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효율적으로 HLA-E 발현을 조절하는 돼지 Elongation Factor 1 Alpha 유전자 프로모터
양현,이해선,김점순,최훈성,정선근,김경운,김동훈,오건봉 한국동물생명공학회(구 한국동물번식학회) 2017 발생공학 국제심포지엄 및 학술대회 Vol.2017 No.10
Human Leukocyte Antigen E (HLA-E)는 Natural killer cell의 활성을 억제시키는 리간드 역할을 수행하는 인자로서 모든 세포에서 발현되며, 이러한 기능적 특성에 의하여 Gal 항원이 없음과 동시에 HLA-E를 과발현하는 돼지 장기를 원숭이에 이식할 경우 발생하는 세포성 거부반응을 억제시킬 수 있을 것으로 기대된다. 본 연구는 돼지의 전 조직 및 세 포에서 HLA-E의 과발현을 조절할 수 있는 돼지의 프로모터를 개발하고자 실시하였다. 이 를 위하여 돼지의 모든 세포에서 발현되는 Elongation factor 1 alpha(pEf1a) 유전자의 프 로모터 영역 중 –750 bp에서 엑손 1과 인트론 1, 그리고 엑손 2의 미번역 부위를 포함하 는 1.5 kb의 프로모터를 클로닝한 후 HLA-E cDNA를 연결한 발현 벡터를 제작하였다. HLA-E 유전자의 발현 조절능을 비교하기 위하여 대조군으로 사람 EF1α 프로모터, 그리 고 돼지에서 외래유전자의 발현을 효율적으로 조절한다고 알려진 CMV enhancer chicken β-actin (CAG) 프로모터에 HLA-E cDNA를 각각 연결한 발현 벡터를 제작하였다. 각 각의 발현벡터를 HEK293 세포에 도입후 quantitative real-time RT PCR (qPCR) 방법으 로 분석한 결과, pEf1a 프로모터의 조절에 의한 HLA-E의 발현 수준이 대조군에 비해 유 의적(p<0.05)으로 높은 것을 확인할 수 있었다. 돼지의 귀 조직에서 분리한 섬유아세포 (fibroblasts)와 대동맥 혈관내피세포에 도입한 후 qPCR, western blot 방법으로 HLA-E의 발현 수준을 분석하였다. 그 결과 pEf1a 프로모터는, CAG, EF1a 프로모터와 유의적인 차이 없이 효율적으로 HLA-E의 발현을 조절하는 것을 확인하였다. 이러한 결과로 본 연 구에서 클로닝한 pEf1a 프로모터의 HLA-E의 발현 조절능은 CAG의 것과 유사하다고 판 단되며, 형질전환 돼지에서 HLA-E 효율적인 발현을 조절할 것으로 기대된다.
닭 오브알부민 프로모터의 길이에 따른 유전자 발현 활성 및 에스트로겐 반응성 분석
양현,김경운,김점순,우제석,이휘철,최훈성,정선근,수레쉬쿠마,이해선,오건봉,변승준 한국가금학회 2019 韓國家禽學會誌 Vol.46 No.1
Chickens have been considered as well-defined animal bioreactor. The optimized ovalbumin promoter is essential for recombinant protein production in transgenic chicken. Here we try to compare the activity and identify the effect of estrogen on ovalbumin promoter according to each promoter length with estrogen response element (ERE) existence. We cloned two (2.8 and 5.5 kb) ovalbumin promoters that the 5.5 kb contained the ERE but the 2.8 kb did not, and these two promoters were cloned to pGL4.11 vector. Additionally, we constructed another pGL4.11 vector containing of the 4.4 kb (with ERE) ovalbumin promoter deleted with 1 kb between ERE region and the 2.8 kb promoter. For reporter assay, HeLa, MES-SA, LMH/2A, and cEF cells were transfected with all the pGL4.11 vectors. The comparative analysis showed that the mutated 4.4 kb promoter has more potent activity than the 2.8 and 5.5 kb promoters in HeLa, MES-SA, and LMH/2A cells. However, there is no significant difference in cEFs. Also, these cells transfected with the mutated 4.4 kb promoter were treated with the 17β -estradiol (0∼3,000 nM) and HeLa, MES-SA, and LMH/2A cells showed estrogen responsibilities, but cEFs did not. Besides, the mutated 4.4 kb promoter has still higher activity than the 2.8 and 5.5 kb promoter, and there is no transcriptional induction effect in 2.8 kb promoter at 500 nM estrogen that is blood concentration of laying hens. Hence our study strongly suggested that the mutated 4.4 kb promoter is considered as one of the most efficient length for generating transgenic chicken.
양현,이정호,노재구,이장욱,박철지,박종원,황인준,김성연 한국발생생물학회 2014 발생과 생식 Vol.18 No.2
Cardiovascular system is the primary organ to develop and reach a functional state, which underscores theessential role of the vasculature in the developing embryo. The vasculature is a highly specialized organ that functions in anumber of key physiological works including the carrying of oxygen and nutrients to tissues. It is closely involved in theformation of heart, and hence it is essential for survival during the hatching period. The expression of genes involved duringvascular development in the olive flounder (Paralichthys olivaceus) in the days after hatching is not fully understood. Therefore, we examined the expression patterns of genes activated during the development of flounder. Microscopicobservations showed that formation of blood vessels is related to the expression of the vimentin gene. Also, the temporalexpression patterns of this vimentin-like gene in the developmental stages and in the normal tissues of olive flounder. Thepurpose of this study was to examine the expression patterns of vimentin in normal tissues of the olive flounder and during thedevelopment of the vascular system in newly hatched olive flounders and HIF-1 plays a vital role in the formation of bloodvessels during development. Vimentin expression was strong at the beginning of the development of blood vessels, and waspresent throughout all developmental stages. Our findings have important implications with respect to the roles of vimentinand HIF-1 in the development and evolution of the first blood vessels in olive flounder. Further studies are required toelucidate the vimentin-mediated hypoxic response signal transduction and to decipher the functional role of vimentin indevelopmental stages.
돼지 섬유아세포에서 장기간 배양 동안 HLA-E의 안정적 과발현을 조절하는 돼지 프로모터의 탐색 및 검증
양현,이해선,김점순,변승준,우제석,이휘철,최훈성,정선근,김경운,오건봉 한국동물생명공학회(구 한국동물번식학회) 2018 발생공학 국제심포지엄 및 학술대회 Vol.2018 No.06
이종이식을 포함하여 바이오 의료산업 분야에 형질전환 돼지는 모델 동물로서 광범위 하게 활용되고 있다. 목표 유전자를 과발현하는 형질전환 돼지를 개발하기 위하여 바이 러스 유래 염기서열이 포함된 cytomegalovirus enhancer chicken beta-actin (CAG) 프로 모터가 가장 많이 활용되고 있다. 그런데, 바이러스 유래의 프로모터는 세대가 지남에 따 라 그 활성능이 감소된다고 알려져 있어, 발현 효율을 세대에 관계없이 지속시킬 수 있 는 프로모터의 개발이 필요하다. 이에 본 연구에서는 효율적으로 목표 유전자를 발현하 는 형질전환 돼지 개발에 활용하기 위한 돼지 유래의 프로모터를 개발하고자 실시하였 다. 이를 위하여 바이러스 유래의 CMV, CAG 프로모터, 사람 유래 elogation factor 1 alpha (EF1α) 프로모터, 돼지 유래 porcine elongation factor 1 alpha (pEf1α) 및 actin (pActb) 영역을 pGL3 vector에 클로닝한 뒤 돼지 신장 상피세포(pk15), 돼지 혈관 내피세 포(pAECs), 돼지 귀 섬유아세포(pEFs)에서 luciferase 분석을 통해 CAG 프로모터에 대한 상대 활성을 비교 분석하였다. 그 결과 pEf1α 프로모터가 CAG 프로모터에 비해 높은 발 현 조절 효율을 보여주었고, 특히 pEFs에서는 유의적으로 높았다(p<0.001). 이종이식시 발생하는 세포성 거부반응 억제 유전자로 알려진 Human Leukocyte Antigen-E (HLA-E) cDNA를 pEf1α와 CAG 프로모터에 각각 연결한 발현 카세트를 제작한 후 pEFs에 도입하 여 발현 효율이 장기간 세포 배양에도 유지되는 지를 분석하였다. 항생제 선별 개시(0일) 후 14, 18, 22, 26, 30일 동안 배양한 각각의 세포에서 RNA와 단백질을 추출하여 정량 -PCR 및 Western blot 방법으로 HLA-E 발현 수준을 분석하였다. 그 결과 pEf1α 프로모 터는 HLA-E의 지속적 발현 유지를 유도하는 반면에 CAG 프로모터에 의한 HLA-E의 발 현은 18일차부터 급격히 감소하는 것을 확인하였다. 14일과 30일째 flow cytometry 분석 을 실시한 결과, HLA-E 발현 세포 수는 CAG에서 12.7%에서 7.4%로 감소한 반면에, pEf1α에서는 25%에서 28.9%로 유지되고 있음을 확인하였다. 이러한 결과로 pEf1α 프로 모터는 돼지 세포에서 목표 유전자의 발현을 장기간 배양에도 효율적으로 조절하여, 과 발현 형질전환 돼지 개발에 유용하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다.