(The) responsiveness of bee venom phospholipase A2 on regulatory T cells correlates with the CD11c+CD206+population in human peripheral blood mononuclear cells

조희진 경희대학교 대학원 2019 국내박사

Bee venom phospholipase A2 (bvPLA2) is the second most abundant active component of bee venom. Recently it has been reported to have many therapeutic effects such as neuroprotection, anti-inflammation, anti-nociception, anti-cancer properties, caused by increasing regulatory T cells (Tregs). The mechanism of Tregs modulation by bvPLA2 has been demonstrated by binding with the mannose CD206 receptor in experimental models of several diseases. The purpose of this study was to confirm whether bvPLA2 would increase the proportion of Tregs in the peripheral blood of healthy humans, and to investigate the correlation between the CD206-positive population of human peripheral blood mononuclear cells (hPBMCs) and the capacity for expansion of Tregs by bvPLA2. Peripheral blood samples were collected from healthy donors and the percentages of monocyte-derived dendritic cells with the CD206 receptor were analyzed. The blood samples were divided into two groups, one of which was treated with bvPLA2 and the other treated with PBS, as a control. The proportions of cell types were measured using flow cytometry. First, the proportions of total Tregs after expansion were compared between cell populations treated with bvPLA2 and those treated with PBS. Second, the subpopulations of Tregs, including naïve Tregs and inflammatory Tregs, were analyzed to demonstrate the changes in total Tregs. Then, the correlations between the CD206 populations and the changes in number of Tregs in both the bvPLA2 and PBS groups were analyzed. The percentage of total Tregs tended to be higher in the bvPLA2 group than in the control group. The percentages of both naïve Tregs and inflammatory Tregs were higher in the bvPLA2 group. The mean difference in naïve Tregs between the bvPLA2 group and the control group was larger than that in inflammatory Tregs. There were significant positive correlations between the CD206 populations in hPBMC and the proportions of Tregs treated with bvPLA2, especially in the Treg fold change comparing the increase ratio of Tregs in bvPLA2 and in PBS. This study indicated that bvPLA2 increased the proportion of Tregs in healthy human peripheral blood. Among the total Tregs, the major increase was in naïve Tregs. The number of CD206+ dendritic cells in human peripheral blood could be a predictor of the bvPLA2 response of different individuals. 봉독 phospholipase A2는 봉독의 활성 성분 중 하나로 두번째로 많은 효소이다. 최근 봉독 phospholipase A2가 조절 T 세포를 증가시켜서 신경 보호 효과, 항염 진통 효과, 항암 효과 등 다양한 치료 효과를 나타낸다는 연구들이 보고되었다. 조절 T 세포를 조정하는 기전은 여러 질환의 실험 모델에서 mannose CD206 수용체와 결합하여 나타나는 것으로 설명되었다. 본 연구는 봉독 phospholipase A2가 건강한 인간 말초 혈액에서도 조절 T 세포 비율을 늘리는지 확인하고, 인간 말초 혈액 단핵 세포 내 CD206 수용체를 갖는 수지상세포의 비율과 봉독 phospholipase A2로 인한 조절 T 세포 증식 정도가 연관성이 있는지 탐색해보고자 하였다. 건강한 자원자들로부터 말초 혈액 표본들을 수집하여, 조절 T 세포 증식 전 단핵세포에서 기원하였으며 CD206수용체가 있는 수지상세포 비율을 분석하였다. 이후 혈액 표본을 각각 두 개의 군으로 나누어 조절 T 세포로 증식시키는 과정 중 실험군에는 봉독 phospholipase A2를 가하고, 대조군에는 PBS를 가하였다. 세포의 비율은 유세포 분석 기법을 통해 분석되었으며, 증식 후 실험군과 대조군에서의 총 조절 T 세포의 비율을 비교하였다. 이후 총 조절 T 세포 내 증가를 설명하기 위해 미접촉 조절 T 세포 또는 염증성 조절 T 세포 등 조절 T 세포의 하위 집단을 분석하였다. 마지막으로 각각 실험군과 대조군에서 조절 T 세포의 양적 변화가 CD206 수용체를 갖고 있는 수지상세포 비율간 연관성을 갖는지 분석하였다. 그 결과 봉독 phospholipase A2를 가한 실험군이 대조군보다 총 조절 T 세포 비율이 높은 경향을 보였다. 미접촉 조절 T 세포와 염증성 조절 T 세포도 대조군보다 실험군에서 비율이 높은 경향이었으나, 총 조절 T 세포 내에서 염증성 조절 T 세포보다 미접촉 조절 T 세포가 주로 증가하였다. 인간 말초 혈액 단핵 세포 내 CD206 수용체를 갖는 수지상세포 비율과 봉독 phospholipase A2 군에서 조절 T 세포의 비율은 모두 양의 상관관계를 보였으며, 특히 PBS와 봉독 phospholipase에서 총 조절 T 세포가 증가한 비율을 비교한 Treg fold change에서 상관계수가 가장 높았다. 따라서, 본 연구는 봉독 phospholipase A2가 건강한 인간 말초 혈액 내에서 조절 T세포 비율을 증가시키는 경향이 있고, 총 조절 T 세포 중에서도 미접촉 조절 T 세포가 비율 증가에 주로 영향을 미치는 것을 밝혔다. 또한, 인체 혈액 내에서 CD206 양성 수지상세포의 구성비가 봉독 phospholipase A2에 대한 조절 T 세포 증식 정도의 개인차와 개인별 효과 예측 인자로서 활용 가능함을 확인한 데 의의가 있다.

In planta maternal haploid induction by MTL/NLD/ZmPLA1 homologous gene editing and enhancement of turnip crinkle virus resistance by overexpressing pPLAIIIα

장진훈 전남대학교 2023 국내박사

Phospholipase를 이용한 시간-온도 지시계의 개발

이창희 서울大學校 大學院 1990 국내석사

Phosphatidylcholine의 감소에 의한 호모시스테인의 혈관내피세포 사멸 및 동맥경화증 유도

김혁중 울산대학교 대학원 2014 국내석사

고호모시스테인 혈증은 동맥경화의 위험인자로 간주되고 있다. 그러나 호모시스테인이 동맥경화를 일으키는 생화학기전은 아직 확립되지 않았다. 최근 지질 대사체가 동맥경화증의 병리기전에 중요한 역할을 한다는 것이 밝혀지고 있어, 본 연구에서는 호모시스테인에 의한 지질 대사의 변화가 동맥경화증 발생에 기여하는지 알아보고자 하였다. 호모시스테인을 처리한 인간 대동맥 내피 세포(human aortic endothelial cells; HAEC)에서 염증과 세포사멸이 유도되었으며, 호모시스테인은 phosphatidylcholine (PC)를 저하시키는 두 효소인 Sphingomyelin synthase 1(SMS1)과 Calcium independent phospholipase(iPLA2)의 발현을 증가시켰다. SMS1과 iPLA2의 억제는 호모시스테인을 통해 유도되는 염증과 세포사멸 반응을 막았다. 이 결과들을 토대로 세포 내 PC농도의 감소가 호모시스테인으로 유발된 염증 및 세포사멸과 SMS/iPLA2 억제에 의한 예방의 공통 분모일 것으로 추정하였다. 인간 대동맥 내피 세포PC의 전구체인 CDP-choline을 처리했을 때 호모시스테인으로 인한 세포사멸이 예방되었다. 메티오닌이 보충된 고지방 다이어트를 먹인 고호모시스테인혈증 쥐와 Apolipoprotein E-결핍 쥐에서 관찰된 혈관내피 기능장애 및 동맥경화증 발생이 콩에서 추출한 PC를 보충됐을 때 각각 감소 하였다. 결론적으로, 본 연구의 결과는 혈관 내피 세포에서 호모시스테인에 의한 동맥 경화증 발생이 SMS1과 iPLA2 증가를 통한PC 분해의 증가에 의한 것임을 보여주었다. 혈관 내피 세포에서 PC 고갈을 방지 할 수 있는 방법이 고호모시스테인혈증에 의한 동맥경화증에 대한 새로운 치료 전략이 될 수 있을 것이다. Hyperhomocysteinemia is a risk factor for atherosclerosis. However, biochemical mechanisms linking homocysteine with atherosclerosis are not yet clear. Here we show that treatment of human aortic endothelial cells (HAEC) with homocysteine (Hcy) induced apoptosis by depleting phosphatidylcholine (PC). Hcy increased the expression of sphingomyelin synthase 1 (SMS1) and calcium-independent phospholipase A2 (iPLA2), two enzymes that degrade PC. Inhibition of the SMS1 and iPLA2 prevented Hcy-induced apoptosis.. Endothelial dysfunction and increased atherosclerosis observed in ApoE -/- mice fed folate deficient diet with methionine supplementation were prevented by supplementation with PC extracted from soybean. Taken together, our results strongly suggest that pro-atherosclerotic actions of homocysteine in vascular endothelium are mediated by increased PC breakdown. Measures that can prevent PC depletion in vascular endothelial cells may be a new therapeutic strategy for atherosclerosis in subject with HHcy.

Enzymatic and physiological characterization of sn-1 specific acylhydrolase families in higher plants

김은유 Graduate School, Yonsei University 2010 국내박사

Phospholipase C 억제제가 Coprinus cinereus의 성장에 미치는 영향

이경진 경상대학교 대학원 2010 국내석사

The role of phospholipase C has been studied in various biological species including mammala, yeast and bacteria. However, the function study of PLC has not been reported in basidiomycete. From database, three types of putative phospholipase C was identified in Coprinus cinereus, designated CcPLC1 (EAU81283.1), CcPLC2 (EAU81219.1) and CcPLC3 (EAU83602.1). To investigate the role of PLCs of C. cinereus, the effect of phospholipase C inhibitor on the growth of C. cinereus was observed the hypha growth of C. cinereus was inhibited about 30% at 3 days culture. In addition, the germination of basidiospore and oidia was reverely inhibited at 20 hours culture. In the presence of inhibitor, hook shaped hypha tip was observed by microscope. Irregular clamp connection was also observed. Therefore, it was concluded phospholipase C may play an important role in the growth of C. cinereus, especially formation of cell wall.

항원에 의해 자극된 비만세포에서 Syk의 활성화를 위한 Phospholipase D2의 역학

이준호 건국대학교 2006 국내박사

한글초록 : IgE에 의해 매개되는 비만세포의 앨러지 반응에 있어 Phospholipase D1과 D2는 비만세포를 활성화시키는데 있어 중요한 역할을 한다고 알려져 있으나, 정확한 기전은 아직 알려져 있지 않다.본 연구에서는 FcRI을 통한 비만세포의 신호전달경로에 있어 Phospholipase D2가 어떠한 역할을 하는지에 대해 다양한 연구기법을 통하여 규명하고자 하였다. 그 결과, Immunoprecipitation (IP) 방법을 통해 Phospholipase D2가 비만세포 활성화 신호전달계에서 중요한 Syk kinase 와 결합함을 확인하였고, 그 결합은 Syk kinase의 tyrosine 잔기의 인산화에 의존적이나 Phospholipase D2의 인산화나 활성과는 관련이 없는 것을 확인하였다. 이러한 결합을 통하여 Syk kinase의 인산화와 활성이 증가하였으며, LAT 및 SLP-76을 포함한 하위 신호전달계의 활성화 유도를 통해 비만세포를 활성화시키는 것으로 확인되었다. In vitro 실험을 통해 Phospholipase D2의 Phox homology (PX) domain과 Syk kinase의 317번 위치의 tyrosine 잔기가 서로 결합한다는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 항원에 의해 자극된 비만세포에서 Phospholipase D2의 역할로서 그 활성화 산물인 phosphatidic acid를 통하지 않은 Syk kinase 의 활성화를 위한 adaptor 단백질로서의 기능을 밝힌 것으로 Phospholipase D2 연구의 큰 전기가 될 것으로 생각되며, 더 나아가 다른 세포에서의 Phospholipase D2 기능연구에도 많은 파급효과를 있을 것으로 기대된다.또한, 본 연구에서는 RBL-2H3 비만세포를 이용하여 다양한 생약 추출물의 탈과립 억제정도를 검색한 결과, 천초근, 빈랑, 구절초 등의 생약이 항앨러지 효과가 있음을 확인하였으며, compound 48/80에 의해 유도된 아나필락시스 동물모델에서도 통계적으로 유의한 억제효과를 확인 하였다. 기전으로 생약추출물들은 비만세포의 활성화에 중요한 Syk kinase 및 MAPK 인산화를 억제시켰다. 이러한 연구결과를 종합할 때 천초근, 빈랑, 구절초 등의 생약제는 비만세포에 의해 유도되는 다양한 앨러지 질환의 예방 및 치료를 위한 천연소재로서 유용하게 활용될 수 있을 것으로 전망된다 영문초록 : Mast cells are responsible for IgE-mediated allergic reactions. Phospholipase (PL) D1 and PLD2 regulate mast cell activation but the mechanisms remain unclear. Here we show that PLD2 associates with and promotes activation of Syk, a key enzyme in mast cell activation. Antigen stimulation resulted in increased association and co-localization of Syk with PLD2 on the plasma membrane as indicated by co-immunoprecipitation and confocal microscopy. This association was dependent on tyrosine phosphorylation of Syk, but not on PLD2 activity. In vitro, PLD2 interacted via its Phox homology (PX) domain with recombinant Syk to induce phosphorylation and activation of Syk. Furthermore, overexpression of PLD2 or catalytically inactive PLD2K758R enhanced antigen-induced phosphorylations of Syk and its downstream targets, the adaptor proteins LAT and SLP-76, while expression of a PLD2 siRNA blocked these phosphorylations. Apparently, the interaction of PLD2 with Syk is an early critical event in the activation of mast cells

Streptomyces Cs 528 균주로부터 Phospholipase D의 생산, 분리정제 및 특성분석

박은정 朝鮮大學校 大學院 2006 국내석사

Soil samples were screened for actinomyces strains that capable of producing phospholipase D, and Streptomyces Cs 528 showing a high phosholipase D activity was isolated. Streptomyces Cs 528 produced phospholipase D when grown in GCS medium containing glycerol 1.0%, soybean meal 1.0%, CaCO₃ 0.1% at 28℃. Analysis of the 16S rDNA showed that the strain Cs 528 was highly homologous to Streptomyces mirabilis DSM 40553T and Streptomyces olivochromogenes DSM 40451T. One form of extracellular phospholipase D was purified through ammonium sulfate fractionation, heat treatment, ultramembrane (YM10) filtration, sepharose CL-6B column chromatography, DEAE-sepharose CL-6B column chromatography, sephadex G-75 column chromatography, which produced a major band of 56KDa on a 10% sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Biochemical properties of purified phospholipase D were examined. The optimal temperature for hydrolytic activity was 60℃. About 100% of enzyme activity kept at 60℃without any loss for 30min. The enzyme showed an optimal pH of 8.0 in hydrolytic reaction and was stable between pH 7.5-10. Triton X-100 increased enzyme activity, but activity of enzyme was inhibited by N-laurylsarcosine and SDS. The enzyme activity was enhanced in the presence of 2mM metal ions namely Ca^(2+) and activity also inhibited in the presence of 2mM metal ions, such as Co^(2+), Zn^(2+), EDTA.

남극에서 분리한 저온성 세균 Pseudoalteromonas sp. L203으로부터 세포외 phospholipase A_(1) 분리 정제 및 이를 이용한 EPA 함유 Phosphatidylcholine 생합성

방지헌 漢陽大學校 大學院 2002 국내석사

Streptomyces Cs 684 균주로부터 Phospholipase D의 생산, 분리정제 및 특성분석

김지현 조선대학교 2006 국내석사

Soil samples were screened for several actinomyces strains, that capable of producing phospholipase D, and it was revealed that a finally selected Streptomyces Cs 684 has a high phosholipase D activity. The production of phospholipase D from Streptomyces Cs 684 was carried out in GYT medium that contains glucose 2.0%, yeast extract 1.5%, tryotone 0.5%, calcium carbonate 0.1% at 28℃. 16S rDNA analysis showed that Streptomyces Cs 684 was highly homologous to Streptomyces jumonjinensis JCM 4947 and Streptomyces nanningensis YIM 33098. A extracellular phospholipase D was purified through several purification procedures such as ammonium sulfate fractionation, heat treatment, ultramembrane (YM10) filtration, sepharose CL-6B column chromatography and DEAE-sepharose CL-6B column chromatography. The purified phospholipase D was identified with a major band of 48KDa on a 10% sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). The optimal temperature for hydrolytic activity was 55℃. Most of enzyme activity was retained for 30min incubation at 55℃ without a significant loss in enzyme activity. The enzyme showed an optimal pH of 7.0 in hydrolytic reaction and was stable between pH 6.0-9.0. Tween 20 increased enzyme activity, but was inhibited by polyoxyethylene-4-laurylether, N-laurylsarcosine and SDS. The enzyme activity was a little affected by Ca+2 metal ion. .