단보 : 생쥐 복수로부터의 단세포군 항체분리를 위한 크로마트그라피 분리정제 방법의 개발 (2) 히드록실아파타이트 크로마토그라피 단일 단계만의 사용

안익성(I . S . Ahn),최차용(C . Y . Choi) 한국미생물생명공학회(구 한국산업미생물학회) 1989 한국미생물·생명공학회지 Vol.17 No.3

주정중류 폐액을 이용한 Actinobacillus sp. EL-9로부터 Poly-β-Hyroxybutyrate의 생산 및 폐액의 처리

손홍주,이상준 한국미생물생명공학회 ( 구 한국산업미생물학회 ) 1996 한국미생물·생명공학회지 Vol.24 No.3

본 연구는 국내 주정공장에서 배출되는 주정증류 폐액을 생물전환 공정을 통하여 PHB의 생산에 이용함과 동시에 COD 제거 효율에 따른 폐수처리 효과를 얻는데 그 목적을 두었다. 주정증류 폐액에서 PHB를 생산하는 공시균 Actinobacillus sp. EL-9의 주정증류 폐액에서의 PHB 생산과 주정증류 폐액에서의 COD제거효과에 대해서 시험한 결과는 다음과 같다. 주정증류 페액 원액에 포도당 0.5%, NH_4NO_3 0.05% 첨가시 PHB 축적율이 향상되었으며, 효소 가수분해한 주정증류 폐액에서 가장 높은 PHB 축적율을 보였다. 또한 주정증류 폐액에서의 PHB 생산량은 1.9 g/l이었다. 균체 생육과 PHB 생산에 따른 주정증류 폐액의 COD 제거효율은 배양 24시간만에 약 54%를 나타내었다. Alcoholic distillery wastes are utilized as dual purposes to produce PHB in lower production cost and to reduce the amount of waste to be treated. In this study, various attempts were made to increase PHB production under various conditions by Actinobacillus sp. EL-9 in a shaker culture. The addition of glucose, NH_4NO_3 to alcoholic distillery wastes slightly promoted cell mass and PHB production. Enzyme hydrolysis of alcoholic distillery wastes increased the production of PHB than that of untreated waste and acid hydrolysis treatment. The PHB weight in alcoholic distillery wastes was 1.91 g/l. Fermentation process of PHB production reduced the amount of COD value p to 54%, which reduced organic loading rate and capacity of activated sludge system.

Pseudomonas sp. JH007에 의한 DL-2-Chloropropionic Acid로부터 D-Lactic Acid의 생산

정자헌,황인균,방원기 한국미생물생명공학회 ( 구 한국산업미생물학회 ) 1996 한국미생물·생명공학회지 Vol.24 No.3

DL-2-chloropropionic acid로부터 D-lactic acid를 생산하기 위하여, 토양으로부터 DL-2-chloropropionic acid를 유일한 탄소원 및 에너지원으로 이용할 수 있는 균주 80여종을 분리하였으며, 분리균주들로부터 DL-2-chloropropionic acid로부터 D-lactic acid 생산성이 우수하며, L-lactic acid를 생산성이 우수하며, L-lactic acid를 생산하지 않은 균주 JH-007을 선별하여 Pseudomonas sp.로 동정하였다. DL-2-chloropropionic acid로부터 D-lactic acid를 생산하기 위한 최적 조건을 조사하기 위하여 3 g/l의 DL-2-chloropropionic acid가 포함된 LB 배지에서 배양하여 수확한 후 수확된 균체를 효소원으로 사용하였다. D-lactic acid 생산시 최적 반응액 조건은 125 mM sodium carbonate buffer에서 휴지균체 10 g/l와 3 g/l의 DL-2-chloropropionic acid를 사용할 때였으며, 최적 반응 pH는 10.0, 최적반응 온도는 30℃이었다. 최적조건하에서 반응액에 1 g/l의 DL-2-chloropropionic acid를 간헐적으로 첨가하여 5시간 반응시켰을 때 5.72 g/l의 D-lactic acid가 생산되었으며, 전환율은 98.4%였으며, 광학순도는 99.8%이었다. For the production of D-lactic acid from DL-2-chloropropionic acid, about 80 strains of bacteria capable of assimilating DL-2-chloropropionic acid as a sole carbon and energy source were isolated from the soil. JH-007 strain that showed the higest productivity of D-lactic acid and didn't produce L-lactic acid from DL-2-chloropropionic acid was selected from them and identified as Pseudomonas sp. The optimal conditions for the production of D-lactic acid from DL-2-chloropropionic acid were examined. The resting cells of JH-007 cultured in LB medium containing 3 g/l of DL-2-chloropropionic acid were used as an enzyme source. The reaction mixtures for the maximal production of D-lactic acid were consist of 10 g/l of resting cells and 3 g/l of DL-2-chloropropionic acid in 125 mM sodium carbonate buffer. The optimal pH for the reaction was 10.0 and the optimal temperature was 30℃. When 1 g/l of DL-2-chloropropionic acid was added intermittently to the reaction mixture under the above condition, 5.72 g/l of D-lactic acid was produced after incubation of 5 hrs. This amount of D-lactic acid corresponded to a 98.4% yields and the optical purity was 99.8%.

TFSCAN 검색 프로그램 TFSCAN의 개발

이병욱,박기정,김기봉,박완,박용하 한국미생물생명공학회 ( 구 한국산업미생물학회 ) 1996 한국미생물·생명공학회지 Vol.24 No.3

TFD는 기능이 알려진 짧은 DNA sequence(signal)들과 그와 연관된 저널 자료로 구성된 데이타베이스이다. 임의의 DNA에서 이 데이타베이스의 sequence들을 검색하여 signal을 찾는 프로그램으로 Dan S. Prestridge가 개발한 SIGNAL SCAN이라는 프로그램이 사용되고 있는데, 이는 간단한 문자열 비교 알고리즘을 사용한다. 본 연구에서는 계산상 보다 효율적인 검색을 위해서, TFD의 sequence를 검색하기 위한 automata를 구성하는 프로그램과, 이 automata에 따라 signal을 검색하도록 하는 TFSCAN이라는 프로그램을 개발하였다. 검색된 signal에 대한 관련 문헌의 검색에서도 인덱싱 방법을 이용하여 계산 속도를 향상시켰다. 프로그램의 사용을 단순화시켰고, 결과 내용을 signal과 관련된 모든 정보를 일목요연하게 보여줄 수 있도록 구성하였다. 이 프로그램을 Web을 통해서도 사용할 수 있도록, GINet Web 서버에 TFSCAN 입력용 form과 CGI 프로그램을 개발·설치하였다. 본 연구의 특정 Motif 패턴으로 구성된 데이타베이스 검색에서, automata를 응용한 알고리즘을 이용하여 계산상 급격히 향상된 결과를 얻을 수 있음을 알 수 있었는데, 이는 생물학의 여러 패턴 검색에 응용될 수 있을 것이다. 더욱 민감한(sensitive) signal 검색을 위해서, 이와 같이 automata를 활용하고, 이 automata를 최적화하는 알고리즘 연구를 계속하고 있다. TFD is a transcription factor database which consists of short functional DNA sequences called as signals and their references. SIGNAL SCAN, developed by Dan S. Prestridge, is used to determine what signals of TFD may exist in a DNA sequence. This program searches TFD database by using a simple algorithm for character string comparison. We developed TFSCAN that aims at searching for signals in an input DNA sequence more efficently than SIGNAL SCAN. Our algorithms consist of two parts, one constructs an automata by scanning sequences of TFD, the other searches for signals through this automata. Searching for signal-related references is radically improved in time by using an indexing method. Usage of TFSCAN is very simple and its output is obvious. We developed and installed a TFSCAN input form and a CGI program in GINet Web server, to use TFSCAN. The algorithm applying automata showed drastical results in improvement of computing time. This approach may apply to recognizing several biological patterns. We have been developing our algorithm to optimize the automata and to search more sensitively for signals.

임신부 뇨로부터 정제된 인간 상피세포 증식 인자 유사체의 in vitro bioassay 및 특성

박세철,전재현,남정현,권태종,고인영,유광현 한국미생물생명공학회 ( 구 한국산업미생물학회 ) 1996 한국미생물·생명공학회지 Vol.24 No.4

벤조산흡착, 음이온 교환수지, 단일클론항체을 이용한 immunoaffinity chromatography를 통하여 임신부 뇨로부터 천연의 hEGF를 정제하였다. 정제된 hEGF는 μ Bonda C_18 column을 사용한 HPLC 분석을 통하여 4개의 fraction으로 분리가 가능하였으며 western blot과 double immunodiffusion 실험 결과, 각각의 fraction이 hEGF의 특성을 가진 유사체인 것을 알 수 있었다. 또한 hEGF 표준 물질과의 spiking 및 아미노산 분석 등을 통하여 두 번째 fraction이 nhEGF와 동일한 것으로 확인하였다. nhEGF 및 그 유사체의 생물학적 활성 비교를 위하여 NIH 3T3 세포주에서 5'-Brdu incorporation 측정을 위한 labelling 시간, 혈청 농도의 최적 조건을 결정하였다. NIH 3T3 세포주의 DNA 합성능은 0.2% FCS가 포함된 저혈청 배지에서 hEGF가 0.1~10 ng/ml 농도로 첨가하였을 때 증가하는 경향을 나타냈다. HPLC를 통하여 분리된 두번째 hEGF 유사체가 다른 유사체보다도 생물학적인 활성이 우수하였으며, rhEGF 표준물질과의 spiking 및 아미노산 서열 분석등을 통하여 nhEGF로 밝혀졌다. 임신부의 뇨의 hEGF 유사체 함량중 natural hEGF는 46%이었다. Natural human epidermal growth facto (nhEGF) was purified from pregnant human urine by benzoic acid adsorption, DEAE-Sepharose ion exchange, and immunoaffinity chromatography. The purified nhEGF was further separated into four fractions using Bondapak C_18 HPLC system. Following characterization by Western blot and double immunodiffusion, we found that each fraction corresponds to four derivatives of the nhEGF. For biological analysis of nhEGF, we optimized the labeling time and serum concentration for the incorporation of 5-bromo-2'-deoxy-uridine (BrdU), a non-radioactive alternative for [^3H]-thymidine uptake, into NIH 3T3 cells. The DNA synthesis of NIH 3T3 cells was gradually increased at the nhEGF concentrations between 0.1~10 ng/ml in the Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) containing 0.2% Fetal calf serum (FCS). When we assayed the biological activity of four fractions, the activity of the second fraction was superior to that of the others.

Escherichia coli에서 발현된 재조합 인간 상피세포 증식인자의 정제 및 특성

박세철,유광현 한국미생물생명공학회 ( 구 한국산업미생물학회 ) 1996 한국미생물·생명공학회지 Vol.24 No.4

E. coli BL21(DE3, pYHB101)을 이용한 rhEGF의 최적 생산조건은 25℃, 48시간 배양에서 변형된 MBL 배지에 glucose를 10g /l 첨가한 배지로 배양한 경우이었고 유도물질로 1mM IPTG를 사용하여 2시간 배양 후에 유도 배양하였을 때 최대 rhEGF가 68.7 mg/l가 발현되었다. 배양액으로부터 Amberlite XAD-7, ultrafiltration, DEAE Sepharose column chromatography 정제 과정을 거쳐 rhEGF가 정제되었으며 이때 정제도는 267배이었으며 66.6%의 회수율을 보였다. 정제된 rhEGF는 HPLC 분석 결과 2개의 분획으로 나누어졌으며 N말단 아미노산 서열 분석결과 Asn-Ser-Asp-Ser-Glu-Cys-Pro-Leu-Ser-His로 나타났다. 또한 5'-bromo-2'-deoxy-uridine (BrdU)의 삽입에 의한 DNA 생성능을 조사하였다. 상기의 결과로 E. coli BL21(DE3, pYHB101)에 의하여 생산된 rhEGF는 nhEGF와 동일한 것으로 추정되었다. Recombinant human epidermal growth factor (rhEGF) was produced strain was cultured at 25℃ for 48 hours in the modified MBS medium containing 10 g/l glucose with 1 mM IPTG induction at 2 hours after inoculation. The rhEGF was purified upto 267 folds by Amberlite XAD-7 chromatography, ultrafiltration, and DEAE Sepharose fast fow ion exchange chromatography with an overall yield of 66.6%. The purfied rhEGF was further separated into two fractions by HPLC. The N-terminal amino acid sequence of the second fraction was Asn-Ser-Asp-Ser-Glu-Cys-Pro-Leu-Ser-His. The effect of rhEGF on the DNA synthesis was examined using in vitro biological assay based on the incorporation of 5'-bromo-2'-deoxy-uridine (BrdU). The purified rhEGF shows no difference with natural human epidermal growth factor (nhEGF) in N-terminal amino acids residues and biological activity. From the results, we concluded that rhEGF produced from E. coli harboring the plasmid pYHB101 was apparently the same as nhEGF.

Micromonospora sp. SA-246 균주가 생산하는 Isochromanequinone계 항생물질

여운형,윤봉식,황경숙,이정욱,유승헌 한국미생물생명공학회 ( 구 한국산업미생물학회 ) 1996 한국미생물·생명공학회지 Vol.24 No.3

저영양성 미생물을 선택적으로 분리, 배양하여 새로운 생리활성물질을 탐색하던 중 SA-246 균주가 강한 항균활성 및 암세포주에 대한 세포독성을 나타내는 것을 발견하였다. SA-246 균주의 동정을 위하여 배양적, 형태적, 생리적 특성을 ISP 방법에 따라 조사한 결과 Micromonospora 層에 속하는 것으로 동정하였으며 따라서 Micromonospora sp. SA-246으로 명명하였다. 배양액으로부터 용매추출, silica gel column chromatography, preparative TLC, HPLC등에 의하여 활성물질을 분리, 정제하였으며 UV 흡수, mass, NMR spectrum의 분석 결과 본 활성물질을 crisamicin A로 동정하였다. 화합물 SA-246은 그람 양성 세균에 항균활성을, 폐암세포주(A549), 난소암세포주(SK-OV-3), 피부암세포주(SK-MEL-2), 신경암세포주(XF498), 대장암세포주(HCT15)에 세포독성을 나타내었다. In the course of screening for new bioactive compounds from oligotrophs in soil, a microorganism, designated as SA-246 and now identified as Micromonospora sp., has been shown to produce a strong antibacterial compound. The active compound was purified form broth filtrate by ethylacetate extraction, silica gel column chromatography, preparative TLC and HPLC, and was identified as crisamicin A based on mass and NMR spectral data. The compound SA-246 exhibited not only strong antibacterial activity against Gram-positive bacteria but also cytotoicity against cancer cell lines such as A549 (lung), SK-OV-3 (ovarian), SK-MEL-2 (melanoma), XF498 (central nervous system) and HCT15 (colon).

Yarrowia lipolytica TH65가 생산하는 Alkaline Proteinase의 정제 및 특성

유춘발,김창화,진영호,진익렬 한국미생물생명공학회 ( 구 한국산업미생물학회 ) 1996 한국미생물·생명공학회지 Vol.24 No.3

최적조건에서 생산한 효소를 40~65% ammonium sulfate 분획, DEAE-cellulose chromatography, Sephadex G-100과 Sephadex G-75 gel filtration을 이용하여 수율 14%, 15배 정제하였다. 정제효소의 분자량은 SDS-PAGE로 측정한 결과 31,500 정도였고, 최적온도와 최적 pH는 각각 40℃와 8.5~9.0이었다. 대부분의 2가 금속이온은 효소활성을 저해하였으며, 특히 Hg^2+, Zn^2+, Co^2+ 등은 강하게 저해하였다. PMSF는 효소활성을 완전히 저해시켰으며, EDTA, EGTA 및 phenanthroline은 부분적으로 저해시켰으나 Ca^2+을 첨가하면 모두 효소활성이 복원되는 것으로 나타나 metalloprotease는 아닌 것으로 생각되었다. 이상의 결과로 보아 본 효모 Yarrowia lipolytica TH65가 생산하는 효소는 alkaline serine proteinase로 생각된다. An alkaline proteinase produced by Yarrowia lipolytica TH65 was purified by 40~65% ammonium sulfate fractionation, DEAE-cellulose chromatography, and gel filtration with Sephadex G-100 and Sephadex G-75. The purified enzyme was shown as a single ban on SDS-PAGE, and its molecular weight 31,500. Optimum temperature and pH were 40℃ and 8.5~9.0, respectively, and the enzyme was stable below 40℃ and in the pH range of 6~8. The enzyme was strongly inhibited by divalent ions, completely by PMSF, and partially by EDTA, EGTA, and phenanthroline. But the inhibitory effect in the presence of EDTA, EGTA and phenanthroline could be reversed by addition of Ca^2+. Thus, these results indicated that the purified enzyme was an alkaline serine proteinase (E.C. 3.4.21.14).

Streptomyces sp. YJB-599가 생산하는 Genistein의 분리 및 정제

함병권,배동훈,유주현 한국미생물생명공학회 ( 구 한국산업미생물학회 ) 1996 한국미생물·생명공학회지 Vol.24 No.3

토양으로부터 세포독성물질을 생산하는 strain No. 5-99 균주를 분리하였다. 본 균주의 세포벽 성분의 diaminopimelic acid(DAP)와 아미노산을 분석하여 본 결과, LL-DAP만을 함유하고 있었고, glycine이 검출된 것으로 보아 glycine으로 연결된 peptide를 가지는 peptidoglycan type A3이고 cell wall chemotype Ⅰ의 방선균인 Streptomyces sp.로 확인되었다. 따라서 본 균주를 Streptomyces sp. YJB-599라 명명하였다. 본 균주가 생산하는 활성물질은 용매추출 및 silica gel column chromatography를 이용하여 정제되었으며, 최종적으로 침상의 백색결정으로 분리하였다. 기기분석과 database로 구조분석을 행한 결과, 본 물질은 genistein으로 밝혀졌다. A cytotoxic material was produced by strain No. 5-99 which was isolated from soil. Analyzing the cell wall components, LL-diaminopimelic acid was identified. From the existance of glycine in the cell wall, this strain was identified to Streptomyces sp. which has cell wall chemotype I and peptidoglycan type A3 connected by glycine. So, we named this strain to Streptomyces sp. YJB-599. The Active material was purified through solvent extraction, silica gel column chromatography and crystallized to needle-shaped white crystal. Analyzing the structure of this crytal by instrumental analysis and database, it was determined to genistein.

Chitosan이 사과 겹무늬썩음병균 Botryosphaeria dothidea의 생육에 미치는 영향

이승지,엄재열,이용현 한국미생물생명공학회 ( 구 한국산업미생물학회 ) 1996 한국미생물·생명공학회지 Vol.24 No.3

고분자물질에 의한 사과 겹무늬썩음병 방제법을 개발함에 있어서 chitosan을 코팅용 소재로 활용하기 위하여, 사과 겹무늬썩음병균인 Botryosphaeria dothidea에 대한 Chitosan의 항진균활성을 고체배양 및 액체배양 조건하에서 검토하였다. Chitosan은 고체배양시 B. dothidea의 균사생장억제, 자라난 균사의 응집, 균사의 팽윤 및 세포의 미세구조의 변화를 유발하였다. 액체배양실험 결과 chitosan은 낮은 농도에서도 강력한 균체생육 억제효과를 보였으며, 1.0mg/ml의 첨가농도에서 90% 이상의 억제효과를 나타내었다. 또한 균사의 신장과정에 영향을 미쳐 균사체의 응집현상이 관찰되었다. 또한 chitosan이 포자의 발아를 지연시켰을 뿐만 아니라 발아관의 형태적 변화를 유발시켰다. 단량체인 glucosamine은 glucosamine은 B. dothidea의 생육저해를 유발하지 않았으며, 항진균 활성은 chitosan polymer에 의한 것임을 알았다. To examine the potential utilization of chitosan, the biodegradable natural ploymer, as a control agent of apple white rot caused by Botryosphaeria dothidea in a new control measure by coating it on the diseased branches, the various antifungal activites of chitosan was investigated. Chitosan showed significant inhibitory effect on the mycelial growth of B. dothidea, along with the morphological changes including hyphal swelling and ultrastructural changes on solid PDA medium. In liquid PD broth medium, the chitosan showed more significant effect on the growth of B. dothidea also forming cell clusters indicating affection on the hyphal extension. The growth of B. dothidea was inhibited more than 90% at the concentration of 1.0 mg/ml. Chitosan also detained the spore germination and induced the morphological change of germ tubes. Glucosamine, monomer of chitosan, did not affect on the growth of B. dothidea indicating the antifungal activity was caused by chitosan polymer.