Characterization of Alcohol Fermenta1ion and Segregation of Protoplast Fusant of Saccharomyces cerevisiae and Pichia stipitis

( Gee Sun Yoon ),( Tae Sik Lee ),( Chul Kim ),( Jin Ho Seo ),( Yeon Woo Ryu ) 한국미생물생명공학회 1996 Journal of microbiology and biotechnology Vol.6 No.4

자일로스 환원효소의 항시발현에 의한 Pichia stipitis 균주에서의 자일리톨 생산성 증대

권훈주 ( Kwon H. J. ),박은희 ( E. H. Park ),김명동 ( M. D. Kim ) 강원대학교 농업생명과학연구원(구 농업과학연구소) 2016 강원 농업생명환경연구 Vol.28 No.3

오탄당인 자일로스를 대사할 수 있는 효모인 P. stipites유래의 자일로스 환원효소 유전자를 항시발현할 수 있는 발현벡터를 제작하여 P. stipitis 균주에 의한 자일리톨 생산성을 증가시키고자 하였다. 배양초기에 100 g/L 농도로 첨가된 자일로스를 탄소원으로 사용하는 호기적인 배양에서 대조구 균주는 자일리톨을 생산하지 않고 40.6 ± 0.9 g/L의 에탄올을 생산하였으나 발현벡터에 의하여 자일로스 환원효소를 추가적으로 발현하는 균주인 P. stipites MB1381 는 40 g 의 자일로스를 소모하여 34.9 ± 0.9 g 의 자일리톨을 생산하여 소모한 자일로스 대비 약 87%의 자일리톨 생산수율을 나타내었다. To enhance the xylitol production in xylose-fermenting yeast Pichia stipitis, an expression vector was constructed to constitutively express the xylose reductase gene in P. stipitis. While the control P. stipitis strain produced 40.6 ± 0.9 g ethanol from 100 g xylose in aerobic shake flasks cultivation, without forming xylitol, P. stipitis MBY1381, which constitutively expresses the xylose reductase gene by the vector, produced 34.9 ± 0.9 g xylitol utilizing 40 g xylose, corresponding to an approximate yield of 87%.

Pichia stipitis에 의한 Glucose, Xylose 및 Cellobiose의 발효

이유석,권윤중,변유량 한국산업미생물학회 1992 한국미생물·생명공학회지 Vol.20 No.1

Xylose와 cellobiose를 모두 발효할 수 있는 효모를 선발한 결과 Pichia stipitis CBS 5775와 5776이 가장 우수하였다. P. stipitis CBS 5776은 glucose, xylose 및 cellobiose에서 각각 0.4, 0.36 및 0.23g/g substrate의 에탄올 수율을 나타내었다. 혼합당에서의 발효결과 glucose는 xylose와 cellobiose 이용에 대하여 catabolite regulation을 일으켜서 glucose가 다 소비된 후에 다른 기질이 소비되었다. 그러나 xylose와 cellobiose는 동시에 소비되었다. 혼합기질에서의 에탄올 수율은 단일기질에서의 각각의 수율의 합과 거의 유사하였다. The hydrolyzates of lignocellulosic biomass contain a mixture of glucose, xylose and cellobiose. The yeast which can produce ethanol efficiently from xylose and cellobiose was selected and its growth and ethanol formation behavior on each sugar and their mixture were investigated. Ethanol yields during batch culture of Pichia stipitis CBS 5776 were 0.4, 0.36 and 0.23 g/g substrate on glucose, xylose and cellobiose, respectively Mixed sugar fermentation data indicate that glucose causes catabolite regulation on xylose and cellobiose utilization. However, xylose and cellobiose were utilized simultaneously. Ethanol yields on mixtures of sugars were generally additive for each of the substrates.

출아효모에서 xylitol dehydrogenase (XYL2)의 최적 생산을 위한 발현 시스템 구축

정회명(Hoe-Myung Jung),김연희(Yeon-Hee Kim) 한국생명과학회 2017 생명과학회지 Vol.27 No.12

본 연구에서는 lignocellulosic biomass (xylose)의 부가가치를 높이고 효율적인 활용을 위해 xylitol dehydrogenase를 Saccharomyces cerevisiae 숙주세포에서 분비 생산하고자 하였다. 먼저 S. cerevisiae와 Pichia stipitis유래 XYL2 유전자(S.XYL2 and P.XYL2 gene)의 발현 시스템을 구축하기 위하여 GAL10 promoter와 ADH1 promoter하류에 각각 mating factor α (MFα) signal sequence와 XYL2유전자를 가진 pGMFα-S.XYL2, pGMFα-P.XYL2, pAMFα-S.XYL2와 pAMFα-P.XYL2 plasmid를 구축하였다. 각각의 plasmid는 S. cerevisiae SEY2102△trp1 균주에 형질전환되었고, 생산된 xylitol dehydrogenase의 활성을 조사해 본 결과, GAL10 promoter가 ADH1 promoter보다 XYL2유전자의 발현에 더욱 적합함을 확인 할 수 있었다. 또한 P. stipitis 유래의 xylitol dehydrogenase효소 활성이 S. cerevisiae 유래의 효소 활성보다 2배 이상 더 높았으며, 활성의 증가를 위해 두 유전자 모두 cofactor로 NAD+에 의존한다는 것을 확인하였다. 재조합 유전자가 가지는 분비서열에 의해 SEY2102△trp1/pGMFα-P.XYL2 균주에서 xylitol dehydrogenase의 약 77%는 periplasmic space로 분비 발현되었음을 알 수 있었다. 또한 재조합 xylitol dehydrogenase의 효율적인 생산을 위해 탄소원의 영향을 조사해본 결과, glucose 단독보다 glucose와 xylose를 혼합 배양한 경우에서 효소활성이 최대 41% 정도 증가되었음을 확인 할 수 있었다. 본 연구에서 최적화한 발현 시스템 및 배양 조건은 xylose 뿐만 아니라 다양한 biomass를 이용한 유용물질 생산을 위한 관련 단백질의 발현 분비시스템 구축 및 대량생산에도 응용될 수 있을 것이라 생각된다. In this study, the xylitol dehydrogenase (XYL2) gene was expressed in Saccharomyces cerevisiae as a host cell for ease of use in the degradation of lignocellulosic biomass (xylose). To select suitable expression systems for the S.XYL2 gene from S. cerevisiae and the P.XYL2 gene from Pichia stipitis, pGMFα-S.XYL2, pGMFα-P.XYL2, pAMFα-S.XYL2 and pAMFα-P.XYL2 plasmids with the GAL10 promoter and ADH1 promoter, respectively, were constructed. The mating factor α (MFα) signal sequence was also connected to each promoter to allow secretion. Each plasmid was transformed into S. cerevisiae SEY2102△ trp1 strain and the xylitol dehydrogenase activity was investigated. The GAL10 promoter proved more suitable than the ADH1 promoter for expression of the XYL2 gene, and the xylitol dehydrogenase activity from P. stipitis was twice that from S. cerevisiae. The xylitol dehydrogenase showed NAD<SUP>+</SUP>-dependent activity and about 77% of the recombinant xylitol dehydrogenase was secreted into the periplasmic space of the SEY2102△trp1/pGMFα-P.XYL2 strain. The xylitol dehydrogenase activity was increased by up to 41% when a glucose/xylose mixture was supplied as a carbon source, rather than glucose alone. The expression system and culture conditions optimized in this study resulted in large amounts of xylitol dehydrogenase using S. cerevisiae as the host strain, indicating the potential of this expression system for use in bioethanol production and industrial applications.

적응진화를 활용한 cellobiose와 xylose 동시발효 Pichia stipitis의 개발

김대환,이원흥 한국미생물·생명공학회 2019 한국미생물·생명공학회지 Vol.47 No.4

Production of biofuels and value-added materials from cellulosic biomass requires the development of a microbial strain capable of efficiently fermenting mixed sugars. In this study, the natural xylose fermenting yeast, Pichia stipitis, was evolved to simultaneously ferment cellobiose and xylose. Serial subcultures of wild-type P. stipitis in 20 g/l cellobiose were performed to increase the rate of cellobiose consumption. A total of ten rounds of the serial subculture led to the isolation of an evolved strain fermenting cellobiose significantly faster than the parental strain. The evolved strain displayed enhanced ethanol yield from 0 to 0.4 g ethanol/g cellobiose. The evolved P. stipitis simultaneously fermented cellobiose and xylose in batch fermentation. The genetic information of our evolved P. stipitis would be valuable in the development of a microbial host for the production of biofuels and biomaterials from cellulosic biomass. 섬유소계 바이오매스로부터 바이오 연료 등과 같은 유용한 물질을 생산하기 위해서는 바이오매스로부터 유래하는혼합당을 효과적으로 대사할 수 있는 균주의 개발이 필수적이다. 본 연구에서는 xylose를 대사가 가능한 효모인 P. stipitis를 적응진화하여 cellobiose 대사효율이 향상되고cellobiose와 xylose를 동시에 대사할 수 있는 균주를 개발하고자 하였다. 총 10회의 계대배양을 통해 얻어진 진화된 P. stipitis 돌연변이 균주는 모균주에 비해 6배 이상 증가된cellobiose 대사속도를 나타내었으며 ethanol 생산수율을 0 에서 0.4 (g ethanol/g cellobiose)로 향상시켰다. 아울러 본실험에서 개발한 돌연변이 균주는 cellobiose와 xylose 혼합당 조건에서 모균주에 비해 2배 가까이 향상된 ethanol 생산 및 생산속도를 나타내었다.

고정화 Pichia stipitis 를 이용한 글루코오스/자일로오스 혼합당으로부터 에탄올 생산

신현석(Hyun Seok Shin),강성우(Seong Woo Kang),이상준(Sang Jun Lee),장은지(Eun Ji Jang),서영웅(Young-Woong Suh),김승욱(Seung Wook Kim) 한국생물공학회 2010 KSBB Journal Vol.25 No.4

리르노셀룰로오스로부터 생산된 글루코오스와 자일로 오스의 혼합당을 동시에 발효하여 에탄올 생산을 증가시키며, 또한 에탄올 생산에서의 세포고정화의 영향과 ICR (immobilized cell reactor)을 이용한 혼합당에서의 에탄올 연속생산을 수행하였다. 고정화 P. stipitis를 이용한 플라스크에서 에탄올을 생산에 대한 혼합당과 질소원의 영향으로부터 5% 혼합당 (글루코오스/자일로오스 = 3:1)과 1% 질소원이 최적으로 타나났으며, 이때 생산된 에탄올 농도는 약 19-20 g/L이었다. 고정화된 P. stipitis을 이용하여 반복적 유가식배양 (repeated fed-batch)으로 에탄올을 생산하였을 때는 모든 당 농도에서 글루코오스는 빠르게 소비되었지만, 혼합당의 농도가 높아질수록 자일로오스의 소비속도는 점차적으로 감소하였다. 즉 혼합당 농도가 증가하면서 더불어 당 소비속도는 감소하였다. 또한 ICR에서 1% 혼합당을 연속적으로 공급하면서 에탄올을 안정적으로 생산하여, 에탄올 농도는 5.6 g/L이었고 에탄올 생산 속도는 0.13 g/L ? h이었다. To increase the production of ethanol by using sugar from lignocellulosic biomass, pentose and hexose have to be fermented simultaneously by yeast. The effects of mixed sugar and nitrogen on ethanol production by immobilized Pichia stipitis KCCM 12009 were investigated. When optimal mixed sugar and nitrogen concentration were 5% (Glucose/Xylose = 3:1) and 1%, respectively, ethanol concentration produced by immobilized P. stipitis was 19-20 g/L. In repeated fed-batch by immobilized P. stipitis, all glucose was consumed very quickly at 1-3% mixed sugar concentration. But, xylose consumption was decreased as the mixed sugar concentration increased. Also, ethanol (5.6 g/L) was stably produced and ethanol production rate was 0.13 g/L ? h in immobilized cell reactor (ICR) with 1% mixed sugar (Glucose/Xylose = 3:1) as feeding media.

단보 : 효모 Pichia stipitis를 이용한 구멍갈파래 가수분해 추출물로 부터 바이오 에탄올 생산

이지은 ( Ji Eun Lee ),이상은 ( Sang Eun Lee ),최운용 ( Woon Yong Choi ),강도형 ( Do Hyung Kang ),이현용 ( Hyeon Yong Lee ),정경환 ( Kyung Hwan Jung ) 한국균학회 2011 韓國菌學會誌 Vol.39 No.3

We studied the repeated-batch process for the bioethanol production from the hydrolysate of Ulva pertusa Kjellman using yeast Pichia stipitis, which is able to assimilate C6- and C5-monosaccharides. During 180-hour operations, the repeated-batch process was carried out stably, and the average bioethanol concentration reached 11.9 g/L from about 30 g/L of reducing sugar in the hydrolysate. Meanwhile, the bioethanol yields, based on the reducing sugar and the quantitative TLC analysis, were 0.40 and 0.37, respectively, which corresponded to 78.4% and 72.5% of theoretical value, respectively. Throughout the quantitative process analysis, it was also demonstrated that 39.67 g-bioethanol could be produced from 1 kg of dried Ulva pertusa Kjellman. In this study, we verified that the bioethanol production from the hydrolysate of Ulva pertusa Kjellman was feasible using a yeast Pichia stipitis, particularly during the repeated-batch operation.

Two-Step Process Using Immobilized Saccharomyces cerevisiae and Pichia stipitis for Ethanol Production from Ulva pertusa Kjellman Hydrolysate

( Sang Eun Lee ),( Yi Ok Kim ),( Woo Yong Choi ),( Do Hyung Kang ),( Hyeon Yong Lee ),( Kyung Hwan Jung ) 한국미생물 · 생명공학회 2013 Journal of microbiology and biotechnology Vol.23 No.10

We established a two-step production process using immobilized S. cerevisiae and P. stipitis yeast to produce ethanol from seaweed (U. pertusa Kjellman) hydrolysate. The process was designed to completely consume both glucose and xylose. In particular, the yeasts were immobilized using DEAE-corncob and DEAE-cotton, respectively. The first step of the process included a continuous column reactor using immobilized S. cerevisiae, and the second step included a repeated-batch reactor using immobilized P. stipitis. It was verified that the glucose and xylose in 20 L of medium containing the U. pertusa Kjellman hydrolysate was converted completely to about 5.0 g/l ethanol through the two-step process, in which the overall ethanol yield from total reducing sugar was 0.37 and the volumetric ethanol productivity was 0.126 g/ l/h. The volumetric ethanol productivity of the two-step process was about 2.7 times greater than that when P. stipitis was used alone for ethanol production from U. pertusa Kjellman hydrolysate. In addition, the overall ethanol yield from glucose and xylose was superior to that when P. stipitis was used alone for ethanol production. This two-step process will not only contribute to the development of an integrated process for ethanol production from glucoseand xylose-containing biomass hydrolysates, but could also be used as an alternative method for ethanol production.

Comparative Study on Ethanol Production with Pentose and/or Hexose by Saccharomyces cerevisiae and/or Pichia stipitis

Jung-Gon Kim(김중곤),Jung Hoon Ahn(안정훈) 한국생명과학회 2011 생명과학회지 Vol.21 No.3

포도당과 자일로스는 자연계에서 가장 풍부한 물질이며 이들은 효모에 의해 에탄올로 전환될 수 있다. 본 연구에서는 Saccharomyces cerevisiae와 Pichia stipitis을 이용하여 분리배양, 공동배양 그리고 순차배양 등의 조합을 통해 가장 효과적인 발효의 방법을 찾고자 하였다. 분리배양에서 S. cerevisiae은 29.4 g/l의 포도당을 발효하여 14.5 g/l의 에탄올을 생산한 반면에 자일로스를 이용하지 못했다. 그렇지만 P. stipitis은 포도당뿐만 아니라 자일로스도 분해하여 각각 포도당 29.4 g/l로부터 11.9 g/l의 에탄올을, 자일로스 29.0 g/l로부터 11.6 g/l의 에탄올을 생산하였다. 포도당과 자일로스 혼합배양에서, S. cerevisiae은 13.4 g/l의 에탄올을 생산한 반면에 P. stipitis은 21.1 g/l의 에탄올을 생산하였다. 공동배양과 순차배양에서, 공동배양이 18.6 g/l, 순차배양이 12.4 g/l의 에탄올을 생산하여 공동배양이 더 효과적인 것으로 나타났다. 두 효모의 생장에서 영양분의 효과를 보기 위해 yeast nitrogen base (YNB)을 S. cerevisiae가 포도당을 소모한 시점에 첨가하니 자일로스의 소비량과 미생물의 성장이 증가하였고 54.6 g/l의 당 혼합배양액에서 22.5 g/l의 에탄올을 생산하여 0.41 g/g의 수득율을 나타내었다. Glucose and xylose are the most abundant materials in nature which can be used to produce ethanol by yeast fermentation. Three combinations of cultivation with glucose and xylose were carried out; separated, co-culture, and sequential fermentation with Saccharomyces cerevisiaeand Pichia stipitis. In the separated fermentation, S. cerevisiae fermented glucose to produce 14.5 g/l ethanol from 29.4 g/l glucose but hardly used xylose. However, P. stipitisutilized not only glucose but also xylose to produce ethanol 11.9 g/l and 11.6 g/l from 29.4 g/l glucose and 29.0 g/l xylose, respectively. In the mixture of glucose and xylose, P. stipitisfermented both sugars, producing 21.1 g/l ethanol while S. cerevisiaefermented only glucose, producing 13.4 g/l ethanol. In the co-culture and sequential fermentation, the co-culture showed more efficient ethanol productivity with 18.6 g/l ethanol than the sequential fermentation with 12.4 g/l ethanol. To investigate the effect of nutrients in the growth of microorganisms and ethanol production, yeast nitrogen base (YNB) was used in the sequential fermentation with S. cerevisiaeand P. stipitis. YNB supplemented some nutrients which S. cerevisiaeused up in the broth and the culture showed increased growth rate, increased consumption of xylose, and increased ethanol productivity producing 22.5 g/l ethanol from 54.6 g/l sugar with a yield of 0.41 g/g.

Pichia stipitis를 이용한 리그노셀룰로스계 바이오매스 기반의 바이오에탄올 생산

배양원(Yangwon Bae),성필제(Pil-Je Seong),조대행(Dae Haeng Cho),신수정(Soo-Jeong Shin),김승욱(Seung Wook Kim),한성욱(Sung Ok Han),김용환(Yong Hwan Kim),박철환(Chulhwan Park) 한국생물공학회 2010 KSBB Journal Vol.25 No.6

We investigated the effect of inhibitory compounds derived lignocellulosic hydrolysates on cell growth, sugar consumption and ethanol productivity, and also we intended to identify the potential for ethanol production based on lignocellulosic hydrolysates. Cell growth and ethanol production in the presence of acetate were initiated after 12 hr. Furans showed a longer lag time and phenolics showed a significant effect on strain and ethanol production in comparison to other model compounds. In the case of lignocellulosic hydrolysates, the acetate strongly affected cell growth and ethanol production.