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電氣刺戟에 의한 제라늄(Pelargonium zonale hybrids)Protoplast의 融合과 Callus 生性
유장걸,김양록 濟州大學校 放射能利用硏究所 1992 연구보고 Vol.7 No.-
형질이 다른 protoplasts를 전기융합시켜 그 융합체를 배양하기 위한 기초 연구로서, Pelargonium zonale hybrids Ringo red”와 “Ringo white”의 잎에서 callus 유기와 배양 및 식물체 재생 조건, Protoplasts 분리 조건, protoplast 전기 융합 조건, 융합된 protoplast 배양에 관여하는 조건을 검토하였다. 1. Callus 유기와 배양을 위한 최적 NAA 와 BA 농도는 각각 3 ppm + 0.5 ppm 이었다. 또한 식물체 재생에 관여하는 growth regulators 의 농도는 NAA 와 BA 의 조합에서는 고농도 NAA(1, 2, 3 ppm) + 저농도 BA(0.1, 0.25 ppm) 에서, IAA 와 kinetin의 조합에서는 고농도 IAA(1, 2, 3 ppm) + 저농도 kinetin(0.1, 0.25 ppm), 저농도 IAA(0.1, 0.25 ppm) + 고농도 kinetin(1, 2, 3 ppm) 에서 낮은 빈도로 식물체가 재생되었으나, 또 Thidiazuron 과 Fulmet 조합에서는 거의 모든 조합에서 더 높은 빈도로 식물체가 재생되었다. 특히 Thidiazuron 5 ppb + Fulmet 5 ppb 에서는 60 % 의 재생율을 나타내었다. 2. Protoplast 분리를 위한 효소 용액의 최적 농도는 4 % Cellulase Onozuka R-10+0.5% Macerozyme R-10이었고, 이때 수율은 3.2 x 10? protoplasts/ml 이었으며, 효소처리 시간은 12 시간이 적당하였다. 3. Protoplast 융합에 미치는 전압 및 주파수 조건은 교류 주파수 1 MHz를 40 V/cm 에서 15sec 동안 가한 후, 직류전압 0.5 kV/cm 를 60 μsec 동안 걸어 주었을 때, 13 % 의 융합율과 81 % 의 생존율을 나타내어 융합 효과가 가장 좋았다. 4. Protoplast 배양에 있어서 세포 분열은 KM-8P액체배지(37%)에서, colony 형성은 AA액체배지(MS무기물+ KM-8P 비타민 + 아미노산 혼합물)에서 가장 양호하였고(8.3 %), 당 종류 및 농도에 따른 결과는 0.2 M glucose 와 fructose 혼합배지에서(세포분열 38 %, colony 형성 8.5%), 삼투압 조절제로서 sorbitol 의 농도는 0.2 M(total 0.6 M) 에서(38 %, 8.4%),배양밀도는 1 x 10? protoplasts/ml 에서(41 %, 8.8 %), Growth regulators는 NAA 2 ppm + BA 0.5 ppm 에서(39 %, 9.1 %) 가장 양호한 결과를 얻었다. 5. 이상의 결과에서 얻은 최적 조건으로 protoplast를 배양했을 때, 배양 2일 후 세포벽이 재생되었고, 4 일 후 제 1 분열이 일어났고, 7 일 후 제 2 분열이, 10 일 후 3 또는 4 분열이 일어났으며, 15일 후에는 colony가 형성되었다. 배양 8 주 후에는 0.5 mm 정도 형성된 세포를 MS 고체배지(NAA 3 ppm + BA 0.5 ppm)에 옮겨 callus를 배양하였고, 배양 12 주 후에는 1cm 정도의 callus 가 형성됨을 볼수 있었다. The conditions of protoplast isolation from leaf callus, electrofusion, and fused protoplasts culture were examined in order to establish a somatic hybrid using Pelargonium zonale hybrids “Ringo red”and “Ringo white”. The concentration of growth regulators and the nutrient media affecting callus formation and plant regeneration were investigated. Callus induction and growth was most efficient at the NAA 3 ppm and BA 0.5ppm combination and the growth rate was highest at 16 to 20 days after culture initiation. Although shooting from the callus was infrequently found at the combinations of NAA(1, 2 and 3 ppm) + BA(0.1 and 0.25 ppm), IAA(2 and 3 ppm) + kinetin(0.1 and 0.25 ppm), and IAA(0.1 and 0.25 ppm) + kinetin(2 and 3 ppm), much higher shooting capability(60 %) was shown at the combination of Thidiazuron(5 ppb) + Fulmet(5 ppb). 12 hour-treatment of 4 % Cellulase Onozuka R-10, 0.5 % Macerozyme R-10, 0.3 % Hemicelluase, 0.3 % Pectolyase and 0.6 M sorbitol (pH 5.8) was most efficient for the protoplast isolation with the yield of 3.2 x 105 protoplasts/ml. The optimum condition of protoplast fusion was 1 MHz of AC frequency with 40 V/cm of amplitude for 15 sec followed by 0.5 kV/cm of DC amplitude for 60 μsec. The cell division in protoplast culture was most active in the KM-8P media and the colony formation in the IAA liquid media. The 0.2 M glucose + 0.2 M fructose medium containing 0.2 M sorbitol as an osmoticum and 2 ppm NAA + 0.5 ppm BA with 1 x 105 protoplasts/ml of culture density seemed to be most suitable for cell division and colony formation. Under the above conditions, the cell wall regeneration of the fused protoplasts was found 2 days after the protoplast cultivation, the first cell division 4 days, the 2nd cell division 7 days, the 3rd or the 4th 10 days, and the colony formation 15 days. After 8 weeks the divided cells were transferred to the MS solid medium and the callus formation was observed at the 12th weeks from the protoplast culture.
45Ca 표지 칼슘 화합물별 토마토와 감귤의 엽면 흡수율
송성준,강영길,김양록,한승갑 한국토양비료학회 2006 한국토양비료학회지 Vol.39 No.2
Ca은 세포벽의 구성성분이며 세포막의 구조와 기능 그리고 세포의 생리 대사과정에 있어 필수원소이다. 식물세포에 있는 대부분의 Ca은 아포플라스트와 액포 내에 존재하며(Mengel and Kirby, 2001), 세포질내 유리 Ca 농도는 0.1-0.2 mM 정도로 매우 낮다(Felle, 1998; Evans et al., 1991). 따라서 세포질내 유리 Ca 농도의 증가는 생리․생화학적으로 매우 중요한 의미를 가지며 Ca-Calmodulin 복합체의 형성을 매개로 각종 효소를 활성화시켜 여러 생리대사 과정에 관여한다(Marschner, 1995; Mengel and Kirby, 2001) 뿌리에 의한 Ca의 흡수는 근권의 조건 즉, 수분 stress, 염류농도와 온도 등에 의해서 많은 제약을 받을 수 있다(Pill and Lambeth, 1980; Adams and Ho, 1993; Choi et al., 1997; Ho et al., 1993). 또한, Ca은 식물체내 조직 간의 이동이 어려워 결핍되면 어린잎 또는 생장점에서 그 현상이 먼저 발생된다. 그러므로, 원예작물에서도 Ca은 성장과 과실생육에 큰 영향을 미치는 것으로 알려져 있는 데, 결핍되었을 때 발생하는 생리장해로는 양배추(Palzkill et al., 1976), 상추(Collier, 1982) 또는 딸기의 tipburn(Shear,1975), 토마토의 배꼽썪음과(Dekock et al. 1979; Adams and Ho, 1994), 감귤의 신초고사 등을 들 수 있다. 일반적으로 엽면시비는 뿌리에 의한 특정 양분의 흡수가 제한되어 생리적인 장해가 유발될 가능성이 있을 때 빠른 시일내에 작물의 생육을 정상적으로 회복시키는 데 능률적이며 효과적인 방법으로 알려져 있다. Ca의 엽면시비는 각종 원예작물의 Ca에 의한 생리장해의 회복과 과일의 품질 및 저장성 등에 도움을 주는 것으로 알려져 있다(Wada et al. 1996; Jeong et al. 1998; Moon et al., 1998; Kim and Kim, 1999; Moon et al., 2002; Kim et al., 2004; Kwak et al., 2004). 주로 사용되는 칼슘화합물로는 CaCO3, CaCl2, Ca(NO3)2, Ca(H2PO4)3, Ca-formate, Ca-acetate 등이 있으나(Bramlage et al., 1985; Wada et al., 1996; Jeong et al. 1998; Moon et al., 1998; Cheon and Jeong, 2003), 그 흡수율이 조사되지 않아 과연 어떠한 칼슘 형태가 더 효율적으로 흡수하는 지 잘 알려져 있지 않다. 특히, Ca은 주로 염 형태의 것을 많이 사용하기 때문에 흡수량을 높이기 위해서는 고농도를 사용하거나 농도가 낮은 경우에는 여러번 반복해서 살포하여야 하므로 축적된 염으로 인해 잎이 염해를 받을 우려가 있다. 또한, Ca의 생리 장해가 심각해지기 전에 효율적으로 흡수하는 Ca 화합물의 사용이 중요하다. 그러므로, 본 연구에서는 45Ca 방사성동위원소로 표지된 Ca 화합물별 토마토와 감귤의 엽면 흡수율을 비교하고 칼슘화합물을 엽면시비하였을 때 그 농도별 엽 피해 여부를 조사하였다.
Marker gene 의 직접삽입에 의한 transgenic plant 의 제조 및 전기융합
홍경애(Kyung Ae Hong),류기중(Ki Jung Riu),소인섭(In Sup So),김양록(Yang Lok Kim),유장걸(Zang Kual U) 한국응용생명화학회 1993 Applied Biological Chemistry (Appl Biol Chem) Vol.36 No.6
The conditions required for plant transformation through the electroporation system and for the electrofusion of the prtoplasts were investigated for geranium (Pelargonium zonale hybrids). The optimum condition for electroporation was 1.77 ㎸/㎝ for 40 μsec under which 70% of the protoplasts were viable and 58% of the viable protoplasts were stained with methylene blue. The pBin19 DNA plasmid used as a carrier vector was isolated from E.coli DH5α strain, purified, identified by the electrophoresis on agarose gel and electroporated into the protoplasts. The KM8 liquid medium gave better cell division than any other media. One ㎒ of AC frequency with 40 V/㎝ of amplitude for 15 sec followed by 0.5 ㎸/㎝ of DC amplitude for 60 μsec was most efficient for the electrofusion of protoplasts.