Aspergillus nidulans mtDNA의 자가복제절편

장승환,한동민,장광엽 한국미생물학회 1999 미생물학회지 Vol.35 No.3

We isolated the ANRI fragment from Aspergillus nidulons that could autononlously replicate and enhance transformation efficiency about $10^4$ fold compared lo the integrative vector in Saccha,omgcer cerevisioe. In A. nidulans recombinant plasmid pLJ16-4.5 which carries the 4.5 kb EcoRI fragment of ANRI showed a 170-[old increase of transformation efficiency compared to the integrative vector pLJ16 and could be recovered from iransfonnants as an intact form. Estimated copy number of transforming plasmid pLJ16-4.5 was scored as 2 to 3 copies in transformed A. nidulans. Recoinbinant plasinid pILJ16-4.5 is inilotically unstable; being lost Irom 65% of aswual progeny of transformants on selective medium and 90% on complete medium. Southern analysis of transformant DNA showed that the pILJ16-4.5 is maintained in free form. The sequencing data showed that ANRl fragment was originated from mitochondiral DNA of A. nid~ilans and contained high AT content as much as 74.7%. One ARS consensus sequence (A/T)TTr4T(A/G)TTT(AiT). I I ARS-like sequence (agreement 10 of 11) and ABFl binding core consensus sequence (TCN7ACG). Also six gyrase binding core consensus sequence (YRTGNYNNY: y=C or T, R=A or G, N=A, G, C or T) of $\Phi$X174 and SV40 DNA and one b site (CACTTTACC) combining with gyrase in ColEl are shown. ANRl can be developed as a repl&ng plasinid for lransfoimation system in A. nirlulmis. Aspergillus nidulans 의 DNA 로부터 Saccharomyces cerevisiae에서 스스로 복제가능하고, 형질전환율도 삽입벡터에 비해 10\sup 4\ 배정도 높여주는 절편을 분리한 바 있다. A. nidulans에서 ANRI 의 일부를 포함한 pILJ16-4.5는 삽입벡터인 pILJ16보다 170배 정도 높은 형질전환 효율을 보였으며, S.cerevisiae와 마찬가지로 plasmid 상태로 회수가능했다. A.nidulans 페소내에서 2-3 copy 정도로 염색체와는 별개로 존재하는 것으로 나타났으며, 재형질전환능력도 있었다. ANRI은 미토콘드리아의 DNA에서 유래한 절편으로 밝고, ARS 공통절편과 유사한 절편도 11곳에 존재한다. $\Phi$X174와 SV40 DNA에서 gyrase 가 결합하는 부위의 공통편인 YRTGNYNNY도 6곳에 존재하며, ColE1에서 gyrase가 결합하는 b site와 일치하는 절편도 하나 포함하고 있으며, ABF1 결합 부위이 공통절편과 유사한 절푠$TCN_7ACG$ 도 하나 포함하고 있다. 이를 토대로 ANRI은 A.nidulans의 형질전환 후 회수가 가능한 replicating vector 개발에 이용할 수 있다.

Aspergillus fumigatus에서 Methyltransferase 유전자 AfuvipB와 AfuvipC의 분리 및 분석

모하메드,한갑훈,Elgabbar, Mohammed A. Abdo,Han, Kap-Hoon 한국균학회 2015 韓國菌學會誌 Vol.43 No.1

사상성 진균에서 veA 유전자와 연계되어 있는 velvet 복합체는 진균의 분화와 이차 대사산물의 조절에 매우 중요한 기능을 한다. 모델 사상균인 Aspergillus nidulans의 경우 methyltransferase인 VipB와 VipC를 포함한 여러 단백질들이 VeA 단백질과 상호작용하는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 인간 기회감염 진균인 Aspergillus fumigatus에서 vipB와 vipC 유전자의 상동유전자를 분리하여 각각 AfuvipB와 AfuvipC로 명명하였다. AfuvipB 유전자는 AspGD 데이터베이스에 Afu3g14920으로 등록되어 있으며 1,510 bp 길이에 10개의 인트론을 가지고 있고, 유전자 산물은 336 아미노산 잔기로 구성된 단백질로 methyltransferase 도메인을 가지고 있었다. AfuvipC는 Afu8g01930으로 AfuvipB와 유사하게 10개의 인트론을 가지고 있으며 339개의 아미노산으로 구성된 methyltransferase를 암호화하고 있었다. A. fumigatus에서 각각의 유전자에 대한 기능을 알아보고자 유전자제거 돌연변이 균주들을 제조하고 그들의 표현형을 관찰하였다. AfuvipB 유전자 제거 돌연변이는 점 접종을 하였을 경우 대조군에 비하여 표현형의 차이를 보이지 않았다. 그러나 단일 포자에서 성장한 콜로니를 비교해 보았을 때 대조군에 비하여 그 크기가 작고 분화 속도도 약간 더딘 것을 관찰할 수 있었다. 반면에 AfuvipC 유전자 제거 돌연변이는 대조군과 비교하였을 때 표현형의 차이를 보이지 않았다. 이러한 결과는 두 개의 methyltransferase가 상호 중복적인 역할을 수행하거나 정상적인 실험실 배양조건에서는 중요한 기능을 수행하지 않을 수 있음을 시사한다. In filamentous fungi, velvet complex associated with the veA gene plays pivotal roles in development and secondary metabolism. In a model fungus Aspergillus nidulans, many proteins that can interact with VeA, including two methyltransferases VipB and VipC, have been isolated and characterized. In this study, we isolated homologs of the vipB and vipC genes in the human opportunistic pathogenic fungus Aspergillus fumigatus and named AfuvipB and AfuvipC. The AfuvipB gene, annotated as Afu3g14920 in the Aspergillus Genome Database (AspGD) database, consists of 1,510 bp interrupted with 10 introns yielding 336 amino acid-long putative methyltransferase protein. Similarly, AfuvipC, which is Afu8g01930, has 10 introns and encodes a polypeptide with 339 amino acids having a methyltransferase domain in the middle of the protein. To characterize the function of the genes in A. fumigatus, knock-out mutants were generated and the phenotypes were observed. Deletion of AfuvipB gene caused no obvious phenotypic change on point inoculation but showed smaller colony than wild-type when the mutant was subjected to culture on single spore-driven culture condition. However, AfuvipC deletion mutant demonstrated no phenotypic difference from wild type both in point inoculation and streaking cultures. These results indicate that the two methyltransfereases might have a redundant role and could be dispensable in normal culture conditions.

Aspergillus nidulans의 분생포자에 존재하는 $\beta$-Glucosidase에 관하여

권기선,이재훈,하영칠,홍순우 한국미생물학회 1986 미생물학회지 Vol.24 No.4

Aspergillus nid$\mu$tans 의 분생포지에는 두 종류의 $\beta$.glucosidase, 즉 tightly-bound enzyme(TBE)과 loosely-bound enzyme(LBE)이 존재한다. 포자수와 효소활성도가 정비례함을 보아 이 효소의 존재을 확인할 수 있었으며, 배양조건 하에서 의 오랜기잔 방치에도 얼정 수준의 활성을 유치하는 높은 안정성을 보였다. 분생포자에 여러가지 물리.화학적 처리를 한 뒤에도 TBE의 환성도에는 큰 변화가 없었으며, TBE의 최적 pH 및 온도는 각각 6.0, $55^{\circ}C$였다.TBE의 열안정성은 균사체의 $\beta$-glucosidase보다 높았으며, $H^{2+}$이온에 대한 내성도 비교적 높은 수준을 보였다. LBE와 균사체 $\beta$-glucosidase의 전기영동 양상이 유사한 것으후 보아 율사체와 동일한 효소가 포자의 표면에 존재후L을 알 수있었다. Two kind of ${\beta}-glucosidase$, tightly-bound enzyme(TBE) and loosely-bound enzyme(LBE), were obtained from the conidia of Aspergillus nidulans. The existence of enzymes in conidia was conformed by the fact that these enzyme activities were proportional to the number of conidia. The levels of enzyme activities were independent of aging of the conidia. Enzymes were characterized partially. In spite of the physical and chemical treatments of conidia, there was no significant change in TBE activity. The optimum pH and temperature was 6.0 and $55^{\circ}C$, respectively. Thermostability of the TBE was remarkably higher than that of mycelial ${\beta}-glucosidase$. The electrophoretic pattern of LBE was identical to that of mycelial ${\beta}-glucosidase$. These results suggest that conidial ${\beta}-glucosidase$ are involved in adaptation process of the conidia to variable environments.

Aspergillus nidulans 색소결핍 억제돌연변이주의 세포벽 미세구조

정윤신 한국생명과학회 2004 생명과학회지 Vol.14 No.1

To investigate the effect of the cell wall on the pigmentation and branching in Aspergillus nidulans, ultrastructure of cell wall in suppressor mutant of the null pigmentation (SU-NPG, SU602) has been examined. Scanning electron microgrphs (SEM) revealed that the most outer layer of conidia wall peeled off in SU-NPG on day 6 from the complete conidiation. They also showed that hyphal growth and branching were not well developed in SU-NPG. Transmission electron micrographs (TEM) showed that the plasma membrane was not crenulated and the hyphal wall was thick in SU-NPG. These results indicated that the ultrastructure of cell wall in SU-NPC might be modified. Cytochemical analysis showed that the cell wall in SU-NPG was differentiated into Cl, C3, C2 and C4 layer in conidia and H1, H3, H2 and H4 layer in hyphae. C3 layer and H3 layer existed in SU-NPG. The increment of the diameter in SU-NPG hyphae might be caused by the thickness of H3 layer. These results suggest that SU-NPG may have an immature but the differentiated structure for the pigmentation in cell wall. A. nidulans의 색소결핍 억제돌연변이주(Suppressor mutant of the null pigmentation; SU-NPG)의 세포벽 구조가 색소형성 및 균사분지에 미치는 영향을 조사하여 다음의 결과를 얻었다. SEM으로 세포 표면구조를 관찰한 결과, 완전배지에서 배양된 SU-NPG의 분생포자벽은 최외각 층이 6일 째부터 박리되었으며, 균사생장이 저조하였다 TEM으로 관찰한 결과, 균사 세포벽은 매우 두꺼워졌다. 이러한 전자현미경관찰 결과는 이들 돌연변이주의 세포벽 구조가 NPG 및 야생형의 그것과는 다르다는 것을 시사한다. 균사에 탄수화물 염색을 한 후, 세포화학적 미세구조를 관찰한 결과, 분생포자벽은 C1, C2, C3와 C4 층으로 되어 있었고, 균사 세포벽은 H1, H2, H3와 H4층으로 되어 있었다. 이러한 C3층과 H3층은 세포분화 시 색소형성 및 균사 분지형성에 필수적인 세포벽 구조임 을 시사한다. SU-NPG는 FGSC4에서와는 다르게 비정상적인 균사생장을 하였지만, 색소결핍 돌연변이를 억제하는데, 이는 SU-NPG의 균사 세포벽에는 H3층이 형성되었으며, 세포벽 형성과정은 정상적으로 진행되기 때문으로 사료된다.

Aspergillus nidulans에서 MsnA 하위 유전자로 선별된 단당류 수송자 mstB의 기능 분석

전미향,채순기,Jeon, Mee-Hyang,Chae, Suhn-Kee 한국미생물학회 2011 미생물학회지 Vol.47 No.4

스트레스 반응에 관여하는 Saccharomyces cerevisiae 전사인자인 Msn2/4의 $C_2H_2$ zinc finger 부위와 아미노산 서열 유사성을 보이는 Aspergillus nidulans MsnA의 하위 유전자 획득을 위하여 msnA 결손 돌연변이체 또는 과발현 균주에서 야생주와 비교하여 차별적으로 발현되는 유전자(Differentially Expressed Gene, DEG)들을 분리하였다. 선별된 DEG들은 염기서열 결정을 통해 해당 유전자들을 동정하였고 이들 중 DEG6는 단당류 수송자(monosaccharide transporter)로 예측된 mstB 유전자로 밝혀졌다. mstB의 발현은 MsnA 과발현에 의하여 증가되었으며 MsnA는 in vitro에서 mstB 프로모터 부위에 직접적으로 결합하였다. MstB는 12개의 막결합 부위를 가지며 A. niger의 고친화성 단당류 수송자(high-affinity monosaccharide transporter)인 MstA와 80%의 높은 아미노산 서열 동일성을 보였다. mstB 결손 돌연변이체의 표현형은 야생주와 유사하였으나 MstB가 과발현된 균주는 낮은 당 농도인 0.1% glucose 배지에서 유성생식 기관인 cleistothecia의 형성이 증가하였다. 이러한 결과는 단당류 수송자인 MstB가 유성분화 과정에서 요구되는 당의 수송에 관여하고 있음을 시사한다. To screen downstream genes of Aspergillus nidulans MsnA showing amino acid sequence similarity to the zinc finger region of Msn2/4 stress response transcription factors in Saccharomyces cerevisiae, differentially expressed genes (DEG) in MsnA overexpressed or msnA null mutant strains compared to wild type have been isolated. The cognate gene IDs were identified by DNA sequencing of the selected DEGs. Among those, DEG6 was known as mstB encoding a putative monosaccharide transporter. Expression level of mstB mRNA was increased in MsnA overproducing strains and MsnA bound directly to the promoter region of mstB in vitro. MstB containing twelve transmembrane domains exhibited 80% of amino acid sequence identities to A. niger MstA a high-affinity monosaccharide transporter. A null mutant of mstB was phenotypically undistinguishable to wild type. On the other hand, forced overexpression of MstB caused the increased formation of sexual structure cleistothecia in 0.1% glucose condition where wild type showed almost no cleistothecia. This result implies that mstB is involved in transport of monosaccharide required for sexual differentiation.

Aspergillus nidulans에서 유성분화 능동조절 유전자 nsdD와 veA 또는 nsdC의 이중결실돌연변이의 분리 및 분석

김이한,김하은,한동민,Kim, Lee-Han,Kim, Ha-Eun,Han, Dong-Min 한국미생물학회 2013 미생물학회지 Vol.49 No.4

Aspergillus nidulans에는 유성분화를 능동조절하는 nsdD, nsdC 그리고 veA의 3 유전자가 알려져 있다. 이들 유전자의 돌연변이들은 각각을 서로 교배한 이핵체에 cleistothecia를 형성하지 못하기 때문에 이중돌연변이의 분리가 어려웠다. 본 연구에서는 ${\Delta}nsdD$ 돌연변이가 저산소 및 저온조건에서 성숙한 cleistothecia를 형성하는 것을 이용하여 ${\Delta}nsdD$와 ${\Delta}veA$ 및 ${\Delta}nsdD$와 ${\Delta}nsdC$의 이중돌연변이를 분리하였다. 이중돌연변이의 형질을 분석한 결과 nsdD 유전자는 veA 또는 nsdC와 독립적으로 정단성장에 관여하는 것으로 보였다. 색소생성형질은 veA나 nsdC가 nsdD에 대해 상위에 있는 것으로 나타났으며, lactose가 탄소원인 액체배지에서 무성포자를 생성하는 형질이 이중돌연변이에도 보임에 따라 이 형질은 nsdC의 고유한 특성으로 사료된다. Three genes, nsdD, nsdC, and veA are known to be necessary for positive regulating sexual development of Aspergillus nidulans. Since the mutants of those genes hardly form fruiting bodies in heterokaryons constructed by cross between two of them, it is difficult to isolate double mutants. In this work, double mutants of ${\Delta}nsdD$ ${\Delta}veA$ and ${\Delta}nsdD$ ${\Delta}nsdC$ were isolated using the characteristic of the nsdD deletion mutant that it could develop mature cleistothecia in hypoxic and low temperature culture condition. According to the phenotypes of double mutants, the nsdD gene controls the apical growth independently with veA or nsdC. Deletion of veA or nsdC was epistatic to nsdD deletion for pigment production. Conidia formation in submerged culture with lactose as sole carbon source was observed in ${\Delta}nsdD$ ${\Delta}nsdC$ double mutant implicating it to be unique phenotype of nsdC deletion.

Aspergillus nidulans에서 플라스미드의 자가복제를 유발하는 DNA절편의 분리 및 분석

김진희,한규용,한갑훈,한동민,Kim, Jin-Hee,Han, Kyu-Yong,Han, Kap-Hoon,Han, Dong-Min 한국미생물학회 1998 미생물학회지 Vol.34 No.3

pNPG는 염색체 1번의 동원체 왼편에 위치하는 npgA1을 상보할 수 있는 genomic DNA를 포함하는 플라스미드인데 Aspergillus nidulans의 형질전환율을 현저히 증가시키는 특징을 보여주었다. 이 플라스미드로 형질전환시켰을 때 $Trp^+$형질전환체 모두가 $Npg^+$이었고 이들 중에 불완전 형질전환체는 전혀 형성되지 않았다. pNPG를 제한효소 PstI으로 절단하여 얻어진 10.4 kb 절편내에 형질전환율을 증가시키는 DNA서열이 존재함을 확인하고 pILJ16의 PstI site에 재조합하여 pKJH10.4라 명명하였다. pKJH10.4에 의한 A. nidulans의 형질전환율은 pILJ16 보다 대략 200배 이상 증가하였다. pKJH10.4에 의한 형질전환체를 비선택적 조건에서 배양하였을 때 $Arg^+$무성생식포자의 약 80%이상이 $Arg^-$로 복귀됨으로써 플라스미드가 매우 불안정함을 보여주었다. argB2 지표와 다른 종류의 연관된 유전자 지표를 지니는 플라스미드로 형질전환하였을 경우 비선택적 조건에서 argB2 지표가 결손될 때 연관된 다른 지표도 항상 함께 결손되는 현상을 보여주었다. 이 결과는 이 플라스미드에 의한 형질전환체의 불안정성이 염색체로 삽입되었다가 절제되어 나오기 때문이기보다는 염색체 밖에서 자가 복제하기 때문임을 시사한다. 형질전환율을 증가시키는 최소한의 DNA절편은 EcoRI-HaeIII 4.9 kb 절편이었으며 PvuII-EcoRI 2.2 kb 절편은 플라스미드의 불안정성과 관련이 있었다. 이러한 결과들을 종합해 볼 때 형질전환율을 증가시키는 새로운 DNA 서열의 특성이 ANS1 보다는 AMA1과 유사하였으므로 AMA2라 명명하였다. A plasmid pNPG contains a genomic DNA complementing npgA1 which is located on the left arm of linkage group I. It transformed Aspergillus nidulans at a high frequency. No abortive transformants were observed and the $Trp^+$ transformants were all $Npg^+$. The 10.4 kb Psti fragment of the genomic DNA was subcloned into pILJ16, which increased the transformation efficiency by more than 200-folds. The transformants were mitotically unstable and yielded $Arg^-$ conidia at the frequency of more than 80%. An additional gene cloned into the plasmid containing the fragment was always lost with $argB^+$ marker. These characteristics strongly indicate the possibility that the plasmids autonomously replicate. The full activity of enhanced transformation was retained on the 4.9 kb EcoRI-HaeIII fragment. The DNA segment was similar to AMA1 rather than ANS1 in function and designated AMA2.

Aspergillus nidulans 에서의 핵전이에 의한 종내잡종 형성

양영기,박열,이영하,맹필재 충남대학교부설 생명공학연구소 1991 생물공학연구지 Vol.1 No.-

The nuclear transfer technique was employed to obtain intraspecific hybrids in Aspergillus nidulans. Nuclei isolated from either a wild type or an auxotrophic mutant strain (FGSC 475) were transferred into the protoplasts of a recipient strain (FGSC 514). The frequency of hybrid formation (4.8% and 10.1%, respectively) by nuclear transfer was higher than the frequency (0.6%) by protoplast fusion. Furthermore, most of the hybrids formed showed increased activity of some components of cellulase system, xylanase system, and mannanase. The hybrids were analyzed to be either diploid or aneuploid. These results suggest that nuclear transfer technique is more efficient in the formation of intraspecific hybrids than protoplast fusion method and is useful for the improvement of Aspergillus strains.

Aspergillus nidulans의 자외선 감수성, uvs 돌연변이주들의 epistatic 연관성 및 성질에 대하여

채순기,Chae, Suhn-Kee 배재대학교 자연과학연구소 1999 自然科學論文集 Vol.11 No.1

4-NQO에 대한 감수성을 이용한 A.nidulans uvs 유전자들의 epistatic grouping은 자외선 및 MMS의 감수성을 이용한 grouping과 동일한 결과를 보였다. 한편, MMS에 대한 감수성을 기준으로 분류한 epistasis group에서 uvsA는 UvsF group 유전자인 uvsF 및 uvsH와 synergistic interaction을 보였으며, uvsA;uvsB 및 uvsA;uvsC 이배체는 uvsB, uvsC의 반수체와 동일한 감수성을 나타내었다. Germination한 뒤 4시간 후의 자외선 감수성을 기준으로 한 uvsI의 epistatic grouping은 conidia 상태에서 자외선을 쬐어 조사한 grouping과 유사하여, uvsH, uvsC, uvsB와 synergistic interaction을 보였다. 하지만, quiescent conidia 상태에서의 additive effect를 보인 uvsI와 uvsF 돌연변이체는 4h germination 후에는 epistatic interaction을 나타내었다. uvsI 돌연변이체의 Intergenic-intragenic recombination frequency는 야생주와 유사하였다. In epistatic grouping of uvs genes in A. nidulans based on the sensitivities to 4-NQO, the same epistatic grouping was obtained as those for UV and MMS-sensitivities. Based on the MMS-sensitivities, uvsA demonstrated synergistic interactions to uvsF and uvsH, the UvsF group genes, but exhibited epistatic interactions to uvsB and uvsC. The same epistatic grouping was also seen for uvsI when UV was irradiated after 4h germination of conidia, showing synergistic interactions to uvsH, uvsC, and uvsB. However, epistatic interactions were observed with uvsF, which were different from those obtained in quiescent conidia by UV. Intergenic and intragenic recombination frequencies were normal in uvsI compared with wild type.

단보 : 고농도 CO2노출에 의한 Aspergillus nidulans의 유성생식 촉진효과

한갑훈 ( Kap Hoon Han ),양영석 ( Yeong Seok Yang ),김종화 ( Jong Hwa Kim ) 한국균학회 2013 韓國菌學會誌 Vol.41 No.3

Fungal development is largely affected by many environmental factors. In a model filamentous fungus Aspergillus nidulans, asexual development is promoted by exposure of light, presence of salt and non-fermentable sugars. In other hand, sexual development is largely induced by absence of light, fermentable sugars and hypoxic condition. Also, some important genes including veA and nsdD play positive roles in activating sexual development. Here, we reported that the effect of high concentration of CO2 on developmental decision in A. nidulans. When wild-type veA + strain was cultured in normal condition, sexual and asexual development occurred in balanced manner. However, high concentration of CO2 (~5%) strongly activated sexual development and inhibited asexual development. Furthermore, this CO2 effect was controlled by the veA(-) or nsdD(-) gene. High CO2 culture of veA or nsdD mutant didn`t activate sexual development, suggesting that the activation of sexual development induced by high CO2 cannot overcome the genetic requirement of sexual development such as veA(-) or nsdD(-). Since 5% CO2 is an important condition for human pathogenic fungi for surviving and adapting in human body, this developmental pattern of A. nidulans affected by CO2 concentration may provide interesting clues for comparative study with human fungal pathogens including Aspergillus fumigatus.