Anti-Apoptotic and Anti-Oxidative Effects of Silkworm Storage Protein 1

이지혜 인천대학교 대학원 2015 국내석사

ABSTRACT Storage protein 1 (SP1) is a type of larval hemocyanin protein derived from silkworm hemolymph. Silkworm hemolymph has already known for its anti-apoptotic activities in mammalian and insect cells. 30K protein, which is one of the major anti-apoptotic molecules in silkworm hemolymph, has been well investigated. However another main protein in silkworm hemolymph, SP1, has not been examined for their biological roles yet. Herein, the anti-apoptotic and anti-oxidative effects of SP1 were identified in HeLa cells. Transient expression of SP1 in HeLa cells showed slightly increased cell viability upon staurosporine treatment. To further explore the effect of SP1, stable cell line expressing SP1 was constructed. This cell line showed strong anti-apoptotic effect induced by staurosporine treatment analyzed by trypan blue exclusion assay, nuclear fragmentation analysis, and flow cytometry using propidium iodide staining. Interestingly, SP1 did not show anti-apoptotic effect induced by TNFa treatment, meaning SP1 is the intrinsic apoptosis inhibitor but not the extrinsic apoptosis inhibitor. In addition, cells expressing SP1 showed resistance to the oxidative stresses caused by hydrogen peroxide and UV B irradiation, and inhibited the generation of reactive oxygen species in the cells. For the practical applications of SP1, the methods for the production and purification of recombinant SP1 were investigated. The supplementation of recombinant SP1 into cell culture medium exhibited anti-apoptotic as well as anti-oxidative activities against staurosporine and hydrogen peroxide, respectively. Recombinant SP1 penetrated cells and was localized on plasma membrane as well as in the cytosol. SP1 is not the anti-oxidant itself but rather predicted to mediate intracellular anti-oxidative activity. As SP1 does not share any sequence homologies with other well-known apoptosis inhibitors, the suppression of apoptosis by SP1 will offer a new strategy that can be utilized in biopharmaceutical industry where the minimization of cell death and maximization of productivity are required. Moreover, SP1 is a novel anti-oxidant and a potential candidate of functional ingredient for the anti-aging cosmetics.

산양삼의 고환조직에 대한 항산화 및 항세포사멸 작용기전 : Testicular Antioxidant and Anti-Apoptosis Mechanisms of Cultivated Wild Ginseng

옥선 경성대학교 일반대학원 2014 국내박사

남성의 정자수의 감소와 불임의 연관성은 이미 잘 알려진 사실이며, 근래에는 환경호르몬의 영향으로 정자수의 감소와 불임의 증가라는 악순환이 나타나고 있다. 또한 인구감소에 대한 우려와 더불어 아이를 갖고자 하는 부부에게는 불임으로 인한 정신적, 신체적, 경제적 부담이 커다란 사회적인 문제로 인식되고 있다. 산양삼은 유효성분의 종류가 다양하고 함량도 풍부하여 다방면에서 뛰어난 약리학적 효능을 가지고 있다. 지금까지 산삼의 주요 사포닌 분석은 주로 HPLC의 UV 검출기에 의한 검출이 많았지만, 낮은 분석파장에 의하여 검출 감도가 떨어지기 때문에 정확한 분석이 어려웠다. CAD (Charged aerosol detector)는 높은 감도와 낮은 검출한계를 제공하여 사포닌을 분석함에 있어서 매우 적합한 검출기임에 반해 연구가 많이 이루어지지 않았다. 따라서 본 연구에서는 먼저 산양삼 추출물을 CAD를 이용하여 사포닌 성분을 분석 한 후, 환경호르몬에 의해 유도된 고환독성에 대한 산양삼추출물의 항산화와 anti-apoptosis기전에 대하여 세포와 동물모델을 이용하여 검증하고자 하였다. 우선, 산양삼 추출물을 분석한 결과, PPT계열 성분(Re, Rf, Rg1, Rh1)의 PPD계열성분(Rb1, Rd)보다 약 6배 정도 높은 함량을 보였다. 사포닌 유효성분과 산양삼추출물의 항산화활성을 Bisphenol A (BPA)로 유발된 고환세포주로 확인한 결과, BPA에 의해 감소한 항산화효소[superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT)]의 활성이 산양삼 추출물 및 Rg1에 의하여 증가하였으며, SOD, CAT, glutathione peroxidase (Gpx)의 발현도 증가하였다. 작용기전을 분석하기 위해 각 신호 전달물질들의 선택적 저해제를 처리한 결과, ERK, p38의 선택적 저해에 의해 SOD, CAT의 활성이 저해되는 것을 확인 할 수 있었다. BPA 투여로 고환독성이 유도된 SD-rat에서 산양삼추출물의 항산화 효과에 미치는 영향을 조사한 결과, SOD, CAT의 활성과 SOD, CAT, Gpx의 발현이 산양삼 추출물 투여에 의해 회복되는 것으로 확인되었다. 이는 고환조직의 조직학적 검경결과와 일치하였다. 마지막으로 산양삼 추출물의 고환독성에 대한 anti-apoptosis효과를 확인한 결과, 고환조직세포에서 분비되는 테스토스테론과 프로게스테론이 BPA에 의해 감소하였지만, 산양삼 추출물 및 Rg1에 의하여 증가하였다. 또한 pro-apoptotic 인자인 Fas, Capase3, Bax의 발현이 BPA에 의하여 증가하였고, anti-apoptotic 인자인 Bcl-2의 발현은 BPA에 의하여 감소하였지만, 산양삼 추출물 및 Rg1에 의하여 발현양상이 반대로 나타났다. 작용기전을 분석하기 위해 각 신호 전달물질들의 선택적 저해제를 처리한 결과, ERK, p38의 선택적 저해에 의해 Caspase3, Bax, Bcl-2의 활성이 저해되는 것을 확인 할 수 있었다. 동물실험에서는 BPA 투여로 고환독성이 유도된 SD-rat에서 산양삼추출물의 anti-apoptosis 효과에 미치는 영향을 조사한 결과, 혈청내의 테스토스테론, LH, FSH의 함량이 BPA에 의하여 감소하였지만, 산양삼 추출물 투여에 의하여 회복된 것을 확인 할 수 있었으며, 고환조직 단백질에서 Fas, Caspase3, Bax 및 Bcl-2의 발현이 세포모델과 같은 결과를 나타내었다. 또한 고환조직의 TUNEL assay실험을 통하여 고환조직의 apoptotic body를 관찰한 결과, BPA투여에 의하여 증가된 apoptotic body수가 산양삼 추출물 투여에 의하여 감소한 것을 확인 할 수 있었다. 그리고 부고환 내의 정자수를 비교한 결과, BPA에 의하여 감소한 정자수가 산양삼 추출물에 의하여 회복된 것도 확인 할 수 있었다. 이상의 결과를 종합해 보면, 산양삼추출물은 in vitro와 in vivo 연구에서 항산화, anti-apoptosis 효과를 가지는 것으로 사료되며, 이의 분자적 기전인 MAPKs 신호전달물질을 통한 세포독성 방어기전 물질로서의 활용이 크게 기대된다.

Tumor Suppressive Effect of Auriculasin Isolated from Flemingia Philippinensis in Human Prostate Cancer : 천근발로부터 분리된 auriculasin의 전립선암 억제효과

조현동 경북대학교 대학원 2018 국내박사

Prostate tumors, the second most common type of tumor in men worldwide, characteristically spreads to secondary places, including bone, lymph node, and the central nervous system. To inhibit development of prostate tumors, chemotherapy drugs are used in various stages of prostate tumors. However, utilization of tumor therapeutics is known to cause significant toxicity to normal tissue and side effects. Therefore, effective regimens with non-toxic natural ingredients to prevent prostate tumors can be used as new molecular targets of therapy for prostate tumors. Chapter 1. Comparison of proximate composition, functional components, and anti-tumor activity between F. philippinensis extracts Flemingia philippinensis is a perennial herb that belongs to the legume family Fabacceae and is known as an herbal folk remedy and food ingredient in China. In this study, we conducted analysis of the proximate composition of Flemingia philippinensis root as well as free sugar, free amino acid, fatty acid, mineral, and total polyphenol contents of various extracts from Flemingia philippinensis. In addition, we compared the anti-tumor effects of F. philippinensis extracts on human prostate tumor cells. Although F. philippinensis extracts contained minor free sugars, free amino acids, fatty acids, and minerals, total polyphenol contents in F. philippinensis extracts were greater than 45.81 mg GAE/g with the highest content observed in 186.31 mg GAE/g in MeOH extract. EtOH, 70% EtOH, MeOH, and 70% MeOH extracts of F. philippinensis caused selective prostate tumor cell death without significant cytotoxicity in RWPE-1 human prostate epithelial cells. However, water extracts showed a weak inhibitory effect on prostate tumor cell proliferation. Furthermore, F. philippinensis extract-induced anti-tumor activities were related with cell cycle arrest and apoptosis. The overall results suggest that methanolic extract of F. philippinensis containing various bioactive compounds plays an effective role in prostate tumor suppression. Chapter 2. Effect of AC on LNCaP prostate tumor cell death via induction of apoptosis Recent studies have demonstrated that natural agents targeting the accumulation of reactive oxygen species (ROS) that selectively kill, leaving normal cells undamaged, can suppress prostate tumor. Here, we show that AC, derived from F. philippinensis, induces significant cell death and apoptosis via ROS generation in prostate tumor cells. AC treatment resulted in selective apoptotic cell death in LNCaP prostate tumor cells, characterized by DNA fragmentation, accumulation of sub-G1 cell population, cleavage of poly (ADP-ribose) polymerase (PARP), regulation of Bax/Bcl-2 ratio, increase of cytosolic apoptosis-inducing factor (AIF) and endonuclease G (EndoG), in addition to inhibiting tumor growth in a xenograft mouse model. Interestingly, AC-induced apoptosis did not result in caspase-3, -8, and -9 activations. We found that AC treatment decreased phosphorylation of AKT/mTOR/p70s6k in a dose- and time-dependent manner. Further, cellular ROS levels increased in LNCaP cells treated with AC and blocking ROS accumulation with ROS scavengers resulted in inhibition of AC-induced PARP cleavage, AIF increase, up-regulation of Bax/Bcl-2 ratio, and decrease in AKT/mTOR phosphorylation. Taken together, these data suggest that AC targets ROS-mediated caspase-independent pathways and suppresses PI3K/AKT/mTOR signaling, which leads to apoptosis and decreased tumor growth. Chapter 3. Effect of AC on suppression of VEGF-induced angiogenesis in human umbilical vein endothelial cells Angiogenesis plays an important role in various pathological conditions such as tumor via excessive delivery of oxygen and nutrients. Recent studies have demonstrated that understanding the molecular basis of natural agents in angiogenesis is critical for the development of promising tumor therapeutics. In this study, AC, an active component from F. philippinensis, was found to exert strong anti-angiogenesis activity. Treatment with AC suppressed proliferation of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) by modulating expression of Bcl-2, Bcl-XL, and vascular endothelial growth factor (VEGF). Further, AC inhibited VEGF-induced chemotactic migration, invasion, and capillary-like structure formation of endothelial cells. In addition, AC abrogated VEGF-induced vascular network formation around rat aortic rings as well as blocked accumulation of hemoglobin in the Matrigel plug of C57BL/6 mice. The inhibitory effect of AC on angiogenesis was well correlated with inhibition of VEGF receptor 2 (VEGFR2) activation as well as phosphorylation of intracellular downstream protein kinases of VEGFR2 containing Akt, mammalian target of rapamycin, phosphoinositide 3-kinase, p-38, extracellular signal-related kinase, and Src. Taken together, this study reports that AC potently inhibits angiogenesis by modulating VEGFR2-related signaling pathways, which further validates its great potential in clinical applications. Chapter 4. Effect of AC on sensitization of TRAIL-induced apoptosis in RC-58T/h/SA#4 primary human prostate tumor cells Increasing evidence suggests that tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) is a promising anti-tumor agent due to its ability to induce apoptosis selectively in tumor cells. However, some prostate tumor cell lines are relatively resistant to TRAIL-induced apoptosis. In this study, AC acted as a synergistic TRAIL sensitizer by mediating expression of death receptor 5 (DR5) in RC-58T/h/SA#4 primary prostate tumor cells. Co-treatment with AC and TRAIL induced apoptotic death in RC-58T/h/SA#4 cells, as indicated by an increase in the apoptotic cell population, DNA fragmentation, and condensation of chromatin or apoptotic bodies. Combined treatment with AC and TRAIL potentially enhanced apoptosis in caspase-dependent and -independent manners. Further analysis revealed that combined treatment also activated death receptor 5, p53, and CHOP, and pre-treatment with a chimeric blocking antibody for DR5 reduced AC-TRAIL-induced apoptotic cell death. AC-suppressed the PI3K/Akt/mTOR signaling pathway also related with inhibition of proliferation in primary prostate tumor cells. In conclusion, our results suggest that AC sensitizes TRAIL-resistant primary prostate tumor cells to TRAIL-mediated apoptosis via up-regulation of DR5 and downstream signaling pathways. 전 세계적으로 남성 발병률이 두번째로 높은 전립선 암은 특징적으로 뼈, 림프절, 중추신경계 등과 같은 2차 위치로 전이된다. 전립선 암의 발병과 발전을 억제하기 위해 다양한 화학약물요법이 이용되고 있으나 이러한 합성 항암제의 사용은 체내 정상 조직과 기관에 독성을 유발하는 것으로 알려져 있다. 따라서 인체 독성이 적은 전립선 암 예방 천연물 및 식품에 대한 연구가 활발히 진행되고 있으며 이들의 분자적 암 억제 기전은 전립선 암 치료를 위한 새로운 발전방향을 제시할 수 있다. 천근발 추출물의 일반성분, 기능성 성분 및 암세포 사멸 효과 비교 천근발은 다년생 콩과식물 중 하나로 예로부터 중국에서 식품 및 전통약재로 이용되어 왔다. 본 연구에서는 다양한 용매로 추출한 천근발 추출물의 유리당, 유리 아미노산 및 폴리페놀 함량을 분석하였으며, 전립선암 성장억제효과를 비교하였다. 천근발 추출물의 유리당, 유리 아미노산, 유리 지방산 및 무기물 함량은 소량이었으나 총 폴리페놀 함량은 45.81-186.31 mg GAE/g으로 나타났으며 메탄올 추출물에서 가장 높은 폴리페놀 함량을 나타내었다. 에탄올, 70% 에탄올, 메탄올 및 70% 메탄올 추출물에서 RWPE-1 전립선 정상세포의 유의적인 독성없이 LNCaP, RC-58T, PC-3 전립선 암세포의 선택적 사멸을 유도하였다. 하지만 물 추출물은 전립선 암세포 및 정상세포에서 모두 세포사멸효과를 확인할 수 없었다. 또한, 천근발 추출물의 전립선암 세포증식 억제효과는 세포주기 정지 및 apoptosis 유도와 관련이 있는 것으로 나타났다. 따라서 폴리페놀 함량이 풍부한 천근발 메탄올 추출물은 정상세포의 독성없이 효과적으로 전립선 암을 억제할 수 있었으며 이를 통해 기능성 식품 및 천연물 의약소재로서 이용할 수 있을 것으로 판단된다. Auriculasin의 LNCaP 인체 전립선 암세포 사멸 효과 최근 천연물에 의해 유도된 암세포 내 활성산소종 (Reactive oxygen species, ROS)이 정상세포에는 독성없이 선택적으로 암의 발전을 억제할 수 있다는 연구가 지속적으로 보고되고 있다. 본 연구에서 천근발 (Flemingia philippinensis)로부터 분리된 프레닐화 이소플라본인 auriculasin은 전립선 암세포 내 ROS를 증가시키고 이를 통해 세포사멸 및 apoptosis를 유도하였다. Auriculasin은 LNCaP 전이성 전립선 암세포에서 DNA 분절, sub-G1 함량의 증가, poly (ADP-ribose) polymerase (PARP), Bax/Bcl-2 조절, apoptosis-inducing factor (AIF) 및 endonuclease G (Endo G)의 활성 증가를 통해 암세포 선택적 apoptosis를 유도하였다. 이는 전립선 암 이종이식 마우스 모델에서도 종양 성장 및 발전을 억제하는 것으로 나타났다. 흥미롭게도 auriculasin에 의한 LNCaP 전립선 암의 apoptosis는 caspase-3, -8 및 -9이 활성화 되지 않았으며 AKT/mTOR/p70s6k 경로 활성이 농도 및 시간의존적으로 억제되는 것을 확인하였다. auriculasin에 의해 증가된 세포 내 ROS는 항산화제에 의해 억제되었으며 이는 전립선 암세포 내 PARP 분절, AIF, Bax/Bcl-2 발현 비율을 억제하였고 AKT/mTOR 인산화 또한 감소시켰다. 따라서 본 연구의 결과는 auriculasin이 세포 내 ROS의 증가를 통해 caspase 비의존형 apoptosis를 유도하고 PI3K/AKT/mTOR 경로를 억제하여 전립선 암의 증식 및 종양성장을 억제하는 것을 나타낸다. 혈관내피세포 성장 인자에 의해 유도된 혈관내피세포에서 auriculasin의 혈관신생 억제 효과 혈관신생 (angiogenesis)은 암과 같은 병리학적 상태에서 과도한 산소와 영양분을 공급하는 역할을 수행한다. 최근 천연물에 의한 분자수준의 혈관신생 억제효과가 다양한 암의 치료에 뛰어난 효능을 보이는 것으로 보고되었다. 본 연구에서 auriculasin의 처리는 혈관내피세포 성장 인자 (vascular endothelial growth factor, VEGF)에 의해 촉진된 혈관내피세포 (human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)의 혈관신생을 억제하는 것으로 확인되었다. AC은 혈관내피세포에서 Bcl-2, Bcl-XL 및 VEGF의 발현을 억제하였으며 VEGF에 의해 유도된 HUVECs의 이동, 침윤 및 모세혈관 유사 생성능을 억제하였다. 또한 쥐 동맥 주위의 모세혈관 생성과 C57BL/6 마우스 내 마트리겔 플러그 속의 헤모글로빈 함량도 감소시켰다. Auriculasin에 의한 혈관신생 억제효과는 VEGF 수용체 2 (VEGF receptor 2)의 인산화 억제, Akt, mammalian target of rapamycin (mTOR), phosphoinositide 3-kinase (PI3K), p-38, extracellular signal-related kinase (ERK) 및 Src의 발현을 억제와 관련이 있었다. 따라서 본 연구의 결과는 auriculasin이 VEGFR2 관련 신호전달 경로를 조절하여 혈관신생을 억제하는 것으로 확인되며 혈관신생 억제 효능을 갖는 천연물 암 억제제에 대한 기초자료를 제공한다. RC-58T/h/SA#4 인체 전립선 원발암 세포에서 AC의 TRAIL 유도 apoptosis 민감성 향상 효과 Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL)은 정상세포에는 독성을 나타내지 않으며 암세포에서만 선택적으로 apoptosis를 유도하는 특성을 갖는 항암제이다. 하지만 전립선 암을 포함한 몇몇 암 종에서는 TRAIL에 의해 유도되는 apoptosis에 상대적으로 저항성을 갖는 것으로 보고되었다. 본 연구에서는 auriculasin의 처리가 TRAIL 저항성 전립선 원발암 세포에서 death receptor 5 (DR5)의 발현을 조절하여 TRAIL 민감성을 향상시키는 것으로 확인되었다. 전립선 원발암 세포에서 auriculasin과 TRAIL의 병용처리는 apoptosis 단계의 세포 증가, DNA 분절 및 염색체 및 apoptotic body 응축을 유도하였다. Auriculasin과 TRAIL의 병용처리는 전립선 원발암 세포에서 caspase 의존형 및 비의존형 apoptosis를 모두 유도하였으며 DR5, p53 및 CCAAT-enhancer-binding protein homologous protein (CHOP) 발현을 증가시키는 것으로 나타났다. 또한, auriculasin에 의한 TRAIL 유도 apoptosis의 증가는 DR5의 경쟁 결합단백질인 DR5 FC chimera protein의 처리에 의해 유의적으로 억제되었다. PI3K/AKT/mTOR 신호전달 경로의 활성이 auriculasin에 의해 농도의존적으로 감소하는 것으로 확인되었다. 결론적으로 본 연구의 결과는 auriculasin이 전립선 원발암 세포에서 DR5와 하위 신호전달 경로의 상향조절을 통해 TRAIL 유도 apoptosis를 증가시키는 것을 나타내며 이는 난치성 전립선 암세포의 사멸에 천연물의 이용가능성을 제시한다.

Anti-apoptotic effect of 30Kc6 gene on induced pluripotent stem cell, and efficient delivery of 30Kc19-based transcription factor proteins for cellular direct conversion

유지나 서울대학교 대학원 2017 국내박사

30K protein, derived from silkworm hemolymph (SH), was known as having many properties. From 30K family (30Kc6, 30Kc12, 30Kc19, 30Kc21, and 30Kc23), 30Kc6 plays role for anti-apoptosis. When the cells were transfected with 30Kc6, the cells had higher viability in stress condition. Also, these property of 30Kc6 could increase the productivity of antibody, recombinant interferon-β, and human erythropoietin (EPO). The mechanism of 30Kc6 for antiapoptosis was due to prevent Bax binding on mitochondria. The other 30K protein, 30Kc19, has reported the properties of cell-penetrating and enzyme-stabilizing. Cell-penetrating peptide (Pep-c19) of 30Kc19 could enter cells by forming dimer. Also, 30Kc19 stabilized enzyme by crowd effect. Recent, 30Kc19 protein was reported enhancing soluble expression for transcription factors. The objective of this research is to overcome several hurdles in stem cell research. Human pluripotent stem cells such as hES and hiPS cells suffer from apoptosis in single cell-dissociation. Because of pre-activated Bax at Golgi in cells, hES and hiPS cells induced rapid apoptosis in stress condition. We applied 30Kc6 in hiPS cells. hiPS-30Kc6 cells were expressed pluripotent stem cell markers, and had a potency of differentiation in three germ layers. Also, the viability of single cells was higher than normal hiPS cells. Then, we wondered that anti-apoptotic property of 30Kc6 was from a specific domain of 30Kc6. From the apoptosis research, BH4 domain of Bcl2 inhibited apoptosis by binding Bax. With structural similarity of BH4, 30Kc6 alpha-helix (30Kc6α) was considered as anti-apoptotic domain. By truncation, we cloned 30Kc6α and observed anti-apoptotic property. Furthermore, 30Kc19-30Kc6α protein could penetrate cell, and showed enhanced cellular viability under STS or UV-irradiation condition. Cell-penetration and enzyme-stabilization are the properties on 30Kc19 protein. We tried to solve the problems on reprogramming which are instability and low solubility of transcription factor proteins. Previous reprogramming methods had a risk of transgene integration to host genome. By using protein, transcription factors were delivered directly without any DNA-related complications. To express transcription factors as soluble form, 30Kc19 was conjugated. 30Kc19 conjugated transcription factors (Oct4, Sox2, c-Myc, and Klf4) were expressed as a soluble protein. Purified soluble transcription factors were penetrated into cells, and stable up to 48 h. Furthermore, Klf4-30Kc19 protein showed a transcriptional activity. Lastly, we generated neuronal cells using transcription factor with 30Kc19. 30Kc19-Ascl1 protein induced successfully mouse embryonic fibroblasts (MEFs) to protein-induced neuronal cells (piNCs). p-iNCs had neuronal morphology, and expressed neuronal markers (Tuj1 and MAP2). Furthermore, the expression levels of neuronal genes (ASCL1, BRN2, and MYT1L) were observed higher on day 7 and 14. In this research, we applied anti-apoptotic 30Kc6 and cellpenetrating 30Kc19 protein on stem cell research. This approach will give a chance for developing new techniques in stem cell research.

Molecular Mechanism Responsible for Apoptosis and Anti-apoptosis induced by hydrogen peroxide in HL60 cells : Activation of Caspase-3

전성회 고려대학교 대학원 2002 국내박사

Reactive oxygen species have been recognized as a common signaling mediator in diverse stimuli-induced apoptosis and hydrogen peroxide is one of natural reactive oxygen species. This study was performed to investigate the role of caspases in hydrogen peroxide-induced apoptosis of HL60 cells. Apoptosis was induced in HL60 cells by treating with 50 mM hydrogen peroxide for 2, 4, and 6 h and the induction of apoptosis was confirmed by flow cytometry and DNA fragmentation analysis. During the apoptosis, caspase substrate assay showed the increased activity of caspase-3 but not those of caspase-8 nor caspase-9, and immunoblotting analysis showed decreasing levels of procaspase-3 protein with the progression of apoptosis. Furthermore, preincubation with caspase-3 inhibitor decreased hydrogen peroxide-induced apoptosis by about 50%. With the progression of apoptosis, analysis of caspase substrates showed the decrease of retinoblastoma protein while the cleaved 89kD fragment of poly(ADP-ribosyl) polymerase protein increased. Taken together, these results suggest that hydrogen peroxide-induced apoptosis in HL60 cells is not associated with the activation of caspase-8 nor caspase-9, while caspase-3 is cleaved and activated during the process.

Anti-apoptotic role of cenexin1

김정순 단국대학교 대학원 2011 국내석사

Apoptosis는 불필요한 세포나 노화된 세포, 각종 상해를 받은 세포에서 enzyme의 순차적인 활성에 의한 자살프로그램에 의해 조절되는 세포사멸의 경로이다. Apoptosis에 의한 죽음은 세포 숫자와 조직의 크기를 유지하며 세포내의 항상성을 위협하는 자극으로부터 보호하도록 하는 세포의 정상적인 현상이다. p53은 일종의 전사인자로 세포분열의 제어나 apoptosis등을 포함한 세포의 다양한 반응을 유도한다. p53은 암세포에서 과발현 시켰을 경우 apoptosis를 유발한다. p53을 과발현 시키는 아데노바이러스로부터 살아남은 clone으로부터 Cenexin1 의 C-terminal fragment를 얻었다. 얻어진 C-terminal fragment와 cenexin1 의 full length는 p53에 의한 extrinsic death signal 과 intrinsic death signal을 통한 apopotosis에서 저항성을 갖는다. siRNA에 의한 Cenexin1의 knock down은 TNF-a에 의해서 유도되는 caspase-8와 PARP의 활성을 늦췄다. extrinsic pathway에서 ligands(FasL, TNFα, etc.)나 receptor recognizing antibodies에 의한 death receptors (Fas, TNF receptor etc.)의 binding은 adaptor molecules (FADD, TNF receptor 1-associated death domain protein (TRADD), etc.)의 보충을 유도한다. TNF에 의한 apoptosis는 TNF Receptor Associated Death Domain Protein (TRADD) protein, Fas-associated death domain protein (FADD)과 pro-caspase-8으로 구성된 DISC를 형성하여 apoptosis의 활성에 관여한다. Cenexin1은 FADD과 co-localization됨을 확인했고 TNF receptor complex와의 localization의 가능성을 제시했다. 이 논문에서 우리는 cenexin1의 anti-apoptotic으로서의 기능과 TNF receptor complex와의 localize의 가능성, caspase-8 cleavage의 억제를 연구했다. 게다가 cenexin1은 새로운 anti-apoptotic protein family 의 구성원일 수도 있음을 나타냈다. Apoptosis is a pathway of cell death that is controlled by tightly regulated suicide program in which cells eventually enter to death by sequential activations of enzymes. Death by apoptosis is a normal phenomenon that serves to get rid of cells that are no longer needed and to maintain a steady number of cell populations in tissue. Apoptosis eliminates cells that are injured beyond repair without inducing a host inflammatory response, thus protecting surrounding tissue from damage. From functional cloning of gene that provides viabilities under the adenovirus mediated overexpression of p53, C-terminal fragment of Cenexin1 could be obtained among the survived cell clones. Both the rescued C-terminal fragment and full length of Cenexin1 had given resistance against apoptosis under the extrinsic death signal activation and intrinsic death signal activation by p53. The siRNA mediated knock down accelerated TNF-α mediated cell death and over expression of this gene showed delayed activation of caspase-8 and cleavage of PARP. In the extrinsic pathway, binding of the death receptors (Fas, TNF receptor etc.) by the ligands (FasL, TNFα, etc.) or by the receptor recognizing antibodies leads to the recruitment of adaptor molecules (FADD(Fas-associated death domain protein), TRADD(TNF receptor 1-associated death domain protein) etc.) and an initiator caspase, caspase-8, to the receptor complex forming DISC(death inducing signalling complex). Under the condition of induction of apoptosis by TNF, the DISC is comprised of TRADD, FADD and pro-caspase-8. The Cenexin1 colocalized with FADD, suggesting that it might be one of the factors in TNF receptor complex. In this study we evaluated the antiapoptotic function of Cenexin1 and its possible action mechanism through localization of TNF receptor complex and inhibition of caspase-8 cleavage. In addition to its centrosomal function as centrosomal scaffold protein, Cenexin1 might be a novel member of antiapoptotic protein family.

대장균에서 30Kc19-30Kc6 퓨전 단백질의 수용성 생산과 포유동물세포에서의 항 에이파토시스 효과

최정선 서울대학교 대학원 2014 국내석사

재조합 단백질을 생산하는 포유동물 세포 배양 과정에서 apoptosis의 중요성은 널리 인식되어 왔다. 이전 연구에서 본 그룹은 누에 체액과 누에 체액 단백질을 이용하여 다양한 세포에서 apoptosis 억제에 대한 연구를 수행하였다. 특히, 누에 체액 단백질 중 하나인 30Kc6 단백질을 Chinese hamster ovary(CHO) 세포에서 발현시켜 anti-apoptosis 효과와 EPO와 같은 재조합 단백질의 생산이 향상됨을 보고하였다. 또한 30Kc6 단백질을 E. coli에서 inclusion body 형태로 발현시켜 정제함으로써 anti-apoptosis 효과를 보려는 연구도 수행하였다. NusA 단백질을 발현 파트너로 도입하여 E. coli에서 soluble form으로 발현시켰으나 효소 반응을 통해 NusA를 제거하는 추가적인 정제 과정이 필요했다. 본 연구에서는 30Kc19을 발현 파트너로 도입함으로써 30Kc6를 soluble form으로 발현시키고 두 단백질의 기능을 모두 갖는 융합 단백질을 만들고자 하였다. 30Kc19 단백질은 E. coli에서의 soluble expression을 위해 선택되었고, 세포투과성과 재조합 단백질의 생산을 향상시키는 효과를 갖고 있다. 30Kc19-30Kc6 단백질은 E. coli에서 soluble form으로 발현되었고, 배지에 첨가하였을 때 HeLa 세포와 CHO 세포에서 세포 내부로 이동함을 확인하였다. 배지에 첨가된 30Kc19-30Kc6 단백질은 HeLa와 CHO 세포에서 apoptosis를 효 과적으로 억제함을 확인하였다. 또한 CHO 세포에서 apoptosis 억제함과 더불어 EPO의 비생산성을 향상시킴으로써 EPO의 전체 생산량이 증가함을 확인하였다. 이를 통해 30Kc19-30Kc6 단백질이 재조합 단백질을 생산하는 세포 배양의 첨가물로서 사용될 수 있을 것으로 기대되며, 30Kc19은 융합단백질에 soluble expression과 세포투과성을 부여하는 발현파트너로서의 가능성도 볼 수 있었다.

(The) Anti-tumor Effect of Orostachys japonicus Extracts on Cholangiocarcinoma Cell Line SNU-1079

최은솔 경희대학교 대학원 2016 국내석사

Orostachys japonicus A. Berger (O. japonicus) extracts have shown various biological activities including anti-inflammatory, neuroprotective, anti-ulcerative, anti-oxidant, and anti-tumor effects. Particularly, it has been recognized as a potential anti-tumor agent against various tumor cells. In the present study, the anti-tumor effect of O. japonicus extracts on intrahepatic cholangiocarcinoma cell line SNU-1079 was investigated. Cells were treated with various concentrations of O. japonicus DW and EtOH extracts (0-300 ㎍/㎖) for 24, 48, or 72 h. Cell viability was evaluated through PMS/MTS assay, and the apoptosis rate was examined through ELISA assay and flow cytometry analysis. The mRNA expression of apoptosis- and cell cycle-related genes (Bcl-2, Mcl-1, Bax, Survivin, Cyclin D1, and p21) was evaluated using real-time PCR, and the caspase activity was examined using immunoblot analysis. O. japonicus extracts inhibited cell proliferation and increased apoptosis rate in both ELISA assay and flow cytometry analysis. O. japonicus extracts decreased Bcl-2, Mcl-1, Survivin, and Cyclin D1 mRNA expression and increased Bax mRNA level. O. japonicus extracts also increased Caspase-3 activation. Overall, O. japonicus DW extracts were more effective than EtOH extracts. Taken these results together, O. japonicus inhibited cell proliferation and induced apoptosis in SNU-1079 cells via mitochondria-mediated intrinsic pathway, which leads to Caspase-3 activation. The results indicate that O. japonicus is a potential therapeutic herb with anti-tumor effect against intrahepatic cholangiocarcinoma. 와송(瓦松)은 항염증, 신경보호, 항궤양, 항산화 및 항암작용이 있는 것으로 알려져 있으며 특히 최근 연구에서는 다양한 암세포들에 대한 항암효과가 보고되고 있다. 본 연구에서는 와송(瓦松) 증류수 추출물과 에탄올 추출물이 간내 담도암 세포주인 SNU-1079 에 미치는 영향을 관찰하였다. 와송(瓦松) 추출물이 세포의 활성도에 미치는 영향은 PMS/MTS 비색분석법으로 분석하였고 세포자멸은 ELISA 방법과 flow cytometry 방법을 통해 측정하였다. 세포자멸과 세포주기에 관련된 유전자인 Bcl-2, Mcl-1, Bax, Survivin, Cyclin D1 및 p21 의 mRNA 발현 정도는 real-time PCR 법으로 측정하였으며 Caspase-3 의 단백질 발현 양상은 immunoblot 법으로 분석하였다. 그 결과, 와송(瓦松) 추출물은 세포 활성도를 감소시켰고, 세포자멸의 내인성 경로에 관련된 유전자 및 Caspase-3 의 발현을 조절하여 세포자멸을 증가시키는 것으로 관찰되어, 간내 담도암에 대한 와송(瓦松)의 활용가능성을 확인할 수 있었다.

Torilis japonica 95% Ethanol extraction compound induces apoptosis and inhibits metastasis via regulated intracellular signaling pathways

김근태 한남대학교 대학원 2015 국내석사

Induced apoptosis and anti-abnormal metastasis in cancer cells is a therapeutic strategy for the treatment of cancer. In this study, I investigated the regulatory mechanism of Torilis japonica 95% ethanol extract-induced apoptosis through the AMPK/p38 MAPkinase signaling pathway and suppressed abnormal metastasis by epidermal-mesenchymal transition (EMT) through regulated EGFR signaling pathways. My results showed that TJE induced apoptosis through generated intracellular Reactive Oxygen Species (ROS), and it responsible for depressed mitochondria membrane potential. And not only in vitro experiment, but TJE suppressed tumor growth and induced apoptosis in in vivo experiment. In addition, treatment with TJE along with stimulation by EGF prevented changes in cell morphology, mobility, expression of actin polarization proteins and EMT markers. Using specific inhibitors and siEGFR, it was demonstrated that TJE suppressed EMT through EGFR inactivation and regulation of its downstream signaling pathways. I suggest that TJE is a new potential multi-target cancer prevention reagent for induced apoptosis through generated intracellular ROS and EGFR-targeted anti-abnormal metastasis.

Cytoprotective and Anti-Aging Effects of Inonotus obliquus Extract via Anti-Oxidative Activity : 차가버섯 추출물의 항산화 활성에 의한 세포 사멸 저해와 항노화 효과

Yun Jong Seok 강원대학교 대학원 2010 국내석사

차가버섯은 북위 45-50도의 러시아 캄카차 반도, 일본의 훗카이도 등과 같이 춥고 깊은 산에서 주로 발견되며, 자작나무에 붙어 자생하는 검은 색상의 담자균류로 알려져 있다. 이러한 차가버섯은 전통적으로 항암, 항종균, 면역증강, 항바이러스 및 항당뇨 효과 등과 같은 다양한 생리활성을 지닌다고 보고되고 있다. 특히, 근래에 알려진 바로는 차가버섯에서 분리된 색소성분이 항산화 효과에 탁월한 효능을 보인다고 보고된 바 있다. 하지만, 이렇듯 다양한 효능이 알려짐에도 불구하고, 산화적 스트레스로 인한 세포 사멸 저해와 노화억제에 관해서는 아직 보고되어지지 않았다. 따라서 본 연구의 목적은 차가버섯 추출물의 항산화 활성으로부터 산화적 스트레스로 가속화된 세포의 비정상적 사멸과 노화를 억제하고자 하였다. 또한, 광노화로 인한 피부 주름 생성을 막아 주름 개선 소재로써의 이용가능성을 평가하였다. 차가버섯 건조 분말 (20 g)은 증류수, 에탄올, 메탄올 (600 ml)의 세 가지 용매로부터 각각 추출되었다. 각각의 추출 수율은 열수로 추출 시 19.5%로 가장 높은 수율을 보였으며, 메탄올 (1.6%), 에탄올 (1.4%) 순으로 나타났다. 각 추출물들의 DPPH, 과산화수소, superoxide 자유 라디칼 소거능을 평가한 결과, 각각 70~98%, 50~60%, 25~33%로 비교적 높은 자유 라디칼 소거능을 보였다. 하지만, 산화적 스트레스로 인한 섬유아세포의 항사멸 효과를 평가하였을 시에는 열수 추출물만이 20% 이상의 저해 효과를 지니는 것으로 나타났다. 따라서 이러한 효능을 보이는 열수 추출물이 산화적 스트레스로 인한 세포의 비 성숙한 노화를 억제 할 수 있을 것으로 판단하여, 활성 분획물로 열수 추출물을 선별하였다. 차가버섯 열수 추출물은 과산화수소에 노출된 섬유아 세포의 세포내 활성 산소종을 효과적으로 소거하였고, 세포의 지질과산화를 억제하였다. 산화적 스트레스는 세포자살의 특징인 세포의 DNA 파괴와 함께 세포 분열 주기를 정지 시켜 세포 자살을 유도하였으며, 세포의 형태를 변화시켰다. 하지만, 차가버섯 열수 추출물 처리 시, DNA 손상 및 세포의 비정상적인 형태를 저해하였고, 비교적 정상적인 세포분열을 유도하는 것을 확인하였다. 다음으로 세포 자살과 관련된 신호 전달 경로에서 차가버섯 열수 추출물의 작용 경로를 조사한 결과, Bax, caspase-3 와 AIF의 발현을 억제하였고, 항세포 사멸 인자인 Bcl-2의 발현을 유도함으로써 세포의 자살이 저해됨을 검증하였다. 또한, 산화적 스트레스는 세포의 비성숙한 노화를 야기 시켰으며, 교원질 분해 효소의 활성 증가와 함께 급속하게 교원질이 분해됨을 확인하였다. 이러한 세포의 비성숙한 노화 현상은 차가버섯 추출물의 존재 하에 효과적으로 저해 될 수 있음을 확인하였다. 세포의 노화와 밀접하게 관련 되어 있는 MAPK 신호 전달 경로에서는 ERK 1/2 와 JNK의 인산화를 선택적으로 저해한다는 것을 알 수 있었다. 이로부터 산화적 스트레스로 유도된 세포의 노화는 차가버섯 열수 추출물로 인해 효과적으로 억제 될 수 있음을 검증하였다. 또한, 차가버섯 열수 추출물의 면역 강화능을 평가한 결과, 대식세포의 활성을 유도하여 NO 의 생성 및 대식작용을 증가시켜 면역강화 효과를 지니는 것으로 나타났다. 끝으로, in vivo 실험으로 12주간 자외선 B를 hairless mice에 조사시켜 주름 생성 정도와 피부 두께를 확인한 결과, 차가버섯 열수 추출물 처리 시 주름 생성이 저해 되는 것을 확인하였고, 피부 두께 역시 자외선 조사되지 않은 대조군과 비교적 유사한 피부 두께를 유지하는 것으로 나타났다. 이상의 연구 결과로부터 차가버섯 열수 추출물은 산화적 스트레스로 인한 세포의 사멸과 비성숙한 노화를 저해 할 수 있음을 확인하였다. 또한 광노화로 인한 피부주름을 예방 및 개선 할 수 있는 새로운 천연 소재로써의 이용 가능성을 확인하였다.