식중독균 Listeria monocytogenes에 대한 단일항체를 이용한 전기화학적 검출시스템 개발

김성중 차의과학대학교 대학원 2015 국내석사

현재 유통 중인 즉석식품 중 냉장에서도 증식이 진행되는 주요 식중독균인 Listeria monocytogenes를 현장에서 신속 정확하게 검출하기 위하여 새로운 단일항체를 제조하고 이미 설계된 lab-on-a chip에 탑재한 후 전기화학적 검출을 위해 새로운 검출시스템을 개발하고자 하였다. 이를 위해 Listeria monocytogenes균을 배양하여 수득한 뒤 파쇄하여 마우스에 면역접종 한 다음 B 림파구를 분리하였고, 이어서 myeloma세포와 융합하여 약 1,500개의 하이브리도마 클론을 제조한 뒤 4번의 스크리닝 단계를 거쳐 최종 3개의 클론을 확보하였다. 확보한 3가지 클론에 대한 특이성을 SPR검사를 통해 최종 10E7 클론을 식중독균 검출 항체로 최종 선별하였다. 현장에서 Listeria monocytogenes균을 신속 정확하게 검출하기 위해 전기 화학적검출시스템을 설계하고 최종 검출기 시제품을 제조하였고, 이미 설계된 lab-on-a-chip에 탑재하여 검출성능을 조사하였다. 이와 같이 제조한 바이오센서와 검출기를 이용하여 냉장 식품 중 식중독균 Listeria monocytogenes를 신속하고 정확하게 검출함으로써 국민보건 향상에 유용하게 활용될 수 있을 것으로 기대되며, 더 나아가 다른 질환의 검출에도 유용하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다. Listeria monocytogenes, a foodborne pathogen, is one of major species of the genus Listeria, which causes serious illness by contaminated foods. There are well established traditional methods, but these take long time to several days to get a result. To develop a rapid and sensitive detection system for L.monocytogenes, we tried to make new monoclonal antibodies against the bacterial cells, mount it on a newly designed lab-on-a-chip, and manufacture a electrochemical detector in this study. We immunized a sonicated L.monocytogenes to mice and produced about 1,500 hybridoma clones. Among them, one clone(10E7) was finally selected and adapted to detection system though the specificity and selectivity tests. In addition, we designed a electrochemical detection system for the detect of L.monocytogenes rapidly and accurately. These results suggest that our system including a new monoclonal antibody (10E7), a novel biosensor and electrochemical detector may be useful to detect foodborne pathogen, L.monocytogenes in foods in the future.

Biological Effects of Fucoidan Isolated from Fucus vesiculosus on Thrombosis and Vascular Cells

곽규원 포천중문 의과대학교 생명과학전문대학원 2009 국내석사

Fucoidan is a highly sulfated glycosaminoglycan, which has a similar molecular structure to that of heparin. The antithrombotic effects of fucoidan in vitro have been widely reported, but its antithrombotic effects in vivo as well as other biological properties of fucoidan in vitro have not been well investigated This study investigated the effects and mechanism of fucoidan from Fucus vesiculosus on thrombosis, both in vitro and in vivo. A ferric chloride-induced mouse carotid artery thrombosis model was used to determine the antithrombotic effects of fucoidan in vivo. Also, change of pro-inflammatory cytokines and chemokines in the vascular cells treated with fucoidan was examined. In vivo studies, employing a ferric chloride-induced mouse carotid artery thrombosis model, indicated that fucoidan had a stronger anti-thrombotic activity than that of heparin. And vascular cells treated with fucoidan demonstrated a decrease in pro-inflammatory cytokines and chemokines production as well as an inhibition of proliferation. That major findings of this study showed that fucoidan has a stronger anti-thrombotic effect than heparin in vivo, and that fucoidan has an inhibitory effect on pro-inflammatory cytokines production and proliferation of vascular cells. fucoidan은 다량의 황산기를 갖는 Glycosaminoglycan으로 heparin과 유사한 구조이다. fucoidna의 in vitro에서의 항혈전 효과는 이미 여러 보고 된 바가 있으나 in vivo에서의 항혈전 효과에 대해서는 경동맥 혈전 유도 방법에 의한 연구된 바가 없었다. 이 연구는 Fucus vesiculosus로부터 추출한 fucoidan으로 ferric chloride로 마우스의 경동맥에 혈전을 유도시킨 후 fucoidan의 항 혈전효과를 측정하였다. 그리고 HUVEC(인간혈관내피세포)에 fucoidan을 처리했을 때의 염증 유도 cytokine과 chemokine 양의 변화를 측정하였다. In vivo 연구에서 경동맥 혈전은 유도 마우스 모델에서 fucoidan이 heparin보다 더 강한 항혈전 활성을 보였다. 또한, fucoidan에 대한 혈관내피세포는 염증을 유발하는 cytokine과 chemokine의 양이 줄어들었다. fucoidan은 in vivo에서 heparin보다 더 강한 항 혈전 효과가 있고 혈관 염증을 유도하는 cytokine 및 chemokine 형성을 억제한다.

혈당상승 억제활성을 가진 아르기닌-프럭토즈의 대량생산과 비임상 및 임상 연구

이광형 차의과학대학교 2015 국내박사

전 세계적으로 식생활 방식이 육류, 밀가루음식 또는 당분함유 음료 등의 섭취로 당뇨 및 합병증으로 인한 환자수가 증가 추세에 있으며 이에 따른 관련 치료제 및 건강식품소재 관련된 연구가 활발히 진행되고 있다. 국내에서도 후천적 요인에 의한 제2형 당뇨병이 지속적으로 증가추세에 있으며 현재 혈당조절에 있어서 소장의 glucose 분해 효소인 α-glucosidase의 저해제로 acarbose가 널리 쓰이고 있으나, 복부 팽만감, 복통, 설사 등의 부작용이 보고되고 있다. Acarbose의 부작용을 보완하면서 혈당상승을 억제하는 물질들 중 비효소적 갈변화 반응인 maillard 반응으로부터 생성되는 아마도리 화합물(Amadori Rearrangement Compounds; ARCs)의 일종인 Arginyl-fructose (AF)가 혈당상승 억제 효과가 있는 것으로 보고되었다. AF의 경우 홍삼의 제조 과정 중 생성되는 물질로 IC50이 6.4mM로 동물실험에서 혈당상승 억제 효과가 있다고 보고되었다. 따라서, 본 연구에서는 AF를 이용한 혈당강하 효능을 지니는 건강식품소재에 관한 대량생산과 임상 연구를 목표로 하였다. AF의 합성조건은 arginine와 glucose를 주성분으로 하여 acetic acid로 pH를 변화시켜 가열하는 방식으로 제조하였고 최적의 조건은 대량합성시 arginine과 glucose를 1:1로 혼합하고 10% acetic acid 를 가하여 2시간 동안 가열시 30% 이상 순도의 AF를 획득할 수 있었다. 이와 동시에 정량 및 정성분석을 위한 HPLC 분석법을 다양한 column을 이용하여 확립하였다. 또한, 실험관내 시험을 통해 인간 정상세포주인 제대정맥 내피세포(HUVEC)과 혈관대동맥 평활근세포(HaSMC)에서 10mM 농도까지 처리 했을 때 독성이 없음을 확인하였고, 혈당상승 억제 기전이외의 효능을 확인하기 위한 연구로 cell migration assay와 면역세포 활성 실험을 한 결과 세포의 이동성에는 영향을 미치지 않았지만 면역활성 실험에서 mouse의 비장세포에서 추출한 면역세포들 중 B 림프구 특이적 표면항원인 CD19의 발현을 대조군대비 10배 정도 증가시켜 B 림프구와 관련된 면역활성에 유용하게 쓰일 수 있다고 판단되었다. 당뇨질환 동물모델을 이용한 혈당억제 효과는 고탄수화물 사료의 섭취로 인해 고혈당 및 체중증가를 유발시켜 AF와 acarbose의 효능을 체중의 변화, 혈당분석, 당화혈색소분석, 지질류의 변화, 맹장의 무게 변화 등을 측정하여 비처리군과 비교하였다. 이때 두 가지 물질 모두에서 체중의 증가와 혈당 상증 억제효과를 보였으나 acarbose의 경우 맹장의 무게가 1.6±0.04g으로 AF 처리군 0.27±0.07g 보다 5배 증가하는 것으로 보여 부작용에 의한 것으로 판단되었다. 당화혈색소의 측정에서는 acarbose가 5.1 ± 0.80%로 AF 7.1 ± 0.6에 비해 높았으나 비처리군 9.8 ± 1.0% 보다는 낮은 결과를 보였다. 따라서, 동물모델에서는 AF가 acarbose를 보완할 수 있는 물질로 유효하다고 판단되었다. AF의 상업화를 위해 진행된 독성시험에서는 단회, 2주 반복, 13주 반복 투여 독성을 조사하였고, 복귀돌연변이시험, 염색체이상시험, 골수 소핵다염성 적혈구 이상시험을 수행한 결과 독성이 없는 것으로 나타났다. 13주 반복 독성시험의 최고 농도인 5,000mg/kg/day에서 독성이 없음을 확인하였다. 이상의 연구결과를 통해 AF는 혈당상승 억제 효능을 가지는 새로운 식품소재로써 효과를 확인할 수 있었다. The present study aimed to determine the large scale production and effects of arginyl-fructose (AF) supplementation on glucose control in the preclinical studies with animal models and clinical studies with prediabetes. AF could be effectively and simply produced only by the addition of 10% acetic acid at 80℃ with mixing in the 1:1 ratio of arginine and glucose. Inhibitory effects of AF on the proliferation and migration of human normal cells(HUVEC and HaSMC) were not revealed at concentration of 10mM. Interestingly, we founded that the CD19+ B cell population in splenocytes (of mice) treated with 10 mM AF was increased in a remarkable level (10 fold), compared to the control. This datum suggested that AF may increase the B cell-specific immune response. In addition, we have studied the inhibitory effect of AF on blood glucose level in diabetic db/db mice, a genetic model for type 2 diabetes. The db/db mice were randomly assigned to high-carbohydrate diets (66.1% corn starch) with and without AF (4% in the diet) for 6 weeks. Changes in body weight, blood glucose level, and food intake were measured daily for 42 days. Dietary supplementation of AF resulted in a significant decrease of blood glucose level (p < 0.001) and body weight (p < 0.001). The level of HbA1c, a better indicator of plasma glucose concentration over prolonged periods of time, was also significantly decreased for 6-week period (p < 0.001). Dietary treatment of acarbose (0.04% in diet), a positive control, also significantly alleviated the level of blood glucose, HbA1c, and body weight. These results indicate that AF Maillard reaction product improves postprandial hyperglycemia by suppressing glucose absorption as well as decreasing HbA1c level. Moreover, we performed preclinical and clinical studies to evaluate the toxicity of AF in in vivo. In preclinical studies, AF did not show any severe side effects on 13-week repeated administration. NOAEL (No-Observed-Adverse-Effect-Level) of AF was determined to be 5,000 mg/kg/day in both sexes. In clinical studies with the collaborative research, AF supplementation (1500 mg/day) showed a beneficial effects on control of glucose levels in the blood of human prediabetes group. Taken above results together, we expect that AF would be a potential anti-hyperglycemic material in the field of heath food research.

수용성 커큐민 유사체의 합성과 생물학적 활성에 관한 연구

조길상 차의과학대학교 2017 국내박사

강황은 생강과의 식물로써 인도를 중심으로 중국 등 아시아 지역에서 재배되며, 오래전부터 뿌리를 이용하여 식품 향신료, 안료, 민간요법 등에 사용되어져 왔다. 그 주요 성분인 커큐미노이드는 노란색 염료로 이용되고 있으며, pH에 따라 색이 변하는 특성으로 인하여 산도 검사지 등의 지시시약으로도 이용되고 있다. 커큐미노이드는 커큐민(I)과 그 유도체인 커큐민(II), 커큐민(III)로 구성된 페놀계 혼합물이다. 이 중 커큐민(I)이 약리작용이 가장 강하다고 알려져 있다. 쥐에 커큐민을 처리하였을 때 ADP, 에피네프린과 콜라겐에 의해 유발되는 혈소판 응집을 강하게 억제하고 프로스타글란딘의 증가를 나타낸다는 보고가 있다. 또한 당뇨성 쥐에 커큐민을 8주간 투여한 결과 혈중 콜레스테롤의 저하가 관찰되었고, 콜레스테롤 가수분해효소의 활성도도 매우 증가하는 것으로 알려졌다. 이 외에도 고 콜레스테롤 식이를 시킨 토끼에서 커큐민이 산화 스트레스의 감소와 동맥경화를 억제하는 효과를 나타내었으며, 배양세포를 이용한 실험에서도 커큐민에 의한 혈관 평활근 세포의 증식 억제 효과가 관찰되었다. 최근엔 신생혈관 억제, NFkB의 신호전달 저해 등을 통해 커큐민이 항암효과가 있음이 보고되고 있다. 이와 같이 커큐민은 다양한 약효로 인해 응용 가능성이 매우 큰 물질이지만 물에 잘 녹지 않는 특성으로 인하여 생체 내 투여 효과가 떨어지고, 식품 및 약제로 개발하기 어려운 점이 있어 그 효능에 비해 널리 이용되지 못하고 있는 실정이다. 선행 연구결과에 의하면 쥐의 구강으로 투여한 커큐민은 대부분 흡수되지 않고 대변으로 배출되지만, 소량의 경우 장 점막의 glucuronic acid와 결합하여 혈액으로 흡수되는 것으로 알려져 있다. 이에 커큐민의 당화(glycoconjugation)가 물에 대한 용해도와 체내 흡수율을 증가시키는 전략으로 많은 주목을 받고 있다. 커큐민의 당화 방법으로 UDP-glucosidase와 같은 당화 효소에 의한 제조방법과 공유결합에 통한 유기합성을 이용한 제조방법 등이 보고되어져 있다. 그러나 커큐민은 자체의 안정한 구조로 인하여 반응성이 현저히 떨어져 수득율이 매우 낮을 뿐만 아니라 앞서 언급한 두 가지 당화 방법은 UDP-glucose와 같은 고가의 반응물이 필요하므로 경제성과 효율성이 낮다. 이러한 수용성 당화 커큐민은 커큐민의 당화 시 베타 형태의 글루코실 결합으로 제조되었으며, 체내에서 탈당화 작용을 거쳐 커큐민으로 생성되는 과정이 필요하다. 이에 본 연구에서는 위에 언급한 문제점에 대한 대안으로 매우 효율적인 glycoconjugation 방법을 제시하였으며, 이를 통해 새로운 커큐민 유사체, curcumin-dimannoside(CDM)을 합성하였다. CDM은 다른 종류의 커큐민 유사체와 비교하여 물에 대한 용해도가 매우 높았으며, 수득율 또한 기존의 방법과 비교하여 증가하였다. 또한 우리는 커큐민이 갖고 있는 여러 가지 기능 중 항염증 효과에 주목하였으며, CDM도 이와 같은 효과가 있는지 알아보았다. 그 결과 CDM은 IKK의 활성을 저해함으로써 NFkB가 핵내로 이동하는 경로를 억제하였다. 그 결과 염증반응에 관여한다고 알려진 IL-1B, IL-6, IL-8 등의 cytokine 발현을 억제하였으며, TNFa에 의해 자극된 혈관내피세포의 monocyte 부착도 효과적으로 억제하는 것을 확인할 수 있었다. 동맥경화를 유발시킨 쥐 모델에서도 CDM의 병행투여 결과 동맥경화 억제 효과를 확인하였다. 이런 실험 결과들로 보아 CDM은 혈관 내피에 대해 뛰어난 항염증 효과를 가지고 있으며, 이는 동맥경화를 포함하여 다양한 염증성 질환의 예방 및 치료에 적용할 수 있을 것으로 기대된다.

Curcumin에 의한 혈관 평활근세포의 증식억제 기작규명

성희진 연세대학교 대학원 2004 국내석사

Atherosclerosis and post-angioplasty restenosis are characterized by the abnormal activation of vascular smooth muscle cell (VSMC) and inflammatory cells, and the excessive accumulation of extracellular matrix (ECM) proteins. In general, VSMC which is a contractile form maintains the blood vessel, but VSMC is transformed into a synthetic form by blood. When vascular endothelial cell is injured, VSMC is activated via contacting with growth factors and ECM proteins. The activation of VSMC causes the neointimal hyperplasia and finally interferes blood flow. In this study, we treated curcumin, an anti-oxidant and anti-inflammatory compounds, isolated from the root of the plant Curcuma longa L. to rat aortic smooth muscle cells (RAoSMCs) to investigate its anti-proliferative mechanism. Cytoskeletal change of RAoSMC treated with curcumin was characterized by α-tubulin staining and cell signaling changes were also investigated by western blotting and RT-PCR analysis. Apoptosis of the cells treated with curcumin was demonstrated by DNA laddering analysis. Also, protein changes of curcumin-treated RAoSMC were determined by 2-D electrophoresis, in-gel digestion, MALDI-TOF MS, and proteome bioinformatics analysis. These results showed that curcumin inhibited serum- and PDGF-stimulated proliferation of RAoSMCs in a dose-dependent manner, by arresting G0G1 phase of cell cycle and inducing apoptosis. Also the mRNA level of c-myc in PDGF-stimulated RAoSMCs was significantly reduced, and cytoskeleton was not changed in spite of cell shrinkage. Proteomics studies revealed that enzymes which is participated in metabolism were reduced and heat shock protein or stress protein were increased. These results suggest that the effect and inhibitory mechanism of curcumin on vascular smooth muscle cells are due to specific inhibition of the PDGF-signaling pathway, cell cycles, and activation of apoptosis. Also, we have tested the biological effects of curcumin-diglucoside (CDG) which is a soluble derivative of curcumin on SMC. 동맥경화나 혈관조형술 후의 혈관재협착(restenosis)은 혈관 평활근세포 및 염증세포의 활성화와 세포외 기질 (extracellular matrix; ECM) 단백질들의 비정상적인 축적에 의해 일어난다. 보통 혈관 내에서의 평활근세포는 혈관의 tone을 유지하기 위해 수축형 형질 (contractile form)로 존재하다가 혈관 내피세포 층의 손상으로 인하여 혈액에 노출되면 증식형 형질 (synthetic form)로 전환된다. 혈관 내피세포층의 손상으로 인하여 노출된 혈관 평활근세포는 각종 성장인자 및 ECM 단백질들과 접촉하여 세포 증식 및 이동의 자극을 받아 인체의 경우 재협착증이라는 질병과 함께 심하게는 혈관이 막히는 증상이 야기된다. 본 연구에서는 인도산 생강인 울금 (Curcuma longa L.)으로부터 추출된 polyphenol류인 curcumin을 혈관 평활근세포에 처리하여 curcumin에 의한 세포 증식억제 효과 및 그 작용 기전을 밝히고자 한다. Curcumin을 처리한 세포내 골격 변화는 α-tubulin으로 염색한 세포를 형광현미경으로 관찰하였고 PDGF 자극에 의한 세포 증식억제와 연관된 세포 신호전달계의 변화는 western blotting과 RT-PCR을 통해 규명하였으며, apoptosis 유발여부는 DNA laddering을 통해 관찰하였다. 또한 two-dimensional electrophoresis (2-DE) 및 in-gel digestion, MALDI-TOF-MS (matrix-assisted laser desorptionionization-time of flight-mass spectrometry)를 통해 세포내 단백질 변화 양상을 확인하였다. 그 결과, curcumin은 serum과 PDGF의 자극에 의한 혈관 평활근세포의 증식을 농도에 비례하여 억제하였으며, 세포주기를 G1에서 정지시킨 후 궁극적으로 세포를 apoptosis로 가게 만들었다. 또한 PDGF의 자극에 의한 c-myc의 mRNA 수준은 확연히 줄어드는 것을 확인할 수 있었으나, 고농도의 curcumin 처리 시 세포 수축이 일어남에도 불구하고 세포 내 골격변화는 없는 것으로 나타났다. Curcumin을 처리하였을 때 세포의 변화가 일어나기 시작하는 시점과 세포 수축이 일어나 부유하는 시점에서의 단백질발현 양상은 대조군과 비교해 보았을 때, 대사에 관련된 단백질의 종류나 양은 줄어들고, heat shock protein이나 stress protein의 경우는 증가한 것을 확인할 수 있었다. 이 논문에서는 쥐의 대동맥유래 혈관 평활근세포에서 curcumin에 의한 증식억제 기전과 apoptotic 효과, transduction signal과 유전자 및 단백질 발현 양상을 규명하였다. 또한 물에 용해되지 않는 curcumin에 두 개의 당 그룹을 붙여 수용성으로 만든 curcumin-diglucoside (CDG)의 활성 및 혈관 평활근세포의 증식 억제효과도 함께 관찰하였다.

Effects of Small Peptide Fragment Derived From Vimentin Protein on the Dermal Papilla Cell Proliferation

박대연 차의과학대학교 대학원 2018 국내석사

Alopecia has come to light with caused by various reasons including androgenetic effect. It is symptom that can be a marker of aging process or a sudden common form induced by many kinds of diseases or androgenetic effects, although alopecia is not harmful and risk of our life. Being as Dermal papilla cells (DPCs) is the main cell of regulating hair cycle, many other reports have shown novel agents, but there is no a stark effect. In our previous study, TAT-vimentin has shown as the potential protein for the applications with therapeutic material of alopecia. In this study, we investigated the role of vimentin protein in DPCs proliferation using deletion mutants of vimentin protein. With considering target sites of deletion mutant, we selected the expected caspase cleavage sites, specific position of vimentin protein sequence. And four vimentin mutant proteins fused with cell-penetrating peptide TAT were generated as recombinant proteins containing one or two caspase cleavage site. Only a mutant containing both caspase sites is as equally effective in DPC proliferation as wild-type vimentin. Keywords: Hair growth, HDPC, Proliferation, H2O2-Induced Oxidative stress So, we designed twelve synthetic peptides based on the result of experiments using mutant proteins. To examine peptides effects, DPCs were induced apoptosis with H2O2 for oxidative stress. In that environment, cleaved vimentin fragments cleaved by caspase were detected. Among twelve, several of peptide containing 85-Asp and 259-Asp site of vimentin showed a significant cell proliferation in DPCs and resistant to oxidative stress. These results suggest small mutant proteins or peptides in vimentin full sequence would be considered as biological agent in treatment of hair growth 탈모 증상은 남성 호르몬 작용을 비롯한 여러 가지 원인으로 인해 발생한다는 것이 알려졌다. 탈모는 우리의 삶의 위험과 해로운 위험 요소가 아니지만 여러 가지 질병이나 남성 호르몬 작용에 의해 유발되는 노화 과정 또는 갑작스런 일반적인 형태의 지표가 될 수 있는 증상이다. 많은 보고에 따르면 모유두 세포 (DPC)가 모발주기를 조절하는 주된 세포이기 때문에 모유두 세포에 대한 새로운 약물에 대한 연구와 신약이 개발되었으나 뚜렷한 효과는 없었다. 이전 연구에서 TAT-비멘틴은 탈모를 치료하는데 있어서 잠재적인 물질로 나타났다. 본 연구에서는 비멘틴 단백질의 돌연변이를 이용하여 DPCs 증식에서 비멘틴 단백질의 역할을 연구 하였다. 돌연변이의 표적 부위를 고려하여, 예상되는 카스파에이즈가 절단하는 부위, 즉 비멘틴 단백질 서열의 특정 위치를 선택 하였다. 또한 세포 안으로 침투할 수 있는 펩타이드인 TAT서열과 융합 된 4 개의 vimentin 돌연변이 단백질은 하나 또는 두 개의 카스파에이즈 분해 절단 부위를 포함하는 재조합 단백질로서 제작되었다. 두 개의 카스파 제 부위를 함유하는 돌연변이가 비멘틴이 모유두 세포에서 비슷한 효과를 보였다. 그래서 우리는 돌연변이 단백질을 이용한 실험 결과를 토대로 12 개의 합성 펩타이드를 제작했다. 펩타이드 효과를 조사하기 위해, 모유두세포에 H2O2로 산화 스트레스를 주어 세포 사멸을 유도했다. 그 환경에서, 카스파에이즈에 의해 절단된 비멘틴이 검출되었다. 제작한 펩타이드12 개 중 비멘틴의 85-Asp와 259-Asp 부위를 포함하는 몇 개의 펩타이드는 모유두 세포에서 유의 한 세포 증식을 나타내었고 산화 스트레스에 저항성을 보였다. 이러한 결과는 비멘틴 전체 서열로부터 제작된 돌연변이 단백질 또는 펩타이드가 탈모 치료에서 생물학적 소재가 될 수 있음을 시사한다.

유전자 재조합 디스인테그린 saxatilin의 발현 및 혈관 평활근세포에 미치는 영향

선새아 연세대학교 대학원 2003 국내석사

연구배경 경피적 중재술 이후에 발생하는 혈관 재협착증은 extracellular matrix (ECM)의 파손과 혈관 평활근세포의 부착, 이동 및 증식이 주요원인이다. 한국산 칠점사의 독으로부터 분리된 신규 디스인테그린 (disintegrin)인 saxatilin을 재조합 Pichia 효모에서 발현시키고, 유전자 재조합 saxatilin이 혈관 평활근세포에 미치는 영향 및 그 작용기전을 규명하고자 하였다. 방법 및 결과 Pichia 효모에서 발현된 saxatilin 단백질을 phenyl-Sepharose와 Source 30 역상 크로마토그래피를 이용하여 순수 정제하였으며, saxatilin의 생물학적 활성은 혈소판 응집 억제활성 측정법을 통하여 확인하였다. Saxatilin의 평활근세포 부착 및 증식 억제효과는 세포배양실험을 이용하여, integrin 유전자들의 발현변화는 RT-PCR (reversetranscription- polymerase chain reaction)을 통하여, MAP kinase 경로 변화 및 apoptosis등은 western blot을 이용하여 분석하였다. 또한 saxatilin 처리에 의한 평활근세포의 세포골격계 변화도 관찰하였다. 또한 saxatilin 유전자를 혈관 평활근세포에서 발현시키기 위하여 전기충격으로 세포 핵내 DNA를 전달하는 방법인 nucleofection을 실시하였고, 그 영향을 saxatilin 재조합 단백질을 처리한 결과와 비교 분석하였다. 이러한 과정을 통해 재조합 saxatilin을 활성형 단백질로 Pichia 효모로부터 발현하고 순수 정제하였다. 재조합 saxatilin은 혈소판응집을 억제하였고, 평활근세포의 vitronectin, fibronectin에 대한 세포부착 (IC_(50) for vitronectin; 65 nM, IC_(50) for fibronectin; 25 mM)과 세포증식 (IC_(50); 2.5~7.5 mM)을 농도 의존적으로 억제하였다. 또한 saxatilin은 혈관 평활근세포의 MAP kinase 경로의 ERK를 활성화시킴에도 불구하고 혈관평활근세포의 세포골격계를 해체시키고 아울러 세포 부착능력을 상실한 평활근세포들이 apoptosis에 도달하는 것을 확인하였다. 결론 이상의 결과에서 보듯이 신규 디스인테그린인 saxatilin이 혈관재협착 및 동맥경화증에 중요한 혈관 평활근세포를 효과적으로 억제하였으며, 그 작용기전은 세포표면의 integrin에 대한 길항작용과 세포내 신호전달계에 영향을 통해 이루어진다는 사실을 규명하였다. Background: Restenosis occurs in approximately 30~40% of patients following percutaneous transluminal coronary angioplasty (PTCA) for treatment of atherosclerosis. The stimulation of vascular smooth muscle cell (SMC) is critical steps in the development of the neointimal tissues that contribute to the restenosis of an arterial wall. RGD-containing peptides are able to inhibit the binding of ligands to certain beta3 integrins, such as alpha(IIb)beta(3) and alpha(v)beta(3), both of which are involved in neointimal hyperplasia. To elucidate the detailed mechanisms involved in the inhibition of neointimal hyperplasia, the effects of saxatilin, a RGD-containing disintegrin, on smooth muscle cell have been studied. Methods and Results: The recombinant saxatilin was highly expressed in Pichia pastoris and purified to be homogeneity with an active form. To investigate the biological effects of the disintegrin on SMC, changes of cellular signaling, gene expression of SMC as well as inhibition of SMC adhesion and proliferation after treatment of the disintegrin have been examined by immunoblot and RT-PCR, respectively. It interacts with integrin alpha(v)beta(3) and significantly suppresses the adhesion of rat aortic SMC to vitronectin with an IC_(50) of 65 nM and the proliferation of SMC induced by basic fibroblast growth factor (bFGF) with an IC_(50) of 2.5 μM. Saxatilin disassembled cortical actins at focal adhesions and induced cells to be rounded and detached, but it did not alter microtubule structures in the early stage of cells being rounded. In saxatilin-treated SMC, focal adhesion kinase and ERK were phosporylated. While SMC proliferated normally on plates coated with saxatilin, cells treated with saxatilin eventually underwent apoptosis. The disintegrin also significantly down-regulated the expression of integrins, beta 3, beta 1, and alpha 5. Conclusion: These results may provide new insights into role of integrin in SMC pathophysiology as well as role of SMC in the process of neointimal hyperplasia and have significant implications for disintegrin therapy for the treatment of restenosis and atherosclerosis.

농축 혈소판(PRP)의 사이토카인 분포와 피부 세포의 증식 및 이동에 미치는 matrix metalloproteinase(MMPs)의 조절 연구

박홍범 차의과학대학교 대학원 2012 국내석사

Background The underlying rationale of platelet rich plasma (PRP) therapy is that an injection of concentrated PRP at the site of injury may promote tissue repair via cytokine release from platelets. The molecular mechanisms of PRP therapy in the skin wound healing process are not well understood at present, and would benefit from clarification. Methods PRP was stimulated with angonists for 5 min, and cytokine profile analysis was performed. To investigate the wound healing activity of PRP, cell proliferation and migration analyses were performed in skin cells. The effects of PRP were analyzed on the expression and activity of matrix metalloproteinase (MMP)-1, -2, -9, and the activation of transcription factors. Results Thrombin was found to be a strong stimulator of PRP activation to release growth factors and chemokines. PRP induced cell proliferation and migration in HUVECs, HaCaT cells, and HDFs, as well as MMP-1and MMP-9 expression in HaCaT cells, but PRP did not have a significant effect on the expression or activity of MMPs in HDFs. The transcription factors, including signal transducer and activator of transcription- 3 (STAT-3) were found to be phosphorylated following PRP treatment in HaCaT cells. Conclusion In this study, we have identified the cytokine profile of activated PRP after agonist stimulation. We have shown that PRP plays an active role in promoting the proliferation and migration of skin cells via the regulation of MMPs, and this may be applicable to the future development of PRP therapeutics to enhance skin wound healing. Key Words : Platelet rich plasma (PRP), Wound healing, Cytokine profile, Cell proliferation, Cell migration, Matrix metalloproteinase 연구배경: 농축 혈소판(Platelet Rich Plasma, PRP)의 사이토카인 및 성장인자, 키모카인들에 의한 염증반응, 조직재생 및 상처치유의 기능은 현재 많은 주목을 받고 있다. 특히 상처치유의 과정에는 세포의 증식, 이동 및 세포외 기질의 합성과 분해에 의한 세포외 기질 재구성과 피부세포의 표피 재생성 등이 주요하게 작용하고 있다. 따라서 본 연구에서는 1) 각 길항제에 의한 농축 혈소판의 활성화에 따른 사이토카인과 성장인자들의 분비를 연구하고 2) 농축 혈소판에 의한 피부세포들의 이동, 증식 영향 및 matrix metalloproteinases(MMPs)의 발현 조절 연구 3) 농축 혈소판에 의한 MMP 발현 조절의 세포내 신호전달 체계에 대해 살펴보았다. 연구방법: 농축 혈소판(PRP)의 분리는 ACD tube에 혈액을 채취한 후 250 Xg, 15 min, 37℃ 에서 원심분리 하고 플라즈마 층만을 모아서 37℃에 10 분간 배양 후 1900 Xg, 8 min 37℃ 에서 원심 분리한다. 침전부분을 Washing buffer (Tyrode’s albumin solution) + 10 U/ml heparin + 0.5 uM PGI2를 넣은 후 침전을 풀어준 후 10 분간 37℃에서 배양 시키고 1900 Xg, 8 분간 37℃ 에서 원심분리 하여 혈소판을 모으고 혈소판 개수를 세어 실험에 사용한다. 농축 혈소판의 활성화 연구는 vwf, Ca2+ (%), Thrombin, collagen, ADP로 5분간 처리한 후 멀티플렉스 분석을 이용해 혈소판 내 사이토카인과 성장인자의 분포를 분석하였다. 농축 혈소판에 의한 세포이동 및 증식기전규명 연구를 위해 피부세포의 일종인 HaCaT 세포와 인간 섬유아세포(Human Dermal Fibroblast(HDF))를 10% DMEM에서 배양하여 이용하였다. PRP 처리에 의한 MMP의 발현조절 및 세포내 신호전달 체계는 10% 농축혈소판을 피부세포에 처리하고 웨스턴 블로팅 분석과 자이모그래피를 수행하여 확인하였다. 연구결과: 각 길항제에 의한 농축 혈소판의 활성화 효과는 트롬빈에서 PDGF와 TGF-β를 비롯한 성장인자와 사이토카인의 발출 비율이 높음을 알 수 있었다. 피부세포의 증식과 이동에 미치는 농축 혈소판 효과는 피부세포에서 유사한 비율로 세포의 증식과 이동을 증가시킴을 확인하였다. 또한 농축 혈소판 처리 시 피부세포에서 MMP-1의 발현이 증가함을 웨스턴 블로팅 분석을 통해 확인하였다. MMP-2, 9의 발현조절 연구는 자이모그래피를 수행하여 측정하였으며 역시 피부세포에서 MMP-9의 활성을 증가함을 알 수 있었다. 농축 혈소판에 의한 MMPs 발현과 활성에 관련 세포내 신호전달 체계에 대한 연구로 NF-kB, JNK, STAT-3의 활성이 주요하게 관련되어 있음을 확인하였다. 결론: 본 연구를 통해 농축 혈소판이 피부재생 및 상처치유에 주요하게 관여함을 확인하였고 메커니즘 연구로 피부세포에서 MMP-1, 9의 발현을 증가시킴으로 세포의 이동과 증식, 세포내 기질의 재구성에 관여함을 알 수 있었다.

Biological activities and mechanisms of a fibrinolytic enzyme and a disintegrin from the venom of Korean snake

조길상 포천중문 의과대학교 생명과학전문대학원 2009 국내석사

Many snake venoms act on the blood coagulation system. Since there is growing medical interest in thrombolysis, snake venoms which affect the hemostatic system have been well investigated. A fibrinolytic enzyme was purified to homogeneity from the venom of Korean Salmosa snake Agkistrodon halys by a combination of benzamidine-Sepharose affinity chromatography and FPLC Unosphere Q ion exchange fractionation. The purified enzyme is a glycoprotein and migrates as a single band with molecular mass of 33KDa on SDS-PAGE. The fibrinolytic enzyme is characterized by its isoelectric point of 4.3. The enzyme was not able to hydrolyze human serum albumin, plasminogen, thrombin, immunoglobulin and tPA. To examine the toxicological effect of saxatilin, a disintegrin isolated from the venom of a Korean snake (Gloydius saxatilis), recombinant saxatilin was highly expressed as a biologically active form in Pichia pastoris, and was successfully purified to homogeneity from the culture broth supernatant. The molecular and biological properties of the recombinant protein were the same as those of its natural form. RGD-peptides can inhibit the binding of ligands to certain β3 integrins, α II bβ3 and a v β3, both of which are involved in neointimal hyperplasia that contributes to atherosclerosis and restenosis of arterial walls. Saxatilin, a disintegrin from a Korean snake (Gloydius saxatilis), interacts with integrins α II bβ3 and a v β3. It suppressed the adhesion of human coronary artery smooth muscle cells (HCASMCs) to vitronectin with an IC 50 of 2.5uM, and growth factor (PDGF-BB or bFGF)-induced proliferation was inhibited at an IC 50 of 25uM. 다양한 종류의 뱀독에는 혈액 응고계에 작용하는 많은 인자들이 보고되고 있으며, 특히 의학적 치료제로써의 개발목적으로 뱀독에 대한 다양한 연구가 진행되어지고 있다. 이에 본 연구에서는 한국에 서식하고 있는 살모사(Agkistrodon halys)와 까치살모사(Agkistrodon saxailis)의 뱀독으로부터 이와 같은 항혈전 단백질을 탐색하고 분리동정한 후 생체내 효능을 알아보기 위해, 이를 재조합 단백질로 발현하였다. 우선 살모사의 뱀독을 확보한 후, benzamidine-Sepharose column과 Unosphere Q column을 이용해 혈전용해효소를 분리, 정제하였다. 정제된 효소는 약 33KDa의 분자량을 가지며 등전점은 4.3인 당단백질이었다. 이 효소는 혈액내에 존재하는 serum albumin, plasminogen, thrombin, IgG, tPA 등에는 영향을 주지 않고, 특이적으로 fibrinogen 과 fibrin 만 분해하였다. 이에 salmonase의 cDNA library를 확보한 뒤 yeast system에서 재조합 단백질로 발현하는데 성공하였다. 또한 디스인테그린인 saxatilin의 생리활성을 알아보기 위해 재조합 단백질로 대량발현을 시킨 후 순수분리, 정제하였으며, 재조합 saxatilin은 천연형의 saxatilin과 그 활성이 동일하였다. RGD-peptide를 지닌 이 saxatilin은 β3 integrins의 binding을 막음으로써 α II bβ3와 a v β3 등의 반응을 억제하였고, 특히 인간 평활근세포의 adhesion과 proliferation을 강하게 저해하였다.

CHA-STATIONTM을 이용하여 분리한 인체유래 Stromal Vascular Fraction의 특성연구

박현경 차의과학대학교 대학원 2013 국내석사

Adipose-derived stem cells (ASC) can be easily obtained and facilely cultured in vitro, compared with bone-marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC). Above all, in compare with BM-MSC are isolated from 100 to 1000 times more. The self-renewal capacity and differentiation of ASC are reported to be excellent. For these ASC, such as in breast augmentation and cosmetic surgery has been applied in a clinical. SVF has been included in the ASC. So, in order to isolate the SVF has been developed CHA-STATIONTM. The SVF isolation method is shorter and can be prevent pollution than the conventional isolation method. The yield of SVF are 3.6 × 105 cell/㎖ via CHA-STATIONTM and the yield of SVF are 3 × 105 cell/㎖ using the conventional isolation method. CHA-STATIONTM and the conventional isolation method was similar in cell yield. The SVF isolated via CHA-STATIONTM and passge 0 (P0) ASC were analyzed the surface immune antigen. As a result, mesenchymal stem cell (MSC) surface antigens CD73, CD90 and CD105's expression were increased. The transcriptional factors Nanog, Oct4, Sox2, and Klf4 expression of self-ren- ewal and multi differentiation ability was confirmed. Cultured ASC was confirmed to differentiate into adipocyte, chondrocyte and osteocyte. SVF isolated via CHA-STATIONTM have the characteristics as stem cells. Su- itable isolation method has been developed for clinical users. Because the all process is performed in aseptic condition. Also isolation time be shorter than the conventional isolation method, can be applied widely in clinical care. Keywords : CHA-STATIONTM, Adipose-derived stem cells (ASC), Stromal vascular fraction (SVF), Bone-marrow mesenchymal stem cell(BM-MSC), Mesenchymal stem cell (MSC), Differentiation 지방줄기세포(Adipose-derived stem cells: ASC)는 골수유래의 중간엽 줄기세포에 비해서 채취하기 쉽고, 배양이 용이하며 무엇보다도 골수에 비해 분리되는 중간엽 줄기세포의 양이 100-1000배나 더 많고 자기 분열 능력 및 다분화 능력도 뛰어난 것으로 보고되고 있다(Wagner W et al, 2005; Takemitsu H et al, 2012). 이러한 ASC를 유방 확대술이나 미용수술로 임상에서 적용을 하고 있다. CHA-STATIONTM은 ASC가 포함이 된, stromal vascular fraction (SVF)을 분리하기 위하여 개발하였다. CHA-STATIONTM을 이용한 SVF 분리 방법은 기존의 분리 방법보다, 분리 시간을 단축시키고 오염의 위험성을 방지할 수 있다. CHA-STATIONTM을 이용하여 분리한 SVF에 대한 세포의 수율이 3.6 × 105 cell/㎖이고 기존 분리 방법의 세포 수율이 3 × 105 cell/㎖로 별 차이가 나지 않았다. 또한, SVF와 계대 배양한 ASC의 표면항원 면역 형질 분석 결과 중간엽 줄기세포의 표면항원인 CD73, CD90 및 CD105의 발현이 증가 되었다. 자가 재생 능력과 다분화능의 전사인자인 Nanog, Oct4, Sox2 및 Klf4의 발현을 확인하였고, SVF를 배양하여 지방세포, 골세포, 연골세포로의 분화를 유도하여, 다분화능을 확인하였다. CHA-STATIONTM을 이용하여 분리한 SVF는 줄기세포로서의 특성을 가지고, 임상 사용자들에게 적합하게 만들어져 최대한 무균상태에서 진행이 되고, 분리 시간이 기존의 방법보다 단축되어서, 시술받는 환자의 안전과 만족도를 높일 수 있는 효과를 도모할 수 있다.