국내 생선회 및 초밥에서 분리한 황색포도상구균의 특성

이주영 성균관대학교 일반대학원 2012 국내석사

사회가 선진화되고 식품산업이 발달함에 따라 식품 소비자들의 생활수준 향상, 핵가족화, 여성의 사회진출이 증가되어 식생활 양식의 변화되었다. 또한 편의성이 강조되는 즉석조리식품 등의 소비증가로 인해 외식산업 규모가 확대되었다. 이에 따라 국내에서 가장 흔하게 발생되는 황색포도상구균에 대해 즉석섭취식품 중 생선회와 초밥에서 오염도를 확인하였으며 장독소 특성조사와 이들 장독소의 유전자 보유현황, 항생제 내성연구와 다제내성 균주 비율, 균막(Biofilm)형성을 확인하여 황색포도상구균의 특징을 파악함으로써 식중독 예방에 활용하고자 하였다. 국내 대형유통매장에서 2006년에서 2008년동안 총 3,196개의 시료를 수거하여 270개의 황색포도상구균을 동정하였다. 이 중 257(95.2%)균주가 항생제 내성율을 보였으며 115균주(42.6%)가 2개 이상의 다제내성율을 보였다. 황색포도상구균은 인간에게 감염되는 주요 식중독균이며 다양한 장독소를 갖고 있다. 이러한 독소를 검출하기 위해서 SET-RPLA와 PCR시험으로 표현형과 유전형을 검사한 결과 각각 95균주(35.2%), 129균주(47.8%)가 검출되었고 장독소 A형이 우점형으로 확인되었다. 표현형에서 SEA 75(78.9%), SEB 5(5.2%), SEC 3(3.2%), SED 0(0.0%), SEA+SEB 2(2.1%) 그리고 SEA+SEC 6(6.3%)검출되었다. 유전형에서는 sea 88(32.6%), seb 7(5.4%), sec 4(3.1%), sed 11(8.5%), sea+seb 3(2.3), sea+sec 7(5.4%), sea+sed 7(5.4%), sea+seb+sed 1(0.8%) 그리고 sea+sec+sed 1(0.8%) 검출되었다. 균막(Biofilm)은 세균이 고체 표면에 부착하여 다당류 또는 단백질로 둘러싸여 있는 미생물의 일반 형태이다. 균막의 특성을 파악하기 위해 slime production, biofilm formation, ica A/ica D 유전자를 확인하였다. 균막은 slime production assay에서 23.7%, biofilm formation assay에서 33.7% 검출되었고 두실험 모두에서 양성결과가 나온 균주를 PCR한결과 ica A/ica D유전자를 100%검출 하였다. 또한 균막형성은 외부환경요인인 온도, Glucose, NaCl과의 상호작용으로 많은 영향을 받는다는 것을 확인하였다. This study was perfomed in order to measure the level of food-borne pathogenic Staphylococcus aureus, entertoxins, antibiotic resistance pattern and Biofilm characterization of found ready to eat meals such as sushi, raw fish. A total of 270 of S.aureus were collected from hyper market in Korea, 2006 to 2008. At least 257(95.2%) of the tested strains showed antibiotic resistance properties 115 strains(42.6%) were resistant to two classes of them showed multiple antibiotic resistance. S.aureus is a major human pathogen that produces various types of entertoxins all of which can cause food poisoning. 270 S.aureus strains isolated from raw fish and sushi samples tested for the presence of SEs phenotype and genotype. SEs phenotype result were SEA 75(78.9%), SEB 5(5.2%), SEC 3(3.2%), SED 0(0.0%) and SEA+SEB 2(2.1%) SEA+SEC 6(6.3%) by reversed passive latex agglutination (RPLA). SEs genotype result were sea 88(32.6%), seb 7(5.4%), sec 4(3.1%), sed 11(8.5%), sea+seb 3(2.3), sea+sec 7(5.4%), sea+sed 7(5.4%), sea+seb+sed 1(0.8%) and sea+sec+sed 1(0.8%) by PCR. Biofilm can be defined as communities of microorganisms attached to a surface. Biofilm characterization were to examine in vitro slime production, biofilm formation, and the presence of the ica genes locus and ica A and ica D genes. Of the 270 isolates tested, the frequency of slim production positive was 23.7% and biofilm assay positive 33.7%, all biofilm producing strains were positive for ica A and ica D genes(100%). The phenotypic and genotypic results showed highly diverse and complex patterns of biofilm formation in S.aureus. The results showed that temperatures suboptimal for growth increased the production of biofilm. The presence of sodium chloride and glucose affected the biofilm formation. The exists a correlation between phenotype and genotype in this findings, also biofilm important to understand the interactions between bacteria and the surfaces in food processing and food environment.

Role of cell wall-associated virulence factors of staphylococcus aureus in biofilm formation and induction of inflammatory responses

안기범 서울대학교 대학원 2017 국내박사

목 적 황색포도상구균은 통성혐기성 그람양성세균으로 사람의 피부 또는 점막에 집락을 형성하고높은 보균율을 가지고 있으며 인체 내 가벼운 피부염증에서부터 패혈증, 폐렴, 심내막염 등과 같은 중증 질환까지 유발하는 치명적인 병원균이다. 특히 황색포도상구균은 세균 최 외곽에 존재하는 세포벽 병독성인자를 통해 강한 면역반응을 일으켜 비정상적인 염증반응을 유도하고 바이오필름 형성을 통해 감염 질환을 유발하는 것으로 알려져 있다. 하지만 현재까지 이에 대한 핵심 세포벽 병독성인자 규명 및 작용기전에 대한 연구는 매우 미비한 상태이다. 황색포도상구균에 의한 감염과 감염질환을 예방하고 치료하기 위해서는 세균 감염기전에 대한 이해가 필요하며 이를 바탕으로 한 조절물질 개발 연구가 이루어져야 한다. 따라서 본 연구에서는 황색포도상구균에 의해 유도된 면역반응 및 바이오필름을 매개하는 주요 세포벽 병독성인자 발굴 및 작용기전을 규명하고 이를 조절할 수 있는 물질개발 및 조절 기전을 규명하고자 하였다. 실험방법 황색포도상구균 세포벽 병독성인자들의 선천성 면역활성 능력을 평가하기 위해 마우스 대식세포 (마우스 대식세포주인 RAW 264.7 세포, C57BL/6 정상마우스 또는 TLR2-, NOD2 결손마우스의 골수유래 대식세포) 또는 인체 대식세포 (인체 단핵구유래 대식세포)를 황색포도상구균 정상균주, 지질단백질 결여균주, 리포테이코익산 결여균주 또는 정제된 지질단백질, 리포테이코익산 및 펩티도글리칸, 펩티도글리칸 소단위체 (MDP, Tri-DAP, M-tri DAP) 물질로 자극한 뒤 생성된 염증매개인자들을 측정 후 비교 분석하였다. 황색포도상구균 세포벽 병독성인자의 염증매개인자 생성 유도능력을 평가하기 위해 마우스 대식세포에 황색포도상구균 정상균주, 지질단백질 결여균주, 리포테이코익산 결여균주를 처리한 후 nitric oxide (NO)의 생성을 Griess시약을 이용한 아질산염 측정법울 통하여 확인하였고 inducible NO synthase (iNOS)의 생성을 RT-PCR과 Western blotting을 통하여 확인하였다. 리포테이코익산과 MDP의 염증매개인자 생성 유도능력을 평가하기 위해 마우스 대식세포와 인체 대식세포에 리포테이코익산과 MDP를 단독 또는 병용처리 후 프로스타글란딘 E2 (Prostaglandin E2, PGE2)의 생성을 효소면역측정법(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)을 통하여 확인하였고 cyclooxygenase-2 (COX-2)의 생성을 RT-PCR과 Western blotting을 통하여 확인하였다. 리포테이코익산과 MDP의 염증매개인자 발현관련 전사인자 활성 능력을 평가하기 위해 마우스 대식세포에 리포테이코익산과 MDP를 단독 또는 병용처리 후 NF-κB, AP-1, CRE의 활성을 루시퍼라아제(발광효소) 리포터 유전자 분석기법을 통해 확인하였다. 세포벽 병독성인자들에 의한 톨유사수용체(Toll-like receptor, TLR)의 신호전달 활성을 조사하기 위해 TLR2 또는 TLR4 의존적인 전사활성에 따라 세포막에 분화항원(Cluster of differentiation, CD) 25를 발현하도록 유전적으로 조작된 중국 햄스터 난소(Chinse hamster ovary cell, CHO)/CD14/TLR2 세포주와 CHO/CD14/TLR4 세포에 황색포도상구균 정상균주, 지질단백질 결여균주, 리포테이코익산 결여균주를 처리한 후 유세포 분석기를 이용하여 CD25 발현을 분석하였다. 황색포도상구균 바이오필름에 대한 세포벽 병독성인자들의 영향을 조사하기 위해 황색포도상구균에 정제된 리포테이코익산, 지질단백질, 펩티도글리칸을 처리한 후 형성된 바이오필름을 crystal violet 염색법, 공초점현미경, 주사전자현미경을 통해 확인하였다. 황색포도상구균의 쿼럼센싱 물질 생성에 대한 리포테이코익산의 영향을 조사하기 위해 황색포도상구균에 리포테이코익산을 처리한 후 생성된 autoindcuer-2 (AI-2)을 비브리오 하베이(Vibrio harveyi) BB170 균주를 이용한 루시퍼라아제 리포터 유전자 분석기법 통해 확인하였다. 결 과 황색포도상구균 지질단백질 결여균주는 대식세포에서 정상균주와 리포테이코익산 결여균주에 비해 NO와 NO 합성 효소인 iNOS의 생성을 유도하지 못하였다. 또한 정상균주와 리포테이코익산 결여균주는 iNOS 생성에 관여하는 전사인자인 NF-κB와 STAT-1의 활성을 유의적으로 증가시켰지만 지질단백질 결여균주는 이들의 활성화를 유도하지 못하였다. 특히 정상균주와 리포테이코익산 결여균주는 TLR2의 활성을 농도 의존적으로 증가시켰지만 지질단백질 결여균주의 자극은 TLR2 활성에 아무런 영향을 주지 못하였다. 따라서 지질단백질은 황색포도상구균에 의한 TLR2 활성과 이로 인한 iNOS 발현 및 NO 생성에 관여하는 핵심 세포벽 병독성인자임을 확인하였다. 정제된 황색포도상구균 리포테이코익산과 펩티도글리칸은 대식세포에서 상승효과를 보이며 COX-2와 PGE2 생성을 유도하였다. 특히 펩티도글리칸의 소단위체 물질들 중 MDP가 리포테이코익산과 COX-2 발현에 상승효과를 보이는 것을 확인하였다. 하지만 리포테이코익산과 MDP의 COX-2 발현에 대한 상승효과는 TLR2와 NOD2 결손마우스 대식세포에서 실험 시 사라졌다. 리포테이코익산과 MDP는 COX-2 발현 관련 전사인자인 NF-κB와 CRE 활성에도 상승효과를 보였다. 따라서 리포테이코익산은 펩티도클리칸의 소단위체 물질인 MDP와 협력하여 황색포도상구균에 의한 염증반응에 관여하는 것을 확인하였다. 분비된 황색포도상구균 리포테이코익산을 포함하고 있는 정상세균의 배양액은 황색포도상구균의 바이오필름을 억제하였지만 리포테이코익산 결여균주의 배양액은 바이오필름을 억제하지 못하였다. 정제된 황색포도상구균 리포테이코익산 역시 바이오필름을 억제하였고 지질단백질은 아무런 영향을 주지 못하였다. 다양한 그람양성세균들에서 정제한 리포테이코익산 모두 황색포도상구균의 바이오필름을 억제하였고 이 중 특히 유산균 Lactobacillus plantarum에서 정제된 리포테이코익산이 매우 큰 억제효과를 보였다. L. plantarum 리포테이코익산은 황색포도상구균 바이오필름에 핵심 구성물질인 poly-N-acetylglucosamine의 생성을 억제하였고 바이오필름의 음성 조절물질로 알려진 AI-2의 생성을 증가시킴으로써 황색포도상구균 바이오필름을 억제하였다. 또한 리포테이코익산의 D-alanine 잔기가 바이오필름 억제 효과에 필수적으로 작용하는 것을 확인하였다 결 론 이상의 연구결과들로부터 다음과 같은 결론을 얻을 수 있었다. 지질단백질은 황색포도상구균에 의한 염증반응에 관여하는 핵심 세포벽 병독성인자이며 리포테이코익산은 MDP와 협력하여 황색포도상구균에 의한 염증반응에 기여한다. 또한 리포테이코익산은 황색포도상구균 바이오필름에 대한 음성조절인자로 작용하며 특히 L. plantarum 리포테이코익산은 황색포도상구균에 의한 염증질환을 예방 및 치료 할 수 있는 항바이오필름 작용제로 활용될 수 있다.

국내 식품류에서 분리한 황색포도상구균의 오염도 및 병원성 인자의 특징

조용선 성균관대학교 일반대학원 2012 국내박사

Staphylococcus aureus is a major human pathogen at produces a wide array of toxins, thus which cause various types of disease symptoms. Prevalence of S. aureus in various food and subsequent antibiotic resistance profiles were investigated from 2006∼2008. S. aureus were isolated from 275 of 5,186 (5.3%) food samples collected from hyper market in Korea. Seasonal temperature affected the prevalence of S. aureus in various foods with high isolation during summer. At least 259(94.2%) of the tested strains showed antibiotic resistance properties 107 strains(41.3%) were resistant to two classes of them showed multiple antibiotic resistance. Most of the enterotoxigenic strains produced enterotoxin A or enterotoxin A in combination with another toxin. A total of 150(54.5%) of the tested strains contained either one or more enterotoxin genes and 10 strains(3.6%) possessed a tst gene that encoded TSST-1. Among the 275 S. aureus isolated studied here, 11 strains were resistant to oxacillin and positive for the mec A gene. Of the 275 isolates tested, the frequency of slim production positive was 24.4% and biofilm assay positive 30.5%. Antibiotic resistance displayed a not significantly higher prevalence of biofilm formation. The Sma I digested chromosomal DNA of MRSA gave 4 diversity clusters and 90% similarity despite being isolated from different food samples in different years so that 11 isolates were closely related. This study offers basic data for securing the stability of food during storage and circulation and provides an epidemiological tool to study to the cause, origin and temporal spread of S. aureus food poisoning.

마우스의 큰포식세포에서 신규 광민감제 CHLO-Cl의 병원성 세균 제어 기전 규명

김민정 강원대학교 대학원 2023 국내석사

항생제의 방대하고 부적절한 사용으로 인해 내성을 가진 세균이 증가함에 따라 각종 감염병 및 감염 질환 치료를 위해 선택할 수 있는 항생제에 많은 제한이 생겼다. 황색포도상구균(Staphylococcus aureus, S. aureus)은 비강과 구강 인후 점막에서 공생하는 세균이지만 혈류, 피부, 연조직 및 뼈에 침입하면 생명을 위협하는 감염을 일으킬 수 있다. 베타 락탐(β-lactam) 계열 항생제 외에도 메티실린(methicillin), 반코마이신(vancomycin)에 내성을 가지는 황색포도상구균이 보고되었기 때문에 새로운 치료 전략이 필요한 상황이다. 항생제 내성균의 출현 뿐만아니라 독소를 생성하는 특징으로 인해 항생제 치료가 어려운 세균들도 존재한다. 병원성 대장균(pathogenic Escherichia coli) 중 장출혈성 대장균(Enterohemorrhagic E. coli, EHEC)에 해당하는 O157:H7이 대표적인 예이다. 장출혈성 대장균 감염이 의심되는 경우 용혈성 요독 증후군(hemolytic-uremic syndrome) 유발 위험으로 항생제 치료는 권장되지 않는다. 광역학 치료(photodynamic therapy, PDT)는 특정한 파장의 빛에 의해 활성화되고 생성된 에너지가 주위 산소 분자로 전달되어 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)을 만드는 광민감제(photosensitizer, PS)를 활용한 치료 방법이다. 이전 연구에서 DH-I-180-3으로부터 신규 합성된 광민감제인 CHLO-Cl이 결핵균(Mycobacterium tuberculosis, Mtb)을 직접 죽이는 항균 활성뿐만 아니라 박테리아를 죽이는 큰포식세포의 능력을 향상시킬 수 있다고 보고된 바가 있다. 따라서 본 연구에서는 광활성화된 CHLO-Cl이 대장균 O157:H7 또는 다제내성 황색포도상구균에 감염된 마우스의 큰포식세포주 Raw264.7의 항균 활성에 미치는 영향을 규명하고자 하였다. 광활성화된 CHLO-Cl의 처리는 Raw264.7 세포의 생존과 대장균 O157:H7, 다제내성 황색포도상구균의 성장에 영향을 미치지 않았다. 대장균 O157:H7 또는 다제내성 황색포도상구균이 감염된 세포에 CHLO-Cl 처리 후 광활성화 시 대조군에 비해 세포 내 대장균의 수는 약 50%, 황색포도상구균의 수는 약 59% 감소하였다. 또한 CHLO-Cl의 처리는 대장균 O157:H7 또는 다제내성 황색포도상구균이 감염된 세포 내 활성산소종의 생산을 증가시켰다. Raw264.7 세포에 CHLO-Cl 처리 후 대장균 O157:H7 또는 다제내성 황색포도상구균 감염 시 ERK1/2, IκBα의 인산화 수준 및 전염증성 사이토카인 TNF-α의 분비는 CHLO-Cl을 처리하지 않은 세포에 비해 유의하게 증가하였다. 포식소체 성숙 마커인 Rab5 및 Rab7의 단백질 수준은 CHLO-Cl 전처리 후 대장균 O157:H7 또는 다제내성 황색포도상구균을 감염시킨 세포에서 상향 조절되었다. 이러한 결과들은 대장균 O157:H7 또는 다제내성 황색포도상구균이 감염된 큰포식세포에서 광활성화된 CHLO-Cl이 활성산소종을 생산하고 ERK1/2를 통한 MAPK 및 NF-κB 신호전달을 활성화하여 전염증성 사이토카인을 증가시킴으로써 세포 내 박테리아를 제어하는데 도움을 줄 수 있음을 시사한다. The overuse and inappropriate use of antibiotics contribute to the increase in antibiotic resistance, and thus the number of available antibiotics is decreasing. Staphylococcus aureus (S. aureus) is a commensal bacterium in the upper respiratory tract and gastrointestinal tract, but it can cause life-threatening infections upon invasion of the bloodstream, skin, soft tissues and bones. S. aureus is resistant to methicillin and vancomycin, in addition to β-lactam antibiotics, necessotating a new therapy strategy. There are also bacteria that are difficult to treat with antibiotics due to their toxin-producing characteristics. Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) infection is associated with the risk of hemolytic-uremic syndrome, so antibiotic treatment is generally contraindicated. Accordingly, photodynamic therapy (PDT) has emerged as a new therapeutic strategy for the control of antibiotic-resistant pathogens or intractable bacteria. In a previous study, it was reported that the photosensitizer CHLO-Cl could improve the ability of macrophages to kill bacteria as well as antibacterial activity against Mycobacterium tuberculosis (Mtb). In this study, to investigate the bactericidal activity of newly synthesized CHLO-Cl derived from DH-I-180-3, Raw264.7 cells were treated with CHLO-Cl and then irradiated with light. As a result, the treatment of CHLO-Cl did not affect the the survival of Raw264.7 cells and the growth of E. coli O157:H7 or multidrug-resistant S. aureus. Photoactivated CHLO-Cl decreased the growth of E. coli O157:H7 or multidrug-resistant S. aureus as well as bacterial survival in E. coli O157:H7 or multidrug-resistant S. aureus-infected cells. Under light illumination, CHLO-Cl increased the production of intracellular reactive oxygen species (ROS). Furthermore, in the presence of photoactivated CHLO-Cl, secretion of tumor necrosis factor-α (TNF-α) and protein levels of p-ERK1/2 and p-IκBα were significantly increased in E. coli O157:H7 or multidrug-resistant S. aureus-infected cells compared to untreated cells. The protein levels of phagosome maturation markers Rab5 and Rab7 were upregulated in cells infected with E. coli O157:H7 or multidrug-resistant S. aureus after CHLO-Cl pretreatment. These results suggest that CHLO-Cl may help regulate intracellular bacterial growth by increasing a proinflammatory cytokine through activation of the ERK MAPK and NF-κB signaling pathway and producing ROS.

오피스 빌딩 사무공간 내 생물학적 오염 분포특성

원동환 고려대학교 대학원 2012 국내석사

오피스 빌딩은 일반주택과는 달리 거주자의 연령, 성별, 질병유무 등의 개인차를 고려하지 않은 채 설계되었고, 다양한 원인 등으로 오염된 실내공기질(Indoor Air Quality; IAQ)은 사무직 근로자(勤勞者)들의 생명을 위협할 정도는 아니지만 장기적으로 볼 때 건강에 나쁜 영향을 미칠 수 있다. 본 연구의 목적은 오피스 빌딩의 사무공간 내 실내공기에서 생물학적 오염인자(총부유세균, 그람양성균, 그람음성균, 황색포도상구균, 메티실린 내성 황색포도상구균, 진균)의 분포특성을 파악하여 쾌적한 오피스 환경을 조성하는 기초조사 자료로 제공하는데 의의(意義)가 있다. 연구방법으로는 문헌(文獻)조사와 실태(實態)조사를 병행(竝行)하였다. 먼저 문헌조사를 통한 이론적 배경을 고찰(考察)하여 국내ㆍ외 오피스 빌딩 연구현황을 조사하였다. 또한, 서울소재 15개 오피스 빌딩의 사무공간 80개소를 대상으로 상반기(여름철)와 하반기(겨울철)에 실태조사를 실시하였다. 본 연구결과를 요약하면 다음과 같다. 오피스 빌딩의 사무공간 실내공기 중 생물학적 오염인자 측정결과 총부유세균의 농도는 여름철과 겨울철 각각 450 CFU/㎥, 71 CFU/㎥ 로 여름철이 6.3배 더 높게 나타났으며, 그람양성균 역시 297 CFU/㎥, 46 CFU/㎥ 으로 여름철이 더 높게 조사되었다(p<0.05). 또한, 그람양성균 중 황색포도상구균과 메티실린 내성 황색포도상구균을 측정한 결과, 황색포도상구균은 여름철이 4배 높게 나타났다. 메티실린 내성 황색포도상구균 및 그람음성균은 여름철과 겨울철 실내 &#8228; 외 모두 낮게 조사되었다. 진균의 경우 여름철과 겨울철에 각각 128 CFU/㎥, 39 CFU/㎥ 으로 여름철이 3.2배 더 높게 나타났으며, 실내보다 실외에서 3~4배 높게 조사되었다. 실내와 실외의 농도비(I/O ratio) 측정결과, 총부유세균은 여름철 2.1, 겨울철 0.8로 여름철이 높게 조사되었다. 또한, 그람양성균도 여름철 3.6, 겨울철 1.5로 황색포도상구균은 여름철 2.9, 겨울철 1.6으로 조사되었다. 메티실린 내성 황색포도상구균 및 그람음성균, 진균은 실내가 실외보다 낮게 조사되었다. 생물학적 오염인자의 분포특성을 보면 실내 총부유세균에 대한 그람양성균의 비율은 여름철과 겨울철 각각 66%, 64%로 나타났고, 그람양성균에 대한 황색포도상구균의 비율은 각각 33%, 57%로 조사되었다. 환경적 요인과 생물학적 오염인자의 분포특성 중 오피스 빌딩의 위치(저층, 중층, 고층, 지하, 실외)에 따른 결과는 여름철에 고층과 실외가 낮게 조사되었고, 겨울철은 모두 큰 차이가 없었다. 하지만 총부유세균의 경우 여름철과 겨울철 모두 저층에서 고층으로 높아질수록 감소하는 경향을 보였다(p>0.05). 시간에 따른 결과에서 여름철은 각각(오전, 오후) 405 CFU/㎥, 338 CFU/㎥, 겨울철은 각각 96 CFU/㎥, 62 CFU/㎥ 로 조사되어 모두 오전이 높고, 오후에 낮아지는 경향을 보였다. 진균의 경우는 여름철에 오전 120 CFU/㎥ 보다 오후 138 CFU/㎥ 가 높아지는 형태를 보였다. 사무공간 구조(개방형, 폐쇄형, 혼합형)에 따른 생물학적 오염인자 분포특성은 총부유세균의 경우 개방형이 452 CFU/㎥, 폐쇄형이 366 CFU/㎥, 혼합형이 287 CFU/㎥ 로 개방형 구조에서 높게 나타났고, 세 그룹 간에 통계적으로 유의한 차이를 보였다(p<0.05). 진균의 경우 개방형이 70 CFU/㎥, 폐쇄형이 128 CFU/㎥, 혼합형이 43 CFU/㎥ 으로 다른 생물학적 오염인자와는 달리 폐쇄형이 높은 것으로 조사되었다(p<0.05). 본 연구 결과를 통해 15개 오피스 빌딩의 생물학적 오염인자는 종합적으로 우려할만한 수준은 아니었다. 하지만 일부 오피스 빌딩의 경우 기준치보다 2~3배 높았고, 황색포도상구균이 다량 검출되어 관리가 필요한 것으로 조사되었다. 하지만 적절한 공조제어방식(HVAC)의 운용(運營)과 사무공간 재실 인원이 조절된다면 오피스 빌딩의 생물학적 오염은 일부 조절가능하다고 판단된다.

Molecular mechanisms for biofilm modulation by lipoteichoic acid in pathogenic Gram-positive bacteria

김아름 서울대학교 대학원 2021 국내박사

Introduction Biofilm is a community of bacteria that attach to the biotic or abiotic surfaces. Bacterial biofilms can cause various diseases ranging from dental diseases such as dental caries, periodontitis, and apical periodontitis to systemic diseases including sepsis, pneumonia, endocarditis, and prosthetic infection. Biofilm formation is initiated by binding of planktonic bacteria to biotic or abiotic surfaces, followed by production of extracellular polymeric substances (EPS) and maturation. Then, mature biofilm can release bacteria that disperse to other sites. Bacteria residing in biofilms have 10- to 1,000-fold more resistance to antibiotics and host immune systems compared to planktonic bacteria, whereas the bacteria dispersed from biofilm tend to appear hyper virulence by producing exotoxins and proteases. Therefore, to prevent bacteria-induced infections, it is important to identify key molecules associated with biofilm formation and dispersion together with their molecular mechanisms. Staphylococcus aureus is a Gram-positive pathogenic bacterium and can cause skin infection, pneumonia, sepsis, septic arthritis, osteomyelitis, and endocarditis. S. aureus easily forms biofilm on biotic or abiotic surfaces. Lipoteichoic acid (LTA) is known as a major cell wall-associated component of Gram-positive bacteria, which plays important roles in bacterial cell division and interactions with host cells. Recently, previous studies suggest that LTA is closely associated with biofilm formation. Although LTA is known to inhibit Gram-positive bacterial biofilm, a little is known about the mechanisms by which LTA regulates biofilm formation. Therefore, the aims of this study were (1) to investigate the effect of Sa.LTA on its own biofilm, (2) to investigate the underlying mechanisms at the molecular level, and (3) to validate the hypothesis that LTA could regulate the biofilm development like quorum sensing molecules. Material and methods Highly pure LTA was purified from Lactobacillus plantarum, Staphylococcus aureus, and Lactobacillus rhamnosus GG through butanol extraction, followed by hydrophobic and ion-exchange chromatography. To study the underlying mechanisms of LTA-induced biofilm regulation, S. aureus, of which mutant library is available for identification of genes related with the biofilm regulation, was used. To investigate the effect of S. aureus LTA (Sa.LTA) on its own biofilm formation, S. aureus wild-type and LTA synthase (ltaS) mutant, and ltaS complementary strains were used. Congo red was an LtaS inhibitor used for the inhibition of LTA synthesis. The level of LTA in the supernatants was determined by Western blot with anti-LTA antibody, and the levels of remaining biofilm were measured by crystal violet assay. To identify key factors which are involved in LTA-induced biofilm regulation, two component system (TCS) mutant strains from the Nebranska transposon mutant library were used for screening. To investigate the mechanism by which LTA regulates biofilm formation, the biofilm infiltration, direct binding, induction of phosphorylation, or regulation of gene expression by LTA were examined using confocal microscopy, flow cytometry, overexpression by gene cloning, glutathione-S-transferase (GST)-pull down assay, Western blot assay and real time RT-PCR. To determine whether Sa.LTA induces bacterial dispersion from biofilm, an in vivo model using BALB/C nude mouse catheter infection model was used. Cell viability of neutrophil was analyzed using trypan blue staining. Results Sa.LTA was released at higher amount under biofilm condition than under shaking condition and correlated with a less forming biofilm for 7 days. Biofilm of LTA-deficient strain rather increased in a time-dependent manner. Biofilm of S. aureus was increased by Congo red, which is an LtaS inhibitor. Purified Sa.LTA also inhibited biofilm formation of S. aureus. Furthermore, purified Sa.LTA infiltrated into S. aureus biofilm, bound to bacterial surfaces, and finally induced biofilm dispersion. Bacteria could sense and respond to Sa.LTA via a TCS leading to the attenuated biofilm formation. As a result of screening 13 TCS mutants in the Nebranska transposon mutant library, Sa.LTA failed to inhibit the biofilm formation of two TCS sensor mutants, ΔsaeS or ΔvraS, and their response regulator mutants ΔsaeR or ΔvraR, respectively. GST pull down assay and Western blot analysis showed that Sa.LTA directly bound to SaeS or VraS. L plantarum LTA (Lp.LTA) and L. rhamnosus GG LTA (Lr.LTA) also showed such effects in those TCS mutants similar to Sa.LTA. Histidine phosphorylation is known as a main signaling in the TCS. Western blot assay demonstrated that, phosphohistidine was increased more in S. aureus wild-type by Sa.LTA than in ΔvraS. Interestingly, Sa.LTA did not induce histidine phosphorylation in ΔsaeS, suggesting that Sa.LTA can induce histidine phosphorylation of SaeS. Lp.LTA has been reported to down-regulate expression of icaC gene which plays a key role in biofilm formation. Real-time RT-PCR data showed that Sa.LTA inhibited icaC gene expression in wild-type, but not in ΔvraS or ΔsaeS strains. Furthermore, Sa.LTA induced dispersion of S. aureus from biofilm in vivo nude mouse catheter infection models, and S. aureus dispersed by Sa.LTA more killed neutrophils than naturally dispersed bacteria. Conclusion The present study demonstrates that Sa.LTA regulates formation and dispersion of its own biofilm in S. aureus. Based on the mechanism study, two candidates, SaeRS and VraRS TCS, are identified as key molecules to regulate biofilm by LTA. These results imply that Sa.LTA may act as a quorum sensing molecule. Further studies for developing new therapeutic strategies or agents targeting SaeS, VraS, or Sa.LTA could be useful to prevent or overcome Gram-positive bacterial biofilm-associated diseases. Moreover, LTA from probiotics could be used as an anti-biofilm or supplemental agent to control biofilm-associated problems by using these underlying mechanisms, given that it suppresses inflammatory responses in host cells. 1. 목 적 바이오필름은 세균이 유기체 혹은 무기체 표면에 달라붙어 집락을 이루는 것이다. 특히 그람양성균에 의해 형성된 바이오필름은 치아우식증, 치주질환, 치근단치주염과 같은 구강질환과 더불어 심내막염, 인공보철물 감염 등 다양한 염증성 전신감염과 연관되어 있다고 알려져 있다. 그람양성균은 인체 내 감염 후 표면에 달라붙고 세포 외 고분자성물질을 만들어 바이오필름을 형성하게 된다. 바이오필름은 점점 성숙화된 뒤 확산이 유도되어 다른 부위로 퍼져나갈 수 있게 된다. 바이오필름이 형성되면 항생제를 포함한 다양한 치료제와 숙주면역에 대한 내성을 가지게 되어 부유 상태의 세균보다 10-1000배 이상 제거하기 어렵게 된다. 반면, 바이오필름에서 세균 확산이 유도되면 세포 외 독성 물질 분비 등을 통해 숙주세포에 대한 병독성과 염증 유도가 증가되는 것으로 알려져 있다. 따라서 그람양성균에 의한 감염을 예방하고 제어하기 위해서는 바이오필름 형성과 확산에 관여하는 인자 및 기전 규명 연구가 필요하며 이를 기반으로 한 제어물질 개발 연구가 이루어져야 한다. 리포테이코익산은 그람양성균의 세포벽 인자 중 하나로, 이전 연구를 통해 유산균 리포테이코익산에 의한 황색포도상구균의 바이오필름 형성 억제가 보고된 바가 있다. 황색포도상구균과 같은 병원성 그람양성균 또한 리포테이코익산을 가지고 있는 것으로 알려져 있으나, 현재까지 병원성 세균이 지닌 리포테이코익산에 의한 자체 바이오필름 조절 및 그 기전 규명 연구는 매우 미비한 상태이다. 따라서 본 연구에서는 병원성 그람양성균의 바이오필름 조절에 대한 자체 리포테이코익산의 역할을 검증하고, 나아가 그 분자적 기전을 규명하고자 하였다. 2. 방 법 병원성 그람양성균의 바이오필름 조절에 대한 자체 리포테이코익산의 역할을 규명하기 위해 대표적인 병원성 그람양성균인 황색포도상구균을 사용하였다. 바이오필름 발달에 따른 리포테이코익산 분비 양상을 확인하기 위해, 황색포도상구균를 정체 또는 부유 조건으로 배양한 뒤 상층액에 분비된 리포테이코익산 양을 Western blot 기법을 이용하여 검증하였으며 잔존 바비오필름은 crystal violet 염색법을 통해 확인하였다. 또한 황색포도상구균이 지닌 리포테이코익산의 자체 바이오필름에 대한 영향을 확인하기 위해 황색포도상구균 바이오필름 형성 시 또는 이미 형성된 바이오필름에 고순도로 정제된 황색포도상구균의 리포테이코익산을 처리하고 바이오필름 조절 양상을 crystal violet 염색법, 공초점현미경, 주사전자현미경 등을 통해 확인하였다. 황색포도상구균의 리포테이코익산에 의한 자체 바이오필름 조절의 핵심인자를 규명하기 위해, 트랜스포존 결손 라이브러리 균주를 이용하였으며 바이오필름 조절 양상을 확인함으로써 핵심인자를 규명하였다. 황색포도상구균의 리포테이코익산의 자체 바이오필름 조절에 대한 기전을 규명하기 위해, 리포테이코익산의 부착 여부, 히스티딘 잔기의 인산화 및 유전자 발현 조절 여부는 유세포분석기법, 클로닝 기법을 통한 과발현, GST-pull down과 Western blot 기법 및 실시간 중합효소연쇄반응 등을 통해 각각 검증하였다. 생체 내에서 리포테이코익산의 바이오필름 조절과 확산을 검증하기 위해 BALB/C nude catheter model을 이용하였으며 리포테이코익산에 의한 황색포도상구균의 병독성 증가 여부는 trypan blue 염색을 통한 호중구 세포 독성을 확인함으로써 검증하였다. 3. 결 과 황색포도상구균의 리포테이코익산 분비와 바이오필름 발달 과정 간의 연관성을 확인해본 결과, 황색포도상구균을 바이오필름 상태로 배양하였을 때 부유 배양보다 더 많은 양의 리포테이코익산이 검출되었으며 시간이 지남에 따라 리포테이코익산 양이 증가되었다. 이때 남아있는 황색포도상구균의 바이오필름 양은 시간이 지남에 따라 감소하였다. 또한 리포테이코익산 생성 억제제인 Congo red를 넣고 배양 시 황색포도상구균 바이오필름의 양이 증가되었다. 이러한 현상들은 리포테이코익산 결손 균주에서는 보이지 않았다. 황색포도상구균으로부터 분리한 리포테이코익산을 외부적으로 처리하였을 때 바이오필름 형성을 효과적으로 억제하였으며, 이미 형성된 바이오필름에 대해서도 효과적으로 감소시켰다. 외부로 처리한 리포테이코익산은 시간이 지남에 따라 이미 형성된 바이오필름을 침투하였으며 황색포도상구균 세균 표면에 붙음을 확인하였다. 트랜스포존 결손 라이브러리 중 세균 표면에 존재하며 외부 환경 변화를 감지한다고 알려진 두단계신호전달시스템(Two component systems, TCS)의 히스티딘 인산화효소(histidine kinase) 결손 균주를 이용하여 핵심인자 후보물질을 규명하였다. 리포테이코익산은 핵심인자 후보물질에 직접적으로 부착하였으며 히스티딘의 인산화 조절 및 관련 유전자 발현을 조절하였다. 카테터 삽입을 통한 쥐 생체 실험으로 확인한 결과, 외부로 처리한 리포테이코익산에 의해 카테터 내부 바이오필름의 양이 효과적으로 줄어들었으며 이때 다른 장기에서는 황색포도상구균이 더 증가하는 양상을 보였다. 또한 리포테이코익산에 의해 황색포도상구균 바이오필름으로부터 확산된 세균은 호중구에 대해 상승된 병독성을 지닌다는 것을 검증하였다. 이상의 결과들을 통해 황색포도상구균이 리포테이코익산을 분비하여 두단계신호전달시스템을 통해 자체 바이오필름 형성을 억제하고 이미 형성된 바이오필름으로부터 확산을 유도하는 등 행동 변화를 유도할 수 있다는 것을 확인하였다. 향후, 본 연구를 통해 밝혀진 핵심 인자 및 황색포도상구균의 리포테이코익산을 타깃으로 하는 치료제 개발은 차세대 치료제로써 황색포도상구균에 의한 질병 치료 및 예방에 효과적일 것으로 생각된다. 또한 이러한 리포테이코익산의 바이오필름 억제 기전을 기반으로, 인체에 유익한 유산균 리포테이코익산은 생체친화적이면서도 효과적으로 바이오필름을 제어할 수 있는 새로운 항바이오필름제로 사용될 수 있을 것이며, 이와 더불어 유산균 리포테이코익산과 항생제를 병용처리하는 방법은 바이오필름 내 세균 확산을 유도시켜 내부로 항생제의 침투를 용이하게 함으로써, 고농도 항생제 사용에 의한 내성균 출현이나 세포 독성 등의 부작용을 최소화시키면서 제어효능을 극대화할 수 있는 새로운 전략으로 활용될 수 있을 것이다.

비용종을 동반한 만성 부비동염 환자에서 비내 황색포도상구균 배양검사결과와 황색포도상구균 외독소에 대한 specific IgE의 발현에 관한 연구

윤진호 가천의과학대학교 대학원 2007 국내석사

목적 : 비용종을 동반한 만성 부비동염의 원인 및 발생 기전은 아직 확실하게 알려져 있지 않지만 감염, 염증 반응, 알레르기, 해부학적인 이상 등이 그 원인으로 생각되고 있다. 이 중 세균에 의한 감염은 가능성이 높은 원인 인자로 최근까지 연구되고 있으며 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)의 외독소(exotoxin)가 비용종을 동반한 만성 부비동염의 발생과 관련이 있다는 연구 결과가 보고되면서 이에 대한 관심이 증가되고 있다. 이에 본 연구를 통해 저자는 황색포도상구균이 알레르기 항원으로 작용함으로써 비용종을 동반한 만성 부비동염의 발생에 관여 하는지를 밝혀 보고자 하였다. 대상 및 방법 : 2005년 1월부터 2005년 6월까지 6개월간 비용종을 동반한 부비동염으로 수술 받은 30명의 비용종군과 정상 대조군 10명을 대상으로 비내 세균배양검사, 각 각 혈청과 비강내 용종 또는 점막에서 3종류의 황색포도상구균의 외독소 Staphylococcus aureus exotoxin A , Staphylococcus aureus exotoxn B, Toxic shock syndrome toxin-1에 대한 specific immunoglobulin E, 조직내의 호산구 개수를 측정하여 비교 분석하였다. 결과 : 비내 세균배양검사 결과 비용종군의 27%에서 황색포도상 구균이 검출 되었으나 정상 대조군에서도 10%의 배양률을 보였다. serum-specific IgE는 비용종군에서 9명에게서 22경우에, 대조군에서는 한 명도 검출되지 않아 유의한 차이를 보였으나, tissue-specific IgE는 비용종군에서는 2명에서 4경우에, 대조군에서는 1명에서 2경우에 검출되어 조직간의 유의한 차이가 없었다. 비용종의 여부와 균배양검사 결과에 따라 전체 실험군을 A : polyp(+), culture(+), B : polyp(+), culture(-), C : polyp(-), culture(+), D : polyp(-), culture(-)로 나누어 specific IgE를 비교하였을 때, 혈청에서 A군 63%, B군 18%, C군 0%, D군 0%의 발현률을 보여 배양 검사에서 양성으로 나온 군에서 specific IgE의 발현이 높았다. 그러나 조직에서는 네 군간에 유의한 차이가 없었다. 또한 specific IgE 양성인 군에서의 평균 조직내 호산구 개수는 142.7개로 음성인 군의 78.2개보다 높게 나타났다. 결론 : 비강내에 산재하는 황색포도상구균의 외독소는 알레르기 항원으로 작용하여 황색포도상구균에 특이한 IgE를 발현시키고 이는 국소적, 전신적인 알레르기 반응을 유발하여 비용종을 동반한 만성 부비동염의 발생에 영향을 줄 것으로 생각된다. Purpose of study : Staphylococcus aureus(S. aureus) exotoxins(SE) have been implicated in the pathogenesis of chronic sinusitis with nasal polyposis(CRS with NP). The aim of this study was to identify the contribution of S. aureus exotoxin as allergen in the development of nasal polyp. Materials and Method : Nasal polyp and serum were obtained from 30 patients undergoing endoscopic sinus surgery for CRS with NP and 10 control turbinate mucosae were used. Nasal cultures were performed for each patients. Specific IgE levels for S. aureus exotoxin A(SEA), S. aureus exotoxin B(SEB), and toxic shock syndrome toxin 1(TSST-1) were measured using ImmunoCAP method in nasal tissue and serum. The patients were divided into four groups A : nasal polyp(+)/culture(+), B : nasal polyp(+)/culture(-), C : nasal polyp(-)/culture(+), D : nasal polyp(-)/culture(-). Result : The culture for S. aureus was 27% in CRS with NP in compared to 10% in control. The specific IgE for S. aureus in serum was significantly expressed in nasal polyp (30%) compared to control(0%). Also the group A showed a significant high rate of specific IgE (63%) compared to group B(18%) and control group (group C (0%), group D (0%)) in serum. In nasal polyp tissue, the specific IgE has showed no specific difference between nasal polyp and control. However it was also increased in group A (25%), compared to group B (0%), group C (0%) and group D(11%). Conclusion : Our results demonstrated that there was a correlation between nasal polyp and specific IgE levels to S. aureus exotoxin. These results suggest that S. aureus exotoxin can act as a traditional allergen and induce the inflammatory reaction in CRS with NP.

만성부비동염을 동반한 비용과 황색포도상구균 외독소(Staphylococcus aureus exotoxin) 발현에 관한 연구

하종수 가천의과학대학교 2008 국내박사

목적: 비용의 발생 기전은 아직 명확하지 않으며 많은 가설이 있다. 최근 연구에서는 비강내의 황색포도상구균이 분비하는 외독소가 비용 발생에 영향을 미친다고 보고되고 있다. 본 연구는 황색포도상구균의 외독소와 비용과의 연관성을 알아보고자 하였다. 대상 및 방법: 2005년 1월부터 2005년 6월까지 6개월간 만성 부비동염을 동반한 비용종으로 부비동 내시경 수술을 받은 30명의 환자군과 정상 대조군 10명을 대상으로 비내 세균배양검사 및 비세척액에서 황색포도상구균의 외독소인 SEA (Staphylococcus aureus exotoxin A), TSST-1(Toxic shock syndrome toxin-1)을 중합효소연쇄반응(PCR)으로 확인하였고 조직에서 SEA, TSST-1에 대한 면역조직화학염색을 시행하여 확인하였으며 각각의 조직을 CD4+ T세포와 CD8+ T세포에 대한 면역조직화학염색을 하여 T세포의 개수를 측정하였다. 또한 H&E염색을 한 후 조직내의 호산구 개수를 측정하여 비교하였다. 이후 도말배양검사와 중합효소연쇄반응, 면역조직화학염색 사이의 관련성을 통계학적으로 분석하였고 각 검사 양성군과 음성군 사이에 CD4+ 및 CD8+ T세포 그리고 호산구 수의 차이가 있는지 알아보았다. 결과: 비내 세균배양검사 결과 비용종을 동반한 만성 부비동염 환자군의 27%에서 황색포도상구균이 배양 되었고 정상 대조군의 경우에도 10%에서 배양되었다. PCR 결과 비용종군에서 SEA, TSST-1은 각각 53%, 60%에서 검출되었고 정상 대조군에서는 각각 20%, 10%에서 검출되어 유의한 차이를 보였다(p<0.05). 면역조직화학염색상 비용종군에서 SEA와 TSST-1은 각각 20%, 33%의 검출률을 보였으나 정상 대조군의 경우 검출되지 않았다. 비용종군에서 CD4+ T 림프구 개수는 256.2±18.16개 정상 대조군에서 149.6±19.04개로 측정되었으며, CD8+ T 림프구 개수는 비용종 환자군에서 213.8±23.37개 정상 대조군에서 112.2±9.28개로 측정 되어 통계적으로 유의한 차이를 보였다(p<0.05). 비용종군의 조직 내 호산구의 평균 개수는 103.8±71.75개 였고 비용종이 없는 정상 대조군에서는 호산구의 개수가 39.9±6.94개로 나와 의미 있는 차이를 보였다(p<0.05). 관련성 조사에서는 대조군에 비해 비용종군에서 도말배양검사와 중합효소연쇄반응, 면역조직화학염색 결과 사이에 유의한 관련성이 있는 것으로 조사되었다(p<0.05). 그리고 도말배양검사와 중합효소연쇄반응, 면역조직화학염색 양성군과 음성군간에 CD4+ 및 CD8+ T세포 그리고 호산구 수의 차이가 대부분 유의하게 있는 것으로 나타났다(p<0.05). 결론: 비강 내에 존재하는 포도상구균의 외독소는 일정 기전에 의해 세포 내로 침투한 후 항원제시세포와 T세포 사이에서 초항원(superantigen)으로 작용하여 싸이토카인 및 화학주성인자를 증가시키고 호산구를 증가시켜 비용종의 발생에 기여한다고 생각된다. Purpose of study: Despite many previous hypotheses, pathogenesis of nasal polyp is still not clear. In recent studies however, Staphylococcus aureus exotoxins have been newly implicated in the pathogen sis of chronic sinusitis with nasal polyp. The aim of this study is to identify the correlation betweenS. aureus exotoxins and nasal polyp. Materials and Method: Nasal lavage and nasal polyp tissue were obtained each from 30 patients undergoing endoscopic sinus surgery for nasal polyp with chronic rhinosinusitis. Likewise, nasal lavage fluid and turbinae mucosa was procured from 10 control individuals. Nasal culture was then performed for each patient. The presence of SEA and TSST-1 was verified through PCR analysis of nasal lavage and immunohistochemical staining of nasal tissue. Immunohistochemical staining for CD4+ T and CD8+ T cells was performed, followed by hematoxylin & eosin stains for eosinophils. The difference in te number of CD4+ T cells, CD8+ T cells and eosinophils was then analyzed. Result: Nasal culture results were positive for Staphylococcus aureus in 27% of the nasal polyp group, in comparison to 10% in the control group. Also, PCR analysis for Staphylococcus aureu exotoxin in nasal lavage demonstratd remarkable expression in the nasal polyp group (SEA: 53%, TSST-1: 60%) compared to the control group (SEA: 20%, TSST-1: 10%). In addition, immunohistochemical stains of nasal tissues reflected significantly higher expression of Staphylococcus aureus exotoxin in the nasal polyp group (SEA: 20%, TSST-1: 33%) compared to control group (SEA: 0%, TSST-1: 0%). Furthermore, the number of T cells and eosinophil in the nasal tissue was notably increased in the nasal polyp group(CD4+ T cell: 256.2±18.16, CD8+ T cell: 213.8±23.37, eosinophil: 103.8±71.75), compared to the normal control group(CD4+ T cell: 149.6±19.04, CD8+ T cell: 112.2±9.28, eosinophil: 39.9±6.94). Significant relation was observed regarding results of the culture, PCR and immunohistochemical stain in the nasal polyp group. Moreover, the number of T cells and eosinophils was significantly increased in the positive experimental groups, compared to the negative groups. Conclusion: Our results demonstrated that there was indeed some correlation between the development of nasal polyp and the expression of Staphylococcus aureus exotoxin, i.e. Staphylococcus aureus exotoxin invading the nasal tissue through some unknown pathway and acting as a superantigen, thereby inducing the inflammatory reaction and nasal polyp.

Development of Antibacterial Agents against Multidrug-Resistant Staphylococcus aureus through Domain Shuffling of Endolysins

이찬영 서울대학교 대학원 2021 국내석사

The increase in the prevalence of multidrug-resistant (MDR) Staphylococcus aureus with strong biofilm-forming capacity poses a serious public health concern. Endolysin derived from bacteriophages is a promising solution for antibiotic resistance problems. However, natural staphylococcal endolysins have several shortcomings, such as low solubility and high sequence homology among domains. Therefore, it is time-consuming and labor-intensive to discover potent endolysin in a natural environment. To overcome these difficulties, I took an advantage of the modular structure of endolysin which consists of the enzymatically active domain (EAD) and cell wall binding domain (CBD), and constructed a hybrid endolysin library by swapping domains of 12 natural staphylococcal endolysins. Based on several screening steps, a novel chimeric endolysin 7A7 was selected and named ‘ClyC’. This chimeric endolysin ClyC showed enhanced lytic activity against S. aureus in turbidity reduction assay and log killing assay compared to its parental endolysin form. ClyC also exhibited strong antibacterial activity against S. aureus in various biomatrices, such as milk and blood. Moreover, the treatment of chimeric endolysin effectively eradicated biofilms of multidrug-resistant bacteria, including methicillin-resistant S. aureus (MRSA), S. epidermidis (MRSE), and bacteremia clinical isolates. Interestingly, ClyC showed effective protection capability against methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) without any toxic effects in an in vivo mouse infection model. Taken together, our data suggest that the chimeric endolysin ClyC can be considered a potential antibacterial agent against multidrug-resistant S. aureus and may have clinical relevance. 강력한 생물막 형성 능력을 가진 다제내성 (MDR) 황색포도상 구균(Staphylococcus aureus)의 증가는 전세계적으로 심각한 공중 보건 문제를 야기하고 있다. 이에 따라, 박테리오파지에서 분리된 세포벽 분해 효소인 엔도라이신이 기존의 항생제를 대체할 수 있는 유망한 해결책으로 주목받고 있다. 그러나 자연계에 존재하는 황색포도상구균 엔도라이신은 낮은 가용성을 갖거나 도메인 간의 높은 서열 상동성을 나타낸다는 등의 한계점을 지닌다. 따라서, 자연 환경에서 강력한 엔도라이신을 개발하는 것은 시간이 많이 걸리며 노동 집약적이다. 본 연구에서는 이러한 한계를 극복하기 위해 22개의 효소 활성 도메인(Enzymatically Active Domain, EAD)과 12개의 세포벽 결합 도메인(Cell Wall Binding Domain, CBD)을 재조합하여 키메릭 엔도라이신 라이브러리를 구축하였다. 이에 대한 선별 과정을 시행한 결과, 모체의 엔도라이신에 비해 훨씬 향상된 특성을 나타내는 키메릭 엔도라이신(7A7)을 선정하였고 ‘ClyC’라고 명명하였다. 이 키메릭 엔도라이신은 모체 엔도라이신인 LysSA12에 비해 황색포도상구균에 대하여 향상된 용균 활성을 나타내었다. 또한 ClyC는 우유 및 동물의 혈액과 같은 다양한 바이오 매트릭스 내에서도 황색포도상구균에 대한 강력한 용균 활성을 유지하였다. 더 나아가, 메티실린 저항성 황색포도상구균 (MRSA), 메티실린 저항성 표피포도상구균 (MRSE), 균혈증 환자 분리 균주 등을 포함한 다양한 포도상구균에 대하여 효과적인 생물막 제거 효능을 보였다. 마지막으로 흥미롭게도, 키메릭 엔도라이신 ClyC는 쥐 모델 내에서 다제내성 황색포도상구균 감염에 대한 치료 효과를 나타내었으며 복강에 과량 투여한 경우에도 독성을 띠지 않는 것이 확인되었다. 종합하면, 본 연구의 실험 결과들은 키메릭 엔도라이신 ClyC가 식품 산업에서 효과적인 항균제로 활용될 수 있음을 시사하며, 의료 산업에서 다제내성 황색포도상구균에 대한 항생제 대체 치료제로서의 활용 가능성을 제안한다.

아파트 주거환경 내 bioaerosol 분포특성

김상돈 고려대학교 대학원 2011 국내석사

일반적으로 실내 오염은 인간 활동, 생활용품 및 사무용품, 건축자재, 오염된 대기의 유입 등으로 발생되며 실내오염물질로는 입자상 오염물질, 가스상 오염물질, 생물학적 오염물질 등이 있다. 이러한 오염물질 중 생물학적 오염물질이 큰 부분을 차지하고 있다. 본 연구의 목적은 아파트 실내 공기 중 bioaerosol의 농도 분포를 파악하고, 실내 생물학적 오염의 위해도 평가를 위한 기초조사 자료를 제공하는데 있다. 2010년 3월부터 2010년 9월까지 봄철과 여름철에 서울과 경기도 지역 아파트 30가구를 대상으로 생물학적 오염원, 입자상 오염원을 조사하였다. 생물학적 오염원으로는 총 부유 세균(Total Suspended Bacteria), 기회감염균(Opportunistic Pathogens), 그람양성균(Gram Positive Bacteria), 포도상 구균(Staphylococcus sp), 황색포도상 구균(Staphylococcus aureus), 항생제 내성 포도상 구균(Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus, MRSA), 그람음성균(Gram Negative Bacteria), 병원성 대장균(Enterovirulent E. coli), 곰팡이(Fungi)와 엔도톡신 그리고 바이러스(Rhinovirus, Coronavirus, Respiratory syncytial virus, Parainfluenza virus, Adenovirus)를 측정하였고 입자상 오염으로는 미세먼지를 측정하였다. 계절에 따른 봄철과 여름철의 실내 총 부유 세균의 측정 결과는 각각 383 CFU/m3, 637 CFU/m3으로 여름철이 1.7배 더 높게 나타났으며, 기회감염균 역시 341 CFU/m3, 462 CFU/m3으로 여름철 농도가 높게 측정되었다(p<0.01). 공기 중의 bioaerosol을 그람양성균과 그람음성균으로 분류하여 측정한 결과, 그람양성균의 경우에는 황색포도상 구균을 제외한 모든 균이 여름철에 1.4~2배까지 높게 나타났으며, 항생제 내성 포도상 구균도 봄철 보다 여름철에 실내와 실외에서 모두 높게 검출되었다. 측정 위치에 따른 결과는 총 부유 세균의 봄철 실내 농도가 실외 농도보다 2.2배 높게 측정되었고, 그람양성균 중 황색포도상 구균을 제외한 모든 세균의 실내농도가 실외 농도보다 2~5배까지 높게 나타났다. 여름철의 경우 총 부유 세균의 실내 농도가 실외 농도 보다 4.6배 높게 측정되었고 그람양성균은 황색포도상 구균을 제외한 모든 세균이 실내에서 실외보다 3.4~9.3배 높게 측정되었다. Bioaerosol의 분포 특성을 보면 실내 총 부유 세균에 대한 그람양성균의 비율은 봄철과 여름철에서 각각 66.1, 52.1%로 나타났고 그람양성균에 대한 포도상 구균의 비율은 각각 61.3, 68.6%로 측정 되었다. 환경적 요인과 bioaerosol의 분포특성 중 거주 지역별(서울, 경기도) bioaerosol 농도측정 결과는 봄철과 여름철, 실내와 실외 모두 큰 차이가 없는 것으로 나타났지만, 봄철 실내측정 결과, 기회감염균이 서울지역에서 경기도 지역보다 높게 측정되었고 여름철에는 총 부유 세균의 농도가 경기도 지역에서 서울지역 실내측정 결과 보다 높게 측정되었다. 아파트 거주 면적별 봄철 실내 총 부유 세균의 농도는 각각 (66~99㎡, 99~132㎡, 132~165㎡, 165㎡이상) 309, 304, 402, 209CFU/㎥으로 특이한 결과를 보이지 않았다. 하지만 그람양성균과 포도상 구균, 황색포도상 구균, 진균, 엔도톡신의 측정결과는 면적이 증가할수록 bioaerosol의 농도가 감소하는 경향을 나타냈다. 여름철에는 총 부유 세균의 농도가 면적이 증가할수록 bioaerosol의 농도는 감소하는 경향을 나타냈고, 기회감염균과 그람양성균, 포도상 구균도 같은 경향을 보였다. 하지만 황색포도상 구균과 진균, 엔도톡신의 경우에는 면적별 경향성이 나타나지 않았다. 가족 구성원 중 질병 이환자 유무와 bioaerosol간의 상관성을 분석한 결과 봄철에는 황색포도상 구균과 유의성을 나타냈고(p<0.05), 여름철에는 질병과 총 부유 세균, 질병과 포도상 구균의 상관성도 유의하게 나타났다(p<0.05). 여름철 측정 시 비가 내린 날과 화창한 날을 비교하였을 경우 화창한 날이 비가 내린 날 보다 bioaerosol 농도가 높게 측정되었다. 바이러스 측정결과 봄철에 15가구에서 호흡기 질환 바이러스인 파라인플루엔자 바이러스 또는 아데노바이러스가 검출 되었으며, 여름철 측정 결과 바이러스가 측정된 2가구는 모두 실외에서 아데노바이러스가 측정되었다. 엔도톡신의 측정값은 봄철과 여름철, 실내와 실외 농도 모두 유사한 결과를 나타냈고, 다른 인자들과의 통계적 유의성은 나타나지 않았다. 입자상 물질 중 미세먼지를 측정하여 다중이용시설 실내 공기질 유지기준과 비교한 결과, 한 세대만 기준치를 초과하였고 나머지 세대의 측정값은 모두 기준치 이하였다.