Studies on the factor Xa-induced mitogenesis of vascular smooth muscle cells : Factor Xa에 의한 혈관평활근세포의 증식유도에 관한 연구 : 999999,이한규

구본훈 연세대학교 대학원 2004 국내박사

그 동안 factor Xa는 PDGF의 분비를 자극해 혈관평활근세포의 증식을 유도한다고 알려져 왔다. 그러나 본 연구 결과에 의하면, factor Xa에 의해 유도되는 혈관평활근세포의 증식은 PDGF의 분비와 무관하다는 것을 알 수 있었다. 더욱이 factor Xa를 처리한 세포 배양액에서는 어떤 종류의 PDGF도 관찰되지 않았다. Factor Xa를 처리한 세포 배양액에서 factor Xa 활성을 없앤 다음, 혈관평활근세포에 대한 증식유도활성을 확인한 결과 새로운 성장인자가 존재함을 확인하였다. 이 성장인자를 정제한 후, 동정한 결과 epiregulin임을 확인하였다. 재조합 epiregulin 또한 혈관평활근세포의 증식을 유도하였다. Factor Xa는 epiregulin의 mRNA합성을 유도한다. Factor Xa의 증식유도활성은 anti-epiregulin antibody와 anti-sense oligonucleotide에 의해 크게 줄어들었다. 이와 같은 결과들을 통해, factor Xa는 epiregulin의 합성을 유도해 혈관평활근세포의 증식을 유도한다는 것을 알 수 있었다. 그 다음 연구로 factor Xa에 의해 활성화되는 혈관평활근세포의 수용체를 확인하고자 하였다. Factor Xa를 세포에 처리 시 [^(3)H]thymidine incorporation과 세포 수를 증가시킬 뿐 아니라 ERK-1/2를 활성화시켰다. 트롬빈을 미리 세포에 처리해 세포를 둔감화 시킨 다음, factor Xa를 처리했을 때 ERK-1/2는 활성화 되었다. 그러나, PAR-2 agonist peptide로 세포를 미리 둔감화 시켰을 때에는, factor Xa는 ERK-1/2를 활성화 시킬 수 없었다. 더욱이 anti-PAR-2 antibody는 factor Xa의 혈관평활근세포의 증식 효과를 억제시켰다. 이러한 결과로부터 factor Xa에 의해 활성화되는 수용체는 PAR-2임을 알 수 있었다. 결론적으로 epiregulin의 합성은 factor Xa에 의해 활성화된 PAR-2에 의한 신호전달에 의해 유도된다는 것을 제안하는 바이다. Factor Xa has been reported to elicit vascular smooth muscle cell proliferation via autocrine release of platelet-derived growth factor. However, I have shown here that factor Xa-induced mitogenesis of vascular smooth muscle cell is independent of platelet-derived growth factor. Neither did I observe any platelet-derived growth factor isoforms in the cultured medium of factor Xa-stimulated cells. Our finding that the cultured medium of factor Xa-stimulated cells strongly induces vascular smooth muscle cell mitogenesis in the absence of factor Xa activity led us to explore the existence of a novel autocrine pathway. The autocrine growth factor was purified from the cultured medium and was identified to be epiregulin. Recombinant epiregulin was also able to induce the mitogenesis. The secretion of epiregulin from factor Xa-stimulated vascular smooth muscle cell required mRNA expression and protein synthesis of the growth factor. The mitogenic effect of factor Xa on vascular smooth muscle cell was significantly reduced by anti-epiregulin antibody or by antisense oligodeoxynucleotide to epiregulin. Several lines of experimental evidence clearly indicate that autocrine production of epiregulin, an epidermal growth factor-related ligand, is induced in factor Xa-stimulated mitogenic process of vascular smooth muscle cell. Next, I investigated the specific receptor that is activated by factor Xa. Factor Xa-induced stimulation of vascular smooth muscle cells was investigated by analyzing [^(3)H]thymidine incorporation, cell proliferation, and ERK-1/2 activation. Exposure of the cells to factor Xa evoked a time-dependent activation of ERK-1/2 with increased [^(3)H]thymidine incorporation and cell proliferation. The factor Xa-induced ERK-1/2 activation was not desensitized by preincubation of the cells with thrombin. However, ERK-1/2 activation was markedly attenuated by prior exposure of the cells to PAR-2 activating peptide, SLIGKV. The mitogenic effect of factor Xa was significantly reduced in the presence of anti-PAR-2 monoclonal antibody. Several lines of experimental evidence clearly indicate that factor Xa-induced mitogenesis of vascular smooth muscle cell is a cellular process mediated by PAR-2 activation. From these experimental data, I suggest that factor Xa induce signaling events and autocrine production of epiregulin via activation of PAR-2 in VSMC.

Study on Turner Syndrome-Specific X- linked Genes and Escape Genes Using In Vitro Vascular models

윤상훈 건국대학교 대학원 2024 국내박사

TS is a genetic disorder caused by abnormalities in X chromosome in women, leading to an incomplete dosage compensation of X-linked genes. TS affect many organs and lead to cardiovascular disease, obesity, diabetes, and infertility. The most common symptom of TS are cardiovascular and vascular abnormalities. However, the underlying pathogenesis of TS has not been well understood. To understand the etiology of TS, researchers are actively studying in vitro models obtained from patient-derived induced pluripotent stem cells (iPSCs). In this study, iPSCs were derived from monosomy X (45,X) TS patient and were further investigated after differentiating them into vascular smooth muscle cells (VSMCs) and blood vessel organoids (BVOs). TS patient-derived iPSCs (TS-iPSCs) showed the hallmark features of typical pluripotent stem cells, such as the expression of pluripotency marker, teratoma formation ability, and global gene expression patterns like pluripotent stem cells. To model the TS-affected cells and tissues in vitro, TS-iPSCs were differentiated into VSMCs and BVOs, as the major symptom of TS is cardiovascular and vascular abnormalities. TS-iPSC-derived VSMCs (TS-VSMCs) expressed VSMC-specific markers, such as α-SMA, PDGFRb, and SM22a. However, RNA sequencing analysis showed that whole genome expression pattern of TS-VSMCs was different from that of control VSMCs. Next, X-linked genes were further analyzed. This investigation revealed differential expression patterns linked to essential cardiovascular functions. Additionally, a comparative analysis was conducted, uncovering differences in genes escaping X-inactivation with potential associations to various cellular activities. In the case of TS-iPSC-derived BVOs (TS-BVOs), we explored 29 X chromosome escape genes across clusters, discovering diverse associations with germ cells, brain functions, and blood/immune cells. Notably, EC clusters expressed DMD and KDM6A, indicating markers for skeletal and heart muscles. Overall, our analysis highlighted specific functions in vascular biology, emphasizing associations with blood vessels. This study confirms the expression of vasculature-specific genes within these cells and employs RNA sequencing to analyze the correlation with X chromosome-associated genes. The comprehensive examination of vascular structures in both two-dimensional and three-dimensional settings provides insights into the composition and interactions of vascular and smooth muscle cells within the tissue. In this paper discusses the underlying genetic mechanisms, emphasizing how incomplete dosage compensation of X-linked genes contributes to the varied clinical phenotype of TS. It explores manifestations in different organs, including the reproductive system, cardiovascular system, liver, kidneys, brain, and skeletal system. The research on vascular aspects not only establishes a foundation for genetic screening related to cardiovascular diseases, the primary cause of mortality in TS, but also contributes to the development of disease models and treatment strategies focused on vascular and smooth muscle cells in Turner syndrome. Keyword : Turner Syndrome, X Chromosome Abnormalities, Cardiovascular Manifestations, Vascular Smooth Muscle Cells, Genetic Mechanisms, Disease Modeling 터너 증후군(Turner syndrome, TS)은 X 염색체의 이상으로 인한 유전적 장애로, X 연관 유전자의 불완전한 용량 보상으로 나타납니다. 이 상태는 대사, 혈관, 난소, 및 골격 이상을 포함하여 다양한 방식으로 나타나며, 심혈관 질환, 비만, 당뇨병, 불임을 초래합니다. 이 증후군은 45,XO, 46,X,i(X), 및 46,X,r(X)와 같은 변이와 관련이 있으며, 이는 하나의 X 염색체의 완전 또는 부분 손실 또는 다양한 세포 라인의 모자이시즘을 포함합니다. TS는 여러 기관 체계에 영향을 미치며 저성선자극호르몬 성선저하증, 단신, 심혈관 및 혈관 이상, 간 질환, 신장 이상, 뇌 이상, 그리고 골격 문제로 나타납니다. 조기 난소 기능 손실은 빠른 난자 고갈로 특징 지어지며 임신 중 불리한 모체 및 태아 결과의 높은 위험을 가지고 있습니다. 특히, 심혈관 문제는 TS 환자의 상당한 비율에 영향을 미치며 선천적 이상이 주요 사망 원인 중 하나입니다. 최근에는 TS 환자에서 유래한 유도만능줄기세포를 사용한 연구가 혈관 평활근 세포 및 장기 모형 생성에 중점을 두었습니다. 이 연구는 이러한 세포 내에서 혈관 특이적 유전자의 발현을 확인하고 RNA 시퀀싱을 사용하여 X 염색체 관련 유전자와의 상관 관계를 분석합니다. 2차원 및 3차원 설정에서 혈관 및 평활근 세포의 조성 및 상호 작용에 대한 포괄적인 검사는 조직 내에서 혈관의 특성을 이해하는 데 도움이 됩니다. 본 논문에서는 X 연결 유전자의 불완전한 용량 보상이 TS의 다양한 임상 표현형에 어떻게 기여하는지에 대한 기저 유전적 기전을 논하며, 임신 중 사망의 주요 원인인 심혈관 질환과 관련된 유전적 스크리닝의 기초를 제공합니다. 또한, TS에서 혈관 및 평활근 세포에 중점을 둔 질병 모델 및 치료 전략의 개발에 기여합니다.

Alterations of large-conductance Ca2+-activated K+ channels in human umbilical arterial smooth muscle during gestational diabetes mellitus

An, Jin Ryeol 강원대학교 대학원 2022 국내박사

Part 1. 전 세계적으로 유병률이 높은 대사질환 중 하나인 당뇨병은 제1형 및 제2형과 임신성 당뇨병으로 구분되며, 이 중 임신성 당뇨병은 기존 당뇨병 이력이 없던 여성이 임신 20주 이후에 당뇨병이 유발되는 대사질환을 의미함. 임신성 당뇨병은 산모의 조산, 난산, 양수과다증, 고혈압성 질환의 빈도 증가 등 산과합병증 유발 빈도가 정상산모에 비해 높으며 태아의 고인슐린혈증, 거대아발생, 당뇨병발병률 증가와 같은 신생아 대사합병증과도 관련이 있음. 이와 같은 임신성 당뇨병으로 인한 태아와 산모의 대사 합병증 유발 기전에 대해서는 현재까지 명확치 않으나 탯줄을 구성하는 혈관의 기능 이상이 주요 유발인자 중 하나로 간주되고 있는 실정임. 임신 5주차에 난황낭과 요막으로부터 생성되는 탯줄은 태아와 태반 사이에 위치하고 있으며 일반적으로 Wharton’s jelly 라는 점액성 조직으로 둘러싸인 3개의 혈관, 즉, 1개의 큰 탯줄정맥과 2개의 작은 탯줄동맥으로 구성되어 있음. 3개의 탯줄혈관들은 태아와 태반 사이를 순환하면서 산소와 영양분이 풍부한 혈액을 태아에게 공급하고 이산화탄소와 대사성노폐물이 함유되어 있는 혈액을 태반으로 배출하는 기능을 함. 이 중 2개의 탯줄동맥은 태아로부터 생성된 이산화탄소와 대사성노폐물을 태반으로 배출하는 기능을 담당하고 있기 때문에 탯줄동맥의 기능 변화는 특히 태아의성장에 부정적인 영향을 미치는 주요 요인중 하나로 거론되고 있음. 그럼에도 불구하고 현재까지 임신성 당뇨병으로 인해 변화되는 탯줄동맥 기능에 대한 대부분의 연구는 이온채널과 같은 동맥기능을 조절하는 주요 인자가 아닌 단순한 조직학적 변화에 초점을 맞추어 진행되고 있는 실정임. 따라서 본 연구에서는 임신성 당뇨병으로 인해 변화되는 탯줄동맥의 전반적인 기능변화를 탐색하고 이로인해 변화되는 동맥 기능조절 인자를 규명하고자 함. 본 연구결과는 32명의 정상 산모군과 18명의 임신성 당뇨병 산모군의 탯줄을 기증 받아 수행되었음. 먼저 동맥 혈관 평활근의 수축 또는 이완을 관장하는 가장 지배적인 이온전도 경로이자 조절인자인 K+ channel에 대한 탯줄동맥의 관련성을 탐색하기 위해 탯줄동맥 평활근세포를 분리하여 네가지 유형의 K+ channel 전류를 기록하였음. 그 결과 칼슘의존성칼륨채널 (Large-conductance Ca2+-activated K+ channel; BKCa channel)의 전류가 가장 크게 기록됨을 확인하였음. 이는 곧 탯줄동맥 평활근세포에 네가지 유형의 K+ channel중 BKCa channel이 지배적으로 발현되어 있으며 탯줄동맥 기능조절의 핵심 역할을 수행할 것을 암시함. 다음으로 정상 산모군과 임신성 당뇨병 산모군의 BKCa channel전류를 기록한 후 비교 분석한 결과 임신성 당뇨병 산모군의 탯줄동맥 평활근세포에서 BKCa channel 전류가 감소됨을 확인 할 수 있었음. 또한 기록된 Channel 전류가 순수한 BKCa channel 전류임을 검증하기 위해 BKCa channel의 특이적 억제제인 Paxilline (10 μM)을 처리 하였을 때 정상 산모군과 임신성 당뇨병 산모군 모두에서 Channel 전류가 대부분 억제됨을 확인 할 수 있었음. 본 연구결과를 바탕으로 실제로 임신성 당뇨시 탯줄동맥 기능이 변화되었는지, 또한 이러한 변화가 BKCa channel과 관련성이 있는지 규명하기 위해 정상 산모군과 임신성 당뇨병 산모군의 탯줄동맥 혈관을 Serotonin (10 μM)으로 전수축 시킨 후 BKCa channel의 특이적 활성제인 NS-1619를 농도별로 처리 하였을 때 이완력의 변화를 비교 분석하였음. 그 결과 임신성 당뇨병 산모군의 탯줄동맥 혈관의 이완력이 감소됨을 확인하였으며, 이는 곧 임신성 당뇨시 탯줄동맥 평활근세포의 BKCa channel의활성이 감소되어 혈관 기능이 저하됨을 의미함. 본 연구결과를 분자생물학적 수준에서 추가로 검증하기 위해 정상 산모군과 임신성 당뇨병 산모군의 탯줄동맥 평활근세포에 대한 BKCa channel의 mRNA, totalRNA, Protein 발현 정도를 비교 분석하였음. 그 결과 임신성 당뇨시 탯줄동맥 평활근세포의 BKCa channel의mRNA, totalRNA, Protein 발현 정도가 모두 감소됨을 확인 할 수 있었음. 다음으로 임신성 당뇨병으로 인한 탯줄동맥 평활근세포의 BKCa channel 활성 감소가 세포내 신호전달경로의 변화로 유발되는지 탐색하기 위해 대표적인 BKCa channel의 활성 조절 신호전달경로인 PKA와 PKG에 대한 Protein 발현 정도를 비교 분석하였음. 그 결과 정상 산모군과 임신성 당뇨병 산모군의 탯줄동맥 평활근세포에서 PKA와 PKG의 발현도는 유사하였으며, 이는 곧 임신성 당뇨병에 의한 탯줄동맥의 기능저하가 BKCa channel의 독립적인 활성저하로 유발됨을 시사하는 결과임. 마지막으로 정상 산모군과 임신성 당뇨병 산모군의 탯줄동맥 평활근의 Basal 혈관톤 및 안정막 전압의 변화를 비교 분석 하였음. 그 결과 BKCa channel의 특이적 억제제인 Paxilline (10 μM)을 처리하였을 때 정상 산모군의 탯줄동맥 평활근에서는 Basal 혈관톤의 수축이 유발되었으며 안정막 전압도 탈분극하였음. 하지만 임신성 당뇨병 산모군의탯줄동맥 평활근에서는 Basal 혈관톤의 수축이 유발되지 않았으며 안정막 전압 역시 탈분극하였으나 기초 안정막 전압이 이미 대조군에 비해서 탈분극화 되어 있는 경향을 보여주었음. 이는 임신성 당뇨시 탯줄동맥 평활근세포에서 BKCa channel의 활성이 저하되어 있음을 생리학적으로 보여주는 실험결과임. 결론적으로, 임신성 당뇨병에 의해서 탯줄동맥 평활근의 기능이 저하되며 이러한 요인에는 BKCa channel활성의 기능저하가 직접적으로 관여되어 있음을 나타냄. 본 연구결과는 임신성 당뇨병으로 인한 태아와 산모의 대사 합병증 유발 기전 중 탯줄동맥의 기능 이상의 관련성에 대한 가설을 생리학적인 연구방법으로 증명하였으며, 대사 합병증을 치료 및 개선하기 위한 타겟 기전중 하나로서 BKCa channel이 관여되어 있음을 처음으로 규명하였음. 더 나아가 임신성 당뇨질환 분야의 기초의학적 지식의 진보와 더불어 임신성 당뇨 및 관련 대사 합병증 치료를 위한 초석이 되는 연구자료가 될 것임. Part 1-1. We investigated the changes in large-conductance Ca2+-activated K+ (BKCa) channels from human umbilical arterial smooth muscle cells (HUASMCs) experiencing gestational diabetes mellitus (GDM). Whole-cell BKCa current density was decreased in the GDM group compared with the normal group. The vasorelaxant effects of the synthetic BKCa channel activator NS-1619 (10 μM) were impaired in the GDM group compared with the normal group. Reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), real-time RT-PCR, and western blot analyses suggested that the mRNA, total RNA, and protein expression levels of the BKCa channel were decreased in the GDM group relative to the normal group. In addition, the expression levels of protein kinase A and protein kinase G, which regulate BKCa channel activity, remained unchanged between the groups. Applying the BKCa channel inhibitor paxilline (10 μM) induced vasoconstriction and membrane depolarization of isolated umbilical arteries in the normal group but showed less of an effect on umbilical arteries in the GDM group. Our results demonstrate for the first time impaired BKCa current and BKCa channel-induced vasorelaxation activities that were not caused by impaired BKCa channel-regulated protein kinases, but by decreased expression of the BKCa channels, in the umbilical arteries of GDM patients. Part 2. 정신과약물이란 인간의 정신 또는 행동 기능장애를 치료하기 위해 뇌에서 분비되는 신경전달물질의 분비를 조절하여 정상적으로 회복시키는 화학물질을 일컬으며 이러한 정신과약물의 종류에는 환자의 기능장애 유형에 따라 항우울제, 항정신병제, 항불안제 등으로 분류되어 사용되고 있음. 이 중 삼환계 항우울제 (Tricyclic antidepressant; TCA)와 비정형 항정신병제 (Atypical antipsychotics)는 각각 세로토닌 또는/그리고 도파민 수용체를 억제하여 신경전달물질의 불균형을 조절하고 이로써 우울증 또는 조현병과 같은 정신병적 증상을 치료하는데 대표적으로 사용되고 있는 정신과약물계열임. 하지만, 이들의 사용은 성기능 장애, 체중증가, 설사, 불면증, 두통, 졸림과 같은 다양한 부작용을 동반하는 것으로 알려져 있음. 이외에도 심장근육세포의 K+ channel, Ca2+ channel, 그리고 Na2+ channel 등을 선택적으로 억제하여 long QT syndrome과 같은 심부정맥도 유발하는 것으로 보고되고 있음. 그럼에도 불구하고 혈액공급을 통해 심장근육의 기능을 관장하는 심혈관계 (i.e., 관상동맥) 이온채널에 대한 이들의 영향과 이에 따른 생리학적 기전에 대한 연구는 명확하게 밝혀진 바가 없음. 따라서 본 연구에서는 세포막에 발현되어 있는여러 유형의 이온채널활성을 전기적으로 기록 할 수 있는 패치클램프 (Whole-cell Patch clamp) 실험기법을 활용하여 대표적인 삼환계 항우울제인 Protriptyline, Imipramine과 비정형 항정신병제인 Risperidone, Ziprasidone, Iloperidone이 관상동맥 평활근세포막의 다양한 이온채널 중 전압의존성 칼륨채널 (Voltage-dependent K+ channel; Kv channel)에 미치는 영향과 생리학적 기전을 연구하여 이들의 심혈관계 부작용을 규명하고자 함. 혈관 평활근세포에 존재하는 다양한 이온채널 중 K+channel은 세포막의 안정막 전위를 조절하여 혈관의 수축 또는 이완을 관장하는 가장 지배적인 이온전도경로임. 혈관의 기능 조절에 중요한 혈관 K+channel은 대표적으로 네가지 유형으로 분류됨; 전압의존성칼륨채널 (Voltage-dependent K+ channel; Kv channel), 칼슘의존성칼륨채널 (Large-conductance Ca2+-activated K+ channel; BKCa channel), ATP-의존성칼륨채널 (ATP-sensitive K+ channel; KATP channel), 내향성정류칼륨채널 (Inward rectifier K+ channel; Kir channel). 이 중 Kv channel은 세포막 탈분극 자극에 의해 활성화되어 재분극을 유발하고 이로인해 세포막을 다시 안정막전위로 되돌려 혈관톤을 안정화시키는 역할을 함. 따라서 현재 Kv channel은 혈관의 수축 또는 이완반응을 매게하는 가장 중요한 K+channel 중 하나로 간주되고 있음. 실제로 다양한 연구결과들에서 약물 또는 특정 화합물에 의한 Kv channel 활성의 억제는 다양한 혈관 평활근세포에서 세포막의 탈분극 및 혈관 수축을 유발하는 것으로 알려져 있음. 또한, Kv channel의 발현 또는 기능의 변화가 고혈압, 당뇨병과 같은 대사성 질환과도 밀접한 관련이 있다고 보고되고 있음. 이러한 이유로 혈관 Kv channel의 활성을 억제할 가능성을 가진 약물을 스크리닝하고 이에 따른 생리학적 기전을 규명하는 것은 전반적인 혈관 기능에 대한 약물의 부작용을 진단하고 더 나아가 이로인해 유발되는 다양한 질환을 예방 및 치료하기 위해 필수적으로 수행되어야 하는 연구임. 본 연구결과에서 Protriptyline, Imipramine, Risperidone, Ziprasidone, 그리고 Iloperidone은 모두 토끼 관상동맥에서 분리된 평활근세포의 Kv channel전류를 농도 의존적으로 억제하였음. 각각의 약물에 의한 Kv channel 억제 기전 및 이에 따른 생리학적 변화들을 살펴보면 다음과 같음. 첫째, Protriptyline은 Kv channel의 inactivation voltage sensor에 영향을 미쳐 억제를 유발하였으며, 이러한 억제 효과는 Use(state, mainly closed state)-dependency하게 발생하였음. 또한 Kv channel의 하위 유형 중 Kv1.5 channel을 매개하여 억제가 유발됨을 확인 할 수 있었음. 둘째, Imipramine은 Kv channel의 activation voltage sensor에 영향을 미쳐 억제를 유발하였으며, 이러한 억제 효과는 Use(state, mainly closed state)-dependency하게 발생하였음. 또한 Kv channel의 하위 유형 중 Kv1.5 channel을 매개하여 억제가 유발되었으며 Imipramine 투여시 관상동맥이 수축함을 확인 할 수 있었음. 추가적으로 Imipramine에 의한 Kv channel의 억제 효과는 성별 (수컷 또는 암컷 토끼의 관상동맥)에 관계없이 발생함을 확인하였음. 셋째, Risperidone은 Kv channel의 activation과 inactivation voltage sensor에 영향을 미쳐 억제를 유발하였으며, 이러한 억제 효과는 Time-, Use(open and closed state)-dependency하게 발생하였음. 또한, Kv channel의 하위 유형 중 Kv1.5 channel을 부분적으로 매개하여 억제가 유발되었으며 Risperidone 투여 시 관상동맥 평활근세포막이 탈분극하고, 이로 인해 관상동맥이 수축함을 확인 할 수 있었음. 넷째, Ziprasidone은 Kv channel의 activation voltage sensor에 영향을 미쳐 억제를 유발하였으며, 이러한 억제 효과는 Use(open and closed state)-dependency하게 발생하였음. 또한, Kv channel의 하위 유형 중 Kv1.5, Kv2.1, Kv7 channel을 모두 부분적으로 매개하여 억제가 유발됨을 확인 할 수 있었음. 다섯째, Iloperidone은 Kv channel의 activation voltage sensor에 영향을 미쳐 억제를 유발하였으며, 이러한 억제 효과는 Use(open and closed state)-dependency하게 발생하였음. 또한 Kv channel의 하위 유형 중 Kv1.5 channel을 매개하여 억제가 유발됨을 확인 할 수 있었음. 결론적으로, 삼환계항우울제인 Protriptyline, Imipramine과 비정형항정신병제 Risperidone, Ziprasidone, Iloperidone 모두 기존의 약리 효과인 세로토닌 또는/그리고 도파민 수용체 억제 효과와 무관하게 토끼관상동맥에서 분리된 평활근세포의 Kv channel 전류를 서로 상이한 생리학적 기전으로 억제 하였음. 또한, 이들을 투여했을시 실제로 관상동맥 평활근세포막이 탈분극되고 이로 인해 관상동맥의 유의한 수축이 유발되었음. 본 연구결과는 임상에서 우울증 또는 조현병과 같은 정신질환 환자에게 삼환계 항우울제 또는 비정형 항정신병제를 처방 할 경우예기치 않은 심혈관계 부작용이 유발될 수 있는 가능성을 제시함. 더 나아가 정신과약물들의 사용에 따른 심혈관계 부작용에 대한 이해를 높임으로써 정신질환 환자에게 안전한 처방 가이드라인을 형성하기 위한 기초 연구자료가 될 것임. Part 2-1. We explore the inhibitory effects of protriptyline, a tricyclic antidepressant drug, on voltage-gated K+ (Kv) channels of rabbit coronary arterial smooth muscle cells (SMCs) using a whole-cell patch clamp technique. Protriptyline inhibited the vascular Kv channel current in a concentration-dependent manner, with an IC50 value of 5.05 ± 0.97 μM and a Hill cofficient of 0.73 ± 0.04. Protriptyline did not affect the steady-state activation kinetics. However, the drug shifted the steady-state inactivation curve to the left, suggesting that protriptyline inhibited the Kv channels by changing their voltage sensitivity. Application of 20 repetitive train pulses (1 or 2 Hz) progressively increased the protriptyline-induced inhibition of the Kv current, suggesting that protriptyline inhibited Kv channels in a use (state)-dependent manner. The extent of Kv current inhibition by protriptyline was similar during the first, second, and third step pulses. These results suggest that protriptyline-induced inhibition of the Kv current mainly occurs principally in the closed-state. The increase in the inactivation recovery time constant in the presence of protriptyline also supported use (state)-dependent inhibition of Kv channels by the drug. In the presence of the Kv1.5 inhibitor DPO-1, protriptyline did not induce further inhibition of the Kv channels. However, pretreatment with a Kv2.1 or Kv7 inhibitor (gungxitoxin or linopirdine) induced the further inhibition of Kv current to a similar to that observed with protriptyline alone. Thus, we conclude that protriptyline inhibited the vascular Kv channels in a concentration- and use (state, mainly closed state)-dependent manner by changing their gating properties regardless of its own function. Furthermore, protriptyline-induced inhibition of Kv currents mainly involves the Kv1.5 subtype. Part 2-2. Imipramine, a tricyclic antidepressant, is used in the treatment of depressive disorders. However, the effect of imipramine on vascular ion channels is unclear. Therefore, using a patch-clamp technique we examined the effect of imipramine on voltage-gated K+ (Kv) channels in freshly isolated rabbit coronary arterial smooth muscle cells (SMCs). Kv channels were inhibited by imipramine in a concentration-dependent manner, with an IC50 value of 5.55 ± 1.24 µM and a Hill coefficient of 0.73 ± 0.1. Application of imipramine shifted the steady-state activation curve in the positive direction, indicating that imipramine-induced inhibition of Kv channels was mediated by influencing the voltage sensors of the channels. The recovery time constants from Kv-channel inactivation were increased in the presence of imipramine. Furthermore, application of train pulses (of 1 or 2 Hz) progressively augmented the imipramine-induced inhibition of Kv channels, suggesting that the inhibitory effect of imipramine is use (state)-dependent. The magnitude of Kv current inhibition by imipramine was similar during the first, second, and third depolarizing steps. These results indicate that imipramine-induced inhibition of Kv channels mainly occurs in the closed state. The imipramine-mediated inhibition of Kv channels was associated with the Kv1.5 channel, not the Kv2.1 or Kv7 channel. Inhibition of Kv channels by imipramine caused vasoconstriction. From these results, we conclude that imipramine inhibits vascular Kv channels in a concentration- and use- (closed state)-dependent manner by changing their gating properties regardless of its own function. Part 2-3. We evaluated the inhibitory effects of the atypical antipsychotic drug risperidone on voltage-gated K+ (Kv) channels in rabbit coronary arterial SMCs using the whole-cell patchclamp technique. Risperidone suppressed Kv currents in reversible and concentration-dependent manners with an apparent half-maximal effective concentration (IC50 value) of 5.54 ± 0.66 μM and a slope factor of 1.22 ± 0.07. The inactivation of Kv currents was significantly accelerated by risperidone. The rate constants of association and dissociation for risperidone were 0.25 ± 0.01 μM–1s–1 and 1.36 ± 0.14 s–1, respectively. Application of risperidone shifted the steadystate activation curve in the positive direction and the inactivation curve in the negative direction, suggesting that the risperidone-induced inhibition of Kv channels was mediated by effects on the voltage sensors of the channels. Application of train pulses at 1 and 2 Hz led to a progressive increase in the blockage of Kv currents by risperidone. In addition, the recovery time constants from inactivation were extended in the presence of risperidone, indicating that risperidone inhibited Kv channels in a use (state)-dependent manner. Pretreatment with the Kv1.5 subtype inhibitor DPO-1 reduced the inhibitory effects of risperidone on Kv channels. However, pretreatment with a Kv2.1 or Kv7.X subtype inhibitor (guangxitoxin or linopirdine) did not affect the inhibitory effects of risperidone. Risperidone induced vasoconstriction and membrane depolarization. Based on these results, we conclude that risperidone inhibits Kv channels in a concentration-, time-, and state (open and closed)-dependent manners. Although risperidone concentration that we used exceeded the therapeutic concentration, our results should be taken into consideration when using risperidone to studythe kinetics of K+ channels in vascular smooth muscle. Part 2-4. We investigated the effect of ziprasidone, a widely used treatment for schizophrenia, on voltage-gated K+ (Kv) channels of coronary arterial smooth muscle cells (SMCs) using the patch-clamp technique.Ziprasidone dose-dependently inhibited Kv channels with an IC50 value of 0.39 ± 0.06μM and a Hill coefficient of 0.62 ± 0.03.Although ziprasidone had no effect on the steady-state inactivation kinetics of the Kv channels, the steady-state activation curve shifted towards a more positive potential.These results suggest that ziprasidone inhibits Kv channels by targeting their voltage sensors.The recovery time constant of Kv channel inactivation was increased in the presence of ziprasidone.Furthermore, application of train steps (of 1 and 2Hz) in the presence of ziprasidone led to a progressive increase in the blockade of Kv currents, suggesting that ziprasidone-induced inhibition of Kv channels is use (state)-dependent. Pretreatment with Kv1.5, Kv2.1, and/or Kv7 subtype inhibitors partially suppressed the ziprasidone-induced inhibition of Kv currents. These results suggest that ziprasidone inhibits vascular Kv channels through its effect on gating properties. The Kv channel-inhibiting action of ziprasidone is concentration- and use (state)-depedent. Part 2-5. Iloperidone, a second-generation atypical antipsychotic drug, is widely used in treatment of schizophrenia. However, the side effects of iloperidone on vascular K+ channels remain to be determined. Therefore, we explored the effect of iloperidone on voltage-gated K+ (Kv) channels in rabbit coronary arterial smooth muscle cells (SMCs) using the whole-cell patch-clamp technique. Iloperidone inhibited vascular Kv channels in a concentration-dependent manner with an IC50 of 2.11 ± 0.5 μM and a Hill coefficient of 0.68 ± 0.03. Iloperidone had no effect on the steady-state inactivation kinetics. However, it shifted the steady-state activation curve to the right, indicating that iloperidone inhibited Kv channels by influencing the voltage sensors. Application of 20 repetitive depolarizing steps (1 and 2 Hz) progressively increased the inhibition of the Kv current in the presence of iloperidone. Furthermore, iloperidone increased the recovery time constant from Kv channel inactivation, suggesting that iloperidone-induced inhibition of Kv channels is use (state)-dependent. Pretreatment with a Kv1.5 inhibitor (DPO-1) inhibited the Kv current to a level similar to that with iloperidone alone. However, pretreatment with a Kv2.1 or Kv7.X inhibitor (guangxitoxin or linopirdine) did not affect the inhibitory effect of iloperidone on Kv channels. Therefore, iloperidone directly inhibits Kv channels in a concentration- and use (state)-dependent manner independently of its antagonism of serotonin and dopamine receptors. Furthermore, the primary target of iloperidone is the Kv1.5 subtype.

순환 미세 세포밖 소포체의 AXL/MERTK 활성을 통한 혈관 평활근세포 증식 및 이동능 조절

이영주 서울대학교 대학원 2021 국내석사

혈관 질환의 손상된 혈관에서는 이를 회복하기 위해 혈관 평활근세포(Vascular smooth muscle cell, VSMC)의 증식과 이동이 촉진된다. 이로 인한 신생내막 증식(neointimal hyperplasia)은 혈관 질환 악화의 주요 기전이다. 특히 허혈성 심질환 등에서 사용되는 경피적 관상동맥 중재술 시 스텐트 삽입으로 인한 혈관 손상은 신생내막 증식을 유도하여 재협착(restenosis)을 일으킨다. 실제로 시술 후 30% 이상의 환자에서 6개월 내 재협착이 발생하여 장기적인 치료 성공에 걸림돌이 되고 있다. 따라서 혈관 평활근세포의 과도한 증식과 이동을 억제하는 것이 혈관 질환 치료의 주요 과제이다. 이를 해결하기 위한 노력으로 스텐트에 내막증식을 억제하는 약물을 도포한 약물 방출형 스텐트(drug eluting stent, DES)가 도입되었다. 현재 DES에는 주로 pAXLitaxel 과 sirolimus(rapamycin)을 도포하여 사용한다. 그러나 이들 약물은 혈관 평활근세포 뿐만 아니라 내피세포의 증식 또한 억제하는 비특이적인 기전을 가지고 있기 때문에 스텐트로 인한 혈전증의 빈도가 증가하게 된다. TAM 수용체(Tyro3/AXL/MERTK) 중 AXL은 혈관 평활근세포의 증식과 이동을 조절하는 수용체로 잘 알려져 있다. 혈관 손상 시 신생내막의 평활근세포에서 AXL 발현이 증가하며, 마찬가지로 혈관 손상 시 증가하는 TAM 수용체의 리간드인 Gas6와 AXL의 상호작용은 혈관 평활근세포의 증식과 이동을 증가시킨다. 그러나 다른 TAM 수용체인 MERTK의 역할에 대한 연구는 미비한 실정이다. 본 연구에서는 순환 미세 세포밖 소포체가 AXL, MERTK 두 수용체를 통하여 혈관 평활근세포의 증식과 이동능을 증가시키는 역할을 할 수 있다는 것을 규명하였다. 순환 미세 세포밖 소포체는 AXL, MERTK의 하위 신호인 FAK과 Akt 신호 전달 경로를 통하여 증식과 이동을 증가시키는 것을 확인하였다. 그동안 질병 상태 또는 특정 세포가 분비하는 미세 소포밖 소포체의 영향에 대해서는 연구가 활발히 이루어졌다. 본 연구에서는 정상 상태의 혈액에서 분리한 순환 미세 세포밖 소포체의 영향을 관찰함으로서 특정 상황의 미세 세포밖 소포체가 함유하는 단백질이나 RNA가 아닌 포스파티딜세린 막 구조 자체로 혈관 평활근세포의 증식과 이동을 증가시킨다는 것을 규명하였다. 한편으로 순환 미세 세포밖 소포체는 YAP 전사 인자를 활성화시킴으로서 AXL의 발현을 증가시키는 것을 관찰하였다. 따라서 AXL 양성 되먹임 고리 형성을 통한 AXL 신호 증폭에 관여할 수 있음을 제시하였다. 추가적으로 혈관 평활근세포에서 그 역할이 잘 알려지지 않았던 MERTK의 역할에 대해 규명하였으며 AXL, MERTK 두 수용체가 하위 신호를 공유하는 것을 확인하여 혈관 질환에서 AXL/MERTK 이중 억제제의 활용 가능성을 제시하였다. In damaged blood vessels of vascular disease, proliferation and migration of vascular smooth muscle cells (VSMCs) are promoted as a recovery mechanism. The resulting neointimal hyperplasia is a major mechanism for worsening vascular disease. In particular, vascular injury caused by stent insertion during percutaneous coronary intervention, which is used in ischemic heart disease, leads to neointimal hyperplasia, causing retenosis. In fact, more than 30% of patients have been diagnosed for restenosis within 6 months after the procedure, hindering the success of long-term treatment. Therefore, inhibiting excessive proliferation and migration of vascular smooth muscle cells is a major challenge in treating vascular diseases. In an effort to overcome, drug-eluting stent (DES) was introduced with drugs that inhibit neointimal hyperplasia. Currently, pAXLitaxel and sirolimus (rapamycin) are applied to DES. However, these drugs have a nonspecific mechanism that inhibits proliferation of endothelial cells as well as vascular smooth muscle cells, which increases the frequency of stent-induced thrombosis. Among TAM receptors (Tyro3/AXL/MERTK), AXL is well known as a receptor that regulates the proliferation and migration of vascular smooth muscle cells. The interaction of AXL and GAS6, the ligands of TAM receptors that increase with vascular damage, promotes the proliferation and migration of vascular smooth muscle cells. However, research on the 0role of MERTK, another TAM receptor, is insufficient. In this study we identified that circulating small extracellular vesicles can play a role in increasing the proliferation and mobility of vascular smooth muscle cells through two receptors, AXL and MERTK. Our results suggest tha csEV activates FAK and Akt signaling pathways of AXL and MERTK to increase proliferation and migration. Until now, research has been actively conducted on the effects of extracellular vesicles secreted by certain cells of in a particular disease status. In this study, the effects of csEV separated from normal serum are observed to increase the proliferation and migration of vascular smooth muscle cells by the phosphatidylserine membrane structure itself, not the protein or RNA contained in a particular situation. csEV increased the expression of AXL by activating the YAP transcription factor. Therefore, the result here demonstrate that csEV develop AXL-positive feedback loop to amplificate AXL signal. Furthermore, we have identified the role of MERTK, whose role in vascular smooth muscle cells was not well clarified, and provided new insights into the availability of AXL/MERTK dual inhibitors in vascular diseases as both AXL and MERTK receptors share sub-signals.

Role of vascular smooth muscle cells in the pathogenesis of cranial vascular diseases : Matrix metalloproteinase and angiogenesis-related factor production by vascular smooth muscle cells

김경민 고려대학교 대학원 2013 국내박사

Purpose : The aim of this study is to investigate the capability of vascular smooth muscle cells (VSMC) to produce matrix metalloproteinase (MMP) and angiogenesis-related cytokines in response to proinflammatory cytokine. Materials and Methods : Human arterial wall tissues were obtained during brain surgery. VSMCs were isolated and cultured. To confirm that the cells were VSMCs and that the VSMC cultures were not contaminated with endothelial cells, immunohistochemical staining was performed using α smooth muscle cell actin (αSMA), CD31 and CD34. Cultured VSMCs were stimulated by 1 ng/ml, 10 ng/ml and 100 ng/ml of tumor necrosis factor-α (TNF-α) and afterwards MMP-1, -3 and –9 concentrations, produced by VSMCs, in the conditioned media were assayed by Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using commercially available kits following manufacturer’s instructions. Concentrations of angiogenesis-related factors [IL-6, IL-8, IL-17, vascular endothelial growth factor (VEGF), and interferon-γ (IFN-γ)] from VSMCs were also assayed by ELISA. Cytotoxicity test was performed using Cell counting kit-8 (CCK-8) to test the cytotoxicity of various concentrations of TNF-α. Result : VSMCs were successfully isolated and cultured from superfical temporal artery tissues. Cultured VSMCs appeared morphologically spindle-shaped. Using immunocytochemical staining, all cells expressed αSMA, strongly suggesting the SMC-type origin of the cells. VSMCs produced detectable amounts of MMP-1 in basal condition. MMP-1 production by VSMCs showed a time-dependent pattern after TNF-α stimulation. MMP-1 was not upregulated in response to TNF-α. However, TNF-α increased MMP-3 production by the VSMCs. MMP-3 production by VSMCs also manifested a time-dependent pattern after TNF-α stimulation. MMP-3 production showed a concentration-dependent pattern after TNF-α stimulation. TNF-α increased IL-6, IL-8 and VEGF productions by the VSMCs. IL-17 and IFN -γ were not produced by VSMCs regardless of TNF-α stimulation. IL-6, IL-8 and VEGF production by VSMCs showed concentration-dependent curves and time-dependent curves in TNF-α groups. Conclusion : VSMCs produced MMP-3 in response to TNF-α stimulation with time- and concentration-dependent patterns. VSMCs also produced angiogenesis-related cytokines, such as IL-6, IL-8 and VEGF, in response to TNF-α-stimulation. VSMCs may play an important role in the pathogenesis of cranial vascular diseases by producing MMPs and angiogenesis-related cytokines.

Vascular smooth muscle cell-specific TXNIP deficiency ameliorates vascular calcification

Ae-rang, Hwang 영남대학교 대학원 2023 국내박사

혈관석회화는 주로 신장질환 환자에서 발생하며 흡연, 고령, 당뇨병, 고혈압, 폐경기, 골다공증 등의 위험인자를 가진 환자에서 유병률이 더 높다. 이전 연구에서는 산화스트레스와 염증 반응이 혈관 석회화 발생에 관여한다고 제시된 바 있다. Thioredoxin-interacting protein(TXNIP)은 활성산소 생성 및 염증복합체(inflammasome) 활성화에 대한 양성 조절인자로 알려져 있지만 그럼에도 불구하고 혈관석회화 발생에 있어서 TXNIP의 역할은 알려져 있지 않았다. 본 연구의 목적은 세포 및 질환동물모델을 이용하여 혈관석회화 조절에 있어 TXNIP의 잠재적인 역할을 제시하는 것이다. 5/6 신장절제 마우스 모델과 사람의 신장경화증 및 당뇨병과 같은 석회화 유발 대사 질환에서 TXNIP유전자 발현의 증가를 확인하였고, 일차 평활근세포 및 비타민 D3(1,25(OH)2D3)에 의한 혈관 석회화 마우스 모델에서 TXNIP 발현 및 칼슘 축적 정도가 증가된 것을 확인하였다. 대조적으로 TXNIP 발현 및 혈관 석회화는 TXNIP WT 대조군 생쥐에 비해 TXNIP SMCKO 생쥐에서 유의하게 감소되었다. 비타민 D3 및 무기 인산염 유도로 인한 혈관평활근세포에서 TXNIP의 역할은 TXNIP WT 대조군 생쥐에 비해 TXNIP smcKO 생쥐에서 칼슘침착, alkaline phosphatase 활성을 억제시켰다. 또한 활성산소 생성, 염증복합체 활성화를 억제하였으며 혈관평활근세포 분화 마커, 골아세포 마커의 발현이 TXNIP smcKO 생쥐에서 현저히 감소되었다. 더 나아가 TXNIP 과발현은 일차 혈관평활근세포에서 골아세포 관련 유전자의 발현 및 미토콘드리아 유래 산화스트레스의 생성을 촉진하였으며 TXNIP 결손은 미토콘드리아 기능을 회복하였으며 석회화를 약화시켰다. 이러한 결과는 평활근세포에서 TXNIP의 유도가 혈관석회화 유발에 중요한 요인임을 나타내며 산화 스트레스와 염증 반응의 중요한 매개체로 알려진 TXNIP을 표적으로 하는 것은 혈관석회화를 조절하는 효과적인 전략이 될 수 있음을 시사한다. Vascular calcification mainly occurs in patients with kidney disease, and the prevalence is higher in patients with risk factors such as smoking, old age, diabetes mellitus, high blood pressure, menopause, and osteoporosis. Oxidative stress and inflammatory responses are known to participate in the development of vascular calcification. Although thioredoxin interacting protein (TXNIP) is known as a positive regulator for reactive oxygen species (ROS) generation and inflammasome activation, its role in the development of vascular calcification has not been reported. This study aimed to identify the role of TXNIP in regulating vascular calcification in vitro and in vivo. In human and 5/6 nephrectomy mice model, metabolic risk factors, such as nephropathy and diabetes increased TXNIP gene expression. In addition, in this study, primary smooth muscle cell and vitamin D3 induced calcification mouse models were used to find that administering vitamin D3 (1,25(OH)2D3) increased the protein levels of TXNIP and calcium accumulation in the vascular smooth muscle layer compared to those in the vehicle control. In contrast, TXNIP expression and vascular calcification induced by vitamin D3 were significantly reduced in the TXNIP SMCKO mice compared to that in littermate control mice. Thus, the data suggest that TXNIP is responsible for the development of vascular calcification in vivo. To verify the role of TXNIP in smooth muscle cells, primary mouse vascular smooth muscle cells from TXNIP SMCKO mice were subjected to vitamin D3 and inorganic phosphate–induced calcification in vitro. ROS generation, inflammasome activation, calcium deposition, alkaline phosphatase activity, osteoblast–like differentiation markers, and calcification were significantly inhibited in vascular smooth muscle cells from TXNIP SMCKO mice compared to those in littermate control mice. Moreover, the overexpression of TXNIP promoted the expression of calcification–related genes in primary smooth muscle cells and mitochondria–derived oxidative stress in TXNIP WT mice, inducing osteogenic differentiation of vascular smooth muscle cells. In contrast, TXNIP knockdown mice showed reduced calcification and restoration of the mitochondrial function. These results indicate that smooth muscle cell-dependent TXNIP induction is crucial for vascular calcification. Taken together, targeting TXNIP, which is known as an important mediator of oxidative stress and inflammatory response, is an effective strategy for regulating vascular calcification and will provide an opportunity to develop therapeutic agents for vascular calcification.

TLR2 accelerates atherosclerosis through KLF4 in vascular smooth muscle cells

임주연 Graduate School, Yonsei University 2023 국내박사

Atherosclerosis is a chronic inflammatory disease that is caused by lipid accumulation in blood vessel walls, namely in macrophage foam cells and vascular smooth muscle cells. Accumulation of lipids induces an inflammatory response and accelerates vascular disease. Among the toll-like receptors (TLRs), TLR2 is an initiator and early inflammatory factor in atherosclerosis. Early atherosclerosis progresses due to lipid accumulation, leukocyte accumulation, and foam cell formation. Atherosclerosis is a vascular disease; however, studies on the function of TLR2 in vascular smooth muscle cells are insufficient. The activation of TLR2 signaling has an important role in promoting accumulation of lipids and phenotypic switching in vascular smooth muscle cells (VSMCs). Therefore, this study aimed to elucidate the effect of Krupple-like factor 4 (KLF4) regulation through TLR2 signaling, on the phenotype switching and acceleration of atherosclerosis in a cholesterol- treated vascular smooth muscle. Primary cells isolated from the whole aorta vascular smooth muscle cells of rats were treated with TLR2 siRNA and cholesterol (20 µg/ml) for 48 h. The expression of RNA and proteins associated with VSMC phenotype switching and signaling was analyzed using RT-PCR and western blotting. Caffeic acid phenylethyl ester (CAPE), an inhibitor of nuclear factor-kappa B (NF-kB) blocked the inflammation and phenotypic switching associated with KLF4 promoter binding. In this study, to investigate the acceleration of atherosclerosis and the underlying molecular mechanism of TLR2 action, a cholesterol-induced atherosclerosis mouse model was developed with overexpression of TLR2 specifically in the VSMCs. The mice were administered tamoxifen via intraperitoneal injection once every 24 hours for a total of 5 consecutive days and were fed a high-cholesterol diet to induce atherosclerosis over 8 weeks. The mouse model with the TLR2Tg SM22αCre+ ApoE-/- genotype showed lower expression of contractile markers (smooth muscle protein 22α, α-smooth muscle actin) and a higher expression of macrophage markers (CD68, Mac2) and KLF4, when compared to hat in SM22αCre+ ApoE-/- mice. In this study, to identify the acceleration of atherosclerosis, the molecular mechanism underlying TLR2 action was elucidated using an atherosclerosis disease model, in which the overexpression of TLR2 was induced specifically in vascular smooth muscle cells, and cholesterol was used for induction. Acceleration of TLR2 by cholesterol confirmed that KLF4 regulation through NF-kB activity affects VSMC phenotypic switching and the promotion of atherosclerosis. 죽상 동맥경화증은 만성 염증성 질환으로 혈관벽에 있는 플락이 혈관벽과 혈관 내피세포 및 혈관 평활근 세포내 지질 축적과 같은 합병증을 초래한다. 이러한 혈관의 지질 축적은 염증 반응을 유도하여 혈관 질환을 가속화시킨다. 이러한 TLRs의 발현 중 TLR2는 죽상 동맥경화증의 개시제 및 초기 염증 인자 이며, 지질 축적 및 백혈구 축적과 거품 세포 형성으로 인해 초기 죽상경화증 이 진행된다. 이러한 동맥경화증은 혈관 질환이지만 혈관 내피세포에서 활발 하게 연구가 진행되어 왔으며, 혈관 평활근 세포는 혈관벽의 구조적인 역할로 만 알려져 있다. 최근에는 죽상 동맥경화증에서의 혈관 평활근 세포에 대한 연구가 차지하는 비중이 높아지고 있는 추세이다. 하지만 죽상동맥경화증에서 의 혈관 평활근 세포에서 TLR2의 기능에 대한 연구는 부족한 실정이다. TLR2 신호전달의 활성화는 지질 축적 및 혈관 평활근 세포 표현형 전환을 촉진하는 데 중요한 역할을 한다. Rat 대동맥의 전체 혈관 평활근 세포에서 분리한 primary cell에서 TLR2 siRNA와 콜레스테롤을 48시간동안 처리하였다. 표현형 전환 및 신호 메커니즘과 관련된 RNA 및 단백질 발현을 RT-PCR 및 웨스턴 블롯으로 분석하였다. 또한 VSMC 표현형 전환의 중요 인자로 알려진 KLF4의 활성 및 발현을 증가시키는 NF-kB의 인산화를 확인하였다. NF-kB의 억제제인 카페산 페닐에틸 에스테르 (CAPE)는 염증 및 KLF4 및 표현형 전환을 억제하 였다. 본 연구에서는 죽상 동맥경화증의 촉진을 조사하기 위해 콜레스테롤 유도에 의한 TLR2의 분자생물학적 기전을 VSMC에서 특이적으로 TLR2 과 발현 이 유도되는 마우스 죽상동맥경화증 질환 모델을 사용하여 콜레스테롤에 의해 TLR2 과발현으로 인해 동맥경화 촉진이 가속화 됨을 확인하였다.총 5일동안 24시간 마다 복강내 주사를 통해 타목시펜을 투여하고 8주동안 죽상동맥경화증을 유발하기 위해 고콜레스테롤 식이를 공급하였다. 또한, 생체 내에서 TLR2Tg SM22αCre+ ApoE-/- 유전자형으로 생산된 마우스 모델에서 SM22αCre+ ApoE-/- 마우스와 비교했을 때, 수축성 마커 SM22α, αSM-actin의 낮은 단백질 발현과 대식세포 마커의 CD68, Mac2 및 KLF4 높은 단백질 발현 을 보였습니다. 또한, 콜레스테롤에 의해 증가된 TLR2가 NF-kB 활성을 통해 전사 인자인 KLF4의 발현을 증가시켜 혈관 평활근 세포 전환을 유도하였다.본 연구는 콜레스테롤 처리된 혈관 평활근 세포에서 콜레스테롤에 의해 TLR2 신호 가속화는 NF-kB 인산화를 통해 KLF4 조절이 VSMC 표현형 전환 및 죽상동맥경화증의 촉진에 미치는 영향을 조사하였다.

Exosomal miRNAs derived from PDGF-stimulated vascular smooth muscle cells

Jeongyeon Heo 인천대학교 대학원 2022 국내박사

Roles of Long Noncoding RNAs in the Differentiation of Vascular Smooth Muscle Cells

임영환 전남대학교 2022 국내박사

Long noncoding RNAs (lncRNAs) are a large class of regulatory RNAs with diverse roles in cellular processes, and thousands of them have been discovered. In addition, it has recently been shown that lncRNAs are implicated in many pathophysiological processes, including vascular remodeling and atherosclerosis. However, the functional role of lncRNAs in the differentiation, proliferation, and apoptosis of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is unclear because no comprehensive analysis of lncRNAs during this process has been performed. Thus, the purpose of this study is to find lncRNAs that regulate cellular processes in VSMCs implicated in various vascular diseases and suggest them as therapeutic targets and diagnostic markers. In my first study, by combining diverse RNA sequencing (RNA-seq) datasets obtained from public database, I discovered lncRNAs that could behave as regulators in the differentiation of smooth or skeletal muscle cells. These analyses confirmed the roles of previously reported lncRNAs in this process. Moreover, I discovered dozens of novel lncRNAs whose expression patterns suggested their possible involvement in the phenotypic switch of VSMCs. The comparison of lncRNA expression change suggested that many lncRNAs have common roles during the differentiation of smooth and skeletal muscles, while some lncRNAs may have opposite roles in this process. The expression change of lncRNAs was highly correlated with that of their neighboring genes, suggesting that they may function as cis-acting lncRNAs. Furthermore, within the lncRNA sequences, there were binding sites for miRNAs with expression levels inversely correlated with the expression of corresponding lncRNAs during differentiation, suggesting a possible role of these lncRNAs as competing endogenous RNAs. The lncRNAs identified in this study will be a useful resource for future studies of gene regulation during muscle differentiation. In my second study, differentially expressed lncRNAs in synthetic and contractile human VSMCs were screened using RNA-seq. Among the seven selected lncRNAs, the expression of MSC-AS1, MBNL1-AS1, and GAS6-AS2 was upregulated, whereas the expression of NR2F1-AS1, FUT8-AS1, FOXC2-AS1, and CTD-2207P18.2 was reduced upon VSMC differentiation. I focused on the NR2F1-AS1 and FOXC2-AS1 lncRNAs and showed that their knockdown significantly reduced the expression of smooth muscle contractile genes (ACTA2, CNN1, and TAGLN). Furthermore, FOXC2-AS1 was found to regulate cell proliferation and apoptosis through AKT/mTOR signaling and affect NOTCH signaling, which is a key regulator of the contractile phenotype of VSMCs. Taken together, I identified novel lncRNAs involved in VSMC proliferation and differentiation and FOXC2-AS1 as a multifunctional regulator for vascular homeostasis and associated diseases. 긴 비암호화 RNA는 세포 내 과정에서 다양한 역할을 하는 조절 RNA의 큰 부류이며 수천 개가 발견되었다. 또한, 긴 비암호화 RNA가 혈관 리모델링 및 죽상 동맥경화증을 비롯한 다양한 혈관 질환의 병태생리학적 과정에 연루되어 있음이 최근에 밝혀졌다. 그러나 이 과정에서 긴 비암호화 RNA에 대한 포괄적인 분석이 수행되지 않았기 때문에 혈관 평활근 세포의 분화, 증식 및 세포자멸사에서 긴 비암호화 RNA의 역할은 불분명하다. 따라서, 본 연구를 통해 다양한 혈관 질환에 관여하고 혈관 평활근 세포 내 기능을 조절할 수 있는 긴 비암호화 RNA를 찾아 질환의 치료 표적 및 진단 마커로 제안하고자 한다. 첫 번째 연구에서는 공개된 데이터베이스로부터 얻은 다양한 RNA 시퀀싱 데이터 세트를 분석하여 평활근 또는 골격근 세포의 분화에서 조절자 역할을 할 수 있는 긴 비암호화 RNA를 발견했다. 분석을 하는 과정에서 이전에 보고된 긴 비암호화 RNA의 역할을 확인했다. 또한, 혈관 평활근 세포의 표현형 전환에 관여할 가능성이 있는 수십개의 새로운 긴 비암호화 RNA의 발현 패턴을 발견했다. 이러한 발현 변화의 비교 분석을 통해 평활근과 골격근의 분화 과정에서 다수의 긴 비암호화 RNA가 공통적인 역할을 하는 반면, 일부는 반대의 역할을 할 수 있음을 확인했다. 긴 비암호화 RNA와 이웃 유전자의 발현 변화는 높은 상관관계를 나타냈으며, 이는 긴 비암호화 RNA가 cis-acting 방식을 통해 기능할 수 있음을 의미한다. 또한, 분화 동안 상응하는 긴 비암호화 RNA와 반비례하는 발현 수준을 가진 마이크로 RNA가 발견되었고, 이 마이크로 RNA에 대한 결합 부위가 긴 비암호화 RNA의 서열상에서 확인되었다. 이는 긴 비암호화 RNA가 경쟁 내인성 RNA로서 마이크로 RNA를 조절할 수 있음을 암시한다. 이 연구에서 확인된 긴 비암호화 RNA는 근육 분화 중 유전자 조절에 대한 향후 연구에 유용한 자원이 될 것으로 예상된다. 다음으로 RNA 시퀀싱을 사용하여 증식성 및 수축성 인간 혈관 평활근 세포에서 차등적으로 발현하는 긴 비암호화 RNA를 선별했다. 분화 동안 선정된 7개의 긴 비암호화 RNA 중 MSC-AS1, MBNL1-AS1 및 GAS6-AS2의 발현은 증가한 반면, NR2F1-AS1, FUT8-AS1, FOXC2-AS1 및 CTD-2207P18.2의 발현은 감소했다. 저자는 NR2F1-AS1과 FOXC2-AS1에 초점을 맞추고, 두 긴 비암호화 RNA의 녹다운이 평활근 수축 관련 유전자의 발현을 유의하게 감소시킨다는 것을 확인했다. 나아가, FOXC2-AS1은 AKT/mTOR 신호 전달을 통해 세포 증식 및 세포 자멸사를 조절하고, 혈관 평활근 세포의 수축성 표현형 핵심 조절자인 NOTCH 신호 전달에도 영향을 준다는 사실을 확인하였다. 결과적으로 본 연구를 통해 혈관 평활근 세포의 증식 및 분화와 관련된 다수의 새로운 긴 비암호화 RNA를 발굴했으며, FOXC2-AS1이 혈관 항상성 및 관련 질병에 대한 조절자로서 가능성이 있음을 제시하였다.

In vitro differentiation of muscle-derived stem cells and their potential role in attenuation of abdominal aortic aneurysm formation

박형섭 서울대학교 대학원 2013 국내석사

Introduction: Abdominal aortic aneurysms (AAA) are a growing problem worldwide, yet there is no known medical therapy. The pathogenesis involves degradation of the elastic lamina by two combined mechanisms: increased degradation of elastin by matrix metalloproteinases (MMP) and decreased formation of elastin due to apoptosis of vascular smooth muscle cells (VSMC). In this study, we set out to examine the ability of muscle-derived stem cells (MDSC) to differentiate to VSMCs in vitro, and their potential role in the attenuation of AAA formation by inhibition of these pathogenetic mechanisms. Methods: Muscle-derived stem cells were isolated from murine skeletal muscles using a modified preplate technique. These cells were stimulated with PDGF-BB in vitro for differentiation to VSMC-like progenitor cells (VSMC-PC) and were subsequently implanted into elastase-induced AAAs in rats. After 6 weeks, the aortas were harvested and the formation of AAA was investigated. Immunohistochemical staining, RT-PCR, western blot and gel zymography for MMPs were performed and compared to a control group. Results: Isolated MDSCs showed characteristic expression of markers Sca-1 and CD34. When stimulated in vitro with PDGF-BB, the cells showed expression of α-SMA, a specific marker for smooth muscle cells. In vivo studies of elastase-perfused AAAs showed that the cell therapy group had decreased rate of aneurysm formation compared to control (83% vs. 50%), and MMP expressions at the genetic, protein and enzymatic levels were significantly decreased in the cell therapy group. Furthermore, direct implantation of VSMC-PCs in the intima of harvested aortas was visualized under immunofluorescent staining, suggesting that these cells were responsible for the inhibition of MMPs and consequent attenuation of AAA formation. Conclusions: These results show a promising role of stem cell therapy for the treatment of AAAs, and with further studies, may be able to reach clinical significance.