개 동결 정자의 apoptosis, oxidative stress, DNA integrity에 관한 연구

김수희 전북대학교 대학원 2009 국내박사

The aims of the present study were designed to investigate impact of freezing-thawing process on apoptosis, oxidative stress and DNA integrity in addition to sperm conventional parameters and to compare the effects of sperm separation techniques (Glass wool [GW] filtration and Percoll density gradient [PDG] centrifugation) on removal of cryo-damage in canine sperm. And also, this study was conducted to determine correlations between sperm conventional parameters (progressive motility, viability and abnormality) and advanced parameters (membrane integrity, apoptosis, ROS production and DNA integrity), and correlations among advanced parameters. Five healthy and sexually mature dogs were used in this study, and semen was obtained by digital manipulation, cryopreserved and thawed. After thawing of cryopreserved semen, sperm conventional parameters such as sperm motility, viability and morphological defects were evaluated for comparison with fresh semen. Sperm membrane integrity (HOS test and 6-CFDA/PI fluorescent test), apoptosis (Annexin V [AN]/PI assay), intracellular H₂O₂ level (DCFDA/PI assay) and DNA integrity (SCSA) were also evaluated before and after freezing-thawing process. And thawed semen was treated by sperm separation techniques using glass wool and Percoll to identify the effect of them on removal of cryo-damaged sperm, and was also evaluated like the preceding before and after treatment. In addition, H₂O₂ stimulation test and recovery rate were evaluated in treated samples. Freezing-thawing process decreased motility, viability, normal morphology and membrane integrity in canine sperm as previously reported (p < 0.05). This process also decreased AN-/PI- sperm, and increased apoptotic index, intracellular H₂O₂ level of viable sperm and DNA fragmentation (p < 0.05). In the correlations among parameters, progressive motility and viability positively correlated with AN-/PI-, CFDA+/PI- and HOST responsive sperm, while negatively correlated with apoptotic index and intracellular H₂O₂ level of viable sperm. Abnormal morphology positively correlated with AN+/PI+ sperm and apoptotic index, while negatively correlated with CFDA+/PI- and HOST responsive sperm. The sperm samples treated by GW filtration after thawing showed significant increase in sperm motility, viability, normal morphology, membrane integrity and AN-/PI- sperm compared with whole samples (before filtration) (p < 0.05). In basal ROS level of viable sperm fraction, the GW filtrated samples showed significant decrease in the percentage of sperm with high intracellular H₂O₂ level and MFI value compared with whole samples, whereas PDG centrifuged samples just showed significant decrease in MFI value compared with whole samples (p < 0.05). When H₂O₂ stimulation was given in two separation groups, PDG centrifuged viable spermatozoa showed significantly higher increasing rate in intracellular H₂O₂ level compared with GW filtrated viable spermatozoa (p < 0.05). DNA fragmentation was no significant difference among whole and the two sperm treatments (p > 0.05). The recovery rate of progressive motile, viable, CFDA+/PI-, AN-/PI- and DCF-/PI- sperm was higher in GW filtrated samples than PDG centrifuged samples (p < 0.05). In the correlations among parameters, progressive motility and viability positively correlated with CFDA+/PI- and HOST responsive sperm, while negatively correlated with AN-/PI+ sperm. In particular, viability also negatively correlated with the percentage of sperm with high intracellular H₂O₂ level of viable sperm fraction. Abnormal morphology did not show correlations with all advanced parameters. In the correlations among advanced parameters, increase in apoptotic index positively correlated with increase in intracellular H₂O₂ level of viable sperm, but not correlated with the others. Increase in intracellular H₂O₂ level of viable sperm positively correlated with increase in DFI, while negatively correlated with increase in HOST responsive sperm. In conclusion, the freezing-thawing procedure significantly affects membrane integrity, apoptosis, ROS production and DNA integrity as well as conventional parameters in canine semen. It is therefore recommended that these parameters be used as an additional parameter for the assessment of sperm quality after freezing-thawing in canine semen. And these cryo-damages can be improved by treatment of GW filtration after freezing-thawing. It is considered that GW filtration may rather lower the risk of selecting sperm with abnormal function for ART. 이 연구는 개의 정액에서 동결이 일반적인 정자성상 뿐만 아니라 apoptosis, 산화적 스트레스, DNA integrity에 미치는 영향을 조사하고자 수행되었으며 동결·융해 후 glass wool (GW) 여과와 Percoll density gradient (PDG) 원심분리법과 같은 정자처리기법이 동결 손상된 정자의 제거에 이용될 수 있는지 알아보고자 수행되었다. 또한 도출된 결과를 이용하여 일반적인 정자성상과 정자 세포의 apoptosis, 산화적 스트레스, DNA integrity와의 상관관계를 규명함으로써 정자에 대한 기존의 일반 성상 검사를 포함하여 정자 핵 및 정자막의 손상과 대사기능의 변화를 평가하여 그 결과 생존성과 수정능력이 높은 정자를 선별하는 기초자료 및 선별방법을 제시하고자 하였다. 실험동물로서 5 마리의 성견 (Beagle 4 두, 슈나우저 1 두)을 사용하여 수지법으로 정액을 채취하였고 채취한 정액은 Sweden 배지를 이용하여 동결하였다. 정자의 동결전과 동결후를 비교하기 위하여 정자 운동성, 생존성, 기형율과 같은 일반적인 정자성상 검사를 수행하였고 정자 세포막의 온전성을 조사하기 위하여 HOS test와 6-CFDA/PI fluorescent test를, apoptosis를 조사하기 위하여 Annexin V (AN)/PI assay를, 세포 내 H₂O₂ 수준 조사를 위하여 DCFDA/PI assay를, 그리고 DNA 온전성을 조사하기 위하여 SCSA와 같은 검사들을 수행하여 평가하였다. 또한 융해된 정액은 생존성과 정상형태율이 높은 정자를 얻기 위한 방법으로 glass wool과 Percoll 처리 후 회수하였으며 회수된 정자들은 상기와 동일한 방법으로 평가되었다. 이 연구의 결과에서 개 정자의 동결-융해 과정은 정자의 운동성, 생존성 및 세포막의 온전성을 감소시켰으며 기형율을 증가시킨 것으로 확인되었다 (p < 0.05). 또한 동결 및 융해 후 동결 전 희석정액에 비해 AN-/PI- 정자의 감소가 나타났고, 정자의 apoptotic index와 살아있는 정자의 세포 내 H₂O₂ 수준 및 DNA fragmentation의 증가가 나타났다 (p < 0.05). 평가인자들의 상관관계 분석 결과, 개 정자의 전진 운동성과 생존성은 AN-/PI-, CFDA+/PI- 그리고 HOST 반응 정자들과 positive 상관관계를 보였으나, apoptotic index와 살아있는 정자 중 높은 H₂O₂ 수준을 가진 정자율과는 negative 상관관계를 보였다. 기형율은 AN+/PI+ 정자, apoptotic index와는 positive 상관관계, CFDA+/PI- 및 HOST 반응 정자들과는 negative 상관관계를 나타내었다. 융해 후 GW 여과에 의해 처리된 정자는 처리하지 않은 정자보다 운동성, 생존성, 형태학적 정상 정자율, 세포막 온전성 그리고 AN-/PI- 정자율에서 증가를 나타냄으로써 이 방법을 통해 더 양호한 정자를 선별할 수 있음이 인정되었다 (p < 0.05). 세포 내 H₂O₂ 수준 검사 결과, H₂O₂로 자극하지 않은 경우, GW 여과된 정자는 대조군에 비해 살아있는 정자에서 높은 수준의 H₂O₂를 가진 정자율 및 Mean Fluorescence Intensity (MFI)에서 감소를 보였으며 (p < 0.05), PDG 원심분리된 정자도 대조군에 비해 MFI에서 감소를 보였다 (p < 0.05). GW 및 Percoll 처리군을 H₂O₂로 자극하였을 경우, PDG 원심분리된 정자는 GW 여과된 정자에 비해 높은 H₂O₂ 증가율을 보였다 (p < 0.05). 그러나 GW 및 PDG에 의해 처리된 정자의 DNA fragmentation율은 대조군의 DNA fragmentation율과 유의적인 차이는 인정되지 않았다. 정자 처리 후 전진 운동성, 생존성, CFDA+/PI-, AN-/PI- 및 DCF-/PI- 정자의 회수율 비교에서, GW 여과군은 PDG 원심분리군보다 정자수의 높은 회수율을 보임으로써, GW 여과군은 PDG 원심분리군에 비해 전진 운동성, 생존성, 세포막 온전성, apoptosis, ROS 평가에서 더 양호하며 더 많은 수의 정자를 회수할 수 있음이 인정되었다 (p < 0.05). 이상의 결과에서 평가인자들의 상관관계 분석 결과, 개 정자의 전진 운동성과 생존성은 CFDA+/PI- 및 HOST 반응 정자들과 positive 상관관계를 보였으나, AN-/PI+ 정자와는 negative 상관관계를 나타내었다. 또한 생존성은 살아있는 정자 중 높은 수준의 H₂O₂를 가진 정자율과도 negative 상관관계를 나타내었다. Apoptotic index의 증가율은 살아있는 정자의 H₂O₂ 증가율과 positive 상관관계를 보였으며, 살아있는 정자의 H₂O₂ 증가율은 DNA fragmentation index (DFI) 증가율과 positive 상관관계를, HOST 반응 정자 증가율과는 negative 상관관계를 나타내었다. 이 연구의 결론으로서, 동결-융해 과정은 개 정액의 일반적인 정자 성상뿐만 아니라 정자 세포막 온전성, apoptosis, ROS 생성 및 DNA 온전성에 영향을 미치는 것으로 나타났다. 따라서, 정자의 핵 상태 및 대사기능을 판정하는 방법들은 동결·융해 후 정액의 질을 평가하고 정자의 생존성과 수정능력을 판정하는데 보다 정확한 방법이 될 것으로 판단된다. 또한 이러한 정자의 동결 손상은 동결-융해 후 GW 여과 처리에 의해 향상될 수 있으며 이는 체외수정 및 ICSI와 같은 번식공학에 적용시 보다 생존성과 수정능력이 높은 정자를 선택할 수 있을 것으로 생각된다. 본 연구는 개의 동결정자의 핵 상태와 대사기능의 변화를 조사한 최초의 보고로서 향후 적절한 동결 프로그램의 개발을 위한 기초자료가 될 것이며, 개 동결정액의 수정능력을 향상시킬 수 있는 정자 처리방안을 구축하는데 효과적으로 활용될 수 있을 것으로 판단된다.

Studies on the molecular mechanism during the acquisition of thermotolerance in Arabidopsis

한신희 서울대학교 대학원 2021 국내박사

In nature, plants continuously exposed to unfavorable conditions. Heat is one of the major stress which affects to plant growth and development. Especially, it has been widely reported in recent decades that global warming is accelerated and widely affects to crop productivity. In this sense, it is essential that I extend understanding on molecular mechanism of thermotolerance. Heat shock has deleterious effects on the cell by protein unfolding and unspecific aggregation. In addition, heat shock triggers disruption of the cytoskeleton that cause the loss of the correction localization of organelles and collapse of intracellular transport process. One of the detrimental effects of heat shock-induced oxidative stress in plants is genetic disturbance that is caused by the induction of DNA damages and the inhibition of DNA repair activity. Therefore, plants possess various mechanisms to cope with damage of cells caused by heat stress. It has been previously reported that the transcription level of heat shock responsive genes in plants is increased by heat stress. The HEAT SHOCK PROTEINs (HSPs) and the HEAT SHOCK FACTORs (HSFs) are major constituents of the heat shock regulatory system in plants by controlling protein homeostasis. Secondary metabolites activate or stabilize Reactive oxygen species (ROS)-scavenging enzymes and suppresses production of ROS. In this study, I investigate how thermotolerance is affected by light priming, and how important the DNA integrity of plants is for thermotolerance of plants. In Chapter 1, a study on the effect of the presence of light on the thermotolerance of plants before the heat stress is described. ROS serve as critical signaling mediators in plant adaptation responses to environmental stimuli. Meanwhile, ROS biosynthesis and metabolism should be tightly regulated, because they often impose oxidative damages on biological molecules, such as DNA and proteins, and cellular structures. It is known that at high temperatures, ROS rapidly accumulate in plant tissues. Thus, a quick activation of ROS scavenging systems is necessary for thermal adaptation. However, it is largely unknown how the thermo-induced ROS detoxifying capacity is enhanced by environmental factors at the molecular level. Here, I demonstrated that environmental light primes the thermally induced ROS detoxification process for thermotolerance development in Arabidopsis. While the ROS detoxification capacity was markedly enhanced in light-pretreated plants at high temperatures, its enhancement was not as evident in dark-pretreated plants as in light-pretreated plants. ASCORBATE PEROXIDASE 2 (APX2) is a representative ROS scavenging enzyme that is activated under heat stress conditions. It was observed that the thermal induction of APX2 gene was more prominent in light-pretreated plants than in dark-pretreated plants. Notably, the light-gated APX2 gene induction was compromised in Arabidopsis mutants lacking the red light photoreceptor phytochrome B (phyB). Furthermore, exogenous application of the antioxidant ascorbate recovered the heat-sensitive phenotype of the phyB mutant. These observations indicate that light-primed ROS detoxifying capability is intimately linked with the induction of thermotolerance. I propose that the phyB-mediated light priming of ROS detoxification is a key component of thermotolerant adaptation in plants. In Chapter 2, I investigated how the DNA integrity of plants affects the high temperature resistance of plants. High temperature stress interferes with the folding of proteins at the cellular level of plants or disrupts the cell wall or cytoskeleton of cells. In addition, it reduces DNA integrity by modifying nucleotides or breaking DNA strands. However, it is not known how this DNA integrity affects the thermotolerance of plants. Here, I proved that thermotolerance of plants is increased by activating a mechanism that repairs DNA integrity reduced by high temperature by HIGH EXPRESSION OF OSMOTICALLY RESPONSE GENES 1 (HOS1). HOS1 protein is known as a regulatory protein that regulates plant low temperature resistance, flowering time, and circadian clock by degrading target proteins or remodeling chromatin. In this study, it was observed that the thermotolerance of HOS1 deficient plants was significantly reduced compared to that of wild-type plants. Based on this phenotype, it was confirmed that HOS1 regulates genes related to DNA repair at high temperatures. Among them, it was observed that the thermotolerance decreased in mutant plants which the RECQ2 helicase enzyme, which released the double strands of DNA, was deficient. In addition, it was confirmed that DNA was damaged by high temperature in HOS1 deficient mutant and RECQ2 deficient mutant. Through this observation, it was proven that the HOS1 protein increases the expression of RECQ2 at high temperatures to repair damaged DNA, thereby increasing thermotolerance of plants. In addition, it was demonstrated that the stability of HOS1 protein is increased by high temperature, and that the HSFA1-HSP90 module is required to increase the stability of HOS1 protein. In conclusion, I propose a new mechanism for regulating the high temperature resistance of plants, and assert how important it is to maintain the integrity of the DNA for the thermotolerance of plants. 자연적으로 식물은 불리한 조건에 지속적으로 노출된다. 열은 식물의 성장과 발달에 영향을 미치는 주요 스트레스 중 하나이다. 특히 최근 수십 년 동안 지구 온난화가 가속화되고 작물 생산성에 크게 영향을 미친다는 연구가 널리 보고되었다. 이러한 의미에서 고온 저항성의 분자 메커니즘에 대한 이해를 넓히는 것이 필수적이다. 고온 스트레스는 단백질 비접힘와 비특이적 응집에 의해 세포에 해로운 영향을 미친다. 또한 고온 스트레스는 세포 골격의 파괴를 통해 세포 기관 위치 조정 방해와 세포 내 수송 과정의 붕괴를 유발한다. 식물에서 고온 스트레스로 인한 산화 스트레스의 해로운 영향 중 하나는 DNA 손상 유도와 DNA 복구 활동의 억제로 인한 유전적 장애이다. 따라서 식물은 고온 스트레스로 인한 세포 손상에 대처할 수 있는 다양한 메커니즘을 가지고 있다. 고온 스트레스에 의해 식물에서 고온 반응 유전자의 전사 수준이 증가한다고 이전에 보고 된 바 있다. 열충격 단백질 (HSP) 및 열충격 전사인자 (HSF)는 단백질 항상성을 제어하여 식물의 고온 스트레스 조절 시스템의 주요 구성 요소이다. 2차 대사 산물은 활성산소 (ROS) 제거 효소를 활성화 또는 안정화시키고 ROS 생성을 억제한다. 이 연구에서 나는 고온 저항성이 빛의 전처리에 의해 어떻게 영향을 받는지, 식물의 DNA 온정성이 식물의 고온 저항성에 얼마나 중요한지 연구하였다. 제 1 장에서는 고온 스트레스가 오기 전 빛의 존재 유무에 따라 식물의 고온 저항성에 끼치는 영향에 대해서 연구하였다. 활성산소는 환경 자극에 대한 식물 적응 반응에서 중요한 신호 매개체 역할을 한다. 한편, 활성산소 생합성과 신진 대사는 종종 DNA 및 단백질과 같은 생물학적 분자 및 세포 구조에 산화 손상을 가하기 때문에 정확하게 조절되어야한다. 고온에서 활성산소는 식물 조직에 빠르게 축적되는 것으로 알려져 있다. 따라서 고온에 적응하기 위해 활성산소를 제거하는 시스템의 빠른 활성화가 필요하다. 그러나 고온에 의해 발생하는 활성산소를 제거하는 메커니즘이 외부의 환경 요인에 의해 어떻게 작동되는지는 거의 알려지지 않았다. 본 연구에서, 나는 외부 환경요소인 빛이 애기 장대의 고온 저항성을 위해 고온에 의해 발생한 활성산소를 제거하는 과정을 미리 대비한다는 것을 보여주었다. 활성산소를 제거하는 능력은 고온 스트레스가 오기 전 빛을 미리 처리 한 식물에서 현저하게 향상되었지만, 빛을 미리 처리하지 않고 암전시킨 식물에서는 그 향상이 분명하지 않았다. ASCORBATE PEROXIDASE 2 (APX2)는 열 스트레스 조건에서 활성화되는 대표적인 활성산소 제거 효소이다. APX2 유전자의 발현은 어두운 전처리 식물보다 빛을 전처리 한 식물에서 더 두드러지게 증가 한 것으로 관찰되었다. 특히, 빛의 전처리로 인한 APX2 유전자 발현의 증가는 적색광 광 수용체 피토크롬 B (phyB)가 망가진 돌연변이 식물에서 감소해있었다. 더욱이, 항산화제인 아스코르베이트를 처리를 했을 때, phyB 돌연변이체는 열에 민감한 표현형을 회복시켰다. 이러한 관찰은 빛의 전처리로 인한 활성산소 제거 능력이 고온 저항성의 증가와 밀접한 관련이 있음을 나타낸다. 나는 활성산소 제거를 위한 피토크롬 B를 통한 빛의 전처리 과정이 식물의 고온 저항성의 핵심 구성 요소라고 제안한다. 제 2 장에서는 식물의 DNA 온정성이 식물의 고온 저항성에 어떤 영향을 미치는지 알아보았다. 고온 스트레스는 식물의 세포수준에서 단백질의 접힘을 방해하거나 세포의 세포벽이나 세포외골격을 붕괴시킨다. 뿐만 아니라 뉴클레오타이드 변형이나 DNA 가닥을 파손시켜 DNA 온전성을 감소시킨다. 하지만 이러한 DNA 온전성이 식물의 고온저항성에 어떻게 영향을 끼치는지 전혀 알려져 있지 않다. 본 연구에서는 HIGH EXPRESSION OF OSMOTICALLY RESPONSE GENES 1 (HOS1) 단백질에 의해서 고온에 의해 감소한 DNA 온전성을 수선하는 메커니즘을 활성화 시켜 식물의 고온저항성을 증가 시킨다는 것을 증명하였다. HOS1 단백질은 표적 단백질을 분해하거나 크로마틴을 리모델링 하여, 식물의 저온 저항성 조절, 개화시기 조절, 일주기 조절 등을 하는 조절 단백질로 알려져 있다. 본 연구에서는 HOS1이 망가진 식물의 고온 저항성이 야생형 식물보다 현저하게 감소해 있는 것을 관찰했다. 이 표현형을 바탕으로 고온에서 HOS1이 DNA 수선과 관련된 유전자들을 조절 하는 것을 확인했다. 그 중에서도 DNA의 이중가닥을 풀어주는 RECQ2 헬리케이즈 효소가 망가진 돌연변이 식물에서 고온 저항성이 감소해 있는 것을 관찰했다. 뿐만 아니라 HOS1이 망가진 돌연변이 식물과 RECQ2가 망가진 돌연변이 식물에서 고온에 의해서 DNA가 망가진 것을 확인했다. 이를 통해서 고온에서 HOS1 단백질이 RECQ2의 발현을 증가시켜 망가진 DNA 수선을 하여 식물의 고온 저항성을 증가시킨다는 것을 알 수 있다. 추가적으로 고온에 의해서 HOS1 단백질의 안정성이 증가하며, HEAT SHOCK FACTOR A1 (HSFA1)-HEAT SHOCK PROTEIN90 (HSP90) 모듈이 HOS1 단백질의 안정성 증가에 필요하다는 것을 증명하였다. 나는 본 연구를 통해서 식물의 고온 저항성을 조절 하는 새로운 메커니즘을 제안하며, 식물의 DNA의 온전성을 유지하는 것이 식물의 고온 저항성에 얼마나 중요한지 주장한다.

Analysis of T-DNA Integration Patterns in Agrobacterium-mediated Transgenic Rice : Agrobacterium을 이용하여 형질전환 된 벼에서 T-DNA의 삽입 형태 분석

김성률 安東大學校 大學院 2002 국내박사

Organizations among plant DNA, T-DNA and vector backbone were analyzed in Agrobacterium-mediated transgenic rice plant using DNA gel blot, PCR, iPCR and DNA sequencing method. In randomly selected 145 pGA2707 tagging lines, 114 T-DNA/Plant DNA junctions were obtained by inverse PCR and analyzed. The asymmetry between the recombination of the 5’-end and 3’-end sides of the T-DNA was founded in transgenic rice. The 5’-end of the transferred-DNA is integrated by the ‘illegitimate recombination’; otherwise the 3’-end is integrated by dependence of sequence homology. The deletion of the 3’-end of transferred-DNA is severe than that of the 5’-end. Approximately forty-five percent has the vector backbone sequence (intact or partial vector backbone sequence) in randomly selected 171 T-DNA tagging lines. And also various junction forms were founded between T-DNA and vector backbone (the left T-DNA end linked the right vector backbone end and the right T-DNA end linked the left vector backbone end). These results show that LB can be used in initiation position and RB can be used in termination position for T-DNA processing step in Agrobacterium cell. Two causes of vector backbone integration into the plant genome were revealed. The first cause is border ‘read-through’. The T-DNA transfer is to start at the RB, passes the T-DNA, read-through at the LB and goes along the entire vector backbone sequence. The second cause is that the transferred-DNA is to start at the LB and goes along the vector backbone sequence. The isolation of rice genomic DNA sequence flanked the left vector backbone end and the ‘border-crossed-linked’ form between T-DNA and vector backbone support the latter case. Three types of T-DNA repeat configuration (direct tandem repeat, 5’-end to 5’-end junction form and 3’-end to 3’-end junction form) were observed in randomly selected 43 pGA2144 tagging lines. Fourteen lines (33%) have T-DNA direct tandem repeat form, 9 lines (21%) have inverted repeat of 5’-ends junction and 3 lines (7%) have inverted repeat of 3’-ends junction. Some tagging lines have two types of T-DNA repeat configurations. I performed investigation of rice chromosome deletion at the T-DNA integrated site. Fourteen to 69 bp chromosome deletions were observed and also no chromosome deletion was founded (line 18). I suggested the model that where finally independent two 5’-ends of the transferred-DNA attacks the plant DNA in configuration of multiple transferred-DNA complex at one locus on plant chromosome.

고정조건에 따른 조직슬라이드의 염색성 및 DNA보존성 연구

정다솜 고려대학교 대학원 2022 국내석사

병리과의 조직병리검사에서 진단까지의 과정 중 가장 초기단계이자 기본이 되는 과정은 고정이다. 고정은 진단을 위해 생체로부터 떼어낸 조직을 생체와 같은 구조로 유지하기 위해 실행하는 과정이다. 고정에는 영향을 미치는 여러가지 요인이 있다. 조직의 종류의 따른 특성, 고정의 시간, 온도, pH 등이 이에 해당한다. 따라서 본 논문에서는 이러한 요인들 중 조직 종류, 시간과 온도에 변화를 주어 고정을 진행하고, 각 조건에 따른 염색성과 DNA 보존성을 평가하여 고정의 조건이 검사에 어떠한 영향을 미치며 어떠한 인자의 영향이 더 큰지 확인해 보고자 시행하였다. 고정은 4℃(냉장), 25℃(실온), 50℃(Oven)에서 각각 1시간, 2시간, 4시간, 8시간, 24시간 진행하였고 24시간은 과고정 상태를 확인하기 위해 설정하였다. 조직의 종류는 특성에 따라 실질장기와 점막층을 포함하고 있는 장관조직으로 선정하였다. 실질장기로는 Liver를 장관조직에는 Colon과 Small intestine을 함께 사용하였다. 염색성 평가는 Hematoxylin-Eosin(HE) 염색과 각 장기의 특성에 맞는 특수염색을 종합하여 평가하였다. 특수염색으로 Liver는 Reticulin염색, Intestine은 Periodic-Acid-Schiff (PAS)염색을 시행하였으며 Liver의 조직형태학적 변화와 염색성, 장관조직의 Mucosal change, Proper muscle layer degeneration와 염색성을 확인하였다. DNA 보존성 평가는 DNA Purity측정 후 안정성 확인을 위해 DNA Integrity Number(DIN)를 평가하였다. 그 결과 염색성 평가의 경우 Liver는 현미경 하에서 조직형태학적 차이는 관찰되지는 않았으며, 모든 온도에서 시간이 길수록 염색성이 진해지는 경향을 보였다. Intestine은 모든 온도에서 고정시간이 길어질수록 Mucosal change, Proper muscle layer degeneration의 정도가 적었으며, PAS염색성이 진해지는 경향을 보였다. DNA보존성평가는 Liver의 경우 Purity의 차이는 거의 없었으며 DIN값은 모든 온도에서 가장 오랜 시간 고정한 조건에서 가장 낮은 값을 나타냈다. Intestine은 Purity의 차이는 거의 없었으며 DIN값은 모든 온도에서 고정시간이 길어질수록 DIN값이 낮아졌다. 유의한 차이는 25℃과 50℃에서 확인되었다. 이는 4℃에서의 고정이 DNA가 가장 안전하게 고정됨을 의미한다. 본 실험 통해 고정은 염색성과 DNA보존성 모두에서 시간과 온도조건 중 시간의 영향이 더 있음을 확인할 수 있었고, 점막을 포함하고 있는 조직이 고정조건에 더 민감하며, 4℃에서 DNA가 안정하게 고정되는 것으로 평가되었다. 본 연구 결과는 향후 조직병리 검사의목적이나 진단을 위한 고정조건설정에 관한 연구에 기초적인 자료로 기여할 수 있을 것으로 기대된다. The initial and basic process of histopathology examination to diagnosis in pathology is fixation. Fixation is the process of keeping tissues removed from the living body in the same structure as the living body for diagnosis. There are several factors that affect fixation. These factors are type of tissue, time of fixation, temperature, pH of fixation solution, and etc. Therefore, in this paper, among these factors, fixation was performed by changing tissue type, time, temperature, stainability, and DNA conservation according to each condition were evaluated to determine how the fixation condition affects the test and which factor is more affected. Tissue samples were fixed for 1hrs, 2hrs, 4hrs, 8hrs, and 24hrs, and at temperature of 4℃, 25℃, and 50℃. 24hrs fixing time was set to check the over-fixed condition. The type of tissue was selected as a spectacular tissue containing a parenchymal organ, Liver, and a mucosal layer, according to its characteristics. The Intestine included Colon and Small intestine. The stainability was evaluated using HE stain and special dyeing suitable for the characteristics of each organ. For special dyeing, Reticulin staining was used for Liver and PAS staining was used for Intestine. Each stainability was assessed by histological change for liver, and mucosal change and Proper muscle layer degeneration for intestine. DNA integrity number was evaluated to confirm stability after DNA Purity measurement. As a result, no histo-morphological difference was observed in the stainability of liver, and the stainability tended to intensify as time increased at all temperatures. There was little difference in Purity in DNA conservation, and the DIN value was the lowest at all temperatures under the longest fixed conditions. Neither chromatin nor DNA conservation showed significant differences. Intestine staining tended to have less degree of mucosal change and professional muscle layer generation as fixed times increased at all temperatures and to have higher staining properties 25℃. DNA conservation had little difference in Purity, and the DIN value decreased as the fixation time increased at all temperatures. Significant differences were identified at room temperature and Oven. This experiment confirmed that fixation had more time effects among time and temperature conditions in both staining and DNA conservation properties 25℃, and that tissues containing mucous membranes were more sensitive to fixed conditions, and DNA was evaluated to be stably fixed at 4℃. The results of this study are expected to contribute as basic data for future research on the purpose of histopathological examination or the setting of fixed conditions for diagnosis.

Droplet digital PCR-based EGFR mutation detection with an internal quality control index to determine the quality of DNA

김성수 서울대학교 대학원 2018 국내박사

Formalin-fixed paraffin-embedded tissue (FFPET) samples are invaluable sources for both translational clinical research and molecular in vitro diagnostics. However, accurate detection of genetic mutations in FFPET is a major challenge due to artifactual results, due to sample age and quality. In a pre-clinical study, we used 315 non-small cell lung cancer (NSCLC) FFPET-derived DNA (FFPET-DNA) samples to establish sample criteria reflecting the minimum DNA quality suitable for PCR by comparing the results of droplet digital PCR-based mutation test (ddEGFR test) and qPCR-based EGFR mutation test (cobas® EGFR test). Using this criteria, we conducted a retrospective comparative clinical study of the ddEGFR and cobas EGFR tests of 171 NSCLC FFPET-DNA samples. Based on the pre-clinical study, the FFPET-DNA sample criterion was established as internal quality control (iQC) index ≥ 0.5 (iQC copies ≥ 500, using 3.3 ng [1000 genome equivalents] of FFPET-DNA), indicating that more than half of the input DNA was amplifiable. Based on this iQC index, an independent clinical study revealed that both tests were significantly concordant (overall percent agreement (OPA) = 92.98%). Discordants not detected by the cobas EGFR test were detected using the ddEGFR test, indicating that the higher sensitivity of the ddEGFR test is due to its lower limit of detection. iQC index is a reliable indicator of the quality of FFPET-DNA and could be used to prevent incorrect diagnoses arising from low-quality samples. Compared with the cobas EGFR test, the ddEGFR test exhibited superior analytical performance and at least equivalent clinical performance. ddEGFR test is expected to serve as an appropriate treatment guidance for NSCLC patients.

동물 피부조직의 DNA 안정성 평가에 관한 연구

강재원 고려대학교 대학원 2020 국내석사

목적: 동물 피부조직은 인체의 피부연구의 대체 조직으로서 표피약물 전달 및 피부를 통한 진단 및 치료 연구에 활발히 적용되어 왔다. 본 실험은 다양한 연구에서 가장 널리 활용되고 있는 대표적 동물조직인 마이크로피그, 돼지, 누드마우스의 피부조직을 이용하여 해동 조건 및 시간 경과에 따른 유전체 손상 특성 및 조직 형태학적 변화를 정량적으로 평가하고자 하였다. 방법: 동물모델은 동결된 마이크로피그, 돼지, 누드마우스의 피부조직을 각각 냉장(4℃)과 실온(Room temp)에서 0, 30, 60, 90, 120분 동안 해동하였다. 추출된 DNA는 분광 흡광도 법으로 DNA 농도 및 A_260/A_280 비를 측정하여 순도를 확인하였고, genomic DNA ScreenTape 분석을 통해 DNA Integrity Number를 측정하여 DNA degradation 정도를 평가하였다. 또한, H&E 염색을 통해 피부조직의 형태학적 변화를 관찰하였다. 결과: 동결된 피부조직의 해동시간 및 온도 조건에 관계없이, 모든 DNA 샘플에서 A_260/A_280 비는 1.8 이상을 나타내었고, 각 동물모델의 피부조직에서 해동 온도 및 시간 경과에 따른 DIN 값의 평균 ± 표준편차는 6.90 ± 0.17, 냉장(4℃)에서 30분 동안 해동한 경우 6.83 ± 0.25, 60분 동안 해동한 경우 6.87 ± 0.06, 90분 동안 해동한 경우 6.70 ± 0.17, 120분 동안 해동한 경우 6.60 ± 0.30 이었다(P=0.808). 실온(Room temp)에서 30분 동안 해동한 경우 6.70 ± 0.20, 60분 동안 해동한 경우 6.87 ± 0.35, 90분 동안 해동한 경우 6.83 ± 0.12, 120분 동안 해동한 경우 6.67 ± 0.06 이었다(P=0.291). 냉장 및 실온에서 해동 시간 경과에 따라 DIN 값의 변화를 관찰하였을 때 감소하는 경향을 보였지만, 통계적 차이는 검출되지 않았다. 또한, H&E 염색상에서 조직 형태학적 차이는 나타나지 않았다. 결론: 본 연구는 동물 피부를 이용한 다양한 연구를 수행함에 있어, 동물 조직의 종류별 보관 방법 및 해동 조건에 따른 조직의 세포조직학적 및 유전체 손상 특성 유무를 정량적으로 평가하였다. 연구에 적용된 동물모델의 피부조직은 냉장 및 실온에서 해동 시 2시간까지 조직의 해부학적 구조 및 DNA의 손상에 영향을 주지 않는 것으로 평가되었다. 본 연구 결과는 인체 피부조직 연구에 활발히 적용되고 있는 동물 피부 조직 기반의 다양한 연구활동에 기여할 수 있을 것으로 기대된다.

Electrical quantitation of BK virus DNA based on integrated nanogap sensor

Yu, Ri Sungkyunkwan university 2020 국내석사

The nanogap sensors are a sensitive tool for molecular diagnostics, but they have the drawback that quantitative analysis is difficult due to irregular conductivity. To overcome these drawbacks, we applied digital domain analysis to integrated nanogap sensors. BK Virus DNA was hybridized with gold nanoparticle (AuNP) and magnetic particles modified with DNA. AuNPs were separated from the hybridization structure and trapped in the nanogap via DEP forces. When AuNPs form a conducting bridge between nanogaps, we can obtained quantification information as ODP (On-Device-Percentage) through the electrical signal. In this study, we observed that the quantification curves vary by DNA-passivated AuNP or AuNP size. As a result, BKV virus DNA can be detected pM level.

Engineering Genetic Systems for Biomedical Applications from Diagnostics to Therapies

장윤하 숙명여자대학교 대학원 2021 국내박사

병원체 및 질병 상태를 조기에 신속하고 효과적으로 감지하는 것은 인간의 건강을 유지하는 데 필수적이다. 현재 이 중요한 일은 대부분 해당 병원체 및 질병과 관련된 생체표지자를 식별하는 것을 통해 이루어진다. 그러나 생체표지자에 해당하는 분자들이 샘플 내에 매우 적은 양으로 존재하고, 복잡하다는 특성을 갖고 있어서, 성공적인 의학적 진단을 어렵게 한다. 본 학위논문에서는 유전 공학과 다른 과학 및 공학 분야를 결합하여 이러한 문제를 극복하고자 한 두 가지 예가 제시된다. 첫 번째는 바이러스 RNA를 검출하기 위한 단일 분자 DNA 이미징 기술 기반의 새로운 진단법을 개발하는 것이다. 분자 단위로 DNA를 볼 수 있는 매우 민감한 단일 분자 DNA 이미징 기술을 적용하여 소량의 바이러스 RNA를 증폭없이 검출하는 것이 가능하다. 본 연구에서 바이러스 RNA를 이용해 이중 가닥 DNA 표지자를 만드는 방법이 고안되었다. 두 번째는 인간 유전체의 복잡한 물리적 성질을 인간 세포와 바이러스 간의 유전적 상호작용의 변화를 모니터링하여 정량적이고 체계적으로 분석하는 것이다. 이 두번째 내용은 또한, 유전자 치료의 응용을 위해 세포 상태를 제어하는 기존과 다른 방법을 보여준다. 마지막으로 본 논문에서는 유전적 변이로 인한 미토콘드리아 질환을 치료하는 방법으로 미토콘드리아 프로모터 대신 강력한 프로모터를 포함하는 유전자 발현 카세트를 전달한다. 강력한 프로모터를 이용함으로써 전달되는 유전자로부터 만들어지는 산물이 증가됨을 확인하였다. 따라서 본 논문은 의학적 진단과 그에 따른 치료법을 향상시키기 위한 새로운 유전적 접근 방법들을 제공한다. Early, rapid, and effective detection of pathogens and disease states is essential for maintaining the wellness of human beings. This important task at present, mostly involves the identification of the relevant biomarker molecules. However, the infinitesimal amount or complicated nature of target molecules often challenge the successful outcomes of medical detections. In this dissertation, I present two examples for overcoming these challenges by combining genetic engineering with other science and engineering disciplines. The first one is developing novel single-molecule imaging-based genetic methods to detect small amounts of viral RNAs. The second one is analyzing the complicated physical nature of human genome quantitatively and systematically by monitoring the changes in genetic interactions between human cells and viruses. The findings from the second work further shows how to better control the cellular states for gene therapy applications. Finally, I present a method for treating mitochondrial diseases caused by genetic mutations. The strategy is to deliver the gene expression cassette containing therapeutic genes and strong promoters instead of the mitochondrial promoters to increase transgene products. Therefore, this dissertation provides new genetic approaches for enhancing medical diagnoses and the therapies that follow.

DNA形 成長DB 基盤의 費用ㆍ日程 統合 Model

유원희 서울대학교 대학원 2008 국내박사

Genome-wide Analysis of T-DNA Integration into the chromosomes and development of activation-tagging system in Magnaporthe oryzae

최재혁 서울대학교 대학원 2009 국내박사