HIP1R interacts with a member of Bcl-2 family, BCL2L10, and induces BAK-dependent cell death

김재홍 포천중문 의과대학교 생명과학전문대학원 2009 국내석사

The Bcl-2 family members are evolutionally conserved and crucial regulators of apoptosis. BCL2L10 (human Diva or BCL-B) is a member of the Bcl-2 family that has contradictory functions in apoptosis. In the present study, we identified the Huntington-interacting protein 1-related (HIP1R) protein following a search for Diva-interacting proteins using the yeast two-hybrid system. HIP1R is a multi-domain protein that regulates the clathrin-mediated endocytic machinery and actin assembly in cells. Interaction of endogenous proteins of BCL2L10 and HIP1R in 293T cells was determined by immunoprecipitation, and their direct association was confirmed by the Far-Western analysis. The deletion of both the AP180-homology (ANTH) and F-actin-binding the talin-HIP1/R/Sla2p actin-tethering C-terminal homology (THATCH) domains of HIP1R greatly compromised its binding ability to BCL2L10. Ectopic expression of HIP1R resulted in moderate cell death of 293T cells in conjunction with the dissipation of mitochondrial membrane potential and caspase 9 activation. A member of proapoptotic Bcl-2 family, BAK, was required for HIP1R to induce cell death, while BAX was dispensable. In addition, BCL2L10 was associated with endogenous caspase 9, and their binding was augmented by HIP1R overexpression. Thus, this study provided the previously unknown function of HIP1R involved in the intrinsic cell death pathway and further explored possible mechanisms by which HIP1R induces cell death. Bcl-2 패밀리는 진화적으로 세포사멸에서의 중추적인 역할을 담당하고 있는 조절자이다. BCL2L10 (Human Diva, BCL-B)는 이러한 세포사멸에서 친 세포사멸 유도기능 또는 항 세포사멸 유도기능의 상반된 연구결과가 보고되어 있다. 본 연구진은 Diva 와 결합하는 단백질을 스크리닝 하게 되었고 이중 Huntington-interacting protein 1 related (HIP1R) 단백질을 발견하였다. HIP1R단백질은 clathrin연관된 endocytosis의 기능과 actin의 세포구성에 관여를 한다. 이러한 HIP1R와 BCL2L10의 단백질의 결합을 면역침강방법을 통해서 endogenous한 수준에서의 결합을 확인하였으며 Direct한 결합인지 확인하기 위해서 Far-western blot 방법을 수행하여 이러한 결합을 다시 확인하였다. 이러한 결합에서의 HIP1R가 BCL2L10과 결합하는 도메인을 확인하기 위해서 AP-180-homology (ANTH)와 F-actin-binding에 관련된 C-말단의 homology (THATCH)가 결여된 돌연변이 단백질을 클로닝 하였고 ANTH와 THATCH 도메인이 결합에 중요한 도메인이라는 것을 확인하였다. HIP1R의 세포사멸에서의 영향을 알아보기 위해서 MMP실험과 Caspase9의 활성유무를 측정한 결과 MMP가 확인 되었고 caspase9이 활성화되었다. 세포생존율 실험을 통해서 직접적으로 세포사멸의 유도양상을 확인하였으며 세포사멸을 유도하는 BH3도메인만을 가지고 있는 BAX, BAK 단백질이 knock-out 된 세포에서 HIP1R의 세포생존율 검사 결과 BAK이 HIP1R에 의한 세포사멸에 중요한 역할을 하는 단백질임을 확인 하였다. 또한 이미 알려져 있는 BCL2L10과 caspase9의 결합에 HIP1R의 과발현이 두 단백질의 association을 강화시켜주는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 연구결과를 통해서 endocytosis와 actin assembly에 관련된 HIP1R단백질의 세포사멸을 유도하며 이는 HIP1R의 intrinsic pathway와 endosytosis 메커니즘과의 상호 연관성에 대하여 연구할 수 있는 중요한 발견이다.

Optimization of 25kDa linear polyethylenimine for effcient gene delivery

허선형 포천중문 의과대학교 생명과학전문대학원 2007 국내석사

A 25 kDa linear polyethylenimine (25 kDa L-PEI) has proven to be efficient and versatile agent for gene delivery. Therefore, we determined the optimal transfection conditions of 25 kDa L-PEI and examined whether it has compatible transfection efficiency with other commercially available reagents, ExGen 500, LipofectAMINE 2000, and Effectene by using EGFP expression vector in different cell lines. Transfection efficiency and cytotoxicity were measured by flow cytometry. First of all, we determined the optimal ratio of nitrogen to phosphorous (N/P) and DNA concentration. With the increase of N/P ratio and DNA amounts, transfection efficiency increased with a slight variation in cell types. The optimal amounts of 25 kDa L-PEI were determined at N/P ratio 40 and DNA concentration varied among the cell types. In addition, 25 kDa L-PEI worked efficiently and was less toxic than other reagents. However, the efficiency and toxicity of all these reagents varied according to cell types as well as the ratio of DNA to reagents and the amounts of DNA. Our finding illustrates the importance of optimal transfection conditions of 25 kDa L-PEI to obtain maximal transgene expression with less cytotoxicity. Importantly, the optimization of those conditions may make possible to perform transfection cost-effectively and efficiently. Polyethylenimine (PEI)은 in vivo나 in vitro에서 유전자를 전달하는데 매우 효율적인 세포 전이 전달체로서 광범위하게 연구되고 있는 물질 중의 하나로 알려져 있다. 우리는 25 kDa PEI의 최적의 transfection 조건을 결정하여 다른 상업적으로 이용되고 있는 transfection reagent인 ExGen500, Lipofectamine 2000, Effectene과 비교하였다. 우리는 25 kDa 선형 PEI를 이용한 transfection 실험에서 HEK293T, COS-7, HeLa, NCCIT 세포를 사용하였다. PEI의 transfection 효율과 세포독성은 flow cytometry에 의해 측정되었다. PEI를 이용하여 최대의 transfection 효율을 얻기 위해 먼저, 최적의 N/P ratio와 DNA 농도를 결정하였다. 실험에 사용된 세포 종류에 따라 약간의 차이를 보이기는 했으나, N/P ratio나 DNA의 농도가 증가함에 따라서 transfection 효율도 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 하지만, 세포 독성도 함께 증가하였다. 우리는 위의 실험 결과를 바탕으로 N/P ratio를 40으로 결정하였고, DNA 농도는 세포 종류에 따라서 다르게 결정되었다. transfection효율을 극대화시키기 위한 선형 PEI의 transfection 조건을 결정 한 후, 선형 PEI와 다른 상업적으로 이용되고 있는 transfection reagent의 transfection 효율을 비교하 는 실험을 수행하였다. 그 결과, 선형 PEI는 다른 transfection reagent와 비교하여 효율적으로 유전자를 전달하였고, 세포 독성 또한 낮게 나타났다. 우리는 이번 실험을 통해 가장 효율적인 transfection의 조건을 결정하는 일이 얼마나 중요한지를 알게 되었고, PEI의 경우 PEI의 양과 DNA의 농도가 높은 transfection 효율과 낮은 세포 독성을 위해 특히 더 중요하다는 것을 알 수 있었다. 중요한 것은 효율적인 transfection의 조건을 결정함으로써 더욱더 경제적이고 효율적인 transfection을 수행할 수 있다는 것이다.

Inducement of chondrogenic differentiation in injectable hydrogels embedded in mouse embryonic stem cells and growth factor for neocartilage formation

이원우 포천중문 의과대학교 생명과학전문대학원 2008 국내석사

성장 인자를 갖고 있는 주입형 하이드로젤은 신생연골조직 형성에 배아줄기세포의 매개체로 제조되고 연구되었다. 주입형 하이드로젤의 최적의 분화 및 성장 인자를 확립하기 위해, GAG/DNA 산출물의 분석, RT-PCR 분석과 조직학적 분석 방법을 사용하였다. GAG/DNA 산출물의 분석결과를 통해 TGF-β3가 GAG 산출물의 분비를 촉진하고 TGF-β3가 없을 때와 비교하여 급격히 증식함을 보여주었다. 신생연골조직에 대한 RT-PCR 결과는 TGF-β3를 가진 p(NiPAAm-co-AAc) 하이드로젤을 사용한 배양조건이, 콜라겐 타입 II와 COMP등의 유전자 형태의 견지에서 신생연골조직형성에 적합함을 보여주며, 이 결과에 미루어 조직학적 결과를 통해 성장인자가 포한된 하이드로젤의 배양환경이 마우스 배아줄기세포가 연골세포로 분화함에 있어 적합하다는 결과를 보여주었다. Injectable hydrogel with growth factor was fabricated and investigated as a delivery vehicle of mouse embryonic stem cells (mES) for neocartilage formation. To determine the optimal growth factor in injectable hydrogel, we evaluated the GAG/DNA assay, RT-PCR analysis, and histology. GAG/DNA assay showed that TGF-β3 enhanced the secretion of GAG content and proliferated well comparing to without TGF-β3. RT-PCR results for the resultant cartilage tissue revealed that p(NiPAAm-co-AAc) hydrogels with TGF-β3 was optimal for cartilage tissue formation in terms of collagen Type II and COMP gene expression. In addition, the fact that the p(NiPAAm-co-AAc) hydrogels with TGF-β3 showed faster formation of new cartilage than those shown by p(NiPAAm-co-AAc) hydrogels without TGF-β3 certified the results of histology and immunochemical histology.

Biological Effects of Fucoidan Isolated from Fucus vesiculosus on Thrombosis and Vascular Cells

곽규원 포천중문 의과대학교 생명과학전문대학원 2009 국내석사

Fucoidan is a highly sulfated glycosaminoglycan, which has a similar molecular structure to that of heparin. The antithrombotic effects of fucoidan in vitro have been widely reported, but its antithrombotic effects in vivo as well as other biological properties of fucoidan in vitro have not been well investigated This study investigated the effects and mechanism of fucoidan from Fucus vesiculosus on thrombosis, both in vitro and in vivo. A ferric chloride-induced mouse carotid artery thrombosis model was used to determine the antithrombotic effects of fucoidan in vivo. Also, change of pro-inflammatory cytokines and chemokines in the vascular cells treated with fucoidan was examined. In vivo studies, employing a ferric chloride-induced mouse carotid artery thrombosis model, indicated that fucoidan had a stronger anti-thrombotic activity than that of heparin. And vascular cells treated with fucoidan demonstrated a decrease in pro-inflammatory cytokines and chemokines production as well as an inhibition of proliferation. That major findings of this study showed that fucoidan has a stronger anti-thrombotic effect than heparin in vivo, and that fucoidan has an inhibitory effect on pro-inflammatory cytokines production and proliferation of vascular cells. fucoidan은 다량의 황산기를 갖는 Glycosaminoglycan으로 heparin과 유사한 구조이다. fucoidna의 in vitro에서의 항혈전 효과는 이미 여러 보고 된 바가 있으나 in vivo에서의 항혈전 효과에 대해서는 경동맥 혈전 유도 방법에 의한 연구된 바가 없었다. 이 연구는 Fucus vesiculosus로부터 추출한 fucoidan으로 ferric chloride로 마우스의 경동맥에 혈전을 유도시킨 후 fucoidan의 항 혈전효과를 측정하였다. 그리고 HUVEC(인간혈관내피세포)에 fucoidan을 처리했을 때의 염증 유도 cytokine과 chemokine 양의 변화를 측정하였다. In vivo 연구에서 경동맥 혈전은 유도 마우스 모델에서 fucoidan이 heparin보다 더 강한 항혈전 활성을 보였다. 또한, fucoidan에 대한 혈관내피세포는 염증을 유발하는 cytokine과 chemokine의 양이 줄어들었다. fucoidan은 in vivo에서 heparin보다 더 강한 항 혈전 효과가 있고 혈관 염증을 유도하는 cytokine 및 chemokine 형성을 억제한다.

Identification of Nuclear Localization Signal in Human Nanog

임혜영 포천중문 의과대학교 생명과학전문대학원 2008 국내석사

Nanog is a homeobox-containing transcriptional factor required for maintaining the pluripotent state of stem cells. We investigated the nuclear localization signal (NLS) motif required for human Nanog (hNanog) nuclear import. Mutation analysis revealed that a mutant containing only the homeodomain (HD) was exclusively localized to the nucleus, while other mutants containing either the N- or C-terminal region (NR or CR) had impaired nuclear localization. In addition, NR and CR were exclusively localized to the nucleus when they were fused to the HD, indicating that complete nuclear localization is only driven by functional NLS motif(s) within the HD. Furthermore, partial loss of HD led to the incomplete localization of hNanog, suggesting that the intact HD is required for hNanog nuclear import. A series of deletion and site-directed mutagenesis within the HD revealed that two basic NLS motifs are located at the N-terminus and C-terminus of the HD and that both motifs are required for complete hNanog nuclear localization. Nanog는 homeodomain protein으로서 배아줄기세포 (Embryonic stem cell)의 자가 재생산 (Self-renewal)과 다능성 (Pluripotency)을 유지하는데 중요한 전사인자 (Transcription factor)이다. Human Nanog (hNanog)는 305개의 아미노산(Amino acid)로 구성되어 있으며, mouse Nanog (mNanog)의 Open Reading Frame과 homeodomain의 아미노산 서열이 각각 58%, 80%의 유사성이 있다. 그러나 hNanog의 기능적인 도메인 (Domain)과 분자생물학적 기전에 대해서는 아직까지 알려진 부분이 많지 않다. 우리는 hNanog가 핵 속으로 유입되기 위해 필요한 nuclear localization signal (NLS) motif에 대해 조사하였다. hNanog의 homeodomain, N-terminal region, C-terminal region을 EGFP와 fusion protein을 만들어 COS-7 cell에 transfection 후 localization을 확인한 결과, N- 또는 C-terminal region 만을 포함하는 경우 각각 핵과 세포질 또는 세포질에서만 EGFP가 발현하는 반면, homeodomain만을 포함한 fusion protein은 핵 안에서 강하게 발현하는 것으로 보아 hNanog의 NLS motif가 homeodomain 안에 존재하는 것으로 추정되었다. 또한 homeodomain을 N- 또는 C-terminal region과 fusion 시켰을 때에도 핵에서 EGFP가 강하게 발현하는 것으로 다시 한번 NLS motif가 homeodomain에 존재하는 것을 확인하였다. 게다가 homeodomain 내 존재하는 NLS motif를 찾기 위해 deletion mapping과 site-directed mutagenesis 결과, hNanog의 homeodomain 내 N- 과 C-terminal NLS motif가 존재하는 것을 확인하였고, N-terminal NLS motif가 C-terminal NLS motif 보다 좀 더 강하게 작용하는 것을 확인하였다. 또한 hNanog가 핵 속으로 유입되기 위해 두 NLS motif가 모두 필요하며 손상되지 않은 전체의 homeodomain이 필요한 것을 확인하였다.

Biological activities and mechanisms of a fibrinolytic enzyme and a disintegrin from the venom of Korean snake

조길상 포천중문 의과대학교 생명과학전문대학원 2009 국내석사

Many snake venoms act on the blood coagulation system. Since there is growing medical interest in thrombolysis, snake venoms which affect the hemostatic system have been well investigated. A fibrinolytic enzyme was purified to homogeneity from the venom of Korean Salmosa snake Agkistrodon halys by a combination of benzamidine-Sepharose affinity chromatography and FPLC Unosphere Q ion exchange fractionation. The purified enzyme is a glycoprotein and migrates as a single band with molecular mass of 33KDa on SDS-PAGE. The fibrinolytic enzyme is characterized by its isoelectric point of 4.3. The enzyme was not able to hydrolyze human serum albumin, plasminogen, thrombin, immunoglobulin and tPA. To examine the toxicological effect of saxatilin, a disintegrin isolated from the venom of a Korean snake (Gloydius saxatilis), recombinant saxatilin was highly expressed as a biologically active form in Pichia pastoris, and was successfully purified to homogeneity from the culture broth supernatant. The molecular and biological properties of the recombinant protein were the same as those of its natural form. RGD-peptides can inhibit the binding of ligands to certain β3 integrins, α II bβ3 and a v β3, both of which are involved in neointimal hyperplasia that contributes to atherosclerosis and restenosis of arterial walls. Saxatilin, a disintegrin from a Korean snake (Gloydius saxatilis), interacts with integrins α II bβ3 and a v β3. It suppressed the adhesion of human coronary artery smooth muscle cells (HCASMCs) to vitronectin with an IC 50 of 2.5uM, and growth factor (PDGF-BB or bFGF)-induced proliferation was inhibited at an IC 50 of 25uM. 다양한 종류의 뱀독에는 혈액 응고계에 작용하는 많은 인자들이 보고되고 있으며, 특히 의학적 치료제로써의 개발목적으로 뱀독에 대한 다양한 연구가 진행되어지고 있다. 이에 본 연구에서는 한국에 서식하고 있는 살모사(Agkistrodon halys)와 까치살모사(Agkistrodon saxailis)의 뱀독으로부터 이와 같은 항혈전 단백질을 탐색하고 분리동정한 후 생체내 효능을 알아보기 위해, 이를 재조합 단백질로 발현하였다. 우선 살모사의 뱀독을 확보한 후, benzamidine-Sepharose column과 Unosphere Q column을 이용해 혈전용해효소를 분리, 정제하였다. 정제된 효소는 약 33KDa의 분자량을 가지며 등전점은 4.3인 당단백질이었다. 이 효소는 혈액내에 존재하는 serum albumin, plasminogen, thrombin, IgG, tPA 등에는 영향을 주지 않고, 특이적으로 fibrinogen 과 fibrin 만 분해하였다. 이에 salmonase의 cDNA library를 확보한 뒤 yeast system에서 재조합 단백질로 발현하는데 성공하였다. 또한 디스인테그린인 saxatilin의 생리활성을 알아보기 위해 재조합 단백질로 대량발현을 시킨 후 순수분리, 정제하였으며, 재조합 saxatilin은 천연형의 saxatilin과 그 활성이 동일하였다. RGD-peptide를 지닌 이 saxatilin은 β3 integrins의 binding을 막음으로써 α II bβ3와 a v β3 등의 반응을 억제하였고, 특히 인간 평활근세포의 adhesion과 proliferation을 강하게 저해하였다.

Transgeration effects of maternally exposed fenarimol on reproductive performance in female mice

박미라 포천중문 의과대학교 생명과학전문대학원 2009 국내석사

Fenarimol, 2, 4-dichloro-a-(pyrimidin-5-yl) benzhydryl alcohol은 광범위하게 사용 되어지고 있는 살균제이다. 이것은 in vivo 와 in vitro실험을 통해 aromatase-억제 기작을 가지고 있음이 보고 되었고 내분비계 교란물질 (Endocrine Disrupter)로 분류 되어진다. 이 실험의 목적은 인간이 환경으로부터 노출 되어지는 농도의 fenarimol을 임신기와 수유기 동안 노출시켰을 때 female 마우스의 reproductive health에 미치는 세대간의 영향에 관해 알아보는 것이다. DBA/2 male 마우스와 mating을 통해 임신한 C57BL/6 female 마우스에게 임신 후 12일 째 부터 출산 후 20일 째 까지 무게에 비례하여 0, 2, 20, 200 ㎍/kg 농도의 fenarimol을 경구 투여하였다. F-0 세대와 F-1 세대의 reproductive performance를 수행하였으며, 그 결과 출생 후 21일째 되는 F-0 세대에서는 유의성 있는 변화를 발견하지 못하였다. 다음세대인 F-1 세대에서는 20㎍ 과 200 ㎍을 투여한 그룹이 control보다 약 60 %, 51 % 늘어 난 것을 확인하였다. 8주된 F-1 세대의 2 ㎍를 처리한 그룹의 난소 무게는 control보다 유의성 있게 증가하였다 (P < 0.05). F-1과 F-2의 anogenital distance (AGD)를 출생 후 14일 21일에 측정하였으며, 그 결과 20㎍과 200㎍ 처리 그룹에서F-1 female 자손의 AGD는 control 그룹보다 유의성 있게 짧아지는 것을 확인하였다 (P < 0.05). 출생 후 8-9주 때, in vitro fertilization assay을 시행하여 마우스의 수정 능력을 알아보기 위해 난자를 채취하였다. 그 결과 fenarimol에 노출된 그룹에서 배란된 난자의 수는 노출되지 않은 그룹의 난자의 수보다 적은 결과를 나타내었다. 이번 실험을 통하여 우리는 낮은 농도의 fenarimol에 대한 노출이 여성의 reproductive health에 대해 세대간의 영향을 미치는 것을 발견하였다. 이 결과로 말미암아, 장기적인 fenarimol에 대한 노출이 인간의 생식 시스템에 영향을 미칠 것이라고 사료된다. Fenarimol, 2, 4-dichloro-a-(pyrimidin-5-yl) benzhydryl alcohol, is a widely used chlorinated fungicide. It is a suspected endocrine disrupter (ED) due to aromatase-inhibiting mechanisms in vivo and in vitro studies. The objective of the study was to examine the transgeneration effects of gestational and lactational exposure to human related exposure levels of fenarimol on female reproductive health in mice. Pregnant C57BL/6 mice (F-0), bred with DBA/2 male, were gavaged with 0, 2, 20, or 200 g fenarimol/kg of body weight per day from gestational day 12 to postnatal day (PND) 20. Parameters of reproductive performance in F-0 were measured as well as in females on their offspring (F-1). There were no significant changes in parameters of reproductive performance in F-0 dams orally exposed to fenarimol. In the next generation, body weights of F-1 dams increased by 60% and 51%, respectively, in the 20 and 200 g treatment groups on PND 21. In the 2 g fenarimol/kg body weight treated group, ovary weights were significantly increased than control group. We measured offspring’s anogenital distance on postnatal day 14 and 21. In the F-1 female offspring which were maternally and orally exposed to fenarimol, anogenital distance in the 20 and 200 mg/kg treatment groups was significantly shorter than controls. At 8-9 weeks of age, the eggs of F-2 were collected to assess fertilizing ability in an in vitro fertilization assay. We were shown the number of eggs of treatment animals was decreased than no treatment group. In these experiments, we found that exposure low concentration of fenarimol has transgeneration effects on female reproductive health. Therfore, we may suggest human exposed chronically to fenarimol can be altered reproductive system.