Variations of Arabidopsis thaliana chloroplast emission spectra with excitation wavelength and exposure time in two-photon microscopy : 이광자현미경의 여기광 파장과 조사 시간에 따른 Arabidopsis thaliana 엽록체의 형광 스펙트럼의 변화

주용준 포항공과대학교 일반대학원 2014 국내석사

Two-photon microscopy는 nonlinear 흡수에 의한 single photon microscopy에 비해 깊은 투과능력과 적은 photobleaching으로 인해 널리 사용되고 있다. 그러나 식물에서는 pigment들에 의해 다른 샘플들에 비해 refractive index mismatch가 있어서 위의 장점들의 효과가 적다. 엽록체는 빛을 흡수해서 광합성을 한다. 엽록체는 다양한 pigment들이 넓은 범위의 파장을 흡수한다. 각각의 pigment들은 서로 다른 파장의 빛을 흡수하여 에너지를 reaction center로 전달하여 광합성을 한다. 광합성 외에 남은 에너지는 열과 형광으로 배출된다. 형광은 680nm에서 700nm의 붉은 파장이 나오게 된다. Two-photon microscopy 연구에서 single-photon excitation과 emission spectrum이 다르게 넓은 spectrum이 나온다는 것이 밝혀져있다. 넓은 emission band는 two-photon excitation의 높은 intensity light에 의한 photodamage이다. 시간에 따른 emission spectrum 변화는 photodamge의 진행상황이라고 볼수 있다. 이러한 two-photon microscopy 연구들은 780nm를 이용하여 진행되었다. 엽록체를 two-photon microscopy로 볼때는 다양한 파장을 사용 할 수 있다. 엽록체만을 볼 때는 레이저 특성과 엽록체의 흡수 등 으로 인해 700~800nm파장을 주로 사용한다. 보다 높은 파장은 엽록체뿐만 아니라 추가로 다른 목적이 있을 때 주로 사용하게 된다. GFP나 로다민 등 다른 형광물질을 보거나 second harmonic generation(SHG), third harmonic generation(THG), fluorescence lifetime imaging(FLIM) 등이 있다. Arabidopsis thaliana는 짧은 수명과 적은 유전자로 인해 식물 연구에 많이 사용되는 식물이다. Two-photon microscopy를 이용한 Arabidopsis thaliana의 연구는 많지만 Arabidopsis thaliana가 어떻게 반응하는 지에 대한 연구는 적다. Two-photon microscopy에 의한 반응에 관한 연구들은 모두 800nm이하의 excitation 파장을 가지고 진행되어 있다. 이 연구에서는 Arabidopsis thaliana 잎의 chloroplast가 800nm 이상의 파장에서 어떠한 반응을 보이는지를 확인하는 것을 목표로 한다. 실험에는 800nm~1000nm의 파장이 사용되었다. TCS SP5 II(Leica Microsystems Ltd.) 현미경을 이용하여 2주된 Arabidopsis Thaliana 잎을 촬영 하였다. 데이터 분석에는 엽록체 신호만을 잡아서 측정하였다. Emission spectrum은 850nm까지 기존의 연구결과와 비슷하게 650nm의 peak에 낮은 파장에서 넓은 spectrum이 나타났다. 그러나 850nm이상부터는 peak이 670nm로 이동하고 낮은 파장대에서 신호가 거의 나오지 않았다. Emission spectrum이 변함에도 불구하고 이미지상의 차이는 거의 나타나지 않았다. 시간에 따른 emission spectrum도 850nm에서 큰 변화가 있었다. 850nm미만에서는 시간에 따라 전체적인 신호가 상승하고 일정 시간 후 600nm이상의 신호가 조금 감소하였지만 850nm이상에서 부터는 처음부터 붉은 신호가 나타났었다. 850nm에서는 붉은 신호가 처음에는 높게 시작했다가 줄어들지만 시간이 지나면 다시 올라간다. 그러나 excitation 파장이 길어질수록 붉은 신호가 올라가는 양이 줄어들다 900nm부터는 단순히 줄어들기만 한다. excitation 파장 1nm에 따라 emission spectrum이 크게 변하는 것은 특이한 결과여서 실험을 반복해 보았으나 결과는 마찬가지였다. 장비에 문제를 확인하기 위해 같은 실험을 다른 샘플을 이용해 실행해 보았으나 아무런 문제가 없었다. 이런 1nm에 따른 변화는 특이한 결과이기 때문에 해석하기 쉽지 않다. 엽록소 a와 b가 emission peak이 각각 670nm과 650nm인데 이것은 위에서 얻은 850nm미만과 이상의 emission peak과 거의 일치한다. 500~600nm대의 emission을 가지는 형광물질은 β-carotene과 riboflavin 등 엽록체 속에 여러 종류가 있다. 이로 보아 850nm를 기준으로 빛 흡수의 방법이나 경로에 변화가 생기는 것이 아닐까 생각해 볼 수 있다. 추후 연구를 위해서는 각각 요소들을 분리해서 emission 및 absorption spectrum을 측정하거나 fluorescence lifetime(FLIM)등 다양한 실험이 필요할 것으로 생각된다. Two-photon excitation microscopy is widely used for deep penetration by non-linear absorption and low photo bleaching compared to single photon microscopy. For botanical specimen, it still has the above advantages to single photon microscopy but is not as effective as in other specimen due to refractive index mismatch in the plant structure and strong absorption by chloroplast. Chloroplast absorbs light and use the energy for photosynthesis. Chloroplast has various pigments to absorb wide range of wavelength. Each pigment absorbs different wavelength of light and transfers the energy to reaction center for photosynthesis. Other then photosynthesis, Energy is released as heat and fluorescence. Fluorescence is typically in the red wavelength apprxomately between 680 nm and 700 nm. Previous two-photon microscopy studies showed that two-photon excitation has different emission spectra of chloroplasts compared to single-photon excitation and the spectra have broad range of emission. This broad emission band was considered as photodamage due to high intensity light for two-photon excitation. Changes of emission spectra with illumination time were measured and considered as the progression of photodamage. These two-photon microscopy studies used excitation wavelength of 780 nm. Various wavelength of excitation laser can be used for imaging chloroplast by two-photon microscopy. When imaging only chloroplast autofluorescence, 700~800nm is widely used due to laser specification and high absorption. Higher excitation wavelength is used for not only imaging chloroplasts but other purposes like using fluorophores such as GFP and rhodamine, imaging second harmonic generation(SHG), third harmonic generation(THG) and fluorescence lifetime imaging(FLIM). Arabidopsis thaliana is widely used in plant studies because of short life cycle and small genome. There are studies done about Arabidopsis thaliana with two-photon microscopy, but little is known about its' behavior. Studies about two-photon behavior are all done with only below 800nm excitation wavelength. The goal of this thesis is to find out how chloroplast behave when imaged with excitation wavelength of 800nm or higher. In this study, Arabidopsis thaliana leaf chloroplast was imaged by two-photon microscopy with 800nm~1000nm excitation wavelength. TCS SP5 II(Leica Microsystems Ltd.) was used to image chloroplast autofluorescence of 2 weeks old Arabidopsis thaliana leaf. For data analysis, only chloroplast signals were chosen. Emission showed similar result of broad spectrum with peak at 650nm until excitation wavelength of 849nm. At excitation wavelength 850nm, emission spectrum peak shifted to 670nm, and did not change until 1000nm. Even though emission spectrum changed, there was not much difference in the image taken. Time lapse emission also changed significantly at 850nm. Below 850nm, overall signal increased as exposure time gets longer. From excitation 850nm and above, initial red signal appears. At 850nm, red signal decrease first from the initial level, and then increase again. As excitation wavelength gets longer, red signal shows less increase and monotonic decrease, which may indicate less photodamage. As the result which emission changes by difference of only 1nm of excitation wavelength is unusual, experiment was done multiple times to ensure the result. Additionally, experiment was done at same condition with other samples to see if there was problem with the microscope and there was no problem. These changes can not be explained easily because of sudden change between just 1nm excitation wavelength. Chlorophyll a and b emission peaks are similar to emission peaks of above and below excitation wavelength of 850nm. Other than peaks, there are many source of fluorescence at 500~600nm range like β-carotene and riboflavin. It is assumed that there is some change in light absorption mechanism or pathway at 850nm. For further study, various approach like measuring emission and absorption spectrum of isolated components or fluorescence life time will be needed.

Molecular Charaterization of Esterase Genes that have a Role for Disease Resistance in Capsicum annuum and Arabidopsis thaliana : 고추(Capsicum annuum)와 애기장대(Arabidopsis thaliana)에서 병저항성에 관여하는 에스테르 가수 분해 효소 유전자의 분자적 특성

전웅배 Graduate School, Korea University 2003 국내박사

HSR203J, EDS1, PAD4 와 같은 에스테르 가수 분해 효소 또는 리파제(lipase) 유사 단백질은, 그들의 효소 활성이 식물체에서 병방어기작에 관련될지도 모른다고 보고되었다. 본 연구에서, 고추(Capsicum annuum)과 애기장대(Arabidopsis thaliana)에서 에스테르 가수 분해 효소 유전자를 분리하고, 그 특성을 밝혀냈다. 그 중 하나는 탄저병 균류(Colletotrichum gloeosporioides)에 상반되는 불친화적 반응 중에 높게 발현되는 고추 에스테르 가수 분해 효소 (PepEST) 유전자 이다. 다른 하나는 애기장대 식물의 2번 염색체에 위치하는 에스테르 가수 분해 효소 (AtEST) 유전자 이다. 이 유전자들에서 번역된 단백질의 아미노산 서열은 포유동물과 원핵생물의 리파제 와 에스테르 가수 분해 효소 와 높은 상동성을 보이고, -HGGGF-와 -GXSXG- motifs와 catalytic triad를 가지고 있다. PepEST유전자의 발현은 열매 특이적이고 열매의 후숙과정에서 상처를 주거나 jasmonic acid에의해 유도된다. PepEST mRNA와 PepEST 단백질의 축적은 친화적 반응보다는 불친화적 반응에서 더 많았다. 불친화적 반응중에 PepEST가 표피와 외피 세포층에 축적되는 것을 Immunolocalization을 통해 확인하였다. 그러나, 친화적 반응중에 PepEST는 표피세포층안에 희소하게 조차 축적되지 않았다. PepEST유전자의 애기장대형질전환체에 phytopathogenic 곰팡이인 Alternaria brassicicola을 접종한 결과, 개선된 병저항성을 보였다. 이는 PepEST의 에스테르 가수 분해 효소 활동이 C. gloeosporioides에대하여 익은 고추열매의 방어기작과 관련 될 지도 모른다는 것을 나타낸다. 재조합 AtEST 단백질에는 p-nitrophenyl butyrate (C_(4))에대한 효소 활성과 고유 활성도가 시험관내에서 측정되었다. AtEST1의 효소 활성은 AtEST2의 것보다는 두배 높게 나타났다. 애기장대의 생체내에서의 AtEST1유전자의 역할을 이해하기 위하여, knockout 돌연변이체가 선발되었다. Necrotrophic 곰팡이인 Botrytis cinerea를 접종한 다음 AtEST1 돌연변이체의 GUS활성도를 시험 한 결과, AtEST1유전자가 이 균에 의해서 유도되는 것으로 여겨진다. AtEST1 transgenic 애기장대 식물은 B. cinerea에의해 증진된 병저항성을 보였다. 이 결과로 유추하면, AtEST1 에스테르 가수 분해 효소는 병원균 침입에의한 식물체의 저항성 반응기작에서 어떤 역할을 하는 것으로 보인다. Esterase and lipase like proteins such as, HSR203J, EDS1, and PAD4 have been reported that the enzyme activity of these proteins in plants may be involved in defense mechanism. Here, we isolated and characterized esterase genes from pepper (Capsicum annuum) and Arabidopsis thaliana. The one is pepper esterase (PepEST) gene highly expressed in incompatible interaction with anthracnose fungus, Colletotrichum gloeosporioides. The other is Arabidopsis thaliana esterase (AtEST) genes, which are located on chromosome II in Arabidopsis plants. The amino acid sequence of the encoded proteins showed significant sequence homology to both lipases and esterases of mammals and prokaryotic organisms, and contained -HGGGF- and -GXSXG- motifs and the catalytic triad. The expression of PepEST gene was fruit-specific and up-regulated by wounding or jasmonic acid treatment during ripening. The accumulation of PepEST mRNA and PepEST protein was higher in the incompatible interaction than in the compatible interaction. Immunolocalization showed that the accumulation of PepEST was localized in epidermal and cortical cell layers in the incompatible interaction. However, in the compatible interaction, the PepEST was rarely localized even in epidermal cell layers. Constitutive expression of PepEST gene in transgenic Arabidopsis plants resulted in enhanced disease resistance against phytopathogenic fungus Alternaria brassicicola. Taken together, these results suggest that the esterase activity of PepEST is may be involved in a defense mechanism of the ripe fruit of pepper against C. gloeosporioides infection. The recombinant AtEST proteins have an enzyme activity and specific activity for p-nitrophenyl butyrate (C_(4)) in vitro. The enzyme activity of AtEST1 was 2-fold higher than that of AtEST2. To better understand an endogenous role of AtEST1 genes in Arabidopsis, a knockout mutant was selected. The GUS activity test of AtEST1 mutant after inoculation with necrotrophic fungus, Botrytis cinerea showed that AtEST1 gene induced for response to the fungus. AtEST1 transgenic Arabidopsis plants showed enhanced disease resistance against B. cinerea. Taken together, these results suggest that AtEST1 esterase has a role for resistance response to fungal invasion.

A study on the functional properties and regulation of cytosolic Ascorbate peroxidase 1 from Arabidopsis thaliana (AtAPX1) : Arabidopsis thaliana (AtAPX1) 세포질 Ascorbate peroxidase 1의 기능적 특성 및 조절에 관한 연구

SHUBHPREET KAUR UNIVERSITY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY, SOUTH KOREA 2022 국내박사

Ascorbate peroxidase (APX) is one of the important antioxidant enzyme that decomposes reactive oxygen species (ROS) such as hydrogen peroxide (H2O2) to prevent oxidative damage. APX belongs to class I heme containing plant peroxidases that decomposes H2O2 using ascorbate as an electron donor. It has been recently reported that APX2 in rice has additional function as molecular chaperone and multimeric forms which are modulated by salt stress in vivo. The peroxidase activity of APX is also regulated by various posttranslational modifications (PTMs) such as S-nitrosylation, S-sulfhydration, and tyrosine nitration. In this study, I aimed to identify the multiple functions, structural modulation by abiotic stresses and effects of PTMs on the structural and functional status of APX. Cytosolic APX1 from Arabidopsis thaliana (AtAPX1) was used in this study. AtAPX1 is one of the most important isoform among all APXs as it has more than 70% activity in total APX activity and it is expressed in both normal and stress conditions. AtAPX1 existed in varied oligomeric forms ranging from dimeric to high-molecular (HMW) weight complexes. AtAPX1 showed dual role by behaving as a typical ascorbate peroxidase and as a molecular chaperone. The dual functions of AtAPX1 were closely linked with its oligomeric status. The major dimeric form showed the highest peroxidase activity, whereas the HMW complexes showed the highest chaperone activity. Moreover, in vivo studies indicated that AtAPX1 structure was modulated by abiotic stresses such as heat and salt. Heat stress promoted association of LMW forms to HMW complexes whereas salt stress promoted dissociation of HMW complexes to LMW forms. In response to heat stress, Columbia-0 (Col-0), AtAPX1 overexpression (OE), and complementation (COMP) plants showed thermotolerance whereas apx1 deficient mutant (apx1-6) showed sensitive phenotype emphasizing the importance of APX1 in response to heat stress. In addition, to investigate the role of AtAPX1 as a chaperone molecule in heat shock tolerance, apx1-6 was complemented with APX1-C32S-FLAG, APX1-C168S-FLAG, and APX1-C32S/C168S-FLAG (double mutation, DM). All the transgenic plants showed slightly lesser APX activity than Col-0 however, the DM transgenic plants showed least APX activity comparable to apx1-6. I then analyzed the ability of Cys-mutant transgenic plants to recover from heat stress. The DM-FLAG/apx1-6 plants, which previously had the lowest level of APX activity, showed recovery from heat stress whereas apx1-6 could not recover. In addition, I have investigated the effects of post-translational modifications (PTMs), such as S-nitrosylation, S-sulfhydration, and tyrosine nitration on the oligomeric status of protein and dual functions. S-nitrosylation and S-sulfhydration were confirmed by biotin switch assay and tyrosine nitration of AtAPX1 was confirmed by immunoblotting using anti-tyrosine antibody. The effects of PTMs analyzed using gel analysis and enzymatic activity assays. S-nitrosylation and S-sulfhydration positively regulated the peroxidase activity, whereas tyrosine nitration had a negative impact. However, no effects were observed on the chaperone function and the oligomeric status of AtAPX1. This study provides a comprehensive evaluation of the effects of abiotic stresses and posttranslational modifications on the dual function and varied oligomeric forms of AtAPX1 protein in Arabidopsis. Ascorbate peroxidase (APX)는 과산화수소(H2O2)와 같은 활성산소종(ROS)을 분해하여 산화적 손상을 방지하는 중요한 항산화 효소 중 하나이다. APX는 아스코르빈산을 전자공여체로 사용하여H2O2를 분해하는 헴(heme)을 포함하는 Class I 효소이다. 벼의 APX2는 분자 샤페론으로 추가 기능을 가지고 있으며 생체 내 염분 스트레스에 의해 조절된는 것으로 최근 보고되었다. APX의 퍼옥시다제 활성은 S-니트로실화(S-nitrosylation), S-황화(S-sulfhydration) 및 타이로신-니트로화 (tyrosine nitration)와 같은 다양한 번역 후 변형(PTM)에 의해 조절된다. 이 연구에서 우리는 APX의 이중 기능, 비생물적 스트레스에 의한 구조적 조절 및 APX의 구조적 및 기능적 상태에 대한 PTM의 영향을 확인하는 것을 목표로 하고 있다. AtAPX의 분석에 사용된 애기장대 (Arabidopsis thaliana)의 세포질 APX1(AtAPX1)은 전체 APX 활성에서 70% 이상의 활성을 가지며 정상 및 스트레스 조건 모두에서 발현되기 때문에 모든 APX 중에서 가장 중요한 동형 단백질 중 하나이다. AtAPX1은 이량체에서 고분자 (HMW) 복합체에 이르는 다양한 다량체로 형태로 존재하였다. AtAPX1은 전형적인 peroxidase와 분자 샤페론으로 작용하여 이중 역할을 나타내었다. AtAPX1의 이중 기능은 중합체 상태와 밀접한 연관성을 가지고 있었다. 주된 이량체 형태는 가장 높은 peroxidase 활성을 보인 반면, 고분자 복합체는 가장 높은 샤페론 활성을 나타냈다. 이러한 기능을 기반으로 AtAPX1은 열 스트레스에 대한 저항력에서 제공하여 중요한 역할을 하는 것으로 보인다. 또한, 생체 내 연구에서AtAPX1 구조는 열 및 염분과 같은 비생물적 스트레스에 의해 조절되었다. 열 스트레스는 저분자 (LMW) 형태의 결합을 촉진하여 고분자 (HMW) 복합체를 형성하는 반면 염 스트레스는 HMW 복합체에서LMW 형태로 분해를 촉진하였다. 또한, 우리는 열 저항성을 제공하는 AtAPX1의 샤페론 역할을 조사하였다. AtAPX1 과발현, complementation (보완) 및 야생형은 열 저항성을 보였지만, apx1 결핍 돌연변이체 (apx1-6)는 열 스트레스에 대해 감수성을 보였다. 더욱이, apx1 결핍 돌연변이체(apx1-6) 에 APX-C32S와 APX-C32S/C168S (이중돌 연변이)가 보완된 식물체는 총 APX 활성이 감소하였다. 따라서 APX 활성에 시스테인 잔기가 중요하게 관여한다는 것을 알 수 있었다. 또한, 우리는 AtAPX1단백질의 다량체로상태와 두 기능에 S-nitrosylation, S-sulfhydration 및 tyrosine nitration과 같은 번역 후 변형(PTMs)의 효과를 조사하였다. S-nitrosylation과 S-sulfhydration은 biotin switch assay로 확인하였고, AtAPX1의 tyrosine nitration은 anti-tyrosine 항체를 이용한 immunoblotting으로 확인하였다. PTM의 효과는 겔 분석 및 효소 활성 분석을 사용하여 분석되었습니다. S-nitrosylation 및 S-sulfhydration은 peroxidase 활성을 긍정적으로 조절한 반면 tyrosine nitration은 부정적인 영향을 미쳤다. 하지만 AtAPX1의 샤페론 기능과 올리고머 상태에 대한 영향은 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 비생물적 스트레스와 번역 후 변형이 단백질의 이중 기능에 미치는 영향에 대한 포괄적인 연구를 제공한다. 이 연구는 비생물적 스트레스와 번역 후 변형 하에서 APX의 역할과 조절에 대한 이해를 촉진할 것이다.

The role of Abscisic acid for root gravitropism and quiescent center maintenance in Arabidopsis thaliana : 애기장대에서 뿌리 굴중성과 QC 유지와 관련된 ABA의 역할

Woong Han 강원대학교 대학원 2011 국내박사

The plant hormone abscisic acid (ABA) plays a role in root gravitropism and has led to an intense debate over whether ABA acts similar to auxin by translating the gravitational signal into directional root growth. We show evidence that ABA plays a role opposite to that of auxin, indicating that it is a negative regulator of the gravitropic response of Arabidopsis roots. ABA promotes root agravitropism in auxin transport mutants. Our data obtained from both vertically and horizontally placed seedlings show that ABA plays a negative role in root gravitropism. NPA in promoting root agravitropism, ABA did not induce auxin accumulation in the root meristem, suggesting that ABA and NPA act through different mechanisms. The root-curling phenotype induced by auxin transport inhibitors in wild-type plants may involve in the endogenous ABA. We provide experimental evidence that ABA links to the maintenance of stem cells, which are vital for the function of meristems, in Arabidopsis root meristems. We show that ABA promotes the quiescence of the stem cells in the quiescent center (QC) and suppresses the differentiation of stem cells and their daughters in both the distal and proximal parts of root meristems. We also show that these two ABA regulations are mediated by distinct pathways and establish that five identified ABA signalling molecules, ABI1, ABI2, ABI3, ABI5 and ERA1, act in the former regulation and that ABA modulates WOX5’'s function in the suppression of stem cell differentiation in the distal part of root meristems. Our results reveal a novel ABA regulatory property which offers an attractive framework for understanding how plants control meristem activity during vegetative growth and protect meristem functions under environment conditions and also demonstrate an important role of negative regulator of root gravitropism in Arabidopsis thaliana.

카드뮴에 의해 변화된 Arabidopsis thaliana 유전체에 대한 RAPD 패턴 분석 연구

이주희 한국교원대학교 교육대학원 2009 국내석사

Cadmium not only cause disease, but also the inhibition of plant growth. It is very harmful heavy metal to human health which can interfere with metabolism of the cells. Cadmium can affect the structure and function of DNA. Therefore it can induce the changes of genomic stability. In this study, the changes of genomic stabilty induced by cadmium stress was analyzed using RAPD in Arabidopsis thaliana. The growth rate of root was measured after growing Arabidopsis thaliana on Murashige and Skoog(MS) medium for 7 days, which was transferred to MS medium containing 0-6mg/L of cadmium and cultured more for 3 or 7 days. DNA was extracted from the plants, which were treated by cadmium for 7 days, and then used for RAPD analysis. The higher concentration and longer treatment of cadmium showed the more decoloration of leaves and severe inhibition of root growth. Using 9 different primers, it was found that there are much changes in RAPD pattern from Arabidopsis thaliana treated by cadmium. Without cadmium treatment, primer OPB7 showed the highest number of DNA bands and primer OPB1 showed the least number of bands. With cadmium treatment, primer OPB10 showed the most high number of new bands. In the lowest concentration of 0.75mg/L, every primer showed the most of original bands and has only small changes. The highest number of original bands disappeared from the genome of plants treated by cadmium of 1.5 mg/L. There are biggest changes in RAPD pattern showing most number of appearnce of new bands and disappearnce of original bands from the plant treated by 3.0mg/L of cadmium. It means this treatment of cadmium induced the most changes of genomic stability. In conclusion, it was found that genomic stability can be changed by cadmium treatment in Arabidopsis thaliana. The different primer showed different pattern of RAPD at different concentration of cadmium treatment. Therefore RAPD analysis will be useful tool to check the changes of genomic stability induced harmful heavy metals. 카드뮴은 유기체에 노출되면 질병의 원인이 될 뿐만 아니라 식물의 생장을 저해하고 세포의 대사 작용을 방해하므로 사람과 식물 건강에 아주 해로운 중금속이다. 카드뮴은 DNA의 구조와 기능에 영향을 미쳐 genome의 안정성에 변화를 유발한다. 이 연구에서는 애기장대(Arabidopsis thaliana)가 카드뮴 스트레스에 의해 어떤 영향을 받는지 RAPD를 이용해 genome의 전반적인 stability 변화를 보고자 하였다. Murashige and Skoog(MS) 배지에서 7일 키운 애기장대의 유식물을 0-6.0mg/L의 카드뮴이 처리된 배지에 옮겨 3일과 7일 더 배양시킨 개체들의 성장정도를 관찰하고, 7일 처리된 개체들의 DNA를 추출하여 RAPD를 수행하였다. 카드뮴의 농도가 높고, 카드뮴 처리 배지에서 배양시간이 길수록 잎의 탈색정도가 심해지고, 뿌리의 생장속도가 느려졌다. 카드뮴 배지에서 7일 배양한 애기장대의 유식물에서 추출한 genomic DNA를 9종류의 primer를 이용해 RAPD를 실시한 결과 RAPD 패턴의 많은 변화를 확인하였다. 정상적인 MS배지에서는 primer OPB7이 가장 많은 수의 밴드를 나타냈고 primer OPB1이 가장 작은 수의 밴드를 나타냈다. 카드뮴의 농도별 배지에서는 primer OPB10이 가장 많은 수의 새로운 밴드를 나타냈다. 카드뮴처리 농도별 배지에서는, 가장 낮은 농도인 0.75mg/L에서 모든 primer가 대부분 원래 있었던 밴드를 유지하면서 조금씩의 변화를 보였다. 1.5mg/L 농도의 카드뮴이 처리된 배지에서 생장한 개체의 genome에서 변화가 심하게 나타나는데 가장 많은 수의 밴드가 사라졌다. 카드뮴 농도 3.0mg/L에서는 새롭게 출현하고 사라지는 밴드들이 가장 활발하게 나타남으로서 genome 안정성에 가장 큰 변화가 일어남을 확인할 수 있었다. 본 연구 결과 애기장대의 성장에 방해가 되는 농도의 카드뮴 처리에 의해 genomic stability에 큰 변화가 생기는 것을 확인할 수 있었다. 그리고 사용된 primer의 종류에 따라 RAPD의 stability 양상이 달랐다. 이런 결과는 RAPD를카드뮴의 농도에 따른 애기장대의 genome stability의 변화를 측정하는 생물학적 마커로 사용할 수 있을 것이다.

애기장대 (Arabidopsis thaliana L.)에서 염류스트레스와 glucose 신호전달에 관여하는 ABC 수송체, AtMRP5의 기능에 관한 연구

이은경 연세대학교 대학원 2003 국내박사

밝혀진 식물 ABC 수송체의 기능은 세포 내 대사산물의 이동 및 축적, 세포 밖으로의 배출, 제초제와 같은 외부 독성 화합물의 제독 및 제거, 환경 스트레스에 대한 반응 등에 관여하는 매우 활용가치가 높은 생명현상에 관여하고 있다. GUS repoter 유전자가 융합된 chmeric plasmid를 포함하고 있는 형질전환 애기장대를 이용하여 AtMRP5 유전자의 promoter의 활성을 측정한 결과 AtMRP5 유전자는 뿌리의 분열조직 바로 위로 연결되는 신장부위와 뿌리털, 잎의 유관속 조직, 꽃받침의 유관속 조직, 수술과 화분, 그리고 pollen tube에서 발현되고 있었다. 본 연 구는 애기장대에서 생화학적 실험과 T-DNA knock-out 돌연변이인 atmrp5-2를 통하여 AtMRP5의 역할과 기능을 확인하였다. AtMRP5는 HEK293 cell에 과발현시켰을때 sulfonurea와 특이적으로 결합하였고 atmrp5-2 돌연변이는 뿌리 성장에 있어서 sulfonylurea의 일종인 glibenclamide에 대해 둔감하였다. atmrp5-2 돌연변이가 100mM NaCl를 포함하는 MS 배지에서 뿌리의 성장이 심하게 억제되고 mannitol 처리에서는 이러한 과민 반응을 보이지 않는 것으로 보아 AtMRP5는 염류 스트레스 시 수반되는 이온 스트레스에 대한 저항 기작에서 그 기증을 하고 있음을 알 수 있었다. 야생형에 염류 스트레스와 함께 K_(ATP) 채녈의 억제제인 glibenclamide를 처리하면 그 표현형질이 atmrp5-2 돌연변이의 NaCl 스트레스시의 뿌리성장 억제 양상과 유사하였다. 또한 이러한 야생형의 glbenelamide에 의해 나타난 뿌리 억제 양상은 K_(ATP) 채널 opener (KCO)인 diazoxide를 처리시 약 30% 정도 극복되었다. 이러한 결과를 통하여 염류 스트레스시 AtMRP5는 이온 채널로서 혹은 이온 채널을 조절함으로서 세포내 이온의 항상성을 유지하는 저항성 기작에서 그 기능을 할 것이라 사료된다. atmrp5-2 돌연변이는 μM 수준으로 감소된 K+ 이온의 결핍시 뿌리 성장에 있어서 과민하게 반응하였고, 본 연구실에서 수행된 ^(86)Rb+ uptake 실험에서 high affinity uptake에서 atmrp5-2 돌연변이가 이상이 있음이 확인되었다. 또한 염류 스트레스시 atmrp5-2 돌연변이가 K+ 이온의 결핍 양상을 보임으로서 AtMRP5는 K+ 이온의 항상성을 유지하는 데서 역할을 하고 이로써 염류 스트레스에서 비롯되는 이온 스트레스에서도 이온의 균형을 유지하는 기능으로 저항 기작에서 관여할 것이라 여겨진다. 한편, 동물에서 sulfonylurea 수용체 (SUR)는 K_(ATP) 채널의 한 subunit으로 glucose 유입에 의한 세포 내 에너지 수위에 따라 K+ 채널을 조절하는 것으로 알려져 있는데, atmrp5-2 돌연변이를 이용하여 AtMRP5가 식물의 glucose sensing과 신호절달 과정에서 역할을 하고 있음을 확인하였다. Glucose가 들어있는 배지에서 광 조건에서 자란 4일된 유묘는 야생형에 비하여 자엽이 정상작으로 발달하지 못하고 전체적인 유묘의 성장과 발달이 억제되어 있었다. 이러한 glucose에 의한 atmrp5-2 돌연변이의 성장 억제 양상은 발아와 하배축의 신장, 유묘의 성장뿐만 아니라 개화시기에 있어서도 나타났다. 개화시기의 지연은 glucose에 의한 전반적인 성장 억제로 개화 시기도 늦추어진 것으로 확인되었다. 그리고 이러한 armrp5-2의 glucose에 의한 과민한 반응은 hexokinase의 활성 변화에 의한 것은 아니었다. 다른 glucose 신호전달 경로에 관련된 gin1/aba2-1, gin6/abi4-1 돌연변이들과의 표현형질의 비교를 통하여 AtMRP5가 glucose를 인지하고 신호를 전달하는 과정에서 역할을 할 것이라 예상된다. atmrp5-2 돌연변이가 ABA에 과민하게 반응하고 ABA에 의해 AtMRP5 유전자의 발현이 조절되는 것으로 보아 기존에 밝혀진 GIN1, ABA, GIN6 등을 경유하여 이루어지는 glucose 신호전달 기작에서 negative regulator로서 역할을 할 것이라 여겨진다. Recently, a new member of the ABC transporter superfamily of Arabidopsis thaliana, AtMRP5, was identified and characterized. In the present work, we found that AtMRP5 can bind specifically to sulfonurea when it is expressed in HEK293 cells. We also present evidence for a new fole of AtMRP5 in the salt-stress response of A. thaliana. We used reverse gentics to identify an A. thaliana mutant (atmrp5-2) in which the AtMRP5 gene was disrupted by T-DNA insertion. In root-bending assays using MS medium supplemented with 100 mM NaCl, root growth of atmrp5-2 was substantially inhibited in consrast to the almost normal growth of wild-type seedlings. This hypersensitive response of the atmrp5-2 mutant was not observed during mannitol treatment. The root growth of the wild-type plant grown in MS medium suppplemented with the MRP ingibitor glibenclamide and NaCl was inhibited to a very similar extent as the root growth of atmrp5-2 grown in NaCl alone. The Na+-dependent reduction of root growth of the wild-type plant in the presence of glibenclamide was partially restored by diazoxide, a known K+ channel opener that reverses the inhibitory effects of sulfonylureas in animal cells. Moreover, the atmrp5-2 mutant was defective in high-affinity ^(86)Pb+ uptake. These dbservations suggest that AtMRP5 is a Putative sulfonylurea receptor that is involved in K+ homeostasis and thus also participats in the NaCl stress response. We have also found an additional putative role of AtMrP5. AtMRP5 functions in glucose signaling mediated by ABa. The atmrp5-2 mutant is hypersensitive to glucose in cotyledon greening and expansion, hypocotyl elongation, shoot development, and flowering. These phenotypes of atmrp5-2 mutant were compared to glucose insensitive mutants (gin1 and gin6) and with glucose hypersensitive mutants (etr1-1, ein2-1, 35S-ABF3 and 35S-ABF4). The hypersensitivity to glucose of atmrp5-2 is not observed when treated with other sugars (fructose, lactose, and sucrose) or mannitol. The hypersensitivity of atmrp5-2 to glucose is not defective in HXK activity. Also the atmrp5-2 mutation cause ABa hypesensitivity in germination and seedling growth. ABa and glucose modulate the gene expression of AtmRP5. These results suggested that AtMRP5 junctions downstream of ABa as a negative regulator in glucose signaling.

Identification and Characterization of Two Peptide Transport Systems in Arabidopsis thaliana

고세리 University of Tennessee - Knoxville 2000 해외박사

식물체에 존재하는 여러 종류의 펩타이드들이 식물 성장과 발달 과정중에 미치는 기능과 역할을 이해하기 위해 이 연구에서는 펩타이드의 전이 운송에 관련된 두 종류의 peptide transporters [di-, tri peptide transporter (PTR) and oligopeptide transporter (OPT)]를 식물에서 분리하고 각각의 독특한 기능적 특성을 밝히고자 한다. AtPTR2 는 애기장대 (Arabidopsis thaliana)에서 클론된 식물 최초의 펩타이드 전이운송체 (peptide transporter)로써, 두 세개의 아미노산으로 연결된 작은 펩타이드 (di-, tri peptide)를 세포내로 운송하는 효모 (Saccaromyces cerevisiae) 의 PTR2p orthoglogue이다 (Song et al., 1996). AtPTR2 antisense 형질전환 식물체는 종자의 발달 미숙을 보인바 있기에 (Song et al., 1997), 이 연구에서는AtPTR2가 식물 종자 발달 과정중에 발현되는 시기와 위치를 상세히 알아보고자 AtPTR2 polyclonal 항체를 이용해AtPTR2단백질의 발현위치를 광학현미경과 전자 현미경을 이용해 관찰하였다. 그결과, AtPTR2는 식물세포막에 위치해 있으며, 종자 이외에도 뿌리의 표피세포층에서도 주로 발현됨이 밝혀졌다. AtPTR2는발달중인 종자의maternal tissue부분에서 특히 많이 발현되었으며, wild-type 애기장대와 AtPTR2 antisense의 상호교배 결과에서도AtPTR2가 maternal effect가 있음을 확인하였다. 이 연구에서는 AtPTR2 이외에도, Candida albicans oligopeptide transporter (CaOpt1p)와 높은 염기서열 유사성을 가진 8개의 Arabidopsis thaliana oligopeptide transporter (AtOPT1 to AtOPT8)를 애기장대의 게놈에서 최초로 발견하였다. 이들은 이전에 알려진PTR family와는 진화적으로 꽤 거리가 있으며, 네, 다섯개의 아미노산으로 연결된 펩타이드 (tetra- and pentapeptides)를 전이 운송하는 같은 OPT family내에서도 곰팡이류에서 발견되는 OPT와는 또 다른 subgroup으로 분리되었다. 식물에서 여러종류의 펩타이드 전이운송체 발견은 이들이 식물의 대사 발달 과정중 각각 다른 기능적 역할을 담당하리라는 추측을 하게하며, 각 AtOPT 유전자들의 독특한 조직 특이적 발현양상 (tissue specific expression)은 이러한 추측은 확인되었다. 또한, 클론된 AtOPT cDNAs (AtOPT1 to AtOPT7) 를 효모에서 발현시켜 본 결과, 다섯AtOPT가 성공적으로tetra- and pentapeptides를 효모 개체내로 흡수하였다. 이는 이들이 식물체내에서도 펩타이드 전이운송체의 역할을 기능적으로 수행할 수 있음을 간접적으로 보여주는 것이다. 더 나아가 식물 발달 과정에서AtOPTs가 맡고 있는 생리적 역할을 심도있게 알아보기 위해, AtOPT2와 AtOPT3의T-DNA knock out mutants를 PCR-based 방법으로 찾아내었다. 그 결과, AtOPT2::T-DNA개체는 잎과 꽃의 형태 발달에 장애를 보였고, AtOPT3::T-DNA 개체는 종자 발달에 심각한 장애를 보여 성숙한 종자의 수가 확연히 줄어듬을 볼수 있었다. 이결과는 AtOPT3 유전자의 발현이 AtPTR2와 유사하게 종자의 발달 성숙에 기능적 역할을 담당하고, 식물체에 존재하는 여러 종류의 펩타이드들도 식물 성장과 발달에 다양하게 영향을 미치고 있음을 보여준다. AtPTR2 is a peptide transporter capable of transporting di- and tripeptides in Arabidopsis thaliana. Previous studies showed that antisense expression of AtPTR2 cDNA resulted in an arrest of seed development (Song et al., 1997). In order to gain more insight into the possible function of AtPTR2, a highly specific polyclonal antibody was raised to AtPTR2 and used for immunolocalization studies. Western blot analysis localized AtPTR2 to a plasma membrane enriched fraction isolated from 3 week-old seedlings. Consistent with this observation, immunogold labeling, using transmission electron microscopy, localized AtPTR2 to the plasma membrane in all tissues examined. Immunolocalization with anti-AtPTR2 antibody, using silver enhanced light microscopy, showed that the protein was present in the root, stem and developing seed. AtPTR2 was found exclusively in the maternal tissue of the developing seed. Reciprocal crosses between transgenic plants expressing AtPTR2 cDNA in the antisense orientation and wild-type A. thaliana showed a pronounced maternal effect on seed development. These data support our hypothesis that AtPTR2 is a plasma membrane localized peptide transporter that plays a crucial developmental role in the maternal tissue of the developing seed. More recently, eight more di- and tripeptide transporter orthologues (AtPTR2C to AtPTR2J) were identified in the database search. In addition to the PTR family, eight oligopeptide transporter orthologues (AtOPT] to AtOPT8) were identified by a search of the Arabidopsis thaliana sequences in the database. These proteins show significant sequence similarity to Candida albicans CaOptlp and oligopeptide transporters identified in Schizosaccharomyces pombe and Saccharomyces cerevisiae (Isp4p and Opt1p). Hydrophilicity plots of the AtOPTs suggest that they are integral membrane proteins with 12-14 transmembrane domains. Sequence comparisons showed that the AtOPTs form a distinct family from the PTR family and form a discrete subfamily when compared to the fungal OPTs. The identification of multiple peptide transporters in Arabidopsis suggests that they may play different functional roles. This idea was supported by the fact that the AtOPTs exhibited a distinct, tissue-specific expression pattern. The cDNA encoding each of the AtOPTs was cloned into a yeast vector under the control of a constitutive promoter. When expressed in S. cerevisiae, five out of the seven AtOPT proteins tested conferred the ability to uptake tetra- and pentapeptides. To determine the physiological roles of AtOPTs in plants, T-DNA knockout mutants of AtOPT2 and AtOPT3 genes were identified using a PCR-based screening method. Single T-DNA insertion mutant lines in both AtOPT2 (G5-1 line) and AtOPT3 (N4 line) were identified by Southern blot analysis and DNA sequencing. The AtOPT2∷T-DNA mutant (G5-1 line) showed a defect in leaf pattern formation resulting in a narrow leaf. This leaf phenotype cosegregated with Kanamycin resistance encoded on the T-DNA. The AtOPT3∷T-DNA N4 line showed a seed abortion phenotype resulting in a low seed number per silique. Seed clearing experiments revealed the absence of developing embryos in the albino seeds produced by the N4 line. Segregation analysis of the N4 line showed a 2:1 ratio (Km^(R):Km^(S)) consistent with the idea that the aborted seeds are homozygous recessive for the AtOPT3∷T-DNA mutation.

Application and delivery of double-stranded RNAs in Arabidopsis thaliana

박민수 서울대학교 대학원 2020 국내석사

RNA interference (RNAi) is an RNA-dependent gene silencing process regulated by interaction of RNA-induced silencing complex (RISC) and double-stranded RNA (dsRNA). Exogenous dsRNA is imported directly into the cytoplasm and cleaved to short dsRNA fragments of 20-25 base pairs by Dicer. These short dsRNA fragments, called small interfering RNAs (siRNAs) have sequence specific interaction with target genes. Guide strand of which siRNAs incorporated in RISC interacts with target mRNA sequence, induces the cleavage and thus degrades target messenger RNAs (mRNAs) by ribonucleases in cells. Recent studies show that dsRNA treatment on plants can induce RNAi. However, the diverse application methods and delivery system of dsRNA are poorly explored. In this study, dsRNA is applicated in Arabidopsis thaliana by two kinds of methods, dipping and spray. I synthesized diverse dsRNAs which designed to target enhanced green fluorescent protein (EGFP) and plastid transcriptionally active 10 (pTAC10) in Arabidopsis thaliana genome. After application of dsRNA that targets EGFP, I found the obvious reduction of GFP expression through fluorescence microscope and mRNA expression level using quantitative reverse transcription PCR (qRT-PCR) in auxin-sensitive reporter DR5-eGFP Arabidopsis thaliana. In addition, after dsRNA application that targets pTAC10, I observed growth repression of Columbia-0 (Col-0) wild type Arabidopsis thaliana. The data revealed that application of target gene specific exogenous dsRNA with dipping and spray methods can induce suppression of target genes of interest. This study might provide a foundation of understanding the processes of dsRNA application and delivery system in plants that can be contributed to RNAi-based technology. RNA 간섭은 RNA-induced silencing complex (RISC) 및 double-stranded RNA(dsRNA)의 상호 작용에 의해 조절되는 RNA 의존적 유전자 침묵과정이 다. 외인성 dsRNA는 세포질 내로 들어가 Dicer에 의해 small interferingRNA로 절단되어, 이 중 guide strand가 RISC와 상호 작용하여 특정 mRNA sequence를 절단한다. 최근 연구에 따르면 식물에서의 dsRNA 처리는 RNAi를 유도할 수 있음이 알려졌으나, dsRNA의 다양한 적용 방법 및 전달 시스템 연구는 부족하다. 이에 본 연구에서는 enhanced green fluorescent protein (EGFP)와 plastid transcriptionally active 10 (pTAC10) 유전자를 표적하는 다양한 dsRNA를 디자인하고 합성하여 애기장대 식물체에 침지와 분사 방법으로 적용하였다. 각각의 유전자를 표적하는 dsRNA를 처리한 후, 형광 현미경, 실체 현미경 그리고 quantitative reverse transcription PCR (qRT-PCR)을 이용하여 EGFP 유전자와 pTAC10 유전자가 저해됨을 확인하였다. 이러한 결과들을 종합하여, 외인성 dsRNA가 침지와 분사 방법으로 식물체 내에 적용되며, 이는 RNA 간섭을 활성화하여 표적 유전자의 발현을 억제 시킬 수 있음을 알 수 있었다. 이는 또한 RNA 간섭 기반 기술에 기초를 제공 할 수 있을 것이다.

Arabidopsis thaliana의 ethylene triple response mutants 에서 생리, 생화학적 특성에 관한 연구

강희연 梨花女子大學校 大學院 1996 국내석사

Understanding the molecular mechanisms of seed number variation in Arabidopsis and Lepidium

김동우 서울대학교 대학원 2022 국내석사

Seeds, the reproductive organs that are the result of ovule fertility, cannot be separated from plant and human life. Seed production is a critical phase in the life history of plants and seeds are used as an essential resource of human history, such as food, feed and fuel. Especially, seed number is one of key traits for the plant fitness and crop yield. Thus, studying the genetic mechanism determining seed number is important, but still many unknown areas are there. In this study, I identified significant variation in seed number per silique among 131 accessions of Arabidopsis thaliana. Ten ecotypes with the lowest number of seeds per silique showed low fertility. Ten ecotypes with the highest number of seeds per silique showed large number of formed ovules. These results suggest that the variation in seed number per silique among 131 accessions is regulated by different fertility and formed ovule number. To identify the genes regulating seed number per silique, Genome-wide Association Study (GWAS) was performed. The analysis characterized 107 Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) that are highly correlated with the observed variation in the seed number per silique among 131 accessions. Ten SNPs were selected for candidate genomic loci statistically supported. I further identified the candidate genes that are closely located or include the selected SNPs. Phenotyping T-DNA insertion knockout mutants of the candidate genes revealed that the loss of function of AT1G61890, PUP15, AT4G23030, and AT4G38710 caused significant different seed number per silique values. AT1G61890 and AT4G23030 encode MATE efflux family protein and the two genes decrease the seed number per silique. PUP15 encodes a member of purine permeases family and pup15 mutants displayed increased seed number per silique. Moreover, I further identified increase in the seed number per silique in the knockout mutants of AT4G38710 that encodes glycine-rich protein. To complement the GWAS, I created a genetic population for Quantitative Trait Loci (QTL) analysis by crossing Col-0 with Di-G that showed consistent seed number phenotype between two independent studies. To confirm the crossing of Col-0 and Di-G, I produced genetic markers. The markers displayed different nucleic acid sequence in Col-0, Di-G, and their crossing. These results indicated success of crossing Col-0 and Di-G for QTL genetic population. In addition to the study on the intra-species variation among A. thalina ecotypes, I tried to extend my study to the inter-species variation in seed number per silique between Arabidopsis and Lepidium. Lepidium and Arabidopsis are closely related species in the family Brassicaceae while they displayed distinct patterns of seed production in silique. Lepidium forms one seed per locule while Arabidopsis does around twenty seeds per locule. To identify the collected Lepidium species, ITS part sequence of Lepidium species in NCBI is used. Used ITS primers to get ITS sequence of the collected Lepidium. Afterwards, I performed MEGA 11 software to compare the ITS sequence of the Lepidium samples and Lepidium species in NCBI. In MEGA 11, the ITS sequence of the Lepidium sample and Lepidium species are aligned by ClustalW option then construct phylogenic tree applying neighbor-joining method. The phylogenic tree with 1000 Bootstrap replication, displayed that the Lepidium species is Lepidium virginicum. To characterize the auxin accumulation patterns of Lepidium during ovule formation, I performed DR5 transformation to Lepidium. I used two plasmids pC3300:pDR5-ntdTOMATO and pC3300:pDR5-GUS for agrobacterium transformation. Afterwards, I performed floral dipping to Lepidium. The selection of Lepidium transformation sample is in progress. In this dissertation, I investigated the genetic basis of intra- and inter-species divergence in seed production per silique. In intra-species study, I identified genes regulating seed number per silique through GWAS and phenotyping in A. thaliana. Furthermore, I did cross Di-G and Col-0 for QTL to overcome GWAS disadvantages. In Inter-species study, I dissected Arabidopsis and Lepidium fruits to characterize seed phenotype difference between them. I further identified collected Lepidium species using ITS sequences. In addition, I performed DR5 transformation to Lepidium to characterize auxin accumulation patterns for studying. I expect that my study will increase and yield control of important crop specie, such as Brassica napus. 밑씨의 수정으로 생성되는 생식기관인 종자는 식물과 인류의 생활에서 떼어낼 수 없는 중요성을 가지고 있다. 종자의 생성은 식물 생활사의 매우 중요한 역할을 하고 있으며, 종자는 인류 역사상 음식, 사료 그리고 연료 등 중요한 자원으로써 사용되어져 왔다. 특히 종자 수는 번식의 성공과 수확량의 영향을 줄 수 있는 중요 형질들 중 하나이다. 그렇기에 종자수를 조절하는 인자의 연구는 중요한 가치를 가지고 있지만, 여전히 미지인 부분들이 남아있다. 본 연구에서는 애기장대에서 열매 당 종자 수 조절인자에 대해 집중을 하였으며, 이를 위해 131개의 애기장대 생태형을 이용하였다. 애기장대의 131 생태형 중 열매 당 종자 수 표현형이 가장 낮은 10개의 생태형은 밑씨 수정률에 영향을 받는다. 열매 당 종자 수 표현형이 가장 높은 10개의 생태형은 밑씨의 형성 수의 영향을 받는다. 이러한 결과들을 통해 본 실험에서 열매 당 종자 수는 밑씨의 수정률과 밑씨의 생성 숫자에 의해 조절되고, 찾고자 하는 조절 유전 인자 또한 밑씨의 수정률과 밑씨의 생성숫자를 조절함으로써 열매 당 종자 수를 조절할 것임을 알 수 가 있다. 애기장대의 131 생태형의 열매 당 종자 수의 GWAS 분석은 열매 당 종자수와 연관이 있는 107 개의 SNP를 나타냈다. 그 중에서 p-value 가 가장 낮은 10개의 SNP를 후보로써 선정했으며 그 후 해당 후보 SNP 주변에 위치하거나 또는 SNP를 포함하고 있는 유전자를 대표 유전자로 선정한다. 선정된 10개의 대표 유전자들의 T-DNA 삽입 돌연변이들의 표현형을 측정하였고, 그 중 AT1G61890, PUP15, AT4G23030, AT4G38710 네 개의 대표 유전자의 T-DNA 삽입 돌연변이의 표현형이 비교용 생태형인 Col-0와 비교했을 시 유의미한 변화를 보여주었다. AT1G61890과 AT4G23030은 MATE 유출 계열(family) 단백질로 T-DNA 삽입 돌연변이에서 둘다 열매 당 종자 수가 증가됬다. PUP15는 푸린 투과효소 구성 계열 중 하나 로 T-DNA 삽입 돌연변이에서 열매 당 종자 수가 증가됬다. AT4G38710은 글리신 풍부 단백질로 T-DNA 삽입 돌연변이에서 열매 당 종자 수가 감소된다. GWAS의 한계점을 극복하기위해 QTL을 수행하기로 하였고, 이를 위해 Col-0와 Di-G를 서로 교배시켰다. 애기장대의 생태형 중 하나인 Di-G가 본 실험 및 다른 실험에서 모두 열매 당 종자 수 및 밑씨 수 가 크게 측정되었다. 이러한 교배가 잘 이뤄졌는지를 확인하기위해 유전자 표식을 제작하여 각 개체의 염기서열을 확인하였고, Col-0, Di-G, 그 둘의 교배종의 염기서열이 서로 다름을 통해 교배가 잘 이뤄졌음을 확인할 수 있었다. 열매 당 종자 수를 같은 종내 말고 종간 에서도 확인하기 위해 비교대상으로 애기장대와 같은 과인 십자화과에 속하며 가까운 유연관계를 가지고 있는 다닥냉이를 선정하였다. 열매당 종자 수에 대해서 다닥냉이는 씨방 당 한 개의 종자가 있는 반면 애기장대는 씨방 당 약 스무개의 종자가 있는 차이점을 보여준다. 이러한 열매 당 종자 수 차이점은 식물의 진화와 연관이 되어있으며 이런 변화에 앞서 발견한 애기장대에서 열매 당 종자 수를 조절하는 유전자가 관련이 있는지를 알아보고자 그 실험의 기초를 세우고자 한다. 그를 위해, 먼저 수집한 다닥냉이의 종이 무엇인지를 ITS 염기서열을 이용해 확인하고자 하였고, NCBI에 있는 다닥냉이 종들의 ITS 염기서열과 수집한 다닥냉이의 ITS 염기서열을 MEGA 11 프로그램을 이용해 비교한 결과, 수집한 다닥냉이의 종이 콩 다닥냉이임을 확인할 수 있었다. 다닥냉이에서 밑씨 생성 시 옥신의 축적 패턴을 확인하기위해 DR5를 형질전환을 수행하였고, 꽃 담그기(floral dippig) 방식을 이용하여 DR5의 형질전환을 시행하였다. 현재 형질전환 된 종자를 구분하는 과정을 진행 중이다. 이번 실험에서, 종내 및 종간 분화에서 열매 당 종자 수 를 조절하는 유전적 메커니즘에 대한 연구를 실시하였다. 종내 연구에서, 나는 열매 당 종자수를 조절하는 유전자들을 GWAS 및 표현형 측정을 통해 찾았으며, GWAS의 한계점을 보완하기 위해 QTL을 이용해 Col-0와 Di-G에서 열매 당 종자 수를 조절하는 유전자를 찾고자 한다. 종간 연구에서는 다닥냉이와 애기장대의 차이점을 해부를 통해 확인하였으며, 다닥냉이의 종을 판별 하고 DR5를 형질전환하여 밑씨 생성 간 옥신패턴을 확인하여 열매 당 종 자 수 와 관련된 연구를 시작하고자 한다. 해당 연구의 결과들은. 유채 등 다른 식물들의 종자 수 연구에 이용될 수 있을 것으로 기대된다.