군소로부터 글리코사미노글리칸의 추출 정제 및 세포주를 이용한 기능성 탐색

윤보영 경상대학교 대학원 2010 국내석사

Chondroitin sulfate와 heparin등의 GAGs는 포유동물의 조직에서 널리 분포하고 있으며, 그에 따라 포유동물이 주 원료로 사용되어 왔다. 그러나 최근 여러 가지 질병으로 인한 안전성이 보장되지 않는 단점으로 인해 그 대상이 해양생물로 바뀌어 가고 있는 실정이다. 그러나 이 또한 원료의 단가가 매우 높고 주원료인 상어, 고래, 다랑어류의 어획량이 감소하고 있어 대체 자원의 탐색이 이루어져야 할 것으로 보인다. 따라서 본 연구는 남해안 일대에서 여름철에 어획되어 부산과 경남지역을 중심으로 특정 지역을 위주로 소비되는 군소를 이용해 GAGs를 추출 정제하고 그 기능성을 검색하고자 하였다. 군소의 PS 추출에서 가수분해 효소로는 Flavourzyme 500 MG가 가장 우수하였다. 당도 및 ethanol 사용량에 따른 영향을 알아본 결과 Brix는 60일 때 가장 우수한 추출율을 나타내었고, ethanol 사용량은 5배를 사용하였을 때 가장 효과적인 추출율을 나타내었다. 군소 PS를 위한 최적 조건은 Flavourzyme 500 MG를 이용하여 60℃에서 15시간 반응 후 Brix를 60으로 조절한 상태에서 ethanol을 5배량 사용이었다. Ion-chromatograpy를 통해 정제된 군소 GAGs는 N-acetylglucoamine, N-acetylgalactosamine이 70% 이상을 차지하는 다당복합체인 것을 확인 할 수 있었으며 주 구성분이 heparin 또는 heparan sulfate일 것으로 추정하고 있으며 이를 확인하기 위해서는 연구가 더 진행되어야 할 것으로 생각된다. 군소로부터 추출한 PS와 정제한 GAGs의 기능성을 확인해 본 결과 대식세포주인 RAW 264.7을 통해 세포독성은 보이지 않는 것으로 나타났으며, NO 생성량, TNF-a, IL-6 생성량을 증가시키는 것으로 나타났다. 이와 같은 결과는 군소 PS와 GAGs는 대식세포를 직접적으로 활성화 시켜 면역증강 효과가 있음을 알 수 있었다. 또한 위암 세포주인 AGS를 통해 100 μg/mL 농도에서 배양 72시간 후 약 40%에 가까운 위암세포 성장 억제 효과 나타내었고, 정상세포 IEC-6에는 독성을 보이지 않았다. 따라서 군소로부터 추출 정제된 PS와 GAGs는 면역증강을 위한 기능성 식품 및 약제 원료로서의 개발 가능성을 보여 주었으며, 위암 치료제로서의 개발 가능성도 있을 것으로 여겨진다. Glycosaminoglycans such as heparin and dermatan sulfate are usually extracted from mammalian tissues. Some have recently been isolated from marine invertebrates. Marine origin may constitute a safer alternative with no infectious risk due to viruses or to prions. In this study, we extracted a whole polysaccharidic fraction from the Aplysia kurodai and screening its functional properties using cell lines. The most effective enzyme was Flavourzyme for extracting polysaccharides from Aplysia kurodai. And the optimum condition of hydrolysis was incubation at 60℃ for 15 hr. Precipitation of polysaccharides were depended on brix and ethanol volume. The most effective concentration of Brix was sixty and ethanol volume was three times. The purified sample from Aplysia kurodai extracts respected heparin or heparan sulfate. The functional activities of extracts were investigated using cell lines. The extracted polysaccharides and its fraction from DEAE-Sepharose fast flow 6B chromatography did not show the toxicity on RAW 264.7 cell line in the range of 10-200 ug/mL, but increased the cell growth rate. The extracted polysaccharides and its fraction also increased the formation of NO, interleukin (IL)-6 and tumor necrosis factor (TNF)-α on RAW 264.7 cell. Particularly, the polysaccharides fraction inhibited the proliferation rate of stomach cancer cell line, AGS, up to 40% for 72 hr incubation, but did not the intestinal epitherial IEC-6 cell lines. The polysaccharides and its response from Aplysia kurodai suggest the potential source to increase immune function and to inhibit the proliferation rate of the stomach cancer.

Destabilization and restabilization of sensitization after retrieval in Aplysia Kurodai

김정은 서울대학교 대학원 2010 국내석사

부산 연안의 군소 (Aplysia kurodai Baba) (Mollusca: Opisthobranchia)의 성장과 생식주기

서현정 부경대학교 대학원 2009 국내석사

본 연구는 부산 영도구 태종대 자갈마당 연안에 서식하고 있는 군소 (A. kurodai)의 성장과 명확한 생식주기를 밝히기 위해 2007년 4월부터 2008년 9월까지 18개월간 SKINSCUBA로 월별 채집하여 각 개체의 습중량 (wet weight)과 internal shell의 각고 (shell height), 그리고 생식소 중량을 측정하였으며, 생식소성숙지수 (gonadosomatic index, GSI), 난경, 생식소의 조직학적 월별 변화 및 군성숙도 등을 조사하였다. 조사기간 동안 채집된 군소 283개체 중 최대 습중량을 기록한 개체는 2007년에는 6월 5일에 채집된 1292.43g이었으며, 2008년에는 4월 5일 채집된 619.90g이었다. 또, internal shell의 각고는 2007년 10월에 8.40mm로 가장 작은 개체가 출현하였고, 2007년 8월에 89.20mm로 가장 큰 개체가 출현하였다. 군소는 각고에 따라 습중량이 유의하게 증가하는 양의 상관관계를 가지는 것으로 나타났으며, 각고와 습중량 간의 상대성장식은 WW = 0.1198SH^(2.0571) (n=217, r²=0.68, p〈 0.001)로 추정되었다. 전반적으로 월별 각고 조성을 살펴보면 하나의 그룹으로 나타났으며, 2007년 10월에는 각고가 8-20mm 사이의 어린 개체들이 나타나 2008년 1월까지는 각고 20mm 이하의 개체들이 주를 이루고 있으며, 6월에는 꾸준히 성장하여 각고 36-40mm 이상이 주를 이루고 있다. 2008년 9월에는 다시 어린 개체들이 나타났음을 알 수 있다. 군소는 기능적 동시 자웅동체로 암·수 생식세포가 동시에 생성되는 난정소 (ovotestis)는 간췌장 (hepatopancreas)의 뒤쪽에서부터 투명하게 발달하기 시작하여 노란색, 주황색 등으로 선명해지며 점차 간췌장에서 차지하는 면적이 확장된다. 2008년 3월에서 5월까지 수온이 상승하는 것과 더불어 GSI가 상승하는 상관관계를 보였으며 (r=0.924, r²=0.855), GSI는 2008년 5월에 1.48±0.30으로 최대값을 보였다. 군소의 난경은 11월에서 2월까지는 약 20㎛이하 (previtellogenic oocyte), 3월에는 30-50㎛ (growing oocyte), 4월부터 7월까지는 60-80㎛ (vitellogenic oocyte) 정도로 나타났다. 난정소의 발달단계는 자웅 생식세포의 특징을 기준으로 각각 4단계로 구분할 수 있었다. 2008년도의 태종대 연안 군소의 웅성 생식소 발달단계는 9월에서 그 다음 해 1월까지 미성숙기 (I), 2월과 3월은 성장기 (G), 4월에 성숙 및 교미기 (M)에 접어들어 5월까지 지속되다가 6월에는 퇴화흡수기 (D)로 들어간다. 반면 자성 생식소 발달단계는 미성숙기 (I)가 9월에 시작되어 2월까지 지속되며, 3월과 4월은 성장기 (G), 5월에 성숙 및 교미기 (M)에 접어들어 6월까지 지속되다가 퇴화흡수기 (D)로 들어간다. 생식소 발달과 생식주기는 수온의 변화와 밀접한 연관성을 가지는 것으로 보이며, 전반적으로 자웅 생식세포 발달단계에서 자성생식세포보다 웅성생식세포가 한 달 정도 빨리 성숙하고 배출되는 경향을 보였다. Internal shell의 각고 (shell height, SH)와 성숙비 (proportion of mature, P) 사이의 관계는 웅성의 경우 P=1/(1+exp[(3.488-0.138SH)]) (r²=0.703, P〈0.001), 자성의 경우는 P=1/(1+exp[(5.245-0.167SH)]) (r²=0.692, P〈0.001)의 함수로 구해졌으며, SH_(50)은 웅성은 25.28mm, 자성은 31.41mm에서 나타났다. The purpose of this study was to determine the growth and reproductive cycle of Aplysia kurodai on the rocky shore of Taejongdae, Korea. These animals were collected monthly from April 2007 through September 2008 by SKINSCUBA. Individual wet weight (WW), internal shell height (SH) and gonadal weight were measured. Monthly change of gonadosomatic index (GSI), egg diameter, histologically gonadal development and size at sexual maturity were investigated. Maximum the highest WW of A. kurodai was 1292.43g on June in 2007, the maximum SH was 89.20mm on October in 2007, and the minimum SH was 8.40mm on August 2007. There is a significantly positive relationship between WW and SH, which are formulated by the following equation; WW = 0.1198SH^(2.0571) (n=217, r²=0.68, p〈0.001). In monthly SH distribution, young individual (SH 8 to 20mm) appeared on October, 2007 and grew up until June, 2008 (SH 36-40mm). On September, 2008, another young individuals appeared. Since korean sea hare, A. kurodai, was simultaneous hermaphrodite. The ovotestis consisted of many follicles. Both egg and sperm were produced in the same follicle. The ovotestis was developed and grew up to the posterior edge of the hepatopancreas from pale to yellow or orange. The relationship between water temperature and GSI was increase simultaneously from March to May in 2008. The maximum GSI value was 1.48±0.30 on May, 2008. The egg diameter of A. kurodai was lower than 20㎛ from November to February, 30-50㎛ on March, 60-80㎛ from April to July. Gonadal phases of these species were divided into 4 stages; immature stage (Male : September to January, Female : September to February), growing stage (Male : February to March, Female : March), mature and mating (or spawning) stage (Male : March to May, Female : April to May) and degenerative and resorptive stage (Male and Female : June to August). The reproductive cycle of these species were closely related to water temperature. It was set up a standard separated male and female gametes characteristics. The male gametes tend to attain maturity faster than female gametes approximately a month. The relationship between internal shell height (SH) and the proportion of mature (P) was calculated by fitting a logistic function; the male was P=1/(1+exp[(3.488-0.138SH)]) (r²=0.703, P〈0.001), the female was P=1/(1+exp[(5.245-0.167SH)]) (r²=0.692, P〈0.001). The SH_(50) is 25.28mm in male, and 31.41mm in female.

동해와 남해 연안에 서식하는 군소의 위 내용물 조성과 서식지 주변의 해조상

김민주 경상대학교 대학원 2019 국내석사

Sea hare, Aplysia kurodai is belongs to the class Gastropoda, order Anaspidea, family Aplysiiae, and is major species in coast of Korea. Boiled A. kurodai is used as a food source in Korea and is also used as a medicine source. But, little is known about stomach contents of A. kurodai that fed marine algae. The purpose of this study was to investigate the stomach contents of A. kurodai and its relationship with marine algae community around their habitat. Sampling site of A. kurodai and marine algae of habitat was Yeongjinri, Bukpyeong, Chuam, Changpo, Daebo, Wollaeri, Dongbaekri in the east coast and Yeongunri, Maemuldo, Yokjido, Mijodo, Cheongsando in the south coast. Collected A. kurodai was dissected and its stomach was cut off. The marine algae occurred at stomach and surrounding marine algae of habitat were identified. In addition the marine algae that identified from stomach contents classsified according to functional form. The number of seaweed species collected in the east coast of Korea were totally 134 species. Among them, Chlorophyta was 12 species, Ochrophyta was 32 species, Rhodophyta was 89 species and seagrass was 1 species. The number of marine algae identified from stomach contents of A. korudai collected from the east coast of Korea were totally 39 species. Among them, Chlorophyta was 7 species, Ochrophyta was 6 species and Rhodophyta was 26 species. The number of seaweed species collected in the south coast of Korea were totally 75 species. Among them, Chlorophyta was 5 species, Ochrophyta was 21 species, Rhodophyta was 48 species and seagrass was 1 species. The number of marine algae identified from stomach contents of A. korudai collected from the south coast of Korea were totally 26 species. Chlorophyta was 2 species, Ochrophyta was 3 species, Rhodophyta was 20 species and seagrass was 1 species. The number of marine algae identified from stomach contents of A. kurodai collected from overall collecting sites were totally 51 species. Among them, sheet form was 10 species, filamentous form was 12 species, coarsely branched form was 27 species and jointed calcareous form was 1 species. Thick leathery form and crustose form were not occurred. Consequently, A. kurodai consumed a variety of Chlorophyta, Ochrophyta and Rhodophyta. Moreover, A. kurodai consumed sheet form, filamentous form and coarsely branched form with soft tissue. Therefore, unlike sea urchin, A. kurodai was not direct herbivore that spread barren ground.

군소 (Aplysia kurodai)의 중추신경계로부터 신경성 펩타이드, Myomodulin A와 E의 정제 및 그 생물활성

서해점 부경대학교대학원 2001 국내박사