HIDE (Hsp90 interacting deubiquitinating enzyme) as a protector of hTERT from proteolysis = 단백질 분해로부터 hTERT를 보호하는 Hsp90 연관 탈유비퀸틴화 효소

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Most eukaryotes have telomerase structure to protect the ends of chromosomes. Human telomerase is constituted with subunits such as human telomerase reverse transcriptase (hTERT) and human telomerase RNA (hTR). Especially, hTERT is an important catalytic subunit, regulating telomerase activity. It is usually expressed in continuously proliferating cells such as germ cells. Heat shock protein 90 (Hsp90) is a chaperone which is required for hTERT activation and assembly with hTR. hTERT is ubiquitinated and degraded when the level of Hsp90 gets dirupted. A previous report showed that HIDE acts as a deubiquitinating enzyme, and interacts with Hsp90. In this study, we identified that Hsp90 is polyubiquitinated. In HIDE expressed cells, the level of ubiquitin-conjugated hTERT is decreased in contrast with catalytic mutant HIDE (C506S) expressed cells. Furthermore, the level of hTERT degradation with Hsp90 antagonist geldanamycin (GA) treatment is inhibited with HIDE overexpression. The HIDE functional activity for hTERT rescue was measured by TRAP assay. Overexpression of HIDE in hTERT transfected cells promotes the telomerase activity, and subsequently increases telomere length. This study indicates that HIDE may protect hTERT from proteolysis.

국문 초록 (Abstract)

대부분의 진핵생물은 염색체 말단에 (TTAGGG)n의 특이적이며 반복적인 뉴클레오타이드 서열을 가지고 있는데, 이를 텔로미어 (telomere) 라고 부른다. 텔로미어는 DNA 복제 과정 중 발생하는 서로 다른 염색체 말단사이의 융합에 의한 세포사멸 및 재조합으로부터 염색체말단을 보호하고 완벽한 복제를 돕는데 관여한다. 하지만 복제가 일어날수록 반 보존적이며 한 방향 (5'→3')으로만 발생하는 DNA 복제의 특성상 지속적으로 텔로미어의 길이가 짧아지게 된다. 짧아진 텔로미어의 길이는 세포의 분열을 중지시키는 생체시계로서의 역할을 한다. 짧아지는 텔로미어의 길이를 유지하기 위해 생물체 내에는 텔로머라제 (telomerase)가 존재한다. 이는 리보뉴클레오단백질 (ribonucleoprotein)로 짧아진 텔로미어 끝부분에 텔로미어의 반복적인 뉴클레오타이드를 붙여주어 세포의 지속적인 분열에 기여한다. 텔로머라제는 대표적으로 텔로머라제 RNA (human telomerase RNA; hTR)와 텔로머라제 역전사효소 (human telomerase reverse transcriptase; hTERT)로 구성되어있다. 그 외에 텔로머라제의 활성에 다른 단백질들이 관여하는 것으로 알려져 있다. Hsp90는 분자 샤페론 (molocular chaperone) 중 하나로 세포의 분화, 생존과 관련된 다양한 단백질들의 안정화 및 활성 조절을 담당하는 것으로 알려져 있다. 텔로머라제 역전사효소도 Hsp90과 관련된 단백질들 중 하나이다. Hsp90는 텔로머라제 역전사효소의 주형 (template)인 텔로머라제 RNA와 텔로머라제 역전사효소가 안정적으로 결합하여 텔로머라제가 활성화 되는데 관여한다. 최근 보고에 의하면, 텔로머라제 역전사효소가 Hsp90와 분리되면 텔로머라제 역전사효소가 유비퀴틴화되어 프로테아좀 (proteasome)에 의해 분해되어 텔로머라제의 활성이 없어진다. 또한, 본 연구실에서는 탈유비퀴틴 효소 활성 (deubiquitinating enzyme activity)을 가지고 있는 HIDE (Hsp90 interacting deubiquitinating enzyme)가 Hsp90과 결합하는 것을 확인하였다.
이번 연구에서는 HIDE와 결합하는 Hsp90이 유비퀴틴화됨을 확인하였다. Hsp90이 텔로머라제 역전사효소의 유비퀴틴화와 연관이 되어 있으므로 탈유비퀴틴화 효소인 HIDE가 텔로머라제 역전사효소와 결합하여 탈유비퀴틴화 시키는 것을 확인하였다. 또한, HIDE가 텔로머라제 역전사효소를 탈유비퀴틴에 의해 안정화 시킬뿐만 아니라 텔로머라제의 활성을 유지하는데에도 관여하는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, HIDE는 텔로머라제 역전사효소를 안정화시켜 텔로머라제의 활성을 유지, 텔로미어의 길이를 유지하여 세포 노화 억제와 선천성 재생 불량성 빈혈 (congenital aplastic anemia)과 같은 텔로미어 기능 부전에 의한 질병을 치료하는데 도움이 될 수 있을 것으로 보여진다.

목차 (Table of Contents)

• Ⅰ. INTRODUCTION 1
• Ⅱ. MATERIALS AND METHODS 7
• Ⅱ. 1. Culture conditions and transfection 7
• Ⅱ. 2. Expression vectors and site-directed mutagenesis 7
• Ⅱ. 3. Immunoprecipitation and immunoblotting 8
• Ⅱ. 4. In vivo deubiquitinating enzyme assay 9
• Ⅱ. 5. Telomerase assay 9
• Ⅲ. RESULTS 10
• Ⅲ. 1. Ubiquitination and degradation of hTERT by Hsp 90 antagonist geldanamycin 10
• Ⅲ. 2. Ubiquitination of Hsp90 14
• Ⅲ. 3. Interaction between hTERT and HIDE 16
• Ⅲ. 4. Deubiquitinating enzyme activity of HIDE for hTERT 18
• Ⅲ. 5. Overexpression of HIDE rescues telomerase activity and telomere length 24
• Ⅳ. DISCUSSION 26
• Ⅴ. CONCLUSION 29
• REFERENCES 30
• ABSTRACT IN KOREAN 35