TiO2 나노유체를 heat-sink로 가지는 마이크로 PCR 칩 제조

김희성 경북대학교 대학원 2007 국내석사

MEMS means that Micro Electro Mechanical Systems, which is one of the very universal technology in recent years. MEMS is micro precision machine manufacturing technology of micron and millimeter size was decided by the basis of semiconductor process technology. It has based on previously developed MEMS process technology and in these days, the application is extending to communication, optical science, the display field, medical treatment biology , chemistry and medical relation field. Above all, the research of a field related to gene analysis which uses a micro electro mechanical system from medical treatment biological field become accomplished actively. In particular, the PCR (Polymerase Chain Reaction) has been used widely for the amplification of DNA profiles. At room temperature, metal of solid is known as larger than thermal conductivity fluid. To improve thermal conductivity of the fluid, the research, which floats the solid metal particles of micron or millimeter size inside the fluid, had been accomplished. but it has failed to commercialization by causing too many problems as sediment, the increase in pressure drop within the pipe, congestion phenomenon, equipment abrasion by the momentum of large particles, other results involving thermal properties. But recently it makes the fluid which is floated the particle of nano size by developed micro process technology and the research regarding nanofluid is being advanced actively. Commercialized PCR chip that previously used equipment was big and the reagent of vast quantity was demanded, resulting reaction time was needed plentifully. However, by using MEMS process technology, the problems can solved in recent years. In order to do quickly cooling rate, it made the size of the PCR chip rather than bigger by using the same cooling apparatus as the fan. It made difficult to the portability and popularity of the PCR chip, development of Lab-On-a-Chip(LOC). In this paper, the PCR chip developed by using MEMS process technology. We have fabricated a thin film heater and sensor at the top glass for effective heat transference and real time temperature sensing of the reagent inside PCR chip. The 5.6 ㎕ and 8.7 ㎕ chamber were fabricated on the middle silicon wafer and The amount of the reagent was compared with effect on heating/cooling rate. When temperature reached to 95℃ which was the denaturation temperature of DNA, it was indicated that heating time of the 5.6 ㎕ chamber is 80 seconds and heating time of the 8.7 ㎕ chamber is 100 seconds. In addition, it was not used fan method which was widely used as role of the heat-sink but used the chamber-type, zigzag-type microfluidic channel fabricated at the bottom glass which could flow nanofluid. When the 5.6 ㎕ and 8.7 ㎕ chamber were reached to 55℃ which the annealing temperature of DNA, natural cooling in the air showed cooling time of 9 seconds, 19 seconds, the zigzag-type microfluidic channel with nanofluid showed cooling time of 7 seconds and 16 seconds and the chamber-type microfluidic channel with nanofluid showed cooling time of 6 seconds and 9 seconds, respectively. The fabricated PCR chip with nanofluid shows more rapid cooling rate than conventional PCR chip, and therefore it is expected that reaction time will be reduced. MEMS(Micro Electro Mechanical Systems)란 미세전자기계시스템을 의미하는 것으로 최근에는 매우 보편화된 기술의 하나로 반도체 공정기술을 기반으로 성립되는 마이크론(㎛)이나 밀리(㎜)크기의 초소형 정밀기계 제작기술을 말한다. 이전에 개발된 MEMS 공정기술들을 기반으로 해서 지금은 통신, 광학, 디스플레이, 의료 생물학, 화학, 의학 관련 분야 등으로 범위가 넓어지고 있다. 그 중 의료 생물학 분야에서 미세전자기계시스템을 이용한 유전자 분석 분야 연구가 활발히 이루어지고 있으며, 특히 DNA(Deoxyribonucleic Acid)를 증폭하기 위해 중합효소연쇄반응(PCR : Polymerase Chain Reaction) 방법이 널리 사용되어져 왔다. 실온에서 고체형태의 금속은 유체보다 더 큰 열전도율을 가지고 있다고 알려져 있다. 그래서 유체의 열전도율을 개선하기 위하여 유체 내에 마이크론(㎛)이나 밀리(㎜) 크기의 고체금속 입자들을 부유시키는 연구가 수행되었으나, 이는 침전, 관내의 압력강하 증가, 막힘현상, 큰 입자의 운동량에 인한 장치의 마모, 열적 특성의 다른 결과 등 많은 문제점을 야기시켜 상용화에 실패하였다. 그러나 최근 미세공정기술의 발달로 나노크기의 입자를 부유시킨 유체를 만들었으며, 나노유체에 관한 연구가 활발히 진행되고 있다. 이전의 상용화된 PCR 칩은 장비가 크고, 다량의 시약이 요구되며, 그로 인하여 반응 시간이 많이 소요되는 등의 문제점을 가지고 있었으나 최근에 이를 MEMS 공정기술을 이용하여 해결할 수 있었다. 하지만 감온 속도를 빠르게 하기 위하여 팬과 같은 냉각장치를 사용함으로써 오히려 PCR 칩의 크기를 크게 만들었다. 그 결과 PCR 칩의 휴대성과 대중화 및 Lab-On-a-Chip(LOC) 개발에 어려움으로 작용하였다. 본 논문에서는 MEMS 공정기술을 적용하여 PCR 칩을 개발하였으며, PCR 칩내 시료의 효과적인 열전달과 시료의 실시간 온도 측정을 위해 히터와 센서를 상부의 글라스에 각각 제작하였고, 중부의 실리콘 웨이퍼에 5.6 ㎕와 8.7 ㎕ 챔버를 제작하여 시료의 양이 승감온 속도에 미치는 영향을 비교하였다. 그 결과 DNA의 변성 온도인 95 ℃에 도달할 때의 가열 시간이 5.6 ㎕ 챔버일 때 80초, 8.7 ㎕ 챔버일 때는 100초로 나타났다. 또한 heat-sink의 역할로서 기존에 많이 사용되던 팬방식이 아니라 나노유체를 흐르게 할 수 있는 챔버형과 지그재그형 마이크로 유체채널은 하부 글라스에 제작하였다. 5.6 ㎕ 챔버와 8.7 ㎕ 챔버가 Primer의 결합 온도인 55 ℃에 도달할 때, 공기에 의한 자연 냉각일 경우에 9초와 19초로 나타났으며, 지그재그형 마이크로 유체 채널에 나노유체가 있을 때 7초, 16초로 나타났다. 챔버형 마이크로 유체 채널에 나노유체가 있을 때 6초, 9초의 냉각특성이 나타났다. 이로 인해 기존의 PCR 칩 보다 더욱 빠른 감온 속도가 나타났으며, 그 결과 실험에 걸리는 반응 시간을 줄여줄 것으로 예상된다.

PCR을 이용한 유전자변형농산물의 검정방법에 관한 연구

정순일 공주대학교 대학원 2004 국내석사

1990년대 중반이후 유전자변형농산물(GMO)이 상업적으로 재배되면서 주요 농산물수출국을 중심으로 재배가 급격히 증가하였고, 많은 농산물을 수입에 의존하고 있는 우리나라는 콩, 옥수수, 감자, 면화, 유채 등에 GMO가 혼입되어 수입되고 있다. 특히 2001년 기준으로 콩의 92.3%, 옥수수의 99.3% 이상을 수입에 의존하고 있는데, 이중 GM콩과 옥수수는 각 41.0%와 3.6%로 추정된다. GMO의 생산과 유통이 급격히 증가됨에 따라 소비자의 알권리 확보와 올바른 구매정보 제공, 건전한 유통질서 확보 차원에서 EU, 일본, 호주, 중국, 대만 등에선 GMO 표시제가 시행이 되고 있고 우리나라에서도 2001년 3월부터 GM 농산물에 대한 표시제를 시행하고 있다. 또한 일반농산물(Non-GM)은 분별유통을 하더라도 재배 및 유통과정에서 비의도적으로 GM농산물이 혼입될 수 있어 비의도적혼입허용치(threshold)를 설정하여 운영하고 있는데 EU의 경우는 0.9%, 일본, 대만은 5.0%, 우리나라는 3.0%로 설정하여 운영하고 있다. 이러한 표시제의 조속한 정착과 효율적인 관리를 위해서 체계적인 분별유통과 과학적인 검정방법 개발의 필요성이 요구되었다. 일반적으로 유전자변형농산물의 검정방법으로는 유전자증폭반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)을 이용하여 도입된 유전자를 확인하는 방법과 항원항체반응을 이용하여 도입된 유전자에 의해 발현되는 단백질을 확인하는 방법 등이 있다. 본 연구에서는 GM농산물 검정을 위해 일반적으로 많이 사용되고 있는 유전자 증폭반응(PCR)을 이용하여, 표시대상 유전자변형농산물의 함유 여부 및 혼입율을 분석하는 방법을 연구하였다. 내재유전자와 도입유전자를 특이적으로 증폭하여 제초제저항성 콩 1종, 제초제저항성 콩나물 1종, 해충 및 제초제저항성 옥수수 6종, 바이러스 저항성 감자 4종 등 총 12종에 대한 정성과 정량분석법을 확립하였다. DNA 추출방법은 CTAB방법과 silicagel membrane 형태인 DNeasy^R plant kit를 이용하여 소량 DNA 추출방법과 대량 DNA 추출방법으로 나누어 이용하였다. 추출된 DNA의 순도와 농도는 아가로스 겔을 이용한 전기영동법과 자외선을 이용한 분광광도계법을 이용하여 확인하였다. GM 계통별 광역 primer와 특이 primer의 특이성을 조사한 결과 각각의 대상 작물에서만 안정적으로 검출이 가능하였으며, 각각의 primer 검출감도를 조사한 결과 0.01%까지 검출이 가능하였다. GM 계통별 보정계수는 TaqMan^R probe를 이용하여 산출하였으며, 정량분석결과 GM 혼입율별로 정도(proficiency)는 콩 6.9~12.5%, 콩나물 1.0~22.7%, 옥수수 4.6~28.2% 그리고 감자는 3.8~26.8%로 나타났다. 3% 시료 허용오차 측정 결과는 국산 콩은 3.4%, 미국산 콩은 3.2%, 중국산 콩은 3.2%이고 표준오차(accuracy)는 5.8~13.3%, 표준편차(precision)는 7.65~9.69%로 매우 안정적이었다. 유전자변형농산물 표시제를 전후로 국내에 유통되고 있는 GM 농산물의 유통현황과 혼입율을 확인한 결과 표시제가 시행되기 바로 전에는 9.2%의 검정시료에서 GMO가 검출되었으나 표시제가 시행되면서 첫해에는 1.1%로 낮아졌으며 현재는 0.1% 미만으로 유통되고 있는 것으로 확인되었다. 또한 표시제 시행 전에는 양성시료의 GM 함유율도 모두 3% 이상이었으나 표시제가 시행이 되면서 2001년도에는 62.7%, 2002년도에는 21.1%로 줄어들다가 2003년도에는 유통되는 GM 농산물이 모두 3% 이하로 유통이 되고 있는 것을 확인하였다. As genetically modified organisms(GMOs) have been commercially cultivated since the middle of 1990s, the amount of them has been sharply increased in main agricultural imports. Korea mainly depends on imported agricultural products, and so soybean, maize, potato, cotton and rape are being imported as mixed with GMOs. As of 2001, we depended on imported agricultural products in 92.3% of soybeans and 99.3% of maizes respectively, and 41.0% soybeans and 3.6% maizes of these imported ones are estimated to be genetically modified. GMO labeling system is being executed in several countries like EU, Japan, Australia, China and Thailand. In Korea, GMO labeling system has been also executed since March 2003 to offer consumers the right to know and to establish clean circulation order. Although GMOs are circulated separately, GMOs and Non-GMOs are mixed unintentionally in stages of cultivation and circulation. For this reason, the threshold of unintentional mixing ratios is established and being applied in GMO labeling system. For example, 0.9% in EU, 5.0% in Japan and Thailand, and 3.0% in Korea. To settle GMO labeling system early and manage it efficiently, development of scientific detection method and identity preserved handling were required. In general, there are two GMO detection methods of identifying protein expressed by genes using immunoassay and identifying introduced genes using PCR. In this study, we have studied method of analyzing the presence and contents of GMO using the latter method. Amplifying endogenous and specific region, we established quantitative and qualitative analysis methods for one line of RRS, one line of RR sprout, six kinds of insects and herbicide resistant maize, and four kinds of virus resistant potatoes. DNA extraction was executed by CTAB method and silicagel membrane method using DNeasy^R plant kit of small or scale volume. The purity and density of extracted DNA was confirmed by UV-spectrophotometer and agarose gel electrophoresis. Investigating specificity of universal primers and specific primers of each GM line, the PCR bands were stably detected only in objective crops and the limit of sensitivity in each primer was 0.01%. Conversion factor of each GM line was determined using TaqMan^R probe and as a result of quantitative analysis, the proficiency per GM mixed ratio was 6.9~12.5% for soybean, 1.0~22.7% for soybean sprout, 4.6~28.2% for maize and 3.8~26.8% for potato. The result of experiments for permissible error of 3% samples was 3.4% for domestic soybeans, 3.2% for American soybeans, 3.2% for Chinese soybeans and the accuracy was 5.8~13.3% and the precision was 7.65~9.69%. We examined GMO circulation circumstances and mixed ratio shortly after and before the execution of GMO labeling system. GMO was detected in 9.2% of samples requested for analysis just before GMO labeling system. After GMO labeling system was introduced, the ratio was 1.1% in the first year and is below 0.1% now. Though GMO mixed ratio of all GM positive samples was above 3% prior to executing GMO labeling system. After GMO labeling system was introduced, the ratio of GMO samples above 3% has been decreased year after year as 62.7% in 2001, 21.1% in 2002 and 0% in 2003.

식품에서의 PCR을 이용한 메밀 알레르기 성분의 검출

전영준 동국대학교 대학원 2007 국내석사

메밀의 BW10KD 단백질은 과민한 사람들에게 식품알레르기를 일으킬 수 있다. 본 연구는 메밀의 보통종과 달단종을 구분하고, 가공식품에서 메밀 성분의 함유여부를 신속 정확하게 조사하기 위하여 메밀 단백질인 BW10KD 유전자를 검출 할 수 있는 Polymerase Chain Reaction(PCR) 방법을 개발 하였다. 국내에서 주로 이용되고 있는 메밀 보통종(Fagopyrum esculentum)과 달단종(Fagopyrum tataricum)의 genomic DNA로부터 각각 BW10KD유전자를 클로닝하고 그 염기서열을 결정하였다. 메밀 보통종과 달단종의 구조유전자는 모두 402 base pair로 intron을 갖고 있지 않았다. GenBank의 BW10KD cDNA 염기서열과 보통종 및 달단종의 genomic DNA 염기서열간의 identity는 각각 99% 및 94%이었으며, 보통종과 달단종은 서로 94%의 identity를 보였다. 메밀 보통종(Fagopyrum esculentum)과 달단종(Fagopyrum tataricum)의 BW10KD 유전자 염기서열차이를 이용하여 각각의 특이적인 primer pair를 제작하였다. 두 primer pair을 혼합하여 사용한 PCR assay에서 교차반응은 일어나지 않아 종-특이적 반응임을 확인하였다. 여러 가공식품에 대해서 비교 실험 결과 우리나라 가공식품에는 메밀 보통종과 달단종을 모두 함유 하고 있었다. 메밀의 알레르기 성분인 BW10KD 검출을 위해 메밀 보통종(Fagopyrum esculentum)의 complementary DNA 염기서열(GenBank accession number: AB055892)에서 특이적인 primers를 합성하였다. 메밀을 포함한 8종의 곡류 및 두류의 genomic DNA를 추출하여 PCR을 수행한 결과, 2종의 primer pair가 메밀에만 특이적인 반응을 나타냈다. 메밀의 특이적인 2종의 primer pair을 이용하여 12종의 가공식품을 조사한 결과 메밀묵, 메밀국수 그리고 시중에서 판매하는 메밀가루가 메밀 성분을 함유하고 있는 것으로 나타났다. 본 연구는 메밀의 알레르기 유발단백질인 BW10KD의 염기서열 차이를 이용하여 메밀의 보통종과 달단종을 구분하는데 이용될 수 있을 것으로 보이며, 식품 중에 함유된 메밀과 같은 hidden allergen을 신속 정확하게 검출하는데 활용될 수 있을 것으로 기대된다. Buckwheat BW10KD protein often causes severe allergic reactions in sensitive people. In this study, we developed a PCR(polymerase chain reaction) method to divide the buckwheat of two species and detect buckwheat DNA in food using primers corresponding to the allergenic BW10KD gene. We developed DNA sequences of buckwheat Fagopyrum esculentum and Fagopyrum tataricum that are used mainly in the country. The structural genes are 402 base pairs and there aren't introns. BW10KD cDNA sequences of GenBank is similar to the genomic DNA sequences of Fagopyrum esculentum and Fagopyrum tataricum . We composed of duplex PCR system that enables to detect Fagopyrum esculentum and Fagopyrum tataricum simulteneously. We identifide PCR primers specific for the detection of buckwheat, because there is no cross-reaction. In the result, domestic processed foods included both Fagopyrum esculentum and Fagopyrum tataricum. For the detection of BW10KD which is buckwheat allergen, we designed two pairs of specific primer sets and applied polymerase chain reaction. Two pairs of oligonucleotide primers successfully enabled PCR amplification of the specific regions of the genomic BW10KD DNA from buckwheat, but no amplification from seven other cereals and beans(barley, wheat, millet, African millet, soybean, red bean, and black bean). The proposed PCR method was applied to analyze 12 processed foods , among them, only three samples including sunsik, buckwheat noodles and buckwheat jelly showed a positive reaction to the detection. This rapid and specific method for distinguish the buckwheat of two species and detection of allergenic buckwheat would be beneficial in reducing food allergy caused by the ingestion of hidden allergen in food.

CMP공정에서 diamond disk와 pad PCR 상관관계 연구

윤영은 성균관대학교 2007 국내석사

회로가 점점 복잡해지고 소자가 미세화됨에 따라 보다 높은 수준의 광역평탄화(global planarization)가 요구된다. Chemical Mechanical Polishing (CMP)는 광역평탄화를 위하여 필수적으로 요구되는 공정이다. 이러한 CMP 공정에서 Diamond Disk(DD)는 removal rate(RR) 유지에 매우 중요한 역할을 한다. 본 연구에서는 DD 사용시간 초기 및 말기에 RR 저하현상이 발생하는 원인이 패드(pad) 표면변화에 기인함을 보였다. 또한 Diamond 의 절삭능력을 가늠하는 인자로써Pad Cutting Rate(PCR)을 분석하여 Diamond 의 크기, 경도, 모양, RPM, 압력에 따른 PCR의 변화를 고찰하고, 각 매개변수들과 PCR에 대한 상관관계를 분석하였다. 실험결과 PCR조정 능력은 압력과 입자의 모양이 RPM과 크기보다 우수하였다. 높은 압력은 패드 표면의 폴리우레탄(polyurethane)을 뭉개면서 패드 표면의 셀 개방비중(cell open ratio)를 감소 시키기 때문에 바람직 하지 않다. 따라서 낮은 압력, 높은 RPM 조건이 지속적인 RR 유지에 더 적합하다. 또한 RPM과 conditioner 압력 사이의 상관관계 실험에 의해 적정한 RR 을 유지 시키기 위한 적정한 PCR safe zone은 0.06mm/hr ~ 0.12mm/hr에 이르는 값을 가짐을 확인하였다.

PCR에 의한 Drosophila melanogaster한국집단내의 P elements 분리 및 분석

신동직 단국대학교 1994 국내석사

천안지역으로부터 채집하여 isofemale line 으로 유지하고 있는 D. melanogaster 의 Q 및 M' 계통을 대상으로 IR (Inverted Repeat) primer를 이용한 Polymerase Chain Reaction (PCR) 방법에 의해 이들 계통의 genome 내에 분포하고 있는 P element 를 분리한 후, AvaII 와 PstI 제한효소 처리에 의해 complete P element 및 KP element 의 존재여부를 Southern hybridization 결과와 비교 분석하였다. IR primer를 이용한 PCR 결과, Q 및 M' 계통에서 모두 2.9 kb (complete P element), 1.15 kb (KP element), 0.55 kb 및 0.45 kb 의 P element 가 확인되었다. 특히, 2.9 kb P element (PCR product) 의 경우 AvaII 와 PstI 제한효소 처리 결과 각각 1.84 kb, 0.54 kb 및 0.48 kb 의 fragments 와 1.24 kb, 1.0 kb 및 0.67 kb 의 fragments 가 확인되었으며, 1.15 kb P element (PCR product) 의 경우 AvaII 처리 결과에서는 0.63 kb 와 0.48 kb fragments 가 확인되었으나, PstI 처리 결과에서는 절단되지 않은 상태로 나타난 것으로 보아 이들은 각각 complete P element 와 KP element 인 것으로 판단되며, 이러한 결과는 Southern hybridization 의 경우와 일치하였다. 따라서, D. melanogaster 한국집단내에는 소수의 complete P element 가 존재하는 것으로 분석되었으며, 특히 deleted P element 중에는 1.15 kb 의 KP element 가 우세하게 분포되어 있는 것으로 조사되었다. We have identified complete P element and KP element in the genome of Q and M' strains derived from a Korean natural population (Cheonan, Choong-Nam) of Drosophila melanogaster by PCR with P specific oligonucleotide primers (IR primers). And then we analyzed PCR product that were digested with AvaII and PstI restriction enzyme with the results of Southern blot hybridization. The results of PCR product by IR primer showed 2.9 kb, 1.15 kb, 0.55 kb and 0.45 kb P element in the Q and M' strains respectively. When the electrophoresis were performed with 2.9 kb PCR product digested with AvaII, three intense bands were seen at 0.48 kb, 0.54 kb, 1.84 kb fragments. And in the PstI digests of 2.9 PCR product, three intense bands were also seen at 0.67 kb, 1.0 kb and 1.24 kb fragments. On the other hand, o.63 kb, 0.48 kb fragments were observed in the 1.15 kb PCR product digested with AvaII. But in the case of the 1.15 kb PCR product digested with PstI didn't show any fragment. These results proposed that 2.9 kb PCR product is complete P element and 1.15 kb PCR product is KP element and consisted with the result of Southern blot hybridization. Thus, it might be proposed that complete P element existed in the low copy numbers in Korean populations and 1.15 kb KP element was distributed dominantly in the deleted P element.

맥류에서 Basal glume rot을 일으키는 Pseudomonas syringae pv. atrofaciens의 PCR을 이용한 특이적 검출

신두산 충북대학교 2019 국내석사

Pseudomonas syringae pv. atrofaciens (Psa) causing basal glume rot occurs worldwide, but it is not reported in Korea. Therefore it has been designated as a quarantine pathogen. This study aimed to establish a specific PCR detection method of Psa, which can be need in the quarantine service. MLST, rep-PCR, BIOLOG, species-specific PCR and pathogenicity tests were conducted to re-establish the phylogenetic location of 13 Psa strains collected from 5 continents. Psa ICMP 9919, and ICMP 10443 that showed different characteristics to typical Psa strains were re-classified as P. coronafaciens. Complete circular genome of 6,109,675 bp in length was obtained from complete genome sequencing of the Psa strain LMG 5095 and 5,243 CDSs were predicted. Comparative genome mapping, whole ORFs BLAST, specific protein searches in the Uniprot protein database, and effector profiling were conducted to find specific genes for Psa, and 185 ORFs considered as putative specific to Psa were obtained. By PCR screening 14 ORFs were selected as Psa specific ORFs. However, none of the 14 ORFs showed Psa specific extended PCR screening. The selected 14 ORFs were knocked out through a maker exchange to confirm pathogenicity and virulence. A knock-out strain of Psa-9 (AZ44_RS0106455) and Psa-42 (AZ44_RS0117230) genes among 14 genes was completed and the pathogenicity of two knock-out strains was weaker than wild-type. Since the 14 ORFs were not completely specific for Psa, a two-step PCR detection system consisting of 6 primers combinations was devised. In the first step using Psa-a and Psa-b primers, Psa can be isolated from all 43 other non-target strains except for three non-target strains (P. syringae pv. japonica, pv. panici, pv. aptata), In the second step, the electrophoretic band patterns of the Psa-c, Psa-d, Psa-e, and Psa-f primers can be used to distinguish between three Psa strains and three non-target strains that were not identifiable in the first step. The PCR detection method developed in this study is currently being used in the Korea quarantine service.

PCR-RFLP법에 의한 배의 자가불화합성 계통과 자가화합성 계통의 교배후대에서 자가화합성 계통의 선발

안승구 韓京大學校 産業大學院 2004 국내석사

배(Pyrus pyrifolia Nakai) 품종은 배우체형 자가불화합성을 나타내고 있으며, 배의 육종은 많은 노동력과 시간이 요구되는 인공수분에 의존하고 있다. 자가불화합성 품종‘Niitaka’(S3S9),‘Whasan’(S3S5),‘Chuwhangbae’ (S4S6)와 자가화합성 품종인‘Osanijisseiki’(S2S4sm)의 사이의 자식으로부터 자가화합계통을 선발하기 위하여 PCR-RFLP분석을 사용하였다. S-allele는 멘델의 법칙에 의해 유전되며, 'Osanijisseiki'가 부친인 경우 자가불화합성 자식(S4sm-allele를 포함하고 있지 않음)과 자가화합성 자식(S4sm-allele를 포함함)를 교배하여 얻어진 F1에는 S2S8, S2S9, S8S4sm, S4smS9의 유전자형으로 4 type으로 나누어지는데 이중 S2S8과 S2S9은 자가불화합성이며 S8S4sm, S4smS9은 자가화합성으로 분리된다. 최근 일본 배와 국내 육성 배 품종에서 S-RNase의 염기서열을 결정하였으며, 배의 S-RNase가 두 개의 보존영역인 exon과 하나의 변이 영역인 intron로 구성된 것을 밝혔다(Kim et al., 2002a, b). PCR 증폭은 9개의 배 S-RNase 염기서열을 기초로 하여 각각의 exon 영역에서 S-RNase 특이적 primer PF (FTQQYQ)와 anti-PR((I/T)IWPNV)의 조합을 이용하여 수행한 결과 각각의 S-RNase의 intron 크기는 S2= 1,153 bp, S3= 179 bp, S4= 168 bp, S5= 179 bp, S6= 147 bp, S9= 1,115 bp 이었다. 또한 S-allele 특이적인 제한효소 선발하기위해 9개의 S-RNase의 염기서열에서 제한효소에 의해 소화되는 S-allele specific cleavage sites를 찾았다. 제한 효소는 ScfI(S1), XbaI(S2), PpuMI(S3, S5), NdeI(S4), AlwNI(S5), HinCII(S6), MluI(S6, S7), NruI(S8), BstBI(S9)을 선발하였다. 이들 data를 근거로 본실험에 사용된 자가불화합성 품종과 자가화합성 품종사이의 교배한 16개 조합에서 PCR-RFLP법에 의해 S4sm-allele를 가진 자가화합성 계통을 선발하였다. 이런 PCR-RFLP 시스템을 이용하여 8개의 자가불화합성 계통의 자가불화합성 유전자형을 결정하였으며, 8개의 자가화합성 계통을 선발하였다. 따라서 얻어진 자가화합성계통을 이용하여 F1품종을 육성한다면 인공수정 없이도 배 생산할 수 있어 경제적으로 막대한 효과를 가질 수 있을 것으로 사료된다. These studies were conducted PCR-RFLP analysis for screening of self-compatible strain from the offspring of the self-incompatible cultivar and self-compatible cultivar of Pyrus pyrifolia (Nakai). These results were summarized as follow: Breeding of the pear cultivars depends on artificial pollination that requires much labor, many worker and time period. The pear cultivar 'Osanijisseiki'(S2S4sm; sm= stylar-part mutant) has been used as a parent to breed a self-compatible cultivars with excellent fruit. We have developed a PCR-RFLP system that could screened out self-compatible strain from the off springs between the self-incompatible cultivar and self-compatible cultivar. Recently, the nucleotide sequences of the S-RNase(S1∼S9) were determined from genomic DNA. Using the intron information, we could screened out the self-compatible strains with digestive only S4-, S5-, S6- and S9-RNase fragments and self-incompatible strain with digestive S2- and S9-RNase fragments. Also, we determined the S-genotype of eight self-incompatible strains and screened the eight self-compatible strains by S-allele based PCR-RFLP system.

축산 가공식품에서 돼지, 소, 양, 닭 성분의 검출을 위한 PCR 및 multiplex PCR 방법의 개발

윤영민 동국대학교 2014 국내석사

오늘날 식품표시 사항에 기재하지 않은 식품원료를 의도적으로 혼입한 사례가 꾸준히 적발되어 오고 있다. 내용이 표시기준과 다른 재료로 만들어지는 경우로서 이러한 것을 부정, 불량식품이라 하며 상세한 범주로는 성분규격 및 표시기준 위반 사례에 해당한다고 할 수 있다. 이러한 식품들은 사업체의 경제적인 이익만을 추구하기 위해 만들어진 식품들로서 소비자를 기만하고 영양 가치상으로 문제가 되는 경우가 많다. 또한, 원재료를 속이는 이러한 부정불량식품의 사례는 코셔(Kosher)나 할랄(Halal) 등, 특정 식품재료의 혼입 여부를 검사하는 인증절차에서도 나타나고 있어 그 심각성을 더하고 있다. 따라서 식품의 규격을 정하여 내용을 마음대로 바꾸지 못하도록 하고 있으나, 관능검사 및 서류상의 확인 등 기본적인 검사절차만으로 그 주원료를 정확히 확인하는 데는 한계가 있어 조금 더 과학적인 접근방법을 요구하고 있다. 본 연구에서는 축산가공식품 중에서 돼지, 소, 양, 닭 성분을 특이적으로 검출할 수 있는 개별적인 PCR 및 multiplex PCR 방법을 계발하였다. PCR 기법은 DNA 분자수준에서 염기서열의 차이에 기초해 종을 구분할 수 있는 기술로서, 열 변성에 약한 단백질 수준의 종 감별의 한계성과 문제점을 극복할 수 있는 장점 때문에 오늘날 식품 분석 분야에서 많이 활용되고 있다. 가축류인 돼지, 소, 양과 가금류인 닭의 미토콘드리온(mitochondrion, 이하 미토콘드리온) 암호화 영역 중 돼지는 NDH5, 소와 양은 D-loop, 닭은 Cox3에서 각각 primer를 제작하여 PCR을 수행하였다. 돼지, 소, 양, 닭의 성분을 검출해 낼 수 있는 primer를 이용하여 가축류(家畜類)인 돼지, 소, 염소, 양, 사슴, 말, 개와 가금류(家禽類)인 닭, 오리를 각 서로 다른3개의 sample씩 27개의 sample 대해 PCR조건을 확립하여 실험을 진행하여 개별적인 적합성을 확인하였다. 또한, PCR실험에서 민감도를 보기 위해 희석 배수에 따른 검출 한계를 확인하였으며, 식품시장에서의 활용 가능성을 위해 일반 축산 가공식품 25개와 할랄가공식품 25개에 대하여 PCR 실험을 진행하였다.

Development of a RAPD-PCR Method for Rapid Identification of Bacillus cereus

이지연 경상대학교 대학원 2010 국내석사

RAPD-PCR is useful for the identification purpose by producing genus, species, or strain-specific profiles (Torriani etal.1999).All B.cereus strains tested in this work generated two bands, 0.91 and 0.5kb, by S30 primer. The 0.5kb band, an internal part of ytcP, was produced by all B.subtilis strains and most B.amyloliquefaciens and B.licheniformis strains, indicating that the band could be used as a Bacillus genus-specific marker. The 0.91 kb band was unique for B.cereus strains. The fact that all 15 B.cereus strains generated the 0.91kb band (or0.8kbinternalband) indicates that the putative transposasegene was present in most B.cereus strains if not in all strains. Although the function of the protein product is not known and should be studied in the future, the whole gene or part of the gene is a useful marker for the identification of B.cereus strains a mongcloselyrelated Bacillus species. The RAPD-PCR method was successfully used to detect B.cereus from spiked cheonggukjang. Since more than 105cells/g food is required to cause eithertype of B.cereus foodpoisoning ,the method seems sensitive enough for detecting B.cereus cells presentinl own numbers from contaminated foods. Distinguishing the 0.91 kb B.cereus band from the 0.88kb B.subtilis band is sometimes difficult and needs some experience of researchers because of their similar sizes. In this respect, the species-specific PCR is more convenient. RAPD-PCR, however, has its own advantage over species-specific PCR because it can provide informations on the presence of other Bacillus species in addition to B.cereus by showing unique bands for eachs pecies. Therefore, combined use of RAPD-PCR and species-specific PCR is desirable. For the initi alanalys is of bacilli in fermented foods, RAPD-PCR is tried first, then species-specific PCR is tried to confirm the presence of B.cereus. The RAPD-PCR method has anadvantage over cultural methods. The whole procedure can be completed within a day if preenrichment step is not necessary. When preenrichment is required, the procedure takes 2days but still fasterth an cultural methods. The RAPD-PCR and species-specific PCR are useful for the initial detection of B.cereus and the nother PCR procedures, especially targeting for toxin production genes, may be used to evaluate the toxinogenic potential of each B.cereusstrain. RAPD-PCR (Randomly Amplified Polymorphic D NA-PCR) 이란 한 개의 길이가 짧은 primer를 이용하여 PCR을 실시함으로써 증폭된 고유한 PCR profile 패턴을 얻는 것으로 본 연구에서는 한국의 콩 발효 식품인 청국장에 존재하여 식중독을 유발하는 유해균주인 Bacillus cereus 균주를 동정하기 위한 RAPD 방법을 개발하고자 하였다. Bacillus cereus의 13개의 표준균주에 대한 RAPD - PCR Profile을 확립하고자 PCR 증폭을 실시하였다. 이 실험에 사용한 primer는 S30을 선택하였으며, PCR 진행은 94 ℃에서 5분간 pre-denaturation한 후, 94 ℃에서 15초, 35.5 ℃에서 15초, 72 ℃에서 2분으로 구성된 amplifying을 35cycle로 수행하고, 마지막 단계인 final extention 과정은 72 ℃에서 4분간 실시하였다. 표준균주인 B. cereus ATCC 9634 , B. cereus ATCC 21768, B. cereus ATCC 14579 , B. cereus ATCC 31429 , B. cereus ATCC 27348, B. cereus ATCC 21366, B. cereus ATCC 21772, B. cereus ATCC 12480, B. subtilis 168, B. licheniformis ATCC 4527, B. licheniformis ATCC 21416, B. licheniformis ATCC 27811, B. amyloliquefaciens ATCC 23350, B. amyloliquefaciens ATCC 23845를 대상으로 RAPD - PCR을 실시한 결과 B.subtilis 는 0.5 kb 0.88 kb, Bacillus amyloliquefancies는 1.1 kb, 1.5 kb 그리고 1.7 kb의 공통적인 PCR profile을 확인하였다. Bacillus cereus는 0.5 kb, 0.9 1kb로 다른 균주들과 구분되는 profile을 확인하였다. 이결과를 바탕으로 B. cereus의 가장 특징적인 0.91 kb PCR fragment를 cloning 하여 sequencing 실시한 결과 NCBI의 Date-base에서 상동성을 보이는 유전자는 확인할 수 없었지만, B. cereus 균주의 종 특이적인 marker로서는 유용한 결과이며, 914 kb의 sequence를 바탕으로 하여 B. cereus specific-PCR 에 이용할 primer를 디자인 하였다. (B. cereus F, R primer). 표준균주 15개에 대하여 B. cereus F, R primer를 이용한 B. cereus specific - PCR을 실시한 결과 B. cereus 균주들에서만 0.80 kb fragment 증폭을 확인할 수 있었다. 다음과 같은 결과를 바탕으로 실제 판매되는 청국장을 구입하여 B. cereus ATCC 31429 균주를 청국장 g 당 10¹에서부터 10^(6) 까지 접종하여 RAPD - PCR 과 B. cereus specific - PCR 실시한 결과 표준균주로 확립한 실험결과와 같은 결과를 확인할 수 있었다.

PCR assays for the detection of haram ingredients in halal cosmetics containing carrot and oyster mushroom extracts

김유송 동국대학교 2017 국내석사

Recently, halal-certified cosmetics have taken a big part of whole halal market because of their high potential growth. Since any haram components like a pig or dog should not be included in halal cosmetic products, raw vegetable materials are becoming popular for its replacement. PCR is one of the ways to analyze the products, and the results might be influenced by the purity of DNA. However, there haven’t been many studies about comparison of effective DNA extraction methods related with cosmetics. In this study, using cosmetics spiked with Haram template DNA, DNA was extracted by five commercial DNA extraction kits (Nucleo spin food kit, Power PrepTM DNA extraction kit, Qiagen stool Mini kit, TIANamp Genomic DNA Kit, and Wizard Genomic DNA Purification Kit) and CTAB. After, extraction efficiency of each kit was compared with detection limit using PCR and real-time PCR system. When PCR and real-time PCR assay was applied to sample spiked with pig DNA, one of major haram components, the following result have been shown; real-time PCR was up to 100times more sensitive than conventional PCR. Also, when real-time PCR was applied to each type of cosmetics, the following results have been shown; 2.28x100 copies/tube of detection limit was observed when Power PrepTM DNA extraction kit and TIANamp Genomic DNA Kit were applied to liquid type of mask pack; 2.28x101 copies/tube of detection limit was shown when using Power PrepTM DNA extraction kit and Qiagen stool Mini kit were used for powder type of mask pack; When DNA was extracted from cream by Power PrepTM DNA extraction kit, 2.28x100 copies/tube of detection limit was observed. So, regardless of its formulation, Power PrepTM DNA extraction kit, having lower detection limit is considered to be ideal kit to extract DNA from products and analyze after. In conclusion, This Study is expected to be applicable to analysis of various halal cosmetics manufactured using food materials such as carrot and oyster mushroom as a substitute material of an existing animal collagen in the future.