Studies on the Nitric Oxide Synthetase Inhibitor Combined Effects of Nitric Oxide Inhibitors and Antioxidants on Streptozotocin Toxicity : 산화질소 저해제와 수산기 Radical Scavenger가 산화질소 합성효소 저해제와의 병용시에 Streptozotocin의 독성에 미치는 영향에

김희진 Graduate school of KonKuk University 1996 국내박사

췌장 β-cell 특이독성이 있어, 당뇨유발에 쓰이는 streptozotocin(STZ)은 nitric oxide(NO)와 hydroxyl radical을 liberation하는 것이 증명되었다. 자가면역성 당뇨병에서도 특히 cytokine의 하나인 interleukin-1β(IL-1β)가 nitric oxide를 분비하여 당뇨병을 유발하는 것과 STZ에 의한 당뇨병이 그 결과가 같아서, STZ 역시 IL-1β와 같은 기전으로 당뇨병을 유발한다는 견해가 지배적이다. 본 연구에서는 STZ이 발생시키는 nitric oxide와 hydroxyl radical에 대한 저해약물을 처리하여 그 병용효과를 알아보고자, rat에서 분리한 췌장소도세포에 Nitric oxide synthetase (NOS) inhibitor인 N-Nitro L-Arginine Methyl Ester(NAME)와 2,4-Diamino-6-hydroxypyrimidine(DAHP), Nitric Oxide inhibitor인 methylene blue(MB), hydroxyl radical scavenger인 1,3-dimethyl-2-thiourea(DMTU), melatonin을 처리한 후 STZ에 노출시켜 각 군의 insulin 분비능과 nilric oxide 발생량으로 약물의 STZ 독성 저해능을 평가하고, 각 약물에 강력한 NOS 저해약물인 NAME와 병용했을 경우와 비교하여 다음과 같은 결과를 얻었다. Control group이 24시간동안 분비하는 insulin의 양을 1로 보았을 때, 실험에 사용된 모든 약물은 저해효과가 있었고, 특히 melatonin 1mM군이 0.79±0.104, MB와 NAME의 병용군이 0.74±0.045, DAHP 와 NAME의 병용군이 0.76±0.071로 control과 통계적 차이가 없었다. 이것은 STZ의 0.16±0.012보다 3배이상의 기능적 독성 저해 효과를 보인 것이다. Nitrite assay에서는 STZ만을 투여한 경우(3.839±0. 1756μM)와 비교할 때 모든 agent가 nitric oxide의 발생을 줄이는 효과가 있었고 특히 DAHP는 NO toxicity의 저해약물로 쓰던 NAME 보다도 효과적이었다. 위의 실험으로 미루어볼 때, nitric oxide liberation만으로 STZ의 β-cell 특이독성이 일어나지 않는 것이 insulin 분비량의 측정에서 나타났고, classic hydroxyl radical scavenger인 DMTU는 NOS 저해제인 NAME와 병용한 경우 insulin과 nitrite 분비량에서 단독 적용시보다 효과적임이 나타났다. Streptozotocin(STZ) has been used to induce Diabetes Mellitus(DM) in laberatories for decades, even though it is not fully proved how to induce DM. It was reported that the diabetogenesis of interleukin-1β (IL-1β) was similar to that of STZ, which liberated nitric oxide(NO) and produced hydroxyl radicals. In this study, that the diabetogeneic mechanism of STZ and the synergic effects of hydroxyl radical scavengers and N-nitro L-arginine methyl ester(NAME) on STZ toxicity has been investigated. NAME is the clinical STZ toxicity inhibitor, as a L-arginine analogue prevents biosynthesis of nitric oxide synthetase(NOS). The level of insulin secretion and nitrite concentration were investigated. Before STZ exposure in isolated rat pancreatic islets were treated 30 minutes with 2,4-diamino-6-hydroxypyrimidine(DAHP), NAME, methylene blue(MB), 1,3-dimethyl-2-thiourea(DMTU) and melatonin. Considering the average insulin secretion as one in control group for 24 hours, all agents used in this study were prevented STZ toxicity. Especially, a novel hydroxyl radical scavenger, melatonin (1mM) treatment (0.79±0.104), DAHP combined NAME treatment(0.76±0.071), and MB combined NAME treatment(0.74±0.045)groups did not have stastical difference comparing it with the control group(1.00±0.056). These inhibited more over three times comparing with the STZ treatment group(0.16±0.012). In nitrite assay, comparing it with the STZ treatment group(3.389±0.1756μM), all agents used in this study decreased NO induced by STZ and DAHP treatment group (0.869±0.2102μM)decreased NO production most powerfully. Totally the classical hydroxyl radical scavenger, DMTU inhibited STZ toxicity more potent NAME combined treatment than single treatment. NO inhibitor, MB appeared in the same manner. NAME increased insulin secretion more than DAHP or NAME combined DAHP treatment groups, however, nitrite to concentration was less than these. The melatonin treatment groups showed same patterns. Even though nitrite concentration was decreased, insulin secretion level did not increase in combination experiments(melatonin and DAHP). Considering above mentioned results, hydroxyl radical scavenger combined NAME inhibited synergically STZ toxicity in insulin secretion and nitrite assay, and NO liberation was not the main mechanism of STZ diabetogenesis.

Effects of nitric oxide on N-methyl-D-aspartate receptor functions in cultured cerebellar granule cells

오세관 University of Mississippi 1995 해외박사

중추 신경계에서 N-methyl-D-asparate (NMDA) 수용체에 의해 생성된 nitric oxide는 여러 신경전달물질의 유리를 촉진시켜 기억, 학습 등에 중요한 역할 을 하며 과량의 nitric oxide를 생성하는 세포는 세포독성에 저항하며, 말초 에서는 nitric oxide가 cyclic GMP를 증가시켜 혈관이완 작용을 유도함이 알 려져 있다. 중추 신경계에서 흥분성 아미노산 수용체 (glutamate receptor) 인 NMDA 수용체와 Kainate 수용체가 흥분되면 세포내 칼슘 농도가 증가하고, 증가된 칼슘은 nitric oxide synthase를 활성화시켜 nitric oxide를 생성하고 생성된 nitric oxide는 cGMP를 증가시킨다. 중추신경계에서 작용하는 glutam ate 수용체의 활성과 nitric oxide의 생성 및 효과를 nitric oxide synthase 가 다량존재하는 쥐의 소뇌 과립세포 (cerebellar granule cells)를 배양하 여 연구 실험하였다. Nitric oxide는 농도에 따라서 biphasic효과가 있어서 생리적인 농도 (저농 도)에서는 NMDA수용체를 활성화시키고 고농도에서는 NMDA수용체를 억제시킬 것이라는 가설을 설정하고 실험을 하였다. 생리적인 농도의 nitric oxide 효과를 규명하기 위해 nitric oxide synthas e inhibitor를 이용하여 NMDA에 의한 세포내 칼슘농도, glutamate유리,cGMP 증가 등을 실험한 결과 nitric oxide는 NMDA 수용체를 활성화 시킴을 알 수 있었다. 여기에 관련된 하나의 작용기전으로 nitric oxide는 cGMP를 증가시 켜 cGMP를 매개로한 phosphorylation에 의한 것이 아닌가 하고 cGMP analogue 인 dibutyrate-cGMP를 이용하여 실험한 결과 nitric oxide의 작용은 cGMP에 의하지 않은 작용임을 알 수 있었다. 고농도의 nitric oxide 효과를 규명하 기 위하여 여러 nitric oxide생성 compound를 이용하여 실험한 결과 흔히 사 용되는 혈관이완제인 sodium nitroprusside는 NMDA 수용체를 억제하나 이것은 nitric oxide에 의한 효과가 아니라 Fe²+를 함유한 약물의 구조특성에 기인 한 것임을 알 수 있었다. 왜냐하면 nitric oxide를 생성하지 않는 Fe²+를 함유한 potassium ferrocyanide도 NMDA수용체를 억제하는 작용이 있었다. 한편 nitric oxide와 nitric oxide 생성 compounds는 kainate 수용체에는 영 향을 주지 않았다. The investigation of laminar name structure has a significant role in the modeling ofturbulent combustion by introducing the namelet concept that is valid under cenain conditions.Several aspects of the lanlinar names are investigated experimentally and nunlehcally. Systematically reduced reaction mechanisms are useful in reducing the computationaleffort with a decrease in the number of species, and for investigating narne structure byasymptotic methods. Such advantages are applicable in the simulation of turbulent reactingnows in which the magnitudes of the time scales of the nuctuating now field rapidly. reduced mechanism is derived Hames. The mechanism has beenvalidated by comparison of the Hame structures and burning velocities and fDund to k in goodagreement with experimental results. Stretched laminar names have attracted considerable attention in the modeling ofturbulent combustion with laminar Hamelet concept in recent years. They become useful byconsidering the hct that the local Hamelets correspond to a distribution of strained rates·rrhename structure determines the distribution of heat release across a name front. Therebre,attention is focused on the impact of suppressants on the radiative heat loss from a name andgaining insight into the complex interactions that impact the global heat release in names. Transient processes can have a beneficial influence on pollutant forITlation. For thisreason, we investigate the change of the NOx emission in a burner stabilized Hame under theefkct of acoustic waves. NO2 emission intensities are investigated at various hequenciesusing a nonintrusive measuren]ent technique. This diagnostic device can be made as pan of afeedback loop for automated control of combustion systems. Flame-vortex interaction studies are perbrmed with a simplined model employing thefield or interface equation. The purpose is to exanline changes in name shape and structurecaused by a vodex, and its innuence on the NO enlission index. XX1l

EFFECTS OF EXERCISE TRAINING ON PLASMA NITRIC OXIDE METABOLITE LEVELS : ASSOCIATION WITH COMMON eNOS GENE POLYMORPHISMS

박정준 University of Maryland 2002 해외박사

본 연구의 목적은 지구력 운동이 안정시 nitric oxide 및 이와 관련된 다른 물질들에 미치는 영향 그리고 혈관내피 nitric oxide 생성효소(eNOS) 유전자 다형성(27-bp repeat, G894T, T-786C)과 운동효과와의 상관관계를 분석하는데 있다. 이를 위해 50-70대의 비운동자 60명을 대상으로 지구력 운동을 최대산소 섭취량의 70% 강도로 하루에 40분씩, 주 3일, 6개월간 실시하였다. 안정시 nitric oxide 분비량을 분석하기 위해 Griess 방법을 이용하여 혈중 NOx(NO2- + NO3-)를 측정하였다. 유전자 다형성은 다른 연구들과 마찬가지로 PCR/RFLP 방법을 이용하여 분석하였다. 지구력 운동 전, 안정시 혈중 NOx와 콜레스테롤 및 저밀도 지단백질 간에는 통계적으로 유의한 역상관관계가 있었다. 그러나 안정시 혈중 NOx는 혈중 혈당, 인슐린, 중성지방, 고밀도 지단백질, 또는 세가지 eNOS 유전자 다형성과는 상관관계가 없었다. 지구력 운동 후, 최대산소 섭취량과 고밀도 지단백질은 통계적으로 유의하게 증가하였으며, 체중, 체질량 지수, 체지방, 중성지방, 혈중 인슐린은 통계적으로 유의하게 감소하였다. 반면, 운동에 따른 안정시 혈중 NOx에는 변화가 없었다. 그러나 콜레스테롤 및 저밀도 지단백질을 공분산으로 한 변량분석 결과, 안정시 혈중 NOx는 통계적으로 유의하게 감소하였다. 이러한 감소는 T-786C eNOS 유전자 다형성과 밀접한 관계가 있었다. TT 유전자형은 안정시 혈중 NOx가 운동후 감소하였으나 TC/CC 유전자형은 변화가 없었다. 단계적 회귀분석 결과, 운동에 따른 혈중 NOx변화의 약 25% 정도는 T-786C eNOS 유전자 다형성과 콜레스테롤 변화에 의해 설명되어지는 것으로 나타났다. 이상의 결과들을 종합해 볼 때, 안정시 nitric oxide는 콜레스테롤 및 저밀도 지단백질과 밀접한 관계가 있으며, 이러한 상관관계를 교려할 때, 안정시 nitric oxide는 지구력 운동을 통해 감소되며 이는 T-786C eNOS 유전자 다형성과 관련이 있음을 알 수 있다. The purpose of the study was to investigate whether endurance exercise training (ET) affected basal nitric oxide (NO) production and whether other confounding factors and endothelial NO synthase (eNOS) gene polymorphisms, such as the 27-bp repeat, G894T, and T-786C polymorphisms, were associated with changes in basal NO production with ET. Sixty healthy sedentary subjects (aged 50-70 yrs) completed 6 months of ET that consisted of endurance exercise at 70% of maximal oxygen consumption (VO_(2)max), 40 min/d, 3 d/wk. Basal NO production was determined as the measure of plasma NO_(x) (NO_(2)^(-) + NO_(3)^(-)) using a modified Griess assay. Genotype analyses were performed using PCR/RFLP. At baseline, there were significant inverse correlations between basal plasma NO_(x) levels and total cholesterol (TC) and low-density lipoprotein cholesterol (LDL-C) levels (r= -0.313, p=0.016 and r= -0.307, p=0.019, respectively). Fasting plasma glucose, insulin, triglyceride (TG), and high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) levels as well as all three eNOS gene polymorphisms were not correlated with basal plasma NO_(x) levels at baseline. After ET, VO_(2)max and HDL-C were significantly increased, and body weight, body mass index (BMI), body fat percentage, TG, and fasting plasma insulin levels were reduced (P<0.05). Basal plasma NO_(x) levels were not changed with ET. However, basal plasma NO_(x) levels were significantly reduced from 20.1±0.7 μmol/L to 19.4±0.7 μmol/L (p=0.002) after statistical adjustment for baseline TC and LDL-C. The change in basal plasma NO_(x) levels tended to be correlated with the change in TC (r=0.262, p=0.055). There was a significant interaction between the T-786C polymorphism and changes in basal plasma NO_(x) levels (p=0.007). The TT genotype group significantly reduced their basal plasma NO_(x) levels from 20.7±0.9 μmol/L to 17.6±0.8 μmol/L (p=0.003), while plasma NO_(x) levels did not change in the TC/CC genotype group. Stepwise regression revealed that the T-786C polymorphism, together with the change in TC, accounted for 25% of variability of the change in basal plasma NO_(x) levels with ET. The present results indicate that ET may not change basal NO production, but when TC and LDL-C levels are accounted for, ET may decrease basal NO production; and that the reduction in basal NO production may be associated with the T-786C polymorphism.

Nitric Oxide가 마우스 간 세포의 생존에 미치는 영향

김유현 전주대학교 1999 국내박사

Nitric oxide(NO)는 면역학적 방어에서 중요한 역할을 수행하고, 분비 조직과 세포의 기능에 영향을 미치며, 세포성 면역계의 주된 역할의 하나로 NO는 세포 독성이나 성장 억제 활성을 나타낸다. 패혈증 또는 염증 상태의 간에서 Kupffer cell(KC)과 hepatocyte(HC)는 유도성 NO 합성 효소(iNOS)를 발현 할 수 있고 reactive oxygen intermediates(ROI)를 생성할 수 있다. NO 합성은 전신성 패혈증을 앓는 동안 간에 이롭게 작용하거나 간을 보호 하지만, NO가 생체 내에서 항 염증성 역할을 할 수 있는 기전은 분명치 않다. 간에서 NO에 대한 본 연구는 패혈증이나 염증시 간 기능을 변화시키는 기전에 관심을 갖게 되었다. 본 연구는 패혈증 또는 염증 상태의 간에서 NO의 역할을 밝히기 위하여 마우스 간 손상에 대한 NO의 생체내 역할과, 마우스 간 세포주인 BNL CL.2 배양에서 혈청과 전리 방사선 조사가 NO 생성에 미치는 영향을 연구하였다. C. parvum과 lipopolysaccharide( LPS)로 유도된 간염에서 NO와 tumor necrosis factor(TNF-α)의 역할을 조사하였다. C. parvum 처리된 마우스는 LPS에 반응하여 다량의 NO를 생성하고 심한 간 손상을 초래하였으며, LPS와 NO 생성의 억제제인 AG를 동시에 투여하면 NO 합성이 억제되고 간 손상은 더욱 증가되었다. 간 보호 기전을 해명하기 위하여 superoxide dismutase(SOD)의 영향과 혈청내 TNF-α량을 조사하였다. 내독혈증동안 NO 생성 억제로 유발된 간 손상은 마우스에 SOD를 처리함으로 감소시킬 수 있었다. 혈청내 TNF-α의 량은 LPS 투여 3시간 후에 최대치에 달했으며, 혈중 NO 농도는 LPS투여 5시간 후에 최대로 상승하였다. 마우스에 aminoguanidine(AG)를 처리한 결과는 TNF-α를 더욱 증가시켰다. 이 결과는 내독혈증에서 NO가 간을 보호하고 간 손상을 감소키는 역할을 하고 있음을 의미하고, 이러한 보호 작용은 superoxide를 중화하고 LPS로 유도된 TNF-α생성을 억제하는 NO의 역량에 따라 조절될 수 있다. 마우스 간 세포주인 BNL CL.2 세포가 혈청이 제거된 배지에서 배양될 때, interferon-γ(IFN-γ)와 LPS의 자극으로 NO가 생성됨을 증명하였다. 혈철이 제거된 세포들은 IFN-γ에 반응하여 농도와 시간에 따라 상당한 량의 nitrite를 생성하고 iNOS 단백질이 발현되었으나, 혈청이 공급된 세포들은 nitrite를 생성하지 않았으며 iNOS도 발현되지 않았다. NO는 genistein과 herbimycin A와 같은 protein tyrosine kinase(PTK)의 억제제에 의하여 생성이 중단되었으나, protein kinase A(PKA)와 C(PKC)의 억제제에는 영향을 받지 않았다. 이는 BNL CL.2 세포주 배양에서 혈청의 제거로 세포가 IFN-γ에 의해 자극되면 NO를 생성하는 계기가 될 수 있고, 마우스 HC의 iNOS 유전자 발현이 PTK 신호 도입 경로와 관련이 있음을 시사한다. 시험관 내에서 BNL CL.2 세포를 전리 방사선에 노출시킨 다음 NO 생성에 대하여 조사하였다. BNL CL.2 세포에 전리 방사선을 조사하고 IFN-γ또는 IFN-γ와 LPS로 처리하면 CO 생성이 유도되었다. ROI는 전리 방사선에 반응하여 생성되므로 NO 생성에서 ROI와의 관계를 관찰하였다. 전리 방사선 조사후 NO 생성은 SOD 단독 처리에는 영향을 받지 않았으나, H_2O_2를 물로 전환시키는 효소인 catalase(CAT)나 SOD와 CAT를 동시에 처리함으로서 뚜렷이 감소되었다. BNL CL.2 세포주에서 방사선 조사로 NO 생성이 유도되는 것은 전리 방사선 조사로 형성된 H_2O_2와 관계가 있을 것으로 사료된다. 주요단어; Nitric oxide, Kupffer cell, hepatocytes, ROI, iNOS, lipopolysaccharide, C. parvum, TNF-α, SOD, AG, IFN-γ, 전리 방사선, H_2O_2. Nitric oxide(NO) plays an important role in immunologic defense and influences the functioning of secretory tissues and cells. It also exhibits cytotoxic/cytostatic activity as one of major effecters of the cellular immunity system. Both Kupffer cells and hepatocytes in the liver under septic or inflammatory conditions can express inducible NO synthase(iNOS) and produce reactive oxygen intermediates(ROI). NO synthesis is beneficial or protective to the liver during systemic sepsis. However, the mechanism by which NO can play an anti-inflammatory role in vivo is unclear. This study on NO in the liver stems from an interest in the mechanism leading to the altered liver function in sepsis or inflammation. Thus, the effect of endogenous NO on the mice liver damages and the effects of serum and ionizing irradiation on NO production in embryonic mouse liver cell line BNL CL.2 were studied to establish the role of NO in the liver under sepsis or inflammation. Roles of NO and tumor necrosis factor - α(TNF-α) in liver inflammation induced by Corynebacterium parvum(C. parvum) and LPS was investigated. C. parvum-treated mice produced large amounts of NO and developed a severe liver injury in response to LPS. Concurrent adminstration of aminoguanidine(AG), non-selective NO inhibitor, following LPS exposure was not only suppressed NO synthesis in these animals but also increased the hepatic damage. To elucidate NO production hepatoprotective mechanism, effects of superoxide dismutase (SOD) and TNF-α content of serum were investigated. Treating the mice with SOD could reduce the hepatic damage induced by inhibition of NO production during endotoxemia. TNF-α content of serum peaked at about 3 hr after LPS injection. In contrast, NO content of serum peaked by 5 hr after LPS injection. The treatment of the mice with AG led to enhanced TNF-α production. These results indicate that NO serves a protective role in the liver and reduces hepatic injury in endotoxemia. This protective action may be mediated by the capacity of NO to neutralize superoxide and to Suppress LPS-induced TNF-α production. The fact that when BNL CL.2 cells, were cultured with serum-free medium, they were induced to produce NO by the stimulation of interteron-γ (lFN-γ) alone or IFN-γ plus LPS was demonstrated. Serum-starved cells showed significant amount of nitrite production and iNOS protein expression in response to IFN-γ in dose- and time- dependent manners, but serumsupplied cells did not. The production of NO was blocked by protein tyrosine kinase(PTK) inhibitors, genistein and herbimycin, but not by protein kinase A or C inhibitors. These results suggest that the deprivation of serum from BNL CL.2 cell culture medium might prime the cells to produce NO when the cells are triggered by IFN-γ and the involvement of PTK signal transduction pathway in the expression of iNOS gene in mouse hepatocytes. The production of NO in BNL CL.2 cells, following exposure to ionizing radiation in vitro, was investigated. High-dose(6 Gy) irradiation induced NO production from BNL CL.2 cells treated with lEN-γ alone or IFN-γ plus LPS. Because ROI is produced in response to ionizing radiation, the participation of ROI in NO production was examined. After ionizing radiation, NO production was not affected by treatment with SOD, but apparently decreased by the treatment with catalase(CAT), an enzyme which can convert H_2O_2 to water, or SOD plus CAT. These results suggest that radiation-induced production of NO in BNL CL.2 cells might be attributed to H_2O_2 formed by ionizing irradiation. Key Words; Nitric oxide, NOS, Kupffer cell, hepatocytes, LPS, ROI, BNL CL.2, TNF-α, Corynebacterium parvum, AG, lFN-γ.

Nitric oxide에 의한 세포손상에 대한 항산화 효소의 방어기작 및 isocitrate dehydrogenase와 질병과의 연관성

양은선 慶北大學校 大學院 2004 국내박사

Nitric oxide (NO) is a messenger molecule with multiple biological functions. NO or its derivatives also interact with the thiol groups of proteins and glutathione to form nitrosothiols. The interaction of NO with sulfhydryl-containing molecules and enzymes have gained considerable importance. The isocitrate dehydrogenases (ICDHs; EC 1.1.1.41 and EC 1.1.1.42) catalyze oxidative decarboxylation of isocitrate to a-ketoglutarate and require either NAD^(+) or NADP^(+), producing NADH and NADPH. NADPH is an essential reducing equivalent for the regeneration of reduced glutathione (GSH) by glutathione reductase and for the activity of the NADPH-dependent thioredoxin system, both being important in the protection of cells from oxidative damages. Therefore, NADP^(+)-dependent ICDH may play important antioxidant roles during oxidative stress. In the present study, we investigated the role of SOD, catalase, and ICDH in cellular defense system against the nitric oxide-mediated oxidative damage and apoptosis. U937 cells were pre-treated with 1 mM DETC (SOD inhibitor), 20 mM ATZ (catalase inhibitor) or 3 mM oxalomalate (ICDH inhibitor) and exposed to nitric oxide. The activities of antioxidant enzymes were decreased upon exposure to nitric oxide. The cellular redox status in inhibitor-treated cells, reflected by an increased level of reactive oxygen species as well as a decrease in the ratio of [NADPH]/[NADPH + NADP^(+)] and the efficiency of glutathione turnover, was shifted to prooxidant state compared to control cells. The cellular damage in inhibitor-treated cells was significantly increased compared to control cells. Furthermore, apoptotic cellular damages like chromatin condensation, mitochondrial membrane potential transition and caspase-3 activation were observed in inhibitor-treated cells. The nitric oxide mediated damage to antioxidant enzymes may result in the perturbation of the cellular antioxidant defense mechanism and subsequently lead to a prooxidant condition. Modification of ICDH by peroxynitrite which induced with ethanol will likely have biological and medicinal significance. When HepG2 cells were incubated with 100 mM ethanol, a significant decrease in both cytosolic and mitochondrial ICDH activities were observed. Using immunoprecipitaion, we were also able to isolate and positive identify S-nitrosylated and nitrated mitochondrial ICDH from ethanol treated HepG2 cells. Intracellular ROS and nitrite levels were increased with ethanol treatment, and mitochondrial dysfunction was observed. We observed a decrease in mitochondrial ICDH activity and the modulation of the cellular redox status in the liver from the ethanol-fed rats. S-nitrosocysteine and nitrotyrosine adducts of mitochondrial ICDH purified by immunoprecipitation were also detected. It has been reported that chronic ethanol administration increases peroxynitrite hepatotoxicity by enhancing concomitant production of nitric oxide and superoxide. The present results show that the accumulation of NO and O_(2)^(-) in liver from the ethanol-fed rats was associated with significant reduction of Mn-SOD and CuZn-SOD activities and increased iNOS activity and induction of iNOS protein. Therefore, it is tempting to speculate that inactivation of ICDH by peroxynitrite is, presumably, at least in part responsible for the perturbation of cellular redox status and oxidative damage in chronic alcoholism. The possibility that inactivation of ICDH by peroxynitrite in neurodegenerative diseases, diabetes, and chronic inflammation is worthy of further consideration.

Effects of nitric oxide synthase inhibitors on osteoclast-like cell formation

안승규 단국대학교 1995 국내석사

교정력에 대한 효과로써 나타나는 치아의 이동은 세포수준에서는 파골세포에 의한 골파괴와 조골세포에 의한 골형성의 효과로 알려져 있다. 파골세포는 골수강과 그 밖의 다른 조혈기관으로부터 단핵세포로 형성되어 혈관을 통하여 이동하여 골세포에서 작용을 나타낸다. endothelium-derived relaxing factor(EDRF)의 생리적인 특이성을 갖는 nitric oxide는 가용성 guanlyate cyclase의 내분비성 자극제이다. L-arginine으로부터 nitric oxide의 형성이 발견된 후 지난 수년간 nitric oxide에 대한 연구는 새로운 분야로 주목 받고 있다. 실험실 연구결과로 N^w-methyl- and N^w-nitro-L-arginine(L-NMA와 L-NAME)는 nitric oxide합성 효소의 경쟁적 억제제(nitric oxide synthase inhibitor)로 알려져 있다. 이 실험에서 nitric oxide는 골수 단핵세포에서 파골세포양세포의 형성에 직접 또는 간접적으로 영향을 미치는 것으로 나타났다. 실험은 19일된 닭의 경골로부터 경골을 분리해 내고 골수를 노출시킨 후 골수세포를 분리해 낸 후 얻어진 세포를 60mm 조직배양접시에서 4시간동안 배양후 미부착 세포를 다시 모아서 96-well plate에서 medium 199로 배양하였다. TRAP양성인 다핵세포의 형성을 관찰하기 위하여 배양 초기부터 1.25(OH)_2D_3와 L-MNA, L-NAME를 투여하였으며, 배양액 교환시마다 투여하였다. 7일간 배양후 TRAP염색을 시행하고 현미경으로 평가하였다. Vit-D3와 NOSI를 투여하여 파골양세포의 형성에 미치는 영향을 관찰하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 1. 닭의 골수 세포배양시 Vit-D_3는 파골세포양 다핵거대세포의 형성을 자극한다. 2. 닭의 골수 세포배양시 nitric oxide 합성효소 억제제는 파골세포양 다핵거대세포의 형성을 자극한다. 3. Vit-D_3와 nitric oxide 합성효소 억제제의 효과는 상승작용을 나타내지는 않았다. 이상의 결과로서, 닭의 골수 세포 배양시 nitric oxide 합성 효소 억제제는 파골세포양 다핵거대세포의 형성과 융합을 촉진시키는 효과가 있다고 사료된다. Orthodontic tooth movement in response to orthodontic force results from actions of osteoclast and osteoblast in the cell level. Convincing evidence has now been provided to support the view that osteoclasts are derived from mononuclear cells that originate in the bone marrow or other hematopoietic organs and migrate to the bones via vascular routes. Nitric Oxide(NO), which accounts for the biological properties of Endothelium-derived relaxing factor(EDRF), is the endogenous stimulator of soluble guanylate cylase. The discovery of the formation of nitric oxide(NO) from L-arginine by mammalian tissue andthe elucidation of some of its biologic roles has, in the last 7 years, thrown new light onto many areas of research. Data from experiments in vitro that N-Metyl-L-arginine(L-NMA), L-nitro-L-arginine(L-NAME) are a competitive inhibitor of Nitric Oxide synthase. This studies suggested that the multinucleated cells in our culture have a characteristics of osteoclasts and that the potent bone cell activity of nitric oxide in vitro may be mediated in part by stimulation of marrow mononuclear cells to form osteoclast-like cells. Bone marrow cells were obtained from tibia of 19-days old chick embryo. After sacrifice, tibia was quickly dissected and the bone were then split to expose the medullary bone. The cells were attached for 4 hrs and the nonadherent cells were collected. Marrow cells were cultured in 96-well plate in medium 199. To examine the number of TRAP-positive multinucleated cells(MNCs), in selected experiments, 10^-8 MVit-D_3 and various concentration of L-NMA, L-NAME are added at the beginning og cultures and each time of medium change. After 7 days culture, tartrate-resistant acid phosphatase(TRAP) stained, evaluated microscopically. Also cells having more than three nuclei per cell were counted as MNCs. The oberved results were follows; 1. 1.25-dihydroxyvitamine D_3 stimulate the osteoclast-like multinucleated cells from chick embryo bone marrow cells in culture. 2. Nitric oxide synthase inhibitor (NOSI;N-NMA, N-NAME) stimulate the osteoclast-like cells from chick embryonic bone marrow cells in culture. 3. The generation of TRAP-positive MNCs induced by 1.25-dihydroxyvitamine D_3 and nitric oxide synthase inhibitors did not occur to adding effect. These results suggest that nitric oxide synthase inhibitors may stimulate the osteoclast-like multinucleated cells formation and fusion from the chick bone marrow cells in culture.

Repeated cocaine increases nitric oxide induction in the rat dorsal striatum

이동근 부산대학교 대학원 2008 국내석사

반복적으로 투여한 코카인에 의하여 발생하는 대뇌 striatum의 nitric oxide의 양적인 변화를 nitric oxide 바이오센서를 이용하여 실시간으로 측정하였다. 반복적으로 1일 1회, 7일간 복강에 투여한 코카인(20 mg/kg)에 의하여 dorsal striatum의 nitric oxide 분비는 증가하였다. Nitric oxide의 양적인 증가와 함께 코카인에 의하여 nitric oxide 합성에 전구체(precursor)로 작용하는 neuronal nitric oxide synthase(nNOS)의 인산화도 증가하였으며, nNOS의 저해(inhibition)에 의하여 nitric oxide의 분비는 감소하는 것으로 나타났다. Nitric oxide의 분비에 관여하는 인산화 효소(protein kinases)의 저해에 의하여 코카인 투여에 의해 증가된 nitric oxide의 분비는 증가하였으나, 탈인산화 효소(protein phosphatases)의 저해에 의하여 nitric oxide의 분비는 감소하였다. D1 도파민 수용체의 억제(blockade) 혹은 D2 도파민 수용체의 자극(stimulation)에 의해서는 코카인에 의하여 증가된 nitric oxide의 분비가 감소하였다. 이온성 글루타메이트(ionotropic glutamate) 수용체인 NMDA와 메타보트로픽(metabotropic) 글루타메이트 수용체인 group I의 억제 및 group III의 자극에 의하여 코카인 투여에 의하여 증가된 nitric oxide의 분비는 감소하였다. 이와 같은 결과는 반복적으로 투여한 코카인에 의한 striatal neurons의 D1 혹은 group I 메타보트로픽 글루타메이트 수용체의 자극은 NMDA에 의존적인(NMDA-sensitive) 세포내 Ca2+ 농도의 증가를 통하여 nitric oxide의 분비를 조절하는 반면, D2 및 group III 메타보트로픽 글루타메이트 수용체의 자극은 도파민과 글루타메이트 뉴런의 말단에서 이들의 분비를 억제함으로써 nitric oxide 분비를 조절하는 것으로 생각할 수 있다. 또한 이들 수용체가 유도하는 신호전달계(signal transduction cascades)에 의하여 활성화된 transducer 들인 PKC, PKA 및 탈인산화 효소들의 상호작용에 의하여 코카인에 의한 대뇌 dorsal striatum의 nitric oxide의 분비는 정교하게 조절되는 것으로 생각된다. Alterations of nitric oxide (NO) evoked by repeated exposures of cocaine are investigated by real-time measures of NO in the dorsal striatum. The results demonstrate that repeated injections of cocaine (20 mg/kg) once daily for 7 consecutive days increase NO levels. Repeated cocaine also increases hosphorylated neuronal nitric oxide synthase (nNOS) immunoreactivity and inhibition of the nNOS decreases repeated cocaine-induced increases in NO levels. Inhibition of protein kinases synergistically increases NO levels by repeated cocaine, however inhibition of protein phosphatases does not. Blockade of D1 receptors or stimulation of D2 receptors decreases NO levels by repeated injections of cocaine. Similarly, blockade of N-methyl-D-aspartate (NMDA), group I metabotropic glutamate receptors (mGluRs) or stimulation of group III mGluRs decreases NO levels by repeated cocaine. These data suggest that stimulation of D1 receptors or group I mGluRs by repeated cocaine upregulates NO efflux via NMDA-evoked Ca2+ influx, while stimulation of D2 receptors or group III mGluRs downregulates NO by the inhibition of dopamine or glutamate releases into the dorsal striatum. Activation of nNOS by protein phosphatases via p-nNOS by protein kinases is necessary for repeated cocaine to increase NO efflux into the dorsal striatum in vivo.

Effect of aging on expression of nitric oxide and inducible nitric oxide synthase in human gingival fibroblasts : 노화가 사람 치은섬유아세포의 Nitric oxide와 Inducible nitric oxide synthase 발현에 끼치는 영향

지숙 Graduate School of Chosun University 2004 국내박사

치주질환의 진행이 나이에 의해 영향을 받는다는 사실은 알려져 있으나 노화에 따른 치주조직 세포의 기능적인 변화에 관한 사실은 많이 알려져 있지 않다. 노화에 따른 세포의 노화가 치주질환의 진행에 어때한 영향을 끼치는가를 아는 것은 중요하다. 염증 상태에서 nitric oxide(NO)는 조직 파괴에 관여하는 인자로 작용하여 치주질환의 진행에 관여하는 하는 것으로 알려져 있다. 따라서 본 연구는 사람의 치은에서 배양된 치은섬유아세포를 이용하여 세포의 노화에 따른 NO와 이의 합성효소인 inducible nitric oxide synthase(iNOS)의 발현을 알아봄으로써 세포의 노화가 치주질환의 진행에 끼치는 영향에 대해 알아보고자 시행되었다. 10세의 환자와 55세의 환자에서 각각 채취한 치은에서 배양된 세포와 10세의 환자에서 채취한 세포를 계속적인 계대배양을 통해 얻은 실험실 상 노화된 세포를 포함하여 총3 종류의 치은섬유아세포를 실험에 이용하였다. Hot phenol-water extraction을 통해 추출된 Porphyromonas. gingivalis ATCC 33277 lipopolysaccharide(LPS) 와 재조합 IFN-γ를 세포에 적용시켜 Griess assay를 통해 조건화된 배지에서 NO를 측정하였다. 20세와 55세의 환자에서 채취된 치은 조직과 총 3 종류의 배양된 세포에 NOS-Ⅱ 항체를 적용시켜 iNOS 단백질 발현을 관찰하였다. Total RNA를 추출하여 RT-PCR를 통해 iNOS mRNA의 발현을 분석하였다. 치은섬유아세포에서 NO는 자발적으로 발생되었고, 이러한 발현은 젊은 세포보다 노화된 세포에서 강하였다. P. gingivalis LPS와 재조합 IFN-γ는 치은섬유아세포에서 NO의 발현을 증가 시켰고, 이러한 발현은 젊은 세포보다 노화된 세포에서 강하였다. 면역조직화학 염색에서 iNOS 단백질은 젊은 사람과 노화된 사람의 치은 조직 모두에서 치은섬유아세포와 상피의 기저층 세포와 염증세포에서 발현되었으나 노화에 따른 발현의 차이를 구별할 수는 없었다. 세포의 면역염색에서 iNOS 단백질은 노화된 세포에서 강하게 발현되었고 이러한 발현은 LPS와 IFN-γ에 의해 강화되었다. LPS와 IFN-γ의 조건이 주어지지 않은 상태에서 iNOS mRNA는 젊은 세포에서보다 노화된 세포에서 강하게 발현되었다. 이러한 결과를 통해 본 연구는 세포의 노화가 NO와 iNOS 발현을 증가시킴으로서 치주질환의 진행에 영향을 끼칠 수 있음을 제시하고자 한다.

Hyaluronan 이 TMJ synoviocyte 에서 nitric oxide 의 생성에 미치는 영향 : 면역조직학적 연구

한국진 연세대학교 2004 국내박사

Hyaluronan 과 nitric oxide와의 관련성에 대한 실험동물연구가 슬관절 (knee joint) 에서 Takahashi (2000, 2001) 와 kobayashi (2002) 등에 의해서 시행 되었으나 측두하악관절 (TMJ) 에서 연구는 Alpaslan (2000) 의 임상적 연구가 있었으나 조직학적 표본을 이용한 연구는 없는 실정이다. 물론 hyaluronan 이 TMJ 에서의 임상적 효능에 대한 연구가 많이 이루어졌으나 nitric oxide와의 관련성에 대한 연구는 부족한 실정이다. 이에 이 연구는 hyaluronan 이 실험동물 내에서 nitric oxide생성에 미치는 영향을 알아보고자 인위적으로 carrageenan 으로 유도된 TMJ synovitis를 가진 rat 에서 고분자 (high molecular weight) 인 exogeneous hyaluronan을 주입하여 nitric oxide의 생성에 관여하는 iNOS (inducible nitric oxide synthetase) 의 발현과 이의 생성을 signalling 하는 NF-κB pathway의 발현을 synoviocyte 에서 immunohistochemistry 로 관찰하고 이 외에 부가적으로 세포증식 (cell proliferation) 과 세포사멸 (cell apoptosis) 에 어떠한 영향을 미치는가를 알아보기 위함이다.실험동물 중 아무 조작을 시행하지 않은 I군과 saline을 주입한 II군 그리고 carrageenan으로 인위적 synovitis을 유도한 후 hyaluronan을 관절 내에 주입하지 않은 III군과 synovitis 유도 후 hyaluronan을 주입한 IV군으로 나누었다. III군 과 IV군 사이에 iNOS, NF-κB의 발현을 면역조직학적 소견을 비교하여 hyaluronan이 nitric oxide의 생성에 어떠한 영향을 미치는 지와 세포증식 정도를 면역조직학적 방법으로 관찰하고 세포사멸 정도를 TUNEL staining으로 관찰하여 다음과 같은 결과를 얻었다. iiiCarrageenan 으로 유도된 III 군이 아무런 조작을 하지 않은 I 군이나 saline 만을 주입한 II군에 비해서 iNOS 와 NF-κB, PCNA immunoreactivity 가 증가된 양상을 나타내었으나 TUNEL staining 에서는 차이가 없었다. Carrageenan 으로 유도된 III군과 IV군사이의 비교에서 hyaluronan 을 주입한 IV군이 주입하지 않은 III군에 비해서 iNOS immunoreactivity, NF-κB immunoreactivity, PCNA immunoreactivity 가 감소되는 양상을 보였다. Carrageenan 으로 유도된 III군과 IV군사이의 비교에서 hyaluronan 을 주입한 IV군과 주입하지 않은 III군 사이에 tunnel staining 의 차이는 보이지 않았다.이상의 결과로 hyaluronan을 주입하는 것이 carrageenan으로 유도된 synovitis가 있는 활막에서 관여되는 여러 염증전구물질중의 하나인 nitric oxide의 생성과 세포 증식을 조절함에 영향을 미치며 세포사멸에는 큰 영향을 보이지 않는 것으로 사료된다. 이와 같이 염증성 질환에서의 hyaluronan 의 주입은 nitric oxide의 감소와 세포증식의 감소를 통하여 염증반응을 억제하여 관절기능의 회복에 중요 역할을 한다. This study was performed to evaluate the effectiveness on the nitric oxide synthesis, cell proliferation and cell apoptosis in the synovial membrane when the intraarticular injection of high molecular weight exogeneous hyaluronan (sodium hyaluronate) in the carrageenan-induced synovitis of rat TMJ is done. The expressions of iNOS, which participate in nitric oxide production, and NF-κB, which is involved cell signals of iNOS from the four groups were immunohistochemically compared by iNOS immunohistochemistry, NF-κB immunohistochemistry. Cell proliferation and apoptosis were compared by PCNA immunohistochemistry and TUNEL staining. Twenty rats were classified into 4 groups. The four groups included the control group I, the saline-injected group II, the carrageenan-induced synovitis group III, and the carrageenan-induced synovitis with hyaluronan injection group IV.54The results were as follows. 1. Group III showed increased iNOS, NF-κB, and PCNA immunoreactivity than groupI or group II.2. In comparing the two carrageenan-induced groups, Group IV showed decreased iNOSimmunoreactivity than Group III.3. In comparing the two carrageenan-induced groups, Group IV showed decreasedNF-κB immunoreactivity in some areas than Group III.4. In comparing the two carrageenan-induced groups, Group IV showed decreased PCNA immunoreactivity than Group IV.5. In comparing the two carrageenan-induced groups, Group III and Group IV didnot show any differences in tunnel staining.These results suggest that injection of hyaluronan into the joint space of rat TMJ synovitis induced by carrageenan is made it to decrease the synthesis of nitric oxide and cell proliferation in the synovial membrane. But it does not have a significant effect on cell apoptosis. Injection of hyaluronan into the joint space as therapy of TMJ inflammatory disease has advantage on the diminishment of inflammatory cascade by involvement of iNOS and cellular interaction

Mycoplasma pneumoniae항원이 마우스 비장세포와 성상세포의 IL-6, IL-12, TNF-α 및 Nitric oxide 생성에 미치는 영향

김종선 고신대학교 대학원 1999 국내석사

목적: Mycoplasma penumoniae는 호흡기로 감염되어 이형폐렴을 일으키며, 때로는 뇌막염이나 뇌염을 일으키는 균으로도 알려져 있으나, 감염 후 뇌막염이나 뇌염의 발병기전은 밝혀져 있지 않다. 이에 M. pneumoniae 항원이 마우스의 비장 림파구와 성상세포에서 Interleukin (IL)-6, IL-12, TNF-α 및 nitric oxide의 생성에 미치는 영향을 비교 검토함으로써 M. pneumoniae에 의한 뇌염의 원인을 규명하여 보고자 하였다. 재료 및 방법: 마우스의 비장림파구와 성상세포를 분리하여 24 well plate에 세포수가 1x106/ml되도록 조정하여 배양하였다. 각 세포 배양 well은 항원을 자극하지 않은 대조군(I), M. pneumoniae 항원을 10μg/ml 투여한 실험군(II), M. penetrans 항원을 10μg/ml투여한 실험대조군(III) 으로 나누어 각각 2 well씩을 사용하였다. 항원 투여 24, 48 시간 후에 각각의 배양 상층액을 100ul씩 취하여 각 사이토카인의 진단용 ELISA kit (Genzyme, Cambridge, USA)를 이용하여 각 사이토카인의 농도를 측정 하였다. 또한, 상기 세포의 각 배양상층액에서 nitric oxide의 생성유무를 Ding 등의 방법에 준하여 측정하였다. 결과: 비장 림프구의 24 시간 배양 상층액에서 IL-6의 농도는 I군에서 2.4pg/ml, II군에서 8.7pg/ml, III군에서 13.8pg/ml이었으며, 48 시간 후에는 I, II, III군에서 각각 1.1, 5.6, 4.5pg/ml이었다. 비장 림파구 배양상층액에서 24시간 후에 IL-12의 농도는 I군에서 110pg/ml, II군에서 98.4pg/ml, III군에 서 69.5 pg/ml이었으며, 48시간 후에는 I, II, III군에서 각각 444.8, 217.0, 107.2pg/ml로 증가되었다. 비장 림파구 배양상층액에서 24시간 후에 TNF- α의 농도는 I군에서 47.8pg/ml, II군에서168.1pg/ml, III군에서 139.2pg/ml 이었으며, 48시간 후에는 I, II, III군에서 각각 81.5, 285.0, 201.1pg/ml이었 다. 성상세포 배양상층액에서 24시간 후에 IL-6의 농도는 I군에서 333.8pg/ml, II군에서 1340.2pg/ml, III군에서 1385.8pg/ml이었으며, 48 시간 후에는 I, II, III군에서 각각 195.8, 1200.0, 72.8pg/ml이었다. 성상세포 배양 상층액에서 24시간 후에 IL-12의 농도는 I군에서 37.6pg/ml, II군에서 20.3pg/ml, III군에서 51.2pg/ml이었으며, 48시간 후에는 I, II, III군에서 각각 375.1, 675.2, 616.3pg/ml이었다. 성상세포 배양상층액에서 24시간 후에 TNF-α의 농도는 I군에서 29.3pg/ml, II군에서 105.0pg/ml, III군에서 63.7pg/ml이었으며, 48시간 후에는 I, II, III군에서 각각 6.0, 47.7, 32.0pg/ml이었다. 비장 림파구 배양상층액에서 24시간 후에 nitric oxide의 농도는 I군에서 5.2nM/ml, IFN+LPS 6.0nM/ml, IFN+M. pneumoniae8.4nM/ml, IFN+M. penetrans 5.0nM/ ml이었으며, 48시간 후에는 각각 5.4, 8.3, 12.0, 5.2nM/ml이었으며, 72시간 후에는 각각 7.3, 9.1, 12.1, 7.0nM/ml이었 다. 성상세포 배양상층액에서 24시간 후에 nitric oxide의 농도는 대조군 5.5nM/ml, IFN+LPS 10.7nM/ml, IFN+M. pneumoniae 20.0nM/ml, IFN+M. penetrans 4.3nM/ml이었으며, 48시간 후에는 각각 6.6, 13.9, 23.0, 5.7nM/ml이었으며, 72시간 후에는 각각 7.2, 15.6, 23.0, 8.5nM/ml이 었다. 결론: 이상의 결과로써 M. pneumoniae 항원으로 자극된 비장세포에 서는 IL-12의 생성이 억제시키지만 IL-6, TNF-α와 nitric oxide의 생성은 증가된다. 성상세포에서는 IL-6, IL-12, TNF-α, nitric oxide의 생성이 증 가시되므로써 M. pneumoniae 감염이 뇌에서 염증반응에 관여할 가능성 이 큰 것으로 생각된다. This study was conducted to investigate whether the mouse astrocyte produce inflammatory cytokines in response to Mycoplasma pneumoniae antigen stimulation. Splenocyte system was induced here as a bona fide control of immune response. Mycoplasma pneumoniae and Mycoplasma pneumoniae antigen were tested for their ability to induce inflammatory cytokines production in the culture systems of astrocytes and slpenocytes of mouse. The concentration of each cytokines in the culture supernatants was measured by each ELISA kits of the cytokines, and Griess reagent was used for nitric oxide. The concentration of IL-6 in the 24 hr culture supernatant of splenocytes was 2.4pg/ml for control, 8.7pg/ml for M. pneumoniae, and 13.8pg/ml for M. penetrans, but in the 48 hr, it was 1.1, 5.6, 4.5pg/ml, respectively. The concentration of IL-12 in the 24 hr cuture supernatant of splenocytes was 110.0pg/ml for control, 98.4pg/ml for M. pneumoniae, and 69.5pg/ml for M. penetrans, but in the 48 hr, it was 444.8, 217.0, 107.2pg/ml, respectively. The concentration of TNF- α in the 24 hr cuture supernatant of splenocytes was 47.8pg/ml for control, 168.1pg/ml for M. pneumoniae, and 139.2pg/ml for M. penetrans, but in the 48 hr, it was 81.5, 285.0, 201.1pg/ml, respectively. The concentration of IL-6 in the 24 hr cuture supernatant of astrocytes was 333.8pg/ml for control, 1340.2pg/ml for M. pneumoniae, and 1385.8pg/ml for M. penetrans but in the 48 hr, it was 195.8, 1200.0, 72.8pg/ml, respectively. The concentration of IL-12 in the 24 hr cuture supernatant of astrocytes was 37.6pg/ml for control, 20.3pg/ml for M. pneumoniae, and 51.2pg/ml for M. penetrans, but in the 48 hr, it was 375.1, 675.2, 616.3pg/ml, respectively. The concentration of TNF-α in the 24 hr cuture supernatant of astrocytes was 29.3pg/ml for control, 105.0pg/ml for M. pneumoniae, and 63.7pg/ml for M. penetrans, but in the 48 hr, it was 6.0, 47.7, 32.0pg/ml, respectively. The concentration of nitric oxide in the 24 hr cuture supernatant of splenocytes was 5.2nM/ml for control, 6.0nM/ml for IFN+LPS, 8.4nM/ml for IFN+M. pneumoniae, and 5.0nM/ml for IFN+M. penetrans, but in the 48 hr, it was 5.4, 8.3, 12.0, 5.2nM/ml, respectively, and in the 72 hr, it was 7.3, 9.1, 12.1, 7.0nM/ml, respecitvely. The concentration of nitric oxide in the 24 hr cuture supernatant of astrocytes was 5.5nM/ml for control, 10.7nM/ml for IFN+LPS, 20.0nM/ml for IFN+M. pneumoniae, and 4.3nM/ml for IFN+M. penetrans, but in the 48 hr, it was 6.6, 13.9, 23.0, 5.7nM/ml, respectively, and in the 72 hr, it was 7.2, 15.6, 23.0, 8.5nM/ml, respecitvely. These results suggest that the inflammatory cytokines production of astrocytes pretreated with M. penetrans antigen may play an important role in the acute inflammation during M. pneumoniae infection of the CNS.