고용량 항암요법 및 자가 조혈모세포 이식을 시행받은 유방암 환자에서 미세진행암 검색을 위한 Cytokeratin-19 검사의 의의

정재화,정희정,이규택,박성규,원종호,백승호,서원석,홍대식,박희숙,이민혁 대한조혈모세포이식학회 2000 대한조혈모세포이식학회지 Vol.5 No.2

배경:1978년 악성 림프종에서 처음으로 자가골수이식이 성공적으로 수행된 후 자가골수이식이 급속도로 증가하여 최근에는 동종골수이식보다 더 많이 시술되고 있다. 이러한 자가 조혈모세포이식은 유방암 환자에서 최근 그 빈도가 증가하고 있는 추세이나 자가이식의 잠재적인 한계인 골수나 말초 조혈모세포 수집으로부터 얻은 오염된 조혈모세포의 재주입의 가능성 여지가 있다는 것이 문제점으로 지적되고 있다. 최근 자가 조혈모세포이식에 따른 잔존 세포암에 대한 중요성이 증가되어져 왔고 이는 잔존 암세포를 발견할 수 있는 분자적 기술의 발전에 기인하고 있다. 유방암 환자에 있어 정상 혈액 단핵구내 유방암 세포 발견을 위해 cytokeratin-19 (CK-19) mRNA와 epithelial growth factor receptor는 민감도와 특이도가 뛰어난 표지자로 알려져 있다. 최근에 세포 특이 단백질에 대한 mRNA를 RT-PCR에 의존한 검사로서 10^(7)개의 정상세포중 최소 1개의 tumor cell을 발견할 수 있게 되었다. 본 연구에서는 autograft 내의 유방암 세포의 발견을 위한 RT-PCR 방법의 민감도를 평가하고 CK-19에 대한 RT-PCR 검사 양성인 말초혈액 내 암세포의 존재와 임상양상 결과를 비교 분석하였다. 방법:1996년 9월부터 1999년 12월까지 순천향대학병원에서 입원하여 고용량 항암요법 및 자가 조혈모세포 이식을 시행받은 환자들을 대상으로 하였다. 이들 총 13명의 환자중에서 10개 이상의 림프절 양성을 보이는 고위험군 유방암 환자가 6명이었고 재발성 유방암 환자가 7명이었다. 대상환자들에게 2번의 FAC 요법이후 mobilization으로 doxorubicin, paclitaxel 및 GM-CSF를 투여하였고 전처치로는 thio-tepa, carboplatin, mitoxantrone을 사용하였다. Mobilization 이후 채취한 조혈모세포의 일부를 이용하여 CK-19에 대한 RT-PCR을 시행하였다. 결과:RT-PCR의 민감도는 유방암 세포주인 MCF-7을 이용하였을때 정상 골수세포 100만개 중 1개의 MCF-7 세포가 존재하여도 RNA가 증폭되는 결과를 얻음으로써 감수성은 1:10^(6)의 비를 보였다. CK- 19에 대한 RT-PCR 결과는 13명의 환자 중 2명에서 CK-19 양성 소견을 보임으로써 15.4%의 양성률을 보였다. 2명의 환자는 모두 재발된 유방암 환자군에 속했으며 이중 1명은 1번에서만 CK-19 양성 소견을 보였고 나머지 한명은 2번 모두 apheresis 내에 CK-19 mRNA를 포함하고 있었다. 또한 전체 생존율을 비교하였을 때 고위험군에서 2년 생존율이 52.6%, 재발된 군에서 19.1%가 관찰되었으나 PCR 양성인 2명의 재발환자는 각각 4개월과 16개월째 사망하였다. 결론:고위험군과 재발된 유방암 환자에서 고용량 항암요법 및 자가조혈모세포 이식은 비교적 안전하며 잠재적 이득이 있는 치료법이다. 유방암 환자의 말초혈액 조혈모세포 내에 미세 잔존암 여부를 확인 위해 시행한 cytokeratin-19에 대한 RT-PCR은 특이도와 민감도가 뛰어난 검사이며 말초혈액 조혈모세포 내 잔존 암세포의 존재는 무병 생존률이나 전체 생존율을 감소시키는 경향을 보여 향후 유방암에서 조혈모세포이식을 시행할 때 잔존 암세포의 검색을 시행할 필요가 있을 것으로 생각되며 채집된 조혈모세포 내에 오염되어 있는 암세포의 제거 방법의 개발이 필요할 것으로 생각된다. Background:Breast cancer is a chemosensitive tumor and dose intensification might improve the disease-free survival and cure rates in high risk and relapsed breast cancer patients with poor prognosis. Autologous peripheral blood stem cells (PBSCs) provide accelerated hematopoietic recovery after myeloablative and myelosuppressive chemotherapy. The appreciation of the importance of minimal residual disease has been associated with a dramatic increase in reports describing application of technology to detect minimal disease, especially molecular techniques based primarily on the polymerase chain reaction. Cytokeratin-19 mRNA and epithelial growth factor receptor mRNA were shown to be highly specific and sensitive markers for the detection of breast cancer cells within normal peripheral blood mononuclear cells. The purpose of this study is to establish a sensitivity of RT-PCR assays for the detection of breast cancer cells within autografts and to evaluate the correlation between clinical outcome and the presense of tumor cells in PBSCs that positively reacted to RT-PCR assays. Methods:A cytokeratin-19 (CK-19) specific-nested RT-PCR assay was developed andoptimized by using limited dilutions of the MCF-7 breast cancer line mixed with normal bone marrow cells. The optimized assay was then used to examine PBPCs samples obtained from 13 patients with high risk and relapsed breast cancer. Results: In the sensitivity, CK-19 expressing tumor cells were detected in the mixture of 10 MCF-7 cells in 10^(7) normal bone marrow cells. Two patients of 13 (15.4%) scored positive to CK-19 in PBSCs with breast cancer, indicating minimal residual disease. Two patients with relapsed breast cancer with positive of CK-19 were died at 4 and 16 months after PBSCT. Conclusion: RT-PCR of cytokeratin-19 assay is a sensitive, specific and rapid method for the detection of minimal residual cancer cells within PBSCs in breast cancer patients. The presence of minimal residual tumor in PBSCs was trending toward short median disease-free survival and overall survival and this assay can be used for detection of cancer cells in harvested PBSCs in breast cancer patients with high dose therapy with autologous PBSCT.

동종골수이식 후 Variable Number of Tandem Repeat 다형성을 이용한 생착의 확인과 키메리즘 양상의 감시

안진석,박영이,정철원,양성현,이숭덕,이정빈,박선양,김병국 대한조혈모세포이식학회 2002 대한조혈모세포이식학회지 Vol.7 No.1

연구배경: 성공적인 동종골수이식 후 조혈세포는 공여자에서 유래하는 세포로 완전 대치된다. 따라서 키메리즘을 분석하는 것이 이식의 생착과 실패를 조기에 발견하는 데 도움을 줄 수 있다. 그러나 환자 세포와 공여자 세포가 혼재하는 혼합 키메리즘이 지속되어도 생착과 무병생존이 가능하므로 그 임상적 의미에 대한 규명이 필요하다. 한편 VNTR은 다형성이 높아 개체 감별력이 우수하다. 저자들은 VNTR에 대한 PCR 조건을 확립하고 이식 초기의 생착 확인과 이식 후 환자의 추적 조사에서의 유용성을 알아보고자 하였다. 방법: 각종 혈액질환으로 동종골수이식을 받은 50명의 환자를 대상으로 하였다. 이식 전에 환자와 공여자의 혈액을 채취하였다. 이식 후 첫 1개월 동안에는 1주 간격으로, 이후로는 수개월 간격으로 환자의 혈액 혹은 골수를 채취하였다. 혈액 혹은 골수의 단핵세포층에서 DNA를 분리하여 D1S80, D17S5, ApoB, vWF, MBP, TC-11, Col2A1 유전자자리에 대한 PCR을 시행하였다. 증폭 생성물은 4% 폴리아크릴아미드겔에서 전기영동 후 은염색으로 확인하였다. 결과: 환자와 공여자 50쌍 모두에서 정보를 제공하는 유전자자리를 확인하였다. 50명 중 46명이 1개월 내에 공여자 완전 키메리즘으로 전환되었다. 1개월 내에 완전 키메리즘으로 전환되지 않은 환자 4명 가운데 2명은 이식 거부, 1명은 질환의 재발을 보였고, 1명은 관해 상태로 1년 후 완전 키메리즘으로 전환되었다. 이식 후 추적기간 동안 질환이 재발한 10명 중 9명에서 사전에 혼합 키메리즘을 발견하지 못한 반면 경과 중 일시적 혼합 키메리즘을 보였던 5명의 백혈병 환자는 재발 없이 관해를 유지하고 있었다. 결론: 동종골수이식에서 VNTR에 대한 PCR은 공여자와 환자 세포의 감별, 이식 초기의 생착 및 이식 거부의 확인에 유용한 검사 방법이었다. 추적 기간 중 혼합 키메리즘의 의미에 대해서는 더 많은 연구가 필요할 것으로 생각한다. Background: After successful allogeneic bone marrow transplantation (BMT), Donor cells replace patient's hematopoietic cells. Therefore, it is useful to evaluate chimerism for the early detection of engraftment and graft failure. However persistence of host cells, so called mixed chimerism, can be compatible with engraftment and prolonged disease-free survival. So, it is necessary to document the significance of mixed chimerism. Variable number of tandem repeat (VNTR) is very polymophic and excellent marker for individual identification. We intended to establish the PCR condition for VNTR and the usefulness of VNTR in the early documentation of engraftment and monitoring of chimerism after BMT. Methods: Fifty patients who were treated with allogeneic BMT for hematologic diseases were studied. Blood samples of both patient and donor were drawn before BMT. Blood or marrow samples from patient were drawn with 1-week interval during the first month and a few month intervals thereafter. DNA was extracted from mononuclear cells of blood or bone marrow and amplified by PCR for D1S80, D17S5, ApoB, vWF, MBP, TC-11, and Col2A1. The amplified product was separated on 4% polyacrylamide gel and was confirmed by silver staining. Results: We identified the informative loci in all 50 patient/ donor pairs. Forty-six out of 50 had complete chimerism within 1 month after BMT. Of 4 patients who did not achieve complete chimerism within 1 month, 2 developed graft rejection, 1 developed disease relapse, and 1 was in complete remission and achieved delayed complete chimerism after 1 year. While we could not find mixed chimerism beforehand in 9 out of 10 patients who developed relapse after BMT, 5 leukemic patients who showed temporary mixed chimerism during follow-up period sustained complete chimerism without relapse. Conclusion: PCR amplification of VNTR is a useful method for the identification of cell origin between patient and donor, thus, early documentation of engraftment or graft failure. More studies with regular follow up are needed to evaluate the significance of mixed chimerism after BMT.

조혈모세포이식 환자에서의 기계 환기의 위험 인자 : Assessment of Risk Factors

안중경,이홍기,황정혜,박세훈,이효락,송서영,이순일,박준오,김기현,김원석,정철원,임영혁,강원기,박근칠 대한조혈모세포이식학회 2002 대한조혈모세포이식학회지 Vol.7 No.1

연구배경: 조혈모세포이식을 시행한 환자에서 집중 치료 시 예후가 매우 나쁜 것으로 알려져 있고, 기계 환기는 강력한 사망 예측 인자로서 보고되고 있다. 그러나 현재까지 이식 환자에서 기계 환기의 위험 인자를 밝힌 연구는 매우 드물다. 따라서 기계 환기를 시행한 조혈모세포이식 환자의 임상적 특징을 살펴보고 기계 환기에 대한 위험 인자를 알아보고자 하였다. 방법: 삼성서울병원에서 조혈모세포이식을 시행한 환자 중 기계 환기를 시행한 23명과 기계 환기를 시행하지 않은 142명을 대상으로 후향적 연구를 시행하였다. 기계 환기에 대한 위험 인자의 여부에 관해서는 chi-square 또는 Fisher's exact 검정을 시행하였으며 기계 환기에 대한 각 위험 인자의 영향에 관해서는 다중로지스틱 회귀분석을 시행하였다. 결과: 기계 환기를 시행한 23명의 환자 중 30일째 생존자는 1명이었고 6개월째 생존율은 0%였다. 생존자와 사망자 모두에서 다기관 기능부전이 관찰되었으며, APACHE II 점수와 SAPS II 점수에 의한 예측 사망률은 각각 56%, 59%였다. 조혈모세포이식 후 기계 환기의 위험 인자로는 선행 질환이 혈액질환, 부분불일치 동종이식, 간정맥폐색성질환, 이식 전 질병 상태가 재발하였거나 약물에 반응하지 않는 경우였다. 다중로지스틱 회귀분석 결과 기계 환기의 위험 인자로 통계적으로 유의한 차이를 나타낸 것은 단지 부분불일치 동종이식을 시행한 경우였다. 결론: 현재까지 조혈모세포이식 환자에서 집중 치료의 역할에 대해서는 확실히 정립되어 있지는 않으며, 이식 환자에서 기계 환기는 강력한 사망 예측 인자이다. 따라서, 조혈모세포이식을 시행한 환자에서 기계 환기의 위험 인자와 불량한 예후 인자를 고려하여 기계 환기 여부에 대한 신중한 결정을 내려야 한다. Background: Respiratory failure requiring mechanical ventilation is a frequent, critical complication of hematopoietic stem cell transplantation (HSCT). Patients who require mechanical ventilatory support after HSCT generally have a very poor prognosis. Mechanical ventilation in HSCT recipients is a strong predictive factor of mortality. The objectives of this study are to describe clinical characteristics of HSCT recipients undergoing mechanical ventilation and to identify the risk factors for mechanical ventilatory support after HSCT. Methods: We performed a retrospective chart review of all patients >15 yrs old who received HSCT at Samsung Medical Center and subsequently required mechanical ventilatory support between 1996 and 2001. Results: Thirty-day mortality rate in HSCT recipients undergoing mechanical ventilation was 95.6%. The mean predictive mortality rates of APAHCE II score and SAPS II score were 56% and 59%, respectively. Reasons for mechanical ventila-tion were sepsis (47.8%) followed by fungal infection (13%) and diffuse alveolar hemorrhage (8.7%). Univariate analysis identified relapsed or refractory diseases at HSCT, hematologic disease, hepatic venoocclusive disease and allogeneic or HLA-mismatched transplant as significant risk factors for mechanical ventilation. On multivariate logistic regression analysis, only allogeneic mismatched transplant remained significant. Conclusion: Overall outcome of HSCT recipients undergoing mechanical ventilation is very poor. Therefore, the risk factors and the poor prognostic factors for mechanical ventilation should be taken into account in making further treatment decision for HSCT recipients requiring mechanical ventilation.

미니동종 조혈모세포 이식에서 T림프구 수용체 단클론성 항체의 이용 가능성 및 혼합 림프구 배양에서 림프구 억제효과에 대한 연구

손상균,박성원,백진호,김동환,정진태,현동우,곽동석,이재태,이규보 대한조혈모세포이식학회 1999 대한조혈모세포이식학회지 Vol.4 No.2

연구배경: 조혈모세포이식 및 조건화 치료는 원발성 질환을 제거 후 새로운 조혈세포를 이용한 공간을 마련하고 세포의 생착을 이름으로써 치료의 목표를 달성하고자 하나 심한 부작용으로 인한 높은 조기 사망률은 극복하여야 할 점이다. 저독성 조건화 처치를 하면 불충분한 면역세포의 살해로 인한 거부반응이 큰 문제가 된다. 이에 거부반응 및 이식편대숙주반응의 중요한 역할을 하는 림프구에 대한 억제작용을 갖는 단클로성 항체의 생체 내에서 효과를 추측하기 위해 DLA(Dog lymphocyte Antigen) mismatched dog의 말초혈액을 이용한 MLC assay를 시행하였다. 방법: DLA typing의 결과와 비교하기 위해 단클론성 항체 첨가 없이 DLA가 서로 다른 3마리의 말초혈액을 이용하여 서로의 MLC 반응을 비교 실험하였다. T림프구 수용체에 대한 단클론성 항체의 농도에 따른 proloferation 억제효과를 보기 위해 2, 10, 20, 200ug/ml의 농도로 DM5 (antigranulocyte antbody: 음성 대조군)와 비교하였다. 항원에 감작된 림프구에서의 D5에 대한 효과를 보기위해 장기 골수 배양 배지에서 responder를 stimulator 및 D5와 함께 3일간 배양후 세척하고 2일간의 배양후 다시 stimulator로서 재자극 후 5일 뒤에 proliferation assay를 시행하였다. 실제 이식을 시행한 donor 및 recipient의 세포를 분리하여 proliferation assay를 하여 이식 전후를 비교하였다. 결과: T림프구 수용체에 대한 단클론성 항체의 농도를 달리한 실험에서 2, 10 ,20ug/ml 모두에서 같은 농도의 DM5는 억제효과가 없는데 비해상 당한 림프구증식 억제효과가 관찰되었다. In vivo 실험에서 중용량의 방사성 치료 및 면역 억제 요법으로 DLA matched 2마리 모두에서 성공적인 생착을 확인하였다. 공여자의 mismatched sample에 대해 G-CSF를 이용한 가동화 치료전 보다 낮은 proliferation score를 보였다. 결론: T림프구 수용체에 대한 단클론성 항체는 In vitro 실험에서 T림프구의 억제효과가 관찰되었고 동물 이식에서 부작용을 줄이는 저용량의 조건화 치료 후 생착을 유도하는 면역억제제로서 그 가능성을 확인하였고 향후 그 기전에 대한 연구 및 많은 생체 실험이 필요하다고 생각된다. 재생불량성 빈혈 같은 저세포 충실도의 골수 질환이나 과거에 방사선 치료를 심하게 받은 경우는 이미 골수 내 생착을 위한 공간이 마련된 상태이므로 특별한 면역억제 요법이 가능하다면 이러한 저독성의 조건화 처치가 유용하게 응용될수 있을 것으로 전망된다. Background: The objective of this study was to evaluate the effect of anti-TCR monoclonal antibody in mixed lymphocyte culture and as a part of immunosuppressive regimens in the allogeneic stem cell transplantation. Since marrow space is empty in the patients with aplastic anemia or previous radiation and no new space for allograft needs to be created, nontoxic imminosuppressive conditioning regimens should be feasible. These may include monoclonal antibody directed against T cell receptor other surface determinants on T cell. Moncoclonal antibody (MAb) 15.9D5 raised to canine TCR α β was found to induce hyporesponsiveness to allogeneic stimulator cells in primary and secondary mixed lymphocyte culture (MLC). Methods: Anti-TCR monoclonal antibody was tested to evaluate its suppressive effect of lymphocyte activity in vitro compared with anti- granulocyte anti body and used as an immuno-suppressive agent in two recipient dogs. Four different concentration of anti-TCR MAbs was tested in MLC to know the appropriate concentration for suppressing lymphocyte proliferation, and MLC assays were serially done from blood sample of recipient dogs and donor dogs before and after transplantation. Results: Anti-TCR monoclonal antibody had significantly suppressed H3-thymidine uptake in MLC compared with anti-granulocyte antibody(control). In two recipient dogs conditioned with non-myeloablative regimens and MAb, transplanted with DLA- matched donor dogs, successful mobilizing stem cells were less reactive to the stimulator lymphocytes than the lymphocytes from the dogs not treated before. Conclusion: The precise mechanism of immunosuppression induced by anti- TCR MAb needs to be elucidated. G-CSF had a role in suppressing lymphocyte activity of donor dogs and might have a role in preventing GVHD. Non-myeloablative conditioning strategy might be useful in patients with hypoplastic marrows who require immunosuppression only (e. g. aplastic anemia) and already has some spaces for engraftment in the marrow (e. g. irradiated marrows).

동종항원 자극에 대한 제대혈 및 성인 말초혈액 단핵세포에서의 Th/Tc 및 세포독성 반응

김연우,박현진,한윤수 대한조혈모세포이식학회 2001 대한조혈모세포이식학회지 Vol.6 No.2

연구배경: 제대혈이식이 골수이식으로 치료될 수 있는 여러 질병에서 골수이식을 대체하여 시술되고 있으며, 골수이식에 비해 이식편대 숙주반응 (graft versus host disease, GVHD)이 상대적으로 적다고 보고되고 있다. 이에 대한 이유로 제대혈 T 림프구가 interferon-γ(IFN-γ)를 생성하는 능력이 저하되어 있기 때문이라는 보고들이 있었으나, 최근에 골수이식시 이식편대 숙주반응의 발생이 IFN-γ에 의해 감소한다는 사실이 보고되었다. 따라서 제대혈 T 림프구의 IFN-γ 생성 능력과 제대혈이식시 나타나는 이식편대 숙주반응의 감소와의 관계를 관찰하는 새로운 연구가 필요하다. 재료 및 방법: 성인 및 제대혈 T 림프구를 동종항원으로 자극한 후 IFN-γ 생성 정도와 세포살해능을 관찰하여 성인 및 제대혈 T 림프구의 IFN-γ 생성 정도와 그에 따른 세포살해능의 변화를 비교하고자 하였다. 또한 각각의 T 림프구를 동종항원으로 자극할 때 IFN-γ 생성 억제인자로 알려진 interleukin-4 (IL-4)와 anti- IFN-γ monoclonal antibody (MoAb)를 첨가하여 그에 따른 세포살해능의 변화를 관찰하고자 하였다. 결과: 제대혈 단핵세포를 4일 동안 동종항원으로 자극하였을 때 상층액에서 IFN-γ는 측정되지 않았으며 Th1/Th2 및 Tc1/Tc2 비율이 낮아 Th2/Tc2 세포의 우월성이 관찰되었다. 그러나 6일 동안 자극하였을 때에는 상층액에서 IFN-γ의 농도, Th1/Th2 및 Tc1/Tc2 비율이 현저히 증가하여 Th1/Tc1 세포들의 우월성이 관찰되었다. 성인의 말초혈액 단핵세포를 동종항원으로 4일 동안 자극하였을 때 제대혈 단핵세포에 비하여 상층액에서의 IFN-γ 농도와 Th1/Th2 및 Tc1/Tc2 비율이 현저히 높았으며, 6일 동안 자극하였을 때에는 상층액에서의 IFN-γ 농도는 제대혈 단핵세포에 비해 높았으나 Th1/Th2 비율은 더 낮았으며 Tc1/Tc2 비율은 거의 대등하였다. 제대혈 및 성인의 말초혈액 단핵세포 모두에서 동종항원으로 4일 동안 자극했을 때에 비해 6일 동안 자극하였을 때 세포살해능이 더 증가하였으며, 모든 경우에서 성인의 말초혈액 단핵세포에 비해 제대혈 단핵세포에서의 세포살해능이 낮았다. 동종항원으로 6일 동안 자극하였을 때 제대혈 및 성인의 말초혈액 단핵세포 모두에서 IL-4와 anti-IFN-γ MoAb를 첨가한 경우 첨가하지 않았을 때에 비해 세포살해능이 증가하였으며 그 정도는 제대혈에서 더 현저하였다. 결론: 제대혈 T 림프구는 자극되지 않았을 때에는 IL-4를 생성하는 Th2 및 Tc2 세포의 우월성을 나타내지만 동종항원으로 충분히 자극되었을 때는 Th2 및 Tc2 세포의 우월성이 소실되고 IFN-γ를 생성하는 Th1 및 Tc1 림프구의 우월성을 나타낸다는 것을 알 수 있었다. 이와 같은 동종항원 자극에 의한 제대혈에서의 우월한 Th1 및 Tc1 림프구의 생성은 성인의 말초혈액 단핵세포에 비교할 때 대등하거나 현저하였으나 이들 세포에 의한 세포살해능은 성인에 비해 낮았다. 또한 동종항원 자극시 IFN-γ 생성 억제가 세포살해능의 감소보다는 증가와 관련된 것으로 관찰되어 이식편대 숙주반응에 있어서 IFN-γ의 역할에 대해서 향후 더 많은 연구가 필요할 것으로 생각된다. Background: The reduced incidence of graft versus host disease (GVHD) following the use of human cord blood as a source of stem cells for bone marrow reconstitution challenges our understanding of the immunocompetence of newborn T cells. Although it has been reported that the reduced incidence of GVHD following cord blood transplantation is due to decreased ability of cord blood T lymphocytes to produce interferon-γ(IFN-γ), others have also reported that GVHD associated with bone marrow transplantation is suppressed by IFN-γ. So it is necessary to investigate the relationship between the ability of cord blood T lymphocytes to produce IFN-γ and lower risk of GVHD following cord blood transplantation. Methods: We examined Th/Tc and cytotoxic responses in cord and adult blood mononuclear cells after stimulation with alloantigen. We also observed the changes of cytotoxicity after stimulation of cord and adult blood mononuclear cells with alloantigen in the presence or absence of interleukin-4 (IL-4) and anti-IFN-γ monoclonal antibody (MoAb). Results: Cord blood mononuclear cells (CBMC) did not produce IFN-γ and showed very low Th1/Th2 and Tc1/Tc2 ratios after 4 days of allogeneic stimulation. However, CBMC, following 6 day stimulation, acquired the ability to secrete IFN-γ and showed marked increases in Th1/Th2 and Tc1/Tc2 ratios. In contrast, adult peripheral blood mononuclear cells (PBMC) which were stimulated with alloantigen produced substantial amounts of IFN-γ and showed markedly higher Th1/Th2 and Tc1/Tc2 ratios than CBMC. Although PBMC were found to produce more IFN-γ following 6 day stimulation, they showed lower Th1/Th2 ratio and equivalent Tc1/Tc2 ratio compared with CBMC. Following stimulation with alloantigen, CBMC and PBMC produced cytotoxicity which was more remarkable in 6 days than in 4 days. In addition, cytotoxic activities of adult blood mononuclear cells were always higher than those of cord blood mononuclear cells. Addition of IL-4 and anti-IFN-γ MoAb enhanced cytotoxic activity by 8.9% in cord blood mononuclear cells and by 5.4% in adult blood mononuclear cells when stimulated with alloantigen for 6 days. Conclusion: These results demonstrate that (a) cord blood mononuclear cells willingly differentiate to Th1 and Tc1 cells and show lower cytotoxic activity than adult blood mononuclear cells in response to allogeneic stimulation, and (b) induction of IFN-γ-producing cells is associated with lower risk of GVHD rather than higher risk of GVHD.

가동화 조혈 모세포에 대한 Interleukin-2의 활성화 효과

김현수,이종욱,양말숙,정철권,박준성,조도연,김문규,최진혁,남동기,임호영,김효철 대한조혈모세포이식학회 1999 대한조혈모세포이식학회지 Vol.4 No.1

연구배경: 자가말초조혈모세포의 이식은 고용량 항암치료후의 치명적 골수 억제의 부작용을 극복할 수 있는 좋은 수단으로 악성 혈액질환 및 각종의 고형암 환자를 대상으로 그 치료 효과가 기대되고 있다. 그러나 자가 이식은 비교적 높은 암의 재발률이 극복하여야 할 과제로 남아있다. 이러한 암의 재발률은 이식편에 오염된 자가 종양세포의 재주입과 동종이식과는 달리 이식편대종양 반응이 없어 미세 잔류암의 제거가 어렵다는 문제에 기인한다. 최근 이러한 재발의 억제를 위해 자가 이식에서 인위적으로 이식편대종양 효과를 얻고자 하는 시도가 있어 왔다. 본 연구는 가동화된 말초조혈 모세포을 대상으로 Interleukin-2(IL-2)를 이용한 림프구의 활성화 효과를 시험관 내에서 관찰하였다. 방법: IL-2 및 granulocyte macrophage-colony stilmulating factor (GM-CSF)로 가동화된 말초조혈모세포를 활성화시켜 림프구 분획의 변화와 K562 세포주에 대한 세포독성 실험을 시행하였다. 저온의 액체 질소 용기에 보고나 중인 가동화된 말초조혈모세포를 온수조에 급속 해동하여 각각 100 U/ml과 1.000 U/ml의 IL-2를 첨가하여 배양하였으며 GM-CS의 효과를 확인하기 위해 50 ng/ml을 첨가한 군과 안한 군으로 나누어 실험하였다. 배양 후 3일, 6일 14일째 활성화 림프구를 유세포 분석기를 이용하여 분석하였으며 K562 세포주에 대한 세포독성 효과를 관찰하였다. 정상인 3명의 검체를 얻어 위와 같은 방법으로 실험하여 비교하였다. 결과: 배양후 CD8^(+) 세포는 3일째부터 증가하기 시작하였으며 IL-2 1.000 U/ml 과 GM-CSF를 같이 투여한 군에서 가장 높은 증가를 보였다. 자연살상 세포는 환자군에서는 IL-2 1.000 U/ml을 투여한 군에서는 가장 높은 증가를 보였다. 세포독성 실험은 K562 세포주에 대해 3일째부터 전 조건에서 증가하였으며 IL-2 1.000 U/ml 단독 투여 군에서 가장 높은 증가를 보였다. 결론: 가동화 된 말초조혈모세포에 대한 IL-2의 효과는 1.000 U/ml 단독 투여 군에서 가장 높은 증가를 보인 것으로 판단되며 임상적 적용을 위한 배양 조건 및 기간에 적합할 것으로 생각된다. 그러나 인위적인 이식편대종양 효과로 임상적 효과를 얻기 위하여 자연살상 및 다른 면역세포의 활성화의 연구가 병용되어 사용된다면 좀더 높은 효과를 기대할 수 있을 것이다. Background: Autologous peripheral blood stem cell transplantation (AutoPBSCT) has been effectively used for reconstitution of hematopoisis following high dose chemotherapy. However, AutoPBSCT is hampered by somewhat higher incidence of disease recurrence than patients receiving allogeneic grafts due in part to reinfusion of residual tumor cells contained in the AutoPBSC and also to the lack of an graft versus tumor(GVT) effect. In the order to induce the GVT effect using AutoPBSC , the effect of Interleukin-2(IL-2) on PBSC was studied in vitro. Methods: The effect of IL-2 and GM-CSF on PBSC in subsets of lymphocyte and the cytotoxic activity against the K562 cell line were investigated. The mobilized PBSC, stored in liquid nitrogen, thawed rapidly and incubated in serum free media with IL-2 con cen trations of 100, and 1.000U/ml with or without GM-CSG of 50 ng/ml. PBSC samples from 10 patients were incubation for 3 day, 6 and 14 days and 3 sample s from heathy were incubated. At the end of incubation, samples were analyzed for the changes of immunopheotype with a flow cytometry, and examined the cytotoxic function against the K562 cell line. Results: The results were as follows. 1) After incubation, CD8 cells tended to increase from day 3 and showed higher value in the conditions cultured with IL-2(1,000 IU/ml)+ GM-CSF. 2) NK cells(CD56 cells) were higher in samples with IL-2 of 1.000 IU/ml only. 3) Cytotoxic function against K562 cell line increased at day 3 in every incubation conditions and showed the highest value in the condition cultured with IL-2 of 1.000 IL/ml (44.3% vs 10.3% of control). Conclusion: The mobilzed AutoPBSC, when incubated with IL-2 of 1,000 IU/ml for 3 days, retains antitumor potential for NK cell lysis function, Further cilnical study is necessary to elucidate the beneficial clinical activity against the autologous tumor cells for its GVT effect.

만성 골수성 백혈병의 가속기에서의 동종 골수이식

엄현석,이종욱,김동욱,박수정,서정곤,민창기,김희제,한치화,민우성,김춘추,김동집 대한조혈모세포이식학회 1998 대한조혈모세포이식학회지 Vol.3 No.2

목적: CML 환자들을 대상으로 실시한 동종 골수이식의 후향적 분석을 통해서 만성기, 가속기, 급성기에 따른 생존 기간의 차이와 가속기에 시행한 이식에서 장기 생존과 관련된 요인들을 분석하고 특히 이중에서 진단 후 이식까지의 기간에 따른 생존 기간의 차이와 전처지 방법에 따른 생존 기간의 차이를 알아보고자 하였다. 대상: 1986년 9월부터 1997년 12월까지 성모병원 가톨릭 조혈모세포이식센터에 입원하여 조직적합성 항원(HLA)이 일치하는 형제로부터 동종 골수 이식을 시행 받은 94명의 성인 환자를 대상으로 하였다. 의무 기록을 후향적으로 분석하여 만성기, 가속기, 급성기에 골수 이식을 시행 받은 환자의 생존 기간을 분석하고, 24예의 가속기 환자에서의 진단 후 이식까지의 기간과 전처치 방법에 따라 생존에 차이가 있는가를 분석하였다. 관찰 기간은 1-144개월(중앙값 21개월)이었고 최소 추적 관찰 기간은 9개월이었다. 결과: 전체 환자 94예 중 만성기에 이식을 받은 환자의 5년 무병 생존율은 48%이고, 가속기에 받은 환자는 36%, 그리고 급성기는 14%였으며 통계적으로 유의한 차이를 보였다(p=0.0015). 만성기에 이식을 받은 환자의 5년 전체 생존율은 62%이고, 가속기에 받은 환자는 53%, 그리고 급성기는 14%였다(p=0.0119). 가속기 환자 24예 중 진단 후 이식까지의 기간이 1년 미만인 경우(n=9)의 5년 생존율은 65%, 1년 이상인 경우(n=15)는 48%였으며, 진단부터 이식까지의 기간이 짧을수록 생존 기간이 증가되는 경향을 보였다(p=0.0734). 전처치 방법에 따른 생존 기간의 차이는 TBI를 포함한 군(n=18)과 Bu+Cy 군(n=6)에서 차이가 없었다(p=0.6829). 가속기에서 이식 받은 환자 24예 중 재발은 10예에서 나타났으며 이 중 3명은 공여자 림프구 투여 혹은 인터폐론 치료로 재관해가 유도되어 생존하고 있다. 급성 및 만성 GVHD가 있었던 경우재발률은 31%(5/16)인 반면, GVHD가 나타나지 않았던 경우는 62%(5/8)의 재발률을 보였다. 3예에서 이식과 관련된 합병증으로 사망하였으며 각각 뇌막염, 급성 GVHD와 동반된 간질성 폐렴, 그리고 생착 부전이 1예씩이었다. 결론: 가속기에서 골수이식을 시행하는 경우 장기생존율 53%의 성적은 고무적인 것으로 적극적으로 이식을 권장할만 하다. 또한 가속기에서 이식을 할 경우 가급적 진단부터 1년 이내의 조기에 이식을 실시하는 것이 생존율을 증가시킬 것으로 사료되며,이식 후 재발의 예방을 위한 면역 치료에 대한 지침을 개발 하는 것이 중요하리라 생각된다. Background: Allogeneic bone marrow transplantation (BMT) remains the gold standard therapy for chronic myelogenous leukemia (CML). The best results are obtained when patients receive the transplant during the chronic phase (CP) of the disease. However, some patients may progress to accelerated phase (AP) or blastic phase (BP) before transplantation. Methods: Between 1986 and 1997 we performed allogeneic BMT for 94 patients with CML from HLA-matched sibling donors. We reviewed records of 24 patients receiving transplants during the AP of CML. The median age of patients was 29(17~38), and median interval from diagnosis to transplants was 14.5 months(3~46). TBI-containing regimen(n=18) and BuCy(n=6) were used as conditioning regimen. GVHD prophylaxis consisted of CsA+MTX(n=20) and CsA(n=4). Median mononuclear cell dose infused was 1.2×10^(8)/kg(1.04~2). Results: 5-year probabilities of overall survival and disease-free survival were 53% and 36%, respectively. Early transplanted patients within 1 year after diagnosis had a trend toward to better survival, but there was no statistical significance(65% vs 48%; p=0.07). Among 10 relapsed patients, 3 are alive in remission after donor lymphocyte infusion and/or interferon therapy. Three patients died of transplantation-related mortality including meningitis(n=1), interstitial pneumonia with acute GVHD(n=1), and graft failure(n=1). Conclusion: Because the results of allogeneic BMT for patients in AP are promising, we suggest that BMT should be actively recommended even in AP as early as possible for better outcome. The high probability of relapse in AP patients will be required the intensified conditioning regimen or posttransplant immunotherapy. Relapse can be treated with interferon or with infusion of donor lymphocytes. The adoptive immunotherapy will improve the survival for patients receiving transplants in AP CML.

급속냉각법으로 -80℃에서 보존된 말초혈 조혈모세포이식을 받은 환자들의 임상경과

최철원,김병수,서재홍,신상원,김열홍,김준석 대한조혈모세포이식학회 2000 대한조혈모세포이식학회지 Vol.5 No.1

배경:조혈모세포를 급속 냉각법으로 -80℃ 냉동고에서 경제적으로 보존하려는 방법이 국내외에서 활발히 연구되어, 그 결과들이 보고되고 있다. 그러나 상기 연구들의 대부분은 유용한 냉동기간 및 생착 여부만을 관찰하였지, -80℃에서 보존한 조혈모세포를 이식받은 환자들의 장기간 경과관찰을 규명한 예는 찾아보기가 힘들었다. 이에 저자 등은 본 교실에서 급속 냉각법으로 -80℃에서 보존한 조혈모세포를 이식받은 환자들의 임상경과를 보고하고자 한다. 방법:총 24명(남녀비; 17:7, 나이; 8~62세)을 대상으로 하였다. 조혈모세포의 채집은 화학요법 후 백혈구 회복기에 G-CSF 혹은 GM-CSF로 말초혈액으로 가동화시킨 상태에서 분리반출술을 통하여 이루어졌다. 채집한 혈액을 단핵구는 2×10^(7)/mL, DMSO는 10%의 농도로 처리한 후 급속 냉각법으로 -80℃에서 보존하였다. -80℃ 보존기간의 중앙값은 76 (18~145)일이었다. 해동 후, 단핵세포회복률, 생존능, 생존 단핵세포회복률, CFU-GM 집락회복률 , CD34^(+) 세포회복률 등을 구하여 냉동전 상태와 비교하였다. 또한, 이식 후 말초혈액의 절대과립구 및 혈소판 수가 각각 2,000/μL, 혈소판수 100,000/μL 이상으로 회복되기까지의 기간을 측정하였고, 이식 후 현시점까지의 경과를 분석하였다. 결과:1) 세포회복률(평균±표준편차): 단핵세포회복률은 93.4±5.6%였고, 생존단핵세포회복률은 82.1±5.1%이었다. 평균 CFU-GM 집락회복률은 78.4±19.7%였고 평균 CD34^(+) 세포회복률은 95.3±3.2%이었다. 2) 이식 후 조혈기능의 회복: 23명에서 평가가 가능하였다. 이식에 합당한 기준인 CD34^(+) 세포(× 10^(6)/kg)수인 5 이상을 만족한 경우는 20명이었고, 나머지 3명은 각각 4.0, 4.2, 4.5이었다. 이식 후 절대과립구 수가 500/μL, 1,000/μL, 2,000/μL 이상으로 회복되는 기간의 중앙값은 각각 8일(5~13일), 19일(9~95일), 31일(16~140일)이었고 혈소판수가 20,000/μL, 50,000/μL, 100,000/μL 이상으로 유지되기까지 걸린 기간의 중앙값은 각각 10일(6~19일), 27일(16~78일 이상), 45일(24~240일 이상)이었다. 이들 중, 지연생착을 보인 3명을 포함한 22명에서 완전생착이 이루어졌고, 1명에서 일차성 생착실패이 관찰되었다. 지연생착 및 생착실패는 이식된 조혈모세포의 수가 적은(CD34^(+) 세포<5× 10^(6)/kg) 3명과 62세로 고령인 1명에서 발생하였다. 3) 생착 후 임상경과: 23명 환자 중 현 시점까지 생존하고 있는 경우는 이식 후 재발 없이 생존한 7명과 재발되어 구제요법 후 관해 상태로 생존하고 있는 2명을 포함한 총 9명이었다. 이식 후 재발 없이 생존한 7명의 추적기간 중앙값은 35 (23~50)개월이었다. 구제요법 후 현재까지 관해상태를 유지하며 생존하고 있는 환자는 이식 후 11, 15개월에 재발이 발견되어 구제요법으로 완전관해를 이룬 후 24, 28개월이 지난 상태에 있다. 생존하고 있는 환자들은 구제요법 시행 후 조혈기능의 회복이 불완전한 부분생착의 소견(혈소판<100,000/μL)을 보이고 있는 1례를 제외하고는 모두 완전생착을 유지하고 있다. 그리고, 나머지 14명의 사인은 질환의 재발이 12명, 패혈증 및 혈소판감소증과 관련된 뇌출혈이 각각 1명씩이었다. 질환이 재발한 환자에서의 이식 후 무병 생존기간의 중앙값은 7 (4~15) 개월이었다. 결론:본 연구를 통하여 저자 등은 나이 등을 고려하여 전신상태가 비교적 양호한 환자들을 대상으로 적절한 조혈모세포수(CD34^(+) 세포수가 5× 10^(6)/kg 이상)가 이식된다면 자가 조혈모세포이식을 위한 급속냉각 후 -80℃ 보존법은 비용-효율 측면에서 보다 유용하게 임상에 응용될 수 있음을 알 수 있었다. Background:Automated controlled-rate freezing by computer-assisted devices and subsequent storage in -196℃ is recognized as the standard freezing and cryopreservation method of peripheral blood stem cell transplantation (PBSCT). As an alternative, the more simple and economic cryopreservation method using -80℃ mechanical freezer without controlled-rate freezing has been introduced. We summarize our experiences involving the long-term follow-up data of the patients transplanted with autologous peripheral blood stem cells (PBSC) cryopreserved without controlled- rate freezer. Methods:Collected PBSCs were mixed with a cryoprotectant solution consisting of autologous plasma and 20% DMSO, then placed in a -80℃ freezer. The recovery rate of frozen-thawed mononuclear cells (MNC), CFU-GM colonies, and CD34^(+) cells were calculated, respectively. Engraftment time (neutrophil >500/μL, platelet >50,000/μL) and normal hemopoiesis (neutrophil >2,000/μL, platelet >100,000/μL) were evaluated. Results: Total number of cases was 24. Median duration of cryopreservation was 76 days. The mean recovery rate of MNC, CFU-GM colonies, and CD34^(+) cells was 93.4%, 78.4%, and 95.3%, respectively. The median engraftment time of neutrophil and platelet was 8 and 27 days, respectively. The median normal hemopoiesis time of neutrophil and platelet was 31 and 45 days, respectively. Nine are alive in a CR status. Seven in CR1 sustain normal hemopoiesis with the median duration of 35 months. Two patients, who achieved CR2 after salvage chemotherapy due to a leukemia relapse after PBSCT, maintained engraftment status for 24 and 28 months and one arrived at normal hemopoiesis. Conclusion:These results demonstrate that PBSCT using a -80℃ mechanical freezer without controlled-rate freezing leads to acceptable long-term engraftment stability.

동종 골수이식 후 재발된 급성 림프구성 백혈병 환자에서 고식적 항암화학요법만으로 장기간 완전관해를 보이는 1례

류현모,이상엽,이경희,현명수 대한조혈모세포이식학회 2000 대한조혈모세포이식학회지 Vol.5 No.1

동종 골수이식 후 재발된 급성 백혈병의 치료에 대해서는 아직 확립된 표준요법은 없다. 골수이식 후 재발된 경우 일반적으로 시행하는 치료로서 고용량 화학요법 및 2차 골수이식을 들 수 있으며 최근 골수성 백혈병 특히 만성 골수성 백혈병에 효과가 있는 공여자 림프구 주입(Donor lymphocyte infusion, DLI)에 의한 이식편대 백혈병 효과(graft-versus-leukemia effect, GVL effect)를 얻고자 시도해 보지만 결과는 만족스럽지 못한 실정이다. 동종 골수이식 이후 이식편대 숙주질환이 발생한 경우 재발률이 낮다는 사실이 여러 연구에서 확인되어 이식편대 숙주질환이 항백혈병 효과가 있다는 사실이 증명되었다. 저자들은 동종골수이식 후 9개월 후 재발된 급성 림프구성 백혈병 환자에서 고식적 항암화학요법 1회 시행 후 동종골수이식 후에는 관찰할 수 없었던 간과 피부를 침범한 이식편대 숙주질환이 발생하였고 이 후 장기간 무병상태로 유지되는 1례를 경험하였기에 보고하는 바이다. 본 증례는 mixed chimerism 상태에서 고식적 항암화학요법으로 선택적으로 환자의 백혈세포나 림프구를 억압하거나 사망시켜 공여자의 T-cell이 우세하여 GVHD가 발생하면서 얻은 GVL 효과로 장기간의 관해 상태가 유지되는 것으로 사료된다. Graft-versus-host disease (GVHD) remains a major immunological complication after allogeneic bone marrow transplantation (allo-BMT), but also favors development of the beneficial graft-versus-leukemia (GVL) effect. A patient with ALL is described, who was given non-myeloablative remission reinduction therapy for leukemic relapse diagnosed on day 270 after HLA-compatible sibling BMT. On day 300, a clinical syndrome suggestive of acute GVHD had developed. Skin biopsy confirmed the clinical diagnosis of GVHD. The patient has since remained in complete remission with an excellent performance status for more than 3 years without an further chemotherapy. The case indicates that intensive non-myeloablative chemotherapy can cure AML relapsing after allo-BMT. The therapeutic effect in this case probably involved a direct pharmacological suppression of the leukemic clone followed by a GVL effect initiated by donor-derived alloreactive T lymphocytes.

동종 골수 이식한 백혈병에서 단반복 유전자로 살펴본 혼합 키메라 현상의 의의

장대영,이정신,서철원,이규형,이제환,지현숙,박찬정,한면수,최동원,김정균,최성준,김성배,김상위,김우건,김상희 대한조혈모세포이식학회 1998 대한조혈모세포이식학회지 Vol.3 No.1

연구배경 : 동종 골수 이식한 백혈병에서 키메라 현상의 분석은 착상, 질병 재발과 이식 거부를 이해하는데 도움을 줄 수 있다. 최근 STR을 PCR로 증폭한 검사법에 의해 매우 민감하고 유용하게 혼합 키메라 현상을 검출할 수 있다고 보고되고 있으나, 이 방법의 민감도와 임상적 의의는 아직 완전히 정립되지는 않았다. 따라서 PCR-STR검사법이 혼합 키메라 현상을 민감하게 검출하는지 보고, 동종 골수 이식 후 혼합 키메라 현상의 변화 양상을 관찰하고, 키메라 현상의 임상적 의의를 보고자 하였다. 방법 : 형제로부터 동종 골수 이식한 급성 백혈병 6명과 만성 백혈병 2명의 모두 8명을 대상으로 하였다. 44개 골수 검체에서 phenol/chloroform방법에 의하여 단핵세포 DNA를 추출하였다. DNA는 CTT 삼중체, vWA와 amelogenin시발체를 이용하여 증폭하였다. 증폭 산물은 5% 폴리아크랄아미드 젤에서 전기영동 뒤 은 염색으로 확인하였다. 2명의 DNA를 여러 비율로 혼합하여 상기 검사를 하여 검출 가능 최소 농도를 결정하였다. 결과 : 상기 검사법의 검출 가능 최소농도는 0.25%였다. 혼합 키메라 현상은 8명중 4명에서 관찰되었다. 혼합 키메라 현상은 보인 1명에서 급성 및 만성 이식편대 숙주 질환이 나타났고, 완전 공여자 키메라 현상을 보인 1명에서 만성 이식편 대 숙주 질환이 나타났다. 점진적으로 증가하는 혼합 키메라 현상을 보인 2명은 이식 후 12개월에 질병 재발을 보였으나, 완전 공여자 키메라 현상을 보인 경우엔 재발이 관찰되지 않았다. 결론 : PCR-STR검사법은 동종 골수 이식 후 남아 있는 환자 세포를 검출하고 키메라 현상을 관찰하는데 유용한 방법이다. 또한 이 검사법은 동종 골수 이식 후 재발의 조기 진단, 이식편 대 숙주 질환의 평가와 면역 관용에 임상적으로 응용할 수 있으리라 생각한다. Background : Chimerism analysis after allogeneic bone marrow transplantation (BMT) for leukemia could be helpful understanding of the early marrow engraftment, disease relapse, and graft rejection. Recently, a PCR technique which amplifies short tandem repeats(STR) has been reported to be highly sensitive and reliable in detecting mixed chimerism. But its sensitivity and clinical significance has not been established. The purpose of this study was firstly, to confirm whether a PCR-STR in highly sensitive enough ti assess mixed chimerism, secondly to monitor the changing patterns of mixed chimerism after allogeneic BMT, and lastly to determine correlation between the chimeric status and the clinical outcome. Methods : A study was made eight patients (six with acute leukemia and two with chronic leukemia) who underwent unmanipulated allogeneic BMT along with matched donors. DNA was extracted from mononuclear cells of 44 bone marrow samples using a phenol/chloroform method. Amplification of DNA was done using CSFIPO-TPOX-TH01(CTT) triplex with or without vWA or amelogenin primer. The amplified product was separated on 5% polyacrylamide gel and was confirmed by silver staining. The sensitivity of CTT triplex method was determined by mixing DNA from two person in serial proportion using the same method. Results : The sensitivity for CTT triplex method was 0.25% Mixed chimerism was documented in 4 of 8 patients. ONe of four patients with mixed chimerism developed acute and chronic graft versus host disease (GVHD) and one of four patients with complete donor chimerism also developed chronic GVHD. Two patient with progressive mixed chimerism relapsed at 12 months post-BMT, whereas no patient with complete donor chimerism has relapsed. Conclusion : The study has found that PCR-STR was an effective method for the detecting residual host cell and monitoring the chimeric status after allogenic BMT. PCR-STR can also be clinically applicable in early prediction of relapse, appropriate assessment of GVHD, as well as tolerance after allogeneic BMT.