telomerase reverse transcriptase (hTERT) and human telomerase RNA (hTR). Especially, hTERT is an important catalytic subunit, regulating telomerase activity. It is usually expressed in continuously proliferating cells such as germ cells. Heat shock protein 90 (Hsp90) is a chaperone which is required for hTERT activation and assembly with hTR. hTERT is ubiquitinated and degraded when the level of Hsp90 gets dirupted. A previous report showed that HIDE acts as a deubiquitinating enzyme, and interacts with Hsp90. In this study, we identified that Hsp90 is polyubiquitinated. In HIDE expressed cells, the level of ubiquitin-conjugated hTERT is decreased in contrast with catalytic mutant HIDE (C506S) expressed cells. Furthermore, the level of hTERT degradation with Hsp90 antagonist geldanamycin (GA) treatment is inhibited with HIDE overexpression. The HIDE functional activity for hTERT rescue was measured by TRAP assay. Overexpression of HIDE in hTERT transfected cells promotes the telomerase activity, and subsequently increases telomere length. This study indicates that HIDE may protect hTERT from proteolysis. 대부분의 진핵생물은 염색체 말단에 (TTAGGG)n의 특이적이며 반복적인 뉴클레오타이드 서열을 가지고 있는데, 이를 텔로미어 (telomere) 라고 부른다. 텔로미어는 DNA 복제 과정 중 발생하는 서로 다른 염색체 말단사이의 융합에 의한 세포사멸 및 재조합으로부터 염색체말단을 보호하고 완벽한 복제를 돕는데 관여한다. 하지만 복제가 일어날수록 반 보존적이며 한 방향 (5'→3')으로만 발생하는 DNA 복제의 특성상 지속적으로 텔로미어의 길이가 짧아지게 된다. 짧아진 텔로미어의 길이는 세포의 분열을 중지시키는 생체시계로서의 역할을 한다. 짧아지는 텔로미어의 길이를 유지하기 위해 생물체 내에는 텔로머라제 (telomerase)가 존재한다. 이는 리보뉴클레오단백질 (ribonucleoprotein)로 짧아진 텔로미어 끝부분에 텔로미어의 반복적인 뉴클레오타이드를 붙여주어 세포의 지속적인 분열에 기여한다. 텔로머라제는 대표적으로 텔로머라제 RNA (human telomerase RNA; hTR)와 텔로머라제 역전사효소 (human telomerase reverse transcriptase; hTERT)로 구성되어있다. 그 외에 텔로머라제의 활성에 다른 단백질들이 관여하는 것으로 알려져 있다. Hsp90는 분자 샤페론 (molocular chaperone) 중 하나로 세포의 분화, 생존과 관련된 다양한 단백질들의 안정화 및 활성 조절을 담당하는 것으로 알려져 있다. 텔로머라제 역전사효소도 Hsp90과 관련된 단백질들 중 하나이다. Hsp90는 텔로머라제 역전사효소의 주형 (template)인 텔로머라제 RNA와 텔로머라제 역전사효소가 안정적으로 결합하여 텔로머라제가 활성화 되는데 관여한다. 최근 보고에 의하면, 텔로머라제 역전사효소가 Hsp90와 분리되면 텔로머라제 역전사효소가 유비퀴틴화되어 프로테아좀 (proteasome)에 의해 분해되어 텔로머라제의 활성이 없어진다. 또한, 본 연구실에서는 탈유비퀴틴 효소 활성 (deubiquitinating enzyme activity)을 가지고 있는 HIDE (Hsp90 interacting deubiquitinating enzyme)가 Hsp90과 결합하는 것을 확인하였다. 이번 연구에서는 HIDE와 결합하는 Hsp90이 유비퀴틴화됨을 확인하였다. Hsp90이 텔로머라제 역전사효소의 유비퀴틴화와 연관이 되어 있으므로 탈유비퀴틴화 효소인 HIDE가 텔로머라제 역전사효소와 결합하여 탈유비퀴틴화 시키는 것을 확인하였다. 또한, HIDE가 텔로머라제 역전사효소를 탈유비퀴틴에 의해 안정화 시킬뿐만 아니라 텔로머라제의 활성을 유지하는데에도 관여하는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, HIDE는 텔로머라제 역전사효소를 안정화시켜 텔로머라제의 활성을 유지, 텔로미어의 길이를 유지하여 세포 노화 억제와 선천성 재생 불량성 빈혈 (congenital aplastic anemia)과 같은 텔로미어 기능 부전에 의한 질병을 치료하는데 도움이 될 수 있을 것으로 보여진다.

Identification and Functional Characterization of Ubiquitin Specific Protease 36 (USP36)

김명선 포천중문 의과대학교 생명과학전문대학원 2009 국내석사

유비퀴틴화 (ubiquitination) 및 탈유비퀴틴화 (deubiquitination) 과정은 단백질의 항상성 유지를 위한 분해 기전에서 중요한 역할을 하며, 현재 세포 내 70-80%의 단백질들이 유비퀴틴화 과정에 거쳐 26S 프로테아좀 (26S proteasome)을 통해 분해된다고 보고되었으며, 이와 같은 과정을 유비퀴틴-프로테아좀 분해 기전 (ubiquitin-proteasome pathway; UPP)이라고 명명하였다. 또한 이와 같은 단백질 분해 기전의 이상은 암을 비롯한 많은 질환들을 유발한다고 보고됨으로써 유비퀴틴화 과정 및 탈유비퀴틴화 과정에 대한 연구의 중요성이 대두되고 있다. 특히 탈유비퀴틴화 과정은 유비퀴틴화 과정의 불가역적인 역반응으로 유비퀴틴화 과정에 비해 연구가 미흡하였던 과거와 달리 현재는 기질 발굴 등을 통한 연구 성과도 많이 보고되고 있다. 또한 탈유비퀴틴화 효소 (DUB enzyme)는 크게 6개의 그룹으로 구분되는데 이 중에서도 유비퀴틴-특이적 단백분해제 (ubiquitin specific processing protease) 그룹은 가장 그룹화가 잘 되어 있으며 큰 단백질들을 대상으로 한다고 보고되어 있어 그 중요성과 연구 필요성이 다른 그룹에 비해서 크게 여겨진다. 따라서 본 연구에서도 이 그룹을 대상으로 하였다. 본 연구의 초기 목표는 부인암 세포 중 하나인 HeLa 세포를 대상으로 하여 단백질 분해 기전에 이상이 있을 것으로 예상하고 탈유비퀴틴화 과정에 관여하는 유비퀴틴-특이적 단백분해제를 발굴하고자 하였다. 이를 위해 유비퀴틴-특이적 단백분해제 그룹에서 공통적으로 존재하는 보존 부위로 알려진 Asp (I) 도메인을 포함하는 여러 유전자를 NCBI 생명정보학 (NCBI, bioinformatics) 사이트를 이용하여 찾았고, 이 중에서 우리는 HeLa 세포에서 존재하며 기존 탈유비퀴틴화 효소인 DUB-1과 유사성을 보인다는 의미로 HeLa DUB-1이라 명명된 새로운 유비퀴틴-특이적 단백분해제를 발굴하였다. 이 유전자는 548개의 아미노산을 암호화하는 1,647 bp의 뉴클레오타이드 (nucleotide)로 구성되었으며, 분자량은 61 kDa으로 예상된다. 또한 유비퀴틴-특이적 단백분해제의 특징적인 보존 부위 (conserved domain)인 Cys, Asp (I), His과 Asn/Asp (II) 도메인을 포함하고 있으며, in vivo와 in vitro 실험을 수행하여 탈유비퀴틴화 효소 활성 (DUB enzyme activity)을 가진다는 것을 확인하였다. 다음으로 노던 블롯 분석 (Northern blot analysis)을 통해 HeLa DUB-1이 인간 골격근과 췌장에서 강하게 발현하며 이 외에도 심장, 태반, 폐, 간 및 신장에서도 발현하지만 뇌에서는 약하게 발현함을 확인하였다. 또한 HeLa DUB-1의 위치 분석 (localization study)을 통해 세포질 (cytoplasm)과 핵 (nucleus) 내에 고르게 분포함을 확인하였고 이는 기질 발굴에 있어 중요한 결과가 될 것으로 예상하였다. 본 연구는 이후에 HeLa DUB-1의 C-말단 부위가 연장된 USP36을 HeLa 세포에서 역전사 중합효소 연쇄 반응 (RT-PCR)을 통해 다시 발굴하였고, 이는 HeLa DUB-1과 동일하게 유비퀴틴을 절단하는 능력을 가진 것을 확인하였다. 특이하게도 배열을 통한 구조 분석으로 USP36은 단백질의 빠른 분해를 위한 주요 부위로 보고된 PEST 모티브 (motif)를 포함한다는 것을 확인하였고 이것은 USP36의 경우 면역 침전 반응법 (immunoprecipitation)을 통해 폴리유비퀴틴화된다는 것을 밝혔다. 이는 인간 유비퀴틴-특이적 단백분해제 중에서 PEST 모티브를 포함하며 이를 통해 폴리유비퀴틴화 된다고 보고한 최초의 연구 결과였다. 또한 본 연구에서는 이와 같은 HeLa DUB-1과 USP36의 발굴 및 기능 분석 이후에 이들의 기질을 발굴하고자 하는 목표를 세웠으며, 이를 위해 프로테오믹스 방법인 2차원 단백질 전기영동법 (2-DE)과 비행시간형-매트릭스보조탈착이온화법 (MALDI-TOF)을 실시하였다. 이 방법을 위해 USP36을 HeLa 세포내로 과발현시킨 후, 2차원 단백질 전기영동법을 실시하였으며 대조군과 비교 분석을 통해 2배 이상 발현하는 스팟 (spot)들을 선택하였고, 펩타이드 서열화를 통해 9개의 단백질을 동정하였다. 이 단백질들은 lamin B1, protein phosphatase methylesterase-1, tropomodulin 3, heterogenous nuclear ribonucleoprotein A0, RAN protein, SOD2, laminin α-2 subunit precursor, germinal histone H4과 thyroid receptor interactor이며, 우리는 본 연구를 위해 이 중에서 SOD2를 선택하여 USP36의 기질 분석을 실시하였다. SOD2는 여러 질환과 노화 등에 관련된 ROS 상태에서 작용하는 방어 기전 중의 하나인 manganese-dependent superoxide dismutase (Mn-SOD)를 암호화하는 유전자이며 SOD2는 핵 내에 존재하는 유전자이며, Mn-SOD는 미토콘드리아 (mitochondria)에 존재하는 단백질로서, ROS 상태에서 가장 먼저 작용하는 방어기전으로 보고되었다. 그러나 아직 그 작용 기전이나 세포질에서 핵 내로의 신호 전달 체계에 대해서도 알려진 바가 없기 때문에 본 연구에서 이 단백질의 분해 기전을 연구하는 것이 중요성을 가진다고 보았다. 이와 같은 목표를 위해 우리는 우선 USP36과 SOD2가 서로 결합하는지를 확인하고 SOD2가 폴리유비퀴틴화가 되는지를 확인하였다. 다음으로 USP36이 SOD2를 탈유비퀴틴화 과정을 거쳐 안정성을 증가시킨다는 것을 확인하였다. 따라서 이와 같은 결과들로부터 우리는 탈유비퀴틴화 효소 활성을 가진 USP36이 SOD2를 조절하는 중요한 인자이며 ROS 상태나 노화 관련 기전에서 중요한 역할을 할 것이라 제안한다. The ubiquitin-mediated protein degradation pathway has been emphasized for the regulation of numerous cellular mechanisms and the importance of deubiquitination mediated by deubiquitinating (DUB) enzymes has been emerged as an essential regulatory step to control these cellular mechanisms. Especially, DUB contains the highly conserved Cys, Asp (I), His, and Asn/Asp (II) domains characteristic of the ubiquitin-specific processing proteases (USP). Previously, we isolated a novel DUB enzyme, containing the UCH domain of ubiquitin specific protease 36 (USP36) from ovarian cancer cells. It was named as HeLa DUB-1, which has 1,647 bp nucleotides and encodes a 548 amino acid polypeptide with a molecular weight of approximately 61 kDa. Biochemical assay revealed that HeLa DUB-1 has DUB enzyme activity in vivo and in vitro. Northern blot analysis for HeLa DUB-1 showed the strong expression in human skeletal muscle and pancreas and to some extent in heart, placenta, lung, liver, and kidney. Interestingly, the expression was hardly seen in the brain. Localization study indicates that HeLa DUB-1 proteins are present in both the cytoplasm and nucleus. Next, we cloned the full length cDNA of human USP36, which has the extension of the C-terminal region of HeLa DUB-1. The expression of human USP36 was confirmed in ovarian cancer cells using RT-PCR, and DUB enzyme activity was confirmed by analyzing its capability to cleave the ubiquitin. Interestingly, structural and immunoprecipitation analyses revealed for the first time that USP36 contains the PEST motif and is polyubiquitinated. Recently, we performed 2-demensional electrophoresis (2-DE) and matrix assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS) analyses to identify proteins which are regulated by USP36. Through these analyses, we obtained 9 overexpressed spots in USP36 transfected HeLa cells, which showed two fold higher expression than the control. We finally focused on mitochondrial superoxide dismutase (SOD2), since it is an important element required for detoxification of mitochondria from H2O2, and the release of reactive oxygen species (ROS) from the mitochondria (mROS) which are associated with a number of human diseases, regulation of normal cellular processes, and aging in eukaryotes. Especially, the manganese-dependent superoxide dismutase (Mn-SOD) is involved in the primary mitochondrial enzymatic defensive mechanism that converts superoxide to peroxide. However, the regulation of specific signaling elements for the ROS release in the mitochindria leading to nuclear gene induction has not yet been described. In this present study, we investigated the functional roles of USP36 on SOD2 in relation to ubiquitin-proteasome pathway (UPP). Firstly, we confirmed whether interaction between USP36 and SOD2 occurs, and SOD2 is polyubiquitinated. Next, we investigated that USP36 has DUB enzyme activity against SOD2, and maintains the stabilization of SOD2. Taken all results together, we suggest that USP36 may be a key factor in ROS and aging mechanisms.

Single Nucleotide Polymorphisms of EPHB1 Gene are Associated with HBV-infected Liver Diseases in a Korean Population

김경연 포천중문 의과대학교 생명과학전문대학원 2009 국내석사

Erythropoietin-producing human hepatocellular carcinoma receptor B1 (EPHB1) is a member of the Eph family of receptor tyrosine kinases that mediate vascular system development. Eph receptor overexpression has been observed in various cancers and is related to the malignant transformation, metastasis, and differentiation of cancers, including hepatocellular carcinoma (HCC). Eph receptors regulate cell migration and attachment to the extracellular matrix by modulating integrin activity. EphrinB1, the ligand of EPHB1, has been shown to regulate HCC carcinogenesis. Here, we sought to determine whether EPHB1 polymorphisms are associated with hepatitis B virus (HBV)-infected liver diseases, including chronic liver disease (CLD) and HCC. We genotyped 26 EPHB1 single nucleotide polymorphisms (SNPs) in 399 Korean CLD, HCC, and LD (CLD+HCC) cases and seroconverted controls (HBV clearance, CLE) using the GoldenGate assay. Two SNPs (rs6793828 and rs11717042) and 1 haplotype that were composed of these SNPs were associated with an increased risk for CLD, HCC, and LD (CLD+HCC) compared with CLE. Haplotypes that could be associated with HBV-infected liver diseases by affecting downstream signaling were located in the Eph tyrosine kinase domain of EPHB1. Therefore, we suggest that EPHB1 SNPs, haplotypes, and diplotypes may be genetic markers for the progression of HBV-associated acute hepatitis to CLD and HCC.

Biological activities and mechanisms of a fibrinolytic enzyme and a disintegrin from the venom of Korean snake

조길상 포천중문 의과대학교 생명과학전문대학원 2009 국내석사

Many snake venoms act on the blood coagulation system. Since there is growing medical interest in thrombolysis, snake venoms which affect the hemostatic system have been well investigated. A fibrinolytic enzyme was purified to homogeneity from the venom of Korean Salmosa snake Agkistrodon halys by a combination of benzamidine-Sepharose affinity chromatography and FPLC Unosphere Q ion exchange fractionation. The purified enzyme is a glycoprotein and migrates as a single band with molecular mass of 33KDa on SDS-PAGE. The fibrinolytic enzyme is characterized by its isoelectric point of 4.3. The enzyme was not able to hydrolyze human serum albumin, plasminogen, thrombin, immunoglobulin and tPA. To examine the toxicological effect of saxatilin, a disintegrin isolated from the venom of a Korean snake (Gloydius saxatilis), recombinant saxatilin was highly expressed as a biologically active form in Pichia pastoris, and was successfully purified to homogeneity from the culture broth supernatant. The molecular and biological properties of the recombinant protein were the same as those of its natural form. RGD-peptides can inhibit the binding of ligands to certain β3 integrins, α II bβ3 and a v β3, both of which are involved in neointimal hyperplasia that contributes to atherosclerosis and restenosis of arterial walls. Saxatilin, a disintegrin from a Korean snake (Gloydius saxatilis), interacts with integrins α II bβ3 and a v β3. It suppressed the adhesion of human coronary artery smooth muscle cells (HCASMCs) to vitronectin with an IC 50 of 2.5uM, and growth factor (PDGF-BB or bFGF)-induced proliferation was inhibited at an IC 50 of 25uM. 다양한 종류의 뱀독에는 혈액 응고계에 작용하는 많은 인자들이 보고되고 있으며, 특히 의학적 치료제로써의 개발목적으로 뱀독에 대한 다양한 연구가 진행되어지고 있다. 이에 본 연구에서는 한국에 서식하고 있는 살모사(Agkistrodon halys)와 까치살모사(Agkistrodon saxailis)의 뱀독으로부터 이와 같은 항혈전 단백질을 탐색하고 분리동정한 후 생체내 효능을 알아보기 위해, 이를 재조합 단백질로 발현하였다. 우선 살모사의 뱀독을 확보한 후, benzamidine-Sepharose column과 Unosphere Q column을 이용해 혈전용해효소를 분리, 정제하였다. 정제된 효소는 약 33KDa의 분자량을 가지며 등전점은 4.3인 당단백질이었다. 이 효소는 혈액내에 존재하는 serum albumin, plasminogen, thrombin, IgG, tPA 등에는 영향을 주지 않고, 특이적으로 fibrinogen 과 fibrin 만 분해하였다. 이에 salmonase의 cDNA library를 확보한 뒤 yeast system에서 재조합 단백질로 발현하는데 성공하였다. 또한 디스인테그린인 saxatilin의 생리활성을 알아보기 위해 재조합 단백질로 대량발현을 시킨 후 순수분리, 정제하였으며, 재조합 saxatilin은 천연형의 saxatilin과 그 활성이 동일하였다. RGD-peptide를 지닌 이 saxatilin은 β3 integrins의 binding을 막음으로써 α II bβ3와 a v β3 등의 반응을 억제하였고, 특히 인간 평활근세포의 adhesion과 proliferation을 강하게 저해하였다.

HIP1R interacts with a member of Bcl-2 family, BCL2L10, and induces BAK-dependent cell death

김재홍 포천중문 의과대학교 생명과학전문대학원 2009 국내석사

The Bcl-2 family members are evolutionally conserved and crucial regulators of apoptosis. BCL2L10 (human Diva or BCL-B) is a member of the Bcl-2 family that has contradictory functions in apoptosis. In the present study, we identified the Huntington-interacting protein 1-related (HIP1R) protein following a search for Diva-interacting proteins using the yeast two-hybrid system. HIP1R is a multi-domain protein that regulates the clathrin-mediated endocytic machinery and actin assembly in cells. Interaction of endogenous proteins of BCL2L10 and HIP1R in 293T cells was determined by immunoprecipitation, and their direct association was confirmed by the Far-Western analysis. The deletion of both the AP180-homology (ANTH) and F-actin-binding the talin-HIP1/R/Sla2p actin-tethering C-terminal homology (THATCH) domains of HIP1R greatly compromised its binding ability to BCL2L10. Ectopic expression of HIP1R resulted in moderate cell death of 293T cells in conjunction with the dissipation of mitochondrial membrane potential and caspase 9 activation. A member of proapoptotic Bcl-2 family, BAK, was required for HIP1R to induce cell death, while BAX was dispensable. In addition, BCL2L10 was associated with endogenous caspase 9, and their binding was augmented by HIP1R overexpression. Thus, this study provided the previously unknown function of HIP1R involved in the intrinsic cell death pathway and further explored possible mechanisms by which HIP1R induces cell death. Bcl-2 패밀리는 진화적으로 세포사멸에서의 중추적인 역할을 담당하고 있는 조절자이다. BCL2L10 (Human Diva, BCL-B)는 이러한 세포사멸에서 친 세포사멸 유도기능 또는 항 세포사멸 유도기능의 상반된 연구결과가 보고되어 있다. 본 연구진은 Diva 와 결합하는 단백질을 스크리닝 하게 되었고 이중 Huntington-interacting protein 1 related (HIP1R) 단백질을 발견하였다. HIP1R단백질은 clathrin연관된 endocytosis의 기능과 actin의 세포구성에 관여를 한다. 이러한 HIP1R와 BCL2L10의 단백질의 결합을 면역침강방법을 통해서 endogenous한 수준에서의 결합을 확인하였으며 Direct한 결합인지 확인하기 위해서 Far-western blot 방법을 수행하여 이러한 결합을 다시 확인하였다. 이러한 결합에서의 HIP1R가 BCL2L10과 결합하는 도메인을 확인하기 위해서 AP-180-homology (ANTH)와 F-actin-binding에 관련된 C-말단의 homology (THATCH)가 결여된 돌연변이 단백질을 클로닝 하였고 ANTH와 THATCH 도메인이 결합에 중요한 도메인이라는 것을 확인하였다. HIP1R의 세포사멸에서의 영향을 알아보기 위해서 MMP실험과 Caspase9의 활성유무를 측정한 결과 MMP가 확인 되었고 caspase9이 활성화되었다. 세포생존율 실험을 통해서 직접적으로 세포사멸의 유도양상을 확인하였으며 세포사멸을 유도하는 BH3도메인만을 가지고 있는 BAX, BAK 단백질이 knock-out 된 세포에서 HIP1R의 세포생존율 검사 결과 BAK이 HIP1R에 의한 세포사멸에 중요한 역할을 하는 단백질임을 확인 하였다. 또한 이미 알려져 있는 BCL2L10과 caspase9의 결합에 HIP1R의 과발현이 두 단백질의 association을 강화시켜주는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 연구결과를 통해서 endocytosis와 actin assembly에 관련된 HIP1R단백질의 세포사멸을 유도하며 이는 HIP1R의 intrinsic pathway와 endosytosis 메커니즘과의 상호 연관성에 대하여 연구할 수 있는 중요한 발견이다.

Identification of Differentially Expressed Genes in Vascular Angiogenic Progenitor Cells Derived from Human Embryonic Stem Cells Using Suppression Subtractive hybridization

안진섭 포천중문 의과대학교 생명과학전문대학원 2009 국내석사

Human embryonic stem cells (hESCs), which are derived from the inner cell mass of a human blastocyst, have the ability of self-renewal and are pluripotent. Due to their pluripotency, hESCs can differentiate into three germ layers. Furthermore, differentiated cells from hESCs express a set of genes that are only observed in these specialized cells. Therefore, when hESCs differentiate into endothelial cells, we can expect to observe the expression of genes only found in endothelial cells. The aim of this research was to identify specific genes present in endothelial cells derived from hESCs. In this study, we identified genes differentially expressed in both vascular angiogenic progenitor cells derived from hESCs (hESC-VAPCs) and cord blood derived endothelial progenitor cells (CB-EPC) compared with hESCs by using suppression subtractive hybridization (SSH). Using this technique, we obtained 207clones containing expressed sequences that are more abundant in hESC-VAPCs and CB-EPCs compared to hESCs, and characterized them using the NCBI GeneBank database. Among them, 105 clones were known genes, 23 clones matched with nucleotide, 13 clones showed homology only to genomic DNA sequence, and 66 clone showed no significant homology. Next, we randomly selected differentially expressed genes and verified the results using RT-PCR. The genes identified are involved in: cell cycle and growth, the cytoskeleton and cell adhesion, development, metabolism, heat shock protein, signal transduction, transcription/nuclear specific genes, and other functions. Here, we successfully identified genes differentially expressed in VAPCs and CB-EPCs compared to hESCs. We anticipate that further study of the genes we have identified will provide insights into their specific roles in the development of endothelial cells from hESCs. 인간배아줄기세포는 다분화능력과 무한분열증식능력을 가진 세포로써 다양한 유전자들과 인자들의 작용과 조절에 의해서 분화 및 증식능력은 조절되게 된다. 인간배아줄기세포는 외배엽, 내배엽, 중배엽, 등과 같은 다양한 조직 및 기관으로의 분화가 이루어지며 이러한 분화와 관련된 연구가 현재 많이 진행되고 있다. 본 연구는 그 중에서도 중배엽의 혈관형성내피전구세포로 분화와 관련된 유전자를 발굴 하는데 목적이 있다. 아직까지 인간배아줄기세포에서 직접적으로 분화시킨 혈관형성내피전구세포와 이를 이용하여 인간배아줄기세포와 비교하여 DEG 발굴이 이루어지지 않았으며 본 연구를 통해 최초로 시도 되었다. 우리는 혈관형성내피전구세포의 분화와 관련된 특이적인 유전자를 발굴하기 위해서 DEG발굴 기법 인 SSH법을 사용하였으며 인간배아줄기세포와 이를 이용해서 분화시킨 혈관형성내피전구세포 그리고 제대혈 혈관형성내피전구세로를 이용하였다. 연구 결과 총 207개의 클론 (배아줄기세포유래 혈관형성내피세포전구 127종, 제대혈 혈관형성내피전구세포 80종)들을 발굴하게 되었으며 그 중 배아줄기세포유래 혈관형성내피전구세포의 특이적인 알려진 유전자 70개와 제대혈 혈관형성내피전구세포의 특이적인 알려진 유전자 35개를 각각 정리 하였다. 또한 인간배아줄기세포와 비교하여 배아줄기세포유래 혈관형성내피전구세포와 제대혈 혈관형성내피전구세포에서 특이적으로 발현하는 알려지지 않은 유전자 2종류도 발굴 하였다. 이외에도 배아줄기세포와 인간암세포에 특이적으로 발현하는 C1orf31 유전자도 발굴하였으며, C1orf31 유전자는 세포주기 관련성 실험결과 S/G2기와 관련이 있는 것으로 사료된다. 본 연구를 통해 발굴 된 혈관형성내피전구세포의 특이적인 유전자들은 미국 국립생물공학정보센터(NCBI)를 통해서 유전자의 기능을 분석하여 유전자 라이브러리를 완성시켰으며 향후 본 연구 결과는 혈관형성내피전구세포의 분화 및 발달과 관련된 연구에 많은 도움을 줄 것으로 기대가 된다.

Transgeration effects of maternally exposed fenarimol on reproductive performance in female mice

박미라 포천중문 의과대학교 생명과학전문대학원 2009 국내석사

Fenarimol, 2, 4-dichloro-a-(pyrimidin-5-yl) benzhydryl alcohol은 광범위하게 사용 되어지고 있는 살균제이다. 이것은 in vivo 와 in vitro실험을 통해 aromatase-억제 기작을 가지고 있음이 보고 되었고 내분비계 교란물질 (Endocrine Disrupter)로 분류 되어진다. 이 실험의 목적은 인간이 환경으로부터 노출 되어지는 농도의 fenarimol을 임신기와 수유기 동안 노출시켰을 때 female 마우스의 reproductive health에 미치는 세대간의 영향에 관해 알아보는 것이다. DBA/2 male 마우스와 mating을 통해 임신한 C57BL/6 female 마우스에게 임신 후 12일 째 부터 출산 후 20일 째 까지 무게에 비례하여 0, 2, 20, 200 ㎍/kg 농도의 fenarimol을 경구 투여하였다. F-0 세대와 F-1 세대의 reproductive performance를 수행하였으며, 그 결과 출생 후 21일째 되는 F-0 세대에서는 유의성 있는 변화를 발견하지 못하였다. 다음세대인 F-1 세대에서는 20㎍ 과 200 ㎍을 투여한 그룹이 control보다 약 60 %, 51 % 늘어 난 것을 확인하였다. 8주된 F-1 세대의 2 ㎍를 처리한 그룹의 난소 무게는 control보다 유의성 있게 증가하였다 (P < 0.05). F-1과 F-2의 anogenital distance (AGD)를 출생 후 14일 21일에 측정하였으며, 그 결과 20㎍과 200㎍ 처리 그룹에서F-1 female 자손의 AGD는 control 그룹보다 유의성 있게 짧아지는 것을 확인하였다 (P < 0.05). 출생 후 8-9주 때, in vitro fertilization assay을 시행하여 마우스의 수정 능력을 알아보기 위해 난자를 채취하였다. 그 결과 fenarimol에 노출된 그룹에서 배란된 난자의 수는 노출되지 않은 그룹의 난자의 수보다 적은 결과를 나타내었다. 이번 실험을 통하여 우리는 낮은 농도의 fenarimol에 대한 노출이 여성의 reproductive health에 대해 세대간의 영향을 미치는 것을 발견하였다. 이 결과로 말미암아, 장기적인 fenarimol에 대한 노출이 인간의 생식 시스템에 영향을 미칠 것이라고 사료된다. Fenarimol, 2, 4-dichloro-a-(pyrimidin-5-yl) benzhydryl alcohol, is a widely used chlorinated fungicide. It is a suspected endocrine disrupter (ED) due to aromatase-inhibiting mechanisms in vivo and in vitro studies. The objective of the study was to examine the transgeneration effects of gestational and lactational exposure to human related exposure levels of fenarimol on female reproductive health in mice. Pregnant C57BL/6 mice (F-0), bred with DBA/2 male, were gavaged with 0, 2, 20, or 200 g fenarimol/kg of body weight per day from gestational day 12 to postnatal day (PND) 20. Parameters of reproductive performance in F-0 were measured as well as in females on their offspring (F-1). There were no significant changes in parameters of reproductive performance in F-0 dams orally exposed to fenarimol. In the next generation, body weights of F-1 dams increased by 60% and 51%, respectively, in the 20 and 200 g treatment groups on PND 21. In the 2 g fenarimol/kg body weight treated group, ovary weights were significantly increased than control group. We measured offspring’s anogenital distance on postnatal day 14 and 21. In the F-1 female offspring which were maternally and orally exposed to fenarimol, anogenital distance in the 20 and 200 mg/kg treatment groups was significantly shorter than controls. At 8-9 weeks of age, the eggs of F-2 were collected to assess fertilizing ability in an in vitro fertilization assay. We were shown the number of eggs of treatment animals was decreased than no treatment group. In these experiments, we found that exposure low concentration of fenarimol has transgeneration effects on female reproductive health. Therfore, we may suggest human exposed chronically to fenarimol can be altered reproductive system.