Ghrelin 유전자의 Leu72Met 다형성 분석에서 PCR-RFLP, PCR-SSCP, Amplication Refractory Mutation System(ARMS)의 비교분석

강주성,김세림,김선영,주찬웅,조수철,황평한,Kang, Ju Sung,Kim, Se Rim,Kim, Sun Young,Joo, Chan Uhng,Cho, Soo Chul,Hwang, Pyoung Han 대한소아청소년과학회 2005 Clinical and Experimental Pediatrics (CEP) Vol.48 No.10

목 적 : 성장호르몬 분비를 촉진하는 ghrelin는 여러 질병에서의 역할은 아직까지 잘 알려져 있지 않았다. 그러나 최근에 ghrelin 유전자 변이가 비만과 당뇨병과 관련이 있는 것으로 알려졌다. 현재까지 보고된 ghrelin 유전자 이상으로는 SNP인 Arg51Gln, Leu72Met, G274A가 있으며 이중 가장 흔한 이상인 Leu72Met 변이이다. 일반적으로 ghrelin 유전자의 Leu72Met와 같은 diallelic 다형성을 스크리닝하는데 SSCP, RFLP, sequencing 등이 사용되어 왔으나 향후 비만 환자들에서 가장 효과적이고 정확하게, 손쉽게 ghrelin 유전자의 Leu72Met 다형성 분석을 검출할 수 있는 스크리닝 방법을 찾아 임상적 적용에 이용하고자 하였다. 방 법 : 비만소아에서 ghrelin 유전자의 Leu72Met 다형성 분석을 PCR-RFLP, PCR-SSCP와 ARMS 분석 방법을 이용하여 비교분석하고 이들의 검사방법의 장단점을 알아보았다. 결 과 : PCR-RFLP, PCR-SSCP와 ARMS 분석 모두에서 allele 특이산물의 밴드가 뚜렷이 구별할 수 있었으며 상기 방법에 의한 결과는 모두에서 일치하였다. PCR-SSCP 방법은 점돌연변이의 존재 여부를 많은 시료를 대상으로 쉽게 분자학적 스크리닝할 수 있는 장점이 있으나 조작이 간단하지 않고 비용부담이 많다. BsrI 제한효소를 이용한 PCR-RFLP법은 비교적 용이하고 간단하여 널리 쓰이는 방법이지만 충분한 고농도의 DNA가 필요하며 전기영동 결과의 올바른 해석이 쉽지 않았다. 이에 비하여 ARMS 분석법은 위의 방법들보다는 간편하여 검사의 소요시간도 짧으며, 검출률이 높고 결과 해석이 매우 쉬웠다. 결 론 : 따라서 본 실험에서 시행한 ghrelin의 Leu72Met 유전자의 다형성을 결정하는 방법 중에는 ARMS 분석법이 정확하고 검사 분석법 및 결과 해석이 매우 쉽고 검사의 소요시간도 짧아 대량 검체에 적용에 매우 효과적으로 사료된다. Purpose : The role of ghrelin, which promotes the secretion of growth hormone, was not well known until now. Recently it was found that the mutation of ghrelin gene is related to obesity and diabetes. This study is to find the screening method that can easily and effectively detect the polymorphism of Leu72Met in ghrelin gene of obesity patients and apply it to clinical usage. Methods : We compared PCR-RFLP, PCR-SSCP and ARMS methodologies for analyzing of the polymorphism of Leu72Met in ghrelin gene of obesity children, and also studied the merits and demerits of these methodologies. Results : In this study, we were able to find out the band of peculiar allele of Leu72Met in ghrelin gene using PCR-RFLP, PCR-SSCP and ARMS analyses. The polymorphism of Leu72Met in ghrelin gene determined by all above methodologies was in complete agreement. Compared to the PCR-RFLP and PCR-SSCP, ARMS analysis is simple, inexpensive and also consume less time. It is very sensitive to analyze the polymorphism and easy to understand the results of test. Conclusion : Though PCR-RFLP, PCR-SSCP and ARMS analyses were sensitive to analyze the polymorphism of Leu72Met in ghrelin gene, ARMS analysis appears to be more efficient than PCR-RFLP and PCR-SSCP. Therefore, we conclude that ARMS analysis is suitable to analyze the polymorphism of Leu72Met in ghrelin gene for large quantity of specimens.

Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism법을 이용한 Chlamydia trachomatis의 혈청형 분석 : Restriction fragment Length Polymorphism Analysis

서일혜,박필환,김완,김덕언,최태열 대한임상병리학회 2000 대한임상병리학회지 Vol.20 No.5

PCR-RFLP와 ITS 염기서열 분석을 이용한 한국산 초롱꽃과 (Campanulaceae)의 계통유연관계

김경아,유기억 한국식물분류학회 2011 식물 분류학회지 Vol.41 No.2

한국산 초롱꽃과 8속 25분류군과 군외군 2분류군 등 총 27분류군에 대한 계통유연관계를 알아보기 위하여 PCR-RFLP와 ITS 지역의 염기서열 분석을 실시하였다. 엽록체 DNA의 11개 지역을 이용한 PCR-RFLP 분석에서는 증폭된 DNA 각각에 대하여 15가지 제한효소를 처리한 결과 총 244개의 제한효소 절편을 얻었으며, 그 중 59개는 분류군간 차이가 있어 24%의 다형화를 보였다. ITS 지역의 길이는 588-707 bp이었으며, 염기변이는 0-39.36%로 나타났다. 계통 분석 결과, PCR-RFLP와 ITS 지역의 염기서열을 이용한 계통수 모두에서 초롱꽃과는 단계통을 형성하였다. 도라지속과 더덕속은 독립적인 분계조로 유집되었고, 홍노도라지속과 영아자속은 잔대속-금강초롱꽃속을 위한 자매군을 형성하였다. 초롱꽃속도 단계통으로 나타났고, 애기도라지속은 ITS분석에서는 가장 기부에 분계조를 형성하였지만 PCR-RFLP결과에서는 초롱꽃속과 더덕속-도라지속 분계조 사이에 위치하여 차이를 보였다. 금강초롱꽃속은 잔대속과 함께 유집되었으며, 잔대속은 병계원으로 분계조를 형성하여 형태형질에 의한 속내 분류체계와 일치하지 않았다. 본 연구에서 다룬 2가지 자료에 기초한 한국산 초롱꽃과의 계통분석 결과, 속 수준에서는 대부분 일치하는 경향을 보였지만 애기도라지속과 금강초롱꽃속의 계통학적 위치와 잔대속의 속내 분류계급의 유집에서는 차이를 보였다. Phylogenetic studies were conducted to evaluate the taxonomic relationships among 27 taxa, including 2 outgroups of Korean Campanulaceae, using PCR-RFLP analysis and ITS sequences. In the PCR-RFLP analysis, 15 restriction endonucleases produced 244 restriction sites and size variations from the chloroplast DNA, and 59 restriction sites (24%) showed polymorphism. The length of the ITS regions ranged from 588 bp to 797 bp. The sequence divergence including the outgroups is 0-39.36%. Phylogenetic analyses based on PCR-RFLP and ITS data suggest that Campanulaceae is monophyletic; Codonopsis and Platycodon forms an independent clade; the Peracarpa and Asyneuma clade is a sister to the Adenophora-Hanabusaya clade; Campanula is monophyletic; and Wahlenbergia basally branches within the ITS tree, whereas they are placed between Campanula and the Codonopsis-Platycodon clade in the PCR-RFLP tree; Hanabusaya is placed within the Adenophora clade; and Adenophora is paraphyletic and shows discordance to the infrageneric classifications based on morphological data. The present results show two data sets, largely congruent at the generic level, but their phylogenetic positions, in particular the Wahlenbergia and Hanabusaya and the infrageneric classifications in Adenophora, show some incongruence.

Development of a Monitoring System for Water-borne Bacteria by a Molecular Technique, PCR-RFLP-sequence Analysis

Ji-Young Lee,Eun-Young Jeong,Kyu-sang Lee,Seul Ju,Jong-Bae Kim,Joon-Wun Kang,Hyeyoung Lee 대한의생명과학회 2003 Biomedical Science Letters Vol.9 No.3

Since water borne infection causes acute diseases and results in spread of diseases by secondary infection, the prevention is very important. Therefore, it is necessary to have a method that is rapid and effective to monitor pathogenic bacteria in drinking water. In this study, we employed a systematic method, Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism (PCR-RFLP) analysis, to develop an effective monitoring system for possible bacterial contaminants in drinking water. For this purpose, PCR primers were derived from 992 bp region of the 16s rRNA gene that is highly conserved through the different species of prokaryotes. To test whether the PCR primers designed are indeed useful for detecting all the possible microbial contaminants in the water, the primers were used to amplify 16s rRNA regions of different microbial water-borne pathogens such as E. coli, Salmonella, Yersinia, Listeria, and Staphylococcus. As expected, all of tested microorganisms amplified expected size of PCR products indicating designed PCR primers for 16s rRNA indeed can be useful to amplify all different microbial water-borne pathogens in the water. Furthermore, to test whether these 16s rRNA based PCR primers can detect bacterial populations present in the water, water samples taken from diverse sources, such as river, tap, and sewage, were used for amplification. PCR products were for then subjected for cloning into a T-vector to generate a library containing 16s rRNA sequences from various bacteria. With cloned PCR products, RFLP analysis was done using PCR products digested with restriction enzyme such as Hae Ⅲ to obtain species-specific RFLP profiles. After PCR-RFLP, the bacterial clones which showed the same RFLP profiles were regarded as the same ones, and the clones which showed distinctive RFLP profiles were subsequently subjected for sequence analysis for species identification. By this PCR-RFLP analysis, we were able to reveal diverse populations of bacteria living in water. In brief, in unsterilized natural river water, over 60 different species of bacteria were found. On the other hand, no PCR products were detected in drinking tap-water. The results from this study clearly indicate that the PCR-RFLP-sequence analysis can be a useful method for monitoring diverse, perhaps pathogenic bacteria contaminated in water in a rapid fashion.

Development of a Monitoring System for Water-borne Bacteria by a Molecular Technique, PCR-RELP-sequence Analysis

이혜영,--,--,--,--,--,-- THE KOREAN SOCIETY FOR BIOMEDICAL LABORATORY SCIEN 2003 Journal of biomedical laboratory sciences Vol.9 No.3

Since water borne infection causes acute diseases and results in spread of diseases by secondary infection, the prevention is very important. Therefore, it is necessary to have a method that is rapid and effective to monitor pathogenic bacteria in drinking water. In this study, we employed a systematic method, Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism (PCR-RFLP) analysis, to develop an effective monitoring system for possible bacterial contaminants in drinking water. For this purpose, PCR primers were derived from 992 bp region of the 16s rRNA gene that is highly conserved through the different species of prokaryotes. To test whether the PCR primers designed are indeed useful for detecting all the possible microbial contaminants in the water, the primers were used to amplify 16s rRNA regions of different microbial water-borne pathogens such as E. coli, Salmonella, Yersinia, Listeria, and Staphylococcus. As expected, all of tested microorganisms amplified expected size of PCR products indicating designed PCR primers for 16s rRNA indeed can be useful to amplify all different microbial water-borne pathogens in the water. Furthermore, to test whether these 16s rRNA based PCR primers can detect bacterial populations present in the water, water samples taken from diverse sources, such as river, tap, and sewage, were used for amplification. PCR products were for then subjected for cloning into a T-vector to generate a library containing 16s rRNA sequences from various bacteria. With cloned PCR products, RFLP analysis was done using PCR products digested with restriction enzyme such as Hae Ⅲ to obtain species-specific RFLP profiles. After PCR-RFLP, the bacterial clones which showed the same RFLP profiles were regarded as the same ones, and the clones which showed distinctive RFLP profiles were subsequently subjected for sequence analysis for species identification. By this PCR-RFLP analysis, we were able to reveal diverse populations of bacteria living in water. In brief, in unsterilized natural river water, over 60 different species of bacteria were found. On the other hand, no PCR products were detected in drinking tap-water. The results from this study clearly indicate that the PCR-RFLP-sequence analysis can be a useful method for monitoring diverse, perhaps pathogenic bacteria contaminated in water in a rapid fashion.

정읍지역 야생 차나무의 분자생물학적 유연관계 분석

김평의(Pyeong-Ui Kim),이솔(Sol Lee),한상섭(Sang-Sub Han) 한국차학회 2008 한국차학회지 Vol.14 No.3

정읍지역 야생차나무의 분자학적 유연관계 및 유전적 다양성을 알아보기 위하여 12개 지역 차나무에 대하여 DFR intron 3, DFR intron 4+5 및 PAL exon 1 유전자 부위에 대하여 PCR-RFLP분석결과 DFR 4 + 5 primer을 이용하여 증폭 결과 DFR유전자의 크기는 약 1.4 kb에서 PCR산물을 획득하였고, PCR산물에 제한효소 Hpa II 및 Nla III를 이용하여 RFLP분석결과 각각의 제한효소에서 각각 서로 다른 3가지 형태의 RFLP밴드를 보여 차나무 집단 간 유전적 다양성을 보였다. 특히 삼성암, 천원리, 중광리, 벽련암, 두승산 집단과, 남산사, 성황산집단의 차나무가 각각의 집단으로 구분되었으며, Hpa II 및 Nla III제한효소 모두에서 2가지 집단으로 뚜렷하게 구분되어졌다. DFR intron 3 유전자의 경우에는 PCR 산물이 모두에서 약 1kb의 크기에서 나타났으며, Hind III 제한효소를 이용하여 RFLP분석 결과 뚜렷한 2가지 형태의 RFLP밴드패턴으로 구분되어졌다. PAL exon 1 유전자는 약 500bp의 크기에서 PCR산물을 얻을 수 있었으며, Hpa II 제한효소를 이용하여 RFLP분석 결과 천원리 집단의 차나무에서 독특한 밴드패턴을 보였으며, 나머지는 대부분 2가지 형태의 밴드패턴을 보였다. 염기서열분석 결과, 천원리 차나무 집단과 중광리 집단 간에는 98.9%의 유사성이 있었으며, 일본에서 보고한 차나무의 염기서열(GeneBank accession number D26596)와 천원리 집단과는 99.5%의 유사성을 보였다. 정읍지역 야생차나무에 대하여 PCR- RFLP분석 결과 사용한 제한효소에서 각각의 밴드패턴을 보여 집단 간 차이를 알아볼 수 있었으며, 다양한 제한효소를 사용한다면 각 집단 간 RFLP 밴드패턴을 더욱 정확하게 알아볼 수 있어 앞으로 우리나라 야생차나무의 계통 간 분류연구에 이용 가능할 것으로 사료된다. 천원리 및 중광리 차나무에 대하여 PAL exon 1유전자의 염기서열의 분석결과에서도 일본차나무 품종에서 보고한 PAL 유전자와 높은 유사성이 나타나 앞으로 차나무의 유연관계 분석에 PAL 유전자부위를 이용하는 것도 차나무의 유연관계를 정확하게 알아보는 방법이 될 것으로 보인다. Molecular relationship and genetic diversity of 12 wild tea plants populations which grown natural region in Jeongeup, Korea were investigated based on PCR-RFLP analysis of three genes which DFR intron 3 genes, DFR intron 4 and 5 genes, and PAL exon 1 genes. The PCR products were successfully obtained approximately 1.4 kb, 1kb and 500bp, respectively. On the bases of RFLP analysis of DFR intron 4 and 5 genes use Hpa II and Nla III enzymes, three kinds of band patterns were shown and divided into three groups; i) Samseongam, Cheonwon-ri, Junggwang-ri, Duseung mountain and ii) Byeokryeonam populations, iii) Namsansa and Seonghwang mountain populations, and showed different RFLP profiles from other wild tea plants populations. The DFR intron 3 genes were divided into 3 groups by RFLP analysis using Hind III enzyme. The first groups belong to Samseongam, Gobu-eupseong, Cheonwon-ri, Songsan, Byeokryeonam and Duseung mountain wild tea populations and other groups belong to Eunseonsa, Jungnim mountain, Junggwang-ri, Bukchanggol, Namsansa and Seonghwang mountain populations. The results of PAL exon 1 genes use Hpa II enzyme shown three kinds of distinct groups which Samseongam, Gobu-eupseong, and Seonghwang mountain populations were belong to same groups, and Eunseonsa, Jungnim mountain, Songsan, Bukchanggol, Byeokryeonam, Namsansa and Duseung mountain populations were shown same groups except Cheonwonri tea population. Based on sequence analysis of amplified PAL exon 1 gene of Chonwon and Junggwang wild tea populations, the tea plant of Chonwon was shown 98.9% and 99.5% homologies with Junggwang and Japan tea(GeneBank accession number D26596). The results of RFLP and sequence analysis indicated that wild tea plants populations in Jeongeup were shown genetic diversity among each other different wild tea plants populations.

폐암 억제유전자 RRM1의 단일염기다형성 검사를 위한 PCR-RFLP법과 Real-Time PCR법의 유용성 비교

정주연 ( Ju Yeon Jeong ),김미란 ( Mi Ran Kim ),손준광 ( Jun Gwang Son ),정종필 ( Jong Pil Jung ),오인재 ( In Jae Oh ),김규식 ( Kyu Sik Kim ),김영철 ( Young Chul Kim ) 대한결핵 및 호흡기학회 2007 Tuberculosis and Respiratory Diseases Vol.62 No.5

연구배경: 단일염기다형성(Single nucleotide polymorphism, SNP)은 인간의 유전자 서열 1000염기에 1개 빈도로 발견되어 인간은 대략 300만개의 유전자 다형성을 가지고 있다. 이 유전자 다형성의 조합결과로 인간의 개체 간 특성들이 결정되는 것으로 이해되고 있다. 이러한 다형성들의 조합양상에 따라 특이 질환에 대한 유전자 감수성 또한 달라지게 되므로 최근에는 많은 질환들과 유전자 다형성들과의 상관관계를 보는 연구들도 활발하게 진행되고 있다. 이러한 SNP분석은 큰 집단을 대상으로 진행되어지므로 적은 비용으로 정확하게 그리고 대용량으로 분석할 수 있는 방법이 필요하다. 방법: 대상 환자 89명의 genomic DNA를 가지고서 promotor상에 위치한 -37과 -524 염기부위에서 유전자 다형성을 보이는 것으로 보고되어져 있는 RRM1 (ribonucleotide reductase M1) 유전자를 대상으로 PCR-RFLP(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism)와 real-time PCR(RT- PCR, TaqMan probe assay)을 동시에 시행한 후 각각의 결과를 비교 분석하였다. 결과: 대상 DNA 89예 중 -37에서는 2예(2.17%), -524에서는 15예(16.26%)가 서로 다른 양상을 보였다. 결과 차이를 보인 샘플 17예를 대상으로 직접 염기서열 분석을 시행하여 본 결과, 17예 모두 RT-PCR에서 확인되었던 결과와 일치함을 확인할 수 있었다. 추가 샘플 138예를 대상으로 RT-PCR을 2회 연속 실행하여 genotyping을 해 본 결과 98%이상의 높은 일치율을 보였으며, 그 중 10예를 무작위로 골라 직접 염기서열 분석을 시행하여 본 결과, 역시 100%일치, 높은 정확도를 보였고 이는 in-tube assay 방식으로 샘플의 오염을 최소화 할 수 있었으며 72 well based system(Corbett Research)을 이용함으로 1회 유전자 증폭반응을 통해 많은 검체를 한 번에 확인할 수 있어 매우 빠른 검사방법 이었다. 결론: 큰 집단을 대상으로 다량의 SNP를 분석하기 위한 실험 방법으로는 RT-PCR이 신속하면서도 정확한 결과를 얻을 수 있는 방법으로 사료된다. Background: Single nucleotide polymorphisms (SNPs), which consist of a substitution of a single nucleotide pair, are the most abundant form of genetic variations occurring with a frequency of approximately 1 per 1000 base pairs. SNPs by themselves do not cause disease but can predispose humans to disease, modify the extent or severity of the disease or influence the drug response and treatment efficacy. Single nucleotide polymorphisms (SNPs), particularly those within the regulatory regions of the genes often influence the expression levels and can modify the disease. Studies examining the associations between SNP and the disease outcome have provided valuable insight into the disease etiology and potential therapeutic intervention. Traditionally, the genotyping of SNPs has been carried out using polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism(PCR-RFLP), which is a low throughput technique not amenable for use in large-scale SNP studies. Recently, TaqMan real-time PCR chemistry was adapted for use in allelic discrimination assays. This study validated the accuracy and utility of real-time PCR technology for SNPs genotyping Methods: The SNPs in promoter sequence (-37 and -524) of lung cancer suppressor gene, RRM1 (ribonucleotide reductase M1 subunit) with the genomic DNA samples of 89 subjects were genotyped using both real-time PCR and PCR-RFLP. Results: The discordance rates were 2.2% (2 mismatches) in -37 and 16.3% (15 mismatches) in -524. Auto-direct sequencing of all the mismatched samples(17 cases) were in accord with the genotypes read by real-time PCR. In addition, 138 genomic DNAs were genotyped using real-time PCR in a duplicate manner (two separated assays). Ninety-eight percent of the samples showed concordance between the two assays. Conclusion: Real-time PCR allelic discrimination assays are amenable to high-throughput genotyping and overcome many of the problematic features associated with PCR-RFLP. (Tuberc Respir Dis 2007; 62: 406-416)

Identification of Fel ursi and Cattle and Pig Bile Juices by speciesspecific PCR and PCR-RFLP

권기록,백승일,최석호,Kwon, Ki-Rok,Baek, Seung-Il,Choi, Suk-Ho KOREAN PHARMACOPUNCTURE INSTITUTE 2009 Journal of pharmacopuncture Vol.12 No.1

Objective : This study developed species-specific PCR and PCR-RFLP to detect the adulteration of Fel ursi products with cattle and pig bile juices. Methods : All the primers for PCR and PCR-RFLP in this study were designed based on nucleotide sequences of cytochrome b genes in the mitochondria. Results : The species-specific PCR amplified a DNA fragment of 214, 214, 295, and 167 bp from Fel ursi product, bear fur, cattle bile juice, and pig bile juice, respectively. The survey using the speciesspecific PCR indicated that some of commercial Fel ursi products were adulterated with cattle and pig bile juices. PCR-RFLP using the restriction endonucleases, HaeIII and HinfI enabled differentiation among Fel ursi product, cattle bile juice, and pig bile juice. Bear furs from two animals showed variations in PCR-RFLP patterns with HaeIII. Discussion : The detection methods of the species-specific PCR and PCR-RFLP could be useful in eliminating adulterated Fel ursi products from the market.

PCR-RFLP에 의한 Vibrio core group을 포함한 Vibrio 종의 구분

Jin-Sook Park(박진숙) 한국생명과학회 2012 생명과학회지 Vol.22 No.2

Vibrio속의 core 균주(Vibrio alginolyticus, Vibrio parahaemolyticus)를 포함하여 총 6 종의 Vibrio 균주(V. fluvialis, V. proteolyticus, V. vulnificus, V. mimicus)와 Grimontia (Vibrio) hollisae의 16S rDNA를 PCR 증폭하여 AluⅠ, CfoⅠ, DdeⅠ, HaeⅢ, MspⅠ, RsaⅠ의 6 종의 제한효소를 처리 후 RFLP 분석을 수행하였다. 2 종의 core 균주와 V. proteolyticus는 4 종의 제한효소(CfoⅠ, DdeⅠ, MspⅠ, RsaⅠ)에서 동일한 제한효소 패턴을 나타내었다. 제한효소의 패턴의 조합에 의해 6 종의 Vibrio 종은 6 개의 RFLP type으로 구분되었다. 특히 AluⅠ의 경우, 실험된 6 종의 Vibrio속에 대하여 각기 다른 6 개의 종 특이적 RFLP type을 나타내었다. 제한효소 패턴에 근거하여 작성한 덴드로그램에서 Vibrio core group 균주인 V. alginolyticus 와 V. parahaemolyticus는 90% 이상의 매우 높은 유사도를 나타내었다. 반면 Grimontia hollisae는 실험된 모든 제한효소 패턴에서 Vibrio속 세균과는 분명히 구분되는 RFLP type을 나타내었다. 따라서 PCR-RFLP는 제한효소를 적절히 선택한다면 Vibrio 속 세균의 신속한 구분에 여전히 유용하다. The 16S rDNA - RFLP types for six Vibrio species (V. fluvialis, V. proteolyticus, V. vulnificus, V. mimicus) including two core group members, V. alginolyticus and V. parahaemolyticus, and Grimontia (Vibrio) hollisae were determined using PCR-RFLP analysis. Six tetrameric restriction enzymes (AluⅠ, CfoⅠ, DdeⅠ, HaeⅢ, MspⅠ, and RsaⅠ) were selected for RFLP analysis. V. alginolyticus, V. parahaemolyticus, and V. proteolyticus showed the same RFLP pattern following digestion with four of the six used restriction enzymes: CfoⅠ, DdeⅠ, MspⅠ, and RsaⅠ. Various restriction enzyme combinations generated digests recognizable as distinct RFLP types for each of the assayed Vibrio species. In particular, AluⅠsingle digestion produced species specific band patterns that enabled the differentiation between these Vibrio species. Dendrogram based on restriction patterns showed that two Vibrio core group members, V. alginolyticus and V. parahaemolyticus were closely related having a similarity over 90%. Although the observed RFLP pattern for Grimontia hollisae shared several common bands with other Vibrio spp., G. hollisae results were still clearly distinct from Vibrio spp. RFLP types for all restriction enzymes tested. If restriction enzymes are aptly selected, PCR-RFLP analysis is still a rapid and effective tool for differentiating Vibrio species.

PCR-RFLP와 화분관 검경에 의한 배 ‘설원’, ‘슈퍼골드’, ‘신화’의 자가불화합 인자 구명

김윤경,강삼석,마경복,원경호,이인복,이별하나,이욱용,김명수,신일섭,최진호 한국자원식물학회 2016 한국자원식물학회지 Vol.29 No.4

This study was accomplished to elucidate self-incompatibility (SI) genotypes of ‘Supergold’, ‘Shinhwa’, and ‘Seolwon’ by polymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) and pollen tube growth analysis with fluorescent microscopy. We determined the S-genotype of ‘Supergold’ (S 3 S 4 ), ‘Shinhwa’ (S 3 S 5 ), and ‘Seolwon’(S 3 S 9 ). The PCR fragments size of ‘Supergold’ and ‘Shinhwa’ amplified by SI gene specific primer were ca. 380bp. The PCR fragments of ‘Supergold’ were cleaved in 140 and 240 bp by the S 4 -specific restriction endonuclease NdeⅠ. And the PCR products were processed to 120 and 260 bp by the S 3 -, S 5 -specific restriction endonuclease PpuMⅠ but it was not cleaved by S 5 -specific restriction endonuclease AlwNⅠ. The 380 bp PCR products of ‘Shinhwa’ by SI gene specific primer were processed to 120 and 260 bp by both PpuMⅠand AlwNⅠ. And also we confirmed S 5 -genotype sequence by 200 bp mRNA sequencing from the ‘Shinhwa’ style. The PCR fragments of ‘Seolwon’ were obtained ca. 380 bp and 1,300 bp by SI gene specific primer. The PCR fragments ca. 380 bp long of ‘Seolwon’ were cleaved in 120 bp and 260 bp with PpuMⅠ not AlwNⅠsuch as S3 genotype of ‘Supergold’. Also, the 1,300 bp size PCR fragments were cleaved into 600 bp and 700 bp by S 9 -specific restriction endonuclease BstBⅠ. Three new cultivars were crossed with ‘Whangkeumbae (S 3 S 4 )’ or ‘Niitaka (S 3 S 9 )’, which posesse identified SI alleles. In the styles of ‘Whangkeumbae (S 3 S 4 )’ × ‘Supergold’, ‘Niitaka (S 3 S 9 )’ × ‘Seolwon’ crossing they showed typical incompatibility effects that elongation of all pollen tube tips in the style was inhibited and hypertrophy. In the style of ‘Whangkeumbae’ (S 3 S 4 ) × ‘Shinhwa’ crossing showed typical partial-incompatibility, where some pollen tubes reached the basal part of the style and others were ceased and swollen. Key words - Endonuclease, Fruit, PCR-RFLP, Pear, Pollen tube, Pyrus pyrifolia 본 연구는 PCR-RFLP와 형광현미경을 이용한 화분관 검경방법을 통해 ‘슈퍼골드’, ‘신화’, ‘설원’의 자가불화합 인자를 확인하기 위해 수행하였다. 그 결과, 3개의 배 신품종 ‘슈퍼골드’, ‘신화’, ‘설원’의 자가불화합 유전자형을 S3S4, S3S5, S3S9로 각각확정하였다. SI gene specific primer에 의한 ‘슈퍼골드’와 ‘신화’의 PCR 결과 380 bp의 PCR product가 얻어졌다. ‘슈퍼골드’ PCR product는 S4 인자임을 확인할 수 있는 NdeⅠ에 의해 140 bp와 240 bp로 절단되었다. S3, S5 인자확인이 가능한 PpuMⅠ 에 의해서는 120 bp와 260 bp로 절단되었으나, S3 인자확인이가능한 AlwNⅠ으로는 절단되지 않았다. ‘신화’는 PpuMⅠ과AlwNⅠ에 의해 각각 120 bp와 260 bp 크기로 절단되고, 주두에서 채취한 200 bp 크기의 mRNA sequencing을 통해 S5 인자가있는 것을 확인하였다. SI gene specific primer에 의한 ‘설원’의PCR 결과 380 bp와 1,300 bp 크기의 산물이 얻어졌고, 그 중380bp의 PCR 산물은 ‘슈퍼골드’에서 확인된 S3 인자처럼 PpuM Ⅰ에 의해서만 120 bp와 260 bp로 절단되었고, 1,300 bp의 PCR 산물은 S9 인자 확인이 가능한 BstBⅠ에 의해 600 bp와 700 bp 로 절단되어 S9임을 확인하였다. 추가적으로 이미 자가불화합인자가 알려진 ‘황금배(S3S4)’ 또는 ‘신고(S3S9)’와 이들 세 품종의 화분을 이용하여 인공 교배한 후 화분관 신장을 관찰한 결과, 자가불화합 인자가 S3S4로 알려진 ‘황금배’와 ‘슈퍼골드’ 교배 조합, 자가불화합 인자가 S3S9로 알려진 ‘신고’와 ‘설원’ 교배조합의 암술대 내 화분관은 발아 신장하던 화분관의 선단이 비대하면서 신장이 정지하는 자가불화합 현상을 보였다. 또한, ‘황금배(S3S4)’와 ‘신화’를 교배한 주두에서는 일부 화분관은 신장을계속하지만 일부는 선단이 비대하며 신장이 정지하는 전형적인부분 불화합 현상을 보여 ‘신화’는 S3 인자를 보유하고 있음이 확인되었다.