Schizophyllum commune W130 유래의 혈전용해효소의 정제 및 특성

박인숙 東義大學校 大學院 2004 국내석사

순환계의 질환은 대부분 혈전에 기인하는데 이 혈전이 원인이 되어 질병을 유발시키는 것을 혈전성 성인병이나 혈전증이라고 한다. 이러한 순환계 질환들을 치료하기 위한 혈전 용해에 관한 연구가 최근에는 발효식품인 젓갈, 된장, 청국장 등에서 안전한 혈전용해제를 찾고 있다. 본 연구는 그 연장선상의 연구로서 치마버섯(Schizophyllum commune W130)의 균사체를 액체 배양하여 배양액으로부터 분비성 혈전용해효소를 확인하였다. 따라서 혈전용해효소 생산을 위한 최적조건의 검토와 혈전용해효소의 정제 및 그 특성을 규명하여 효소의 안정성을 검토한 후 식품으로서의 이용 이외에도 균사체 배양에 의한 혈전용해효소의 대량생산에 의해 의약품으로서 응용하기 위한 목적이 있다. 치마버섯을 이용한 혈전용해효소 생산최적조건을 검토한 결과 1.5% cornsteep liquor, 2% dextrose, 1.0% soytone, 그리고 initial pH6.0에서 배양온도는 25℃였다. 이러한 조건을 이용하여 150 ml/300 ml flask를 이용하여 배양한 결과 혈전용해효소는 균체 내보다 균체 외에서 약 6배나 많은 것으로 보아 본 버섯 균사체는 효소 분비력이 강한 것으로 나타났다. 균사체를 최적 배양생산 조건에서 접종하여 25℃, 80 rpm으로 8일간 배양한 후 원심 분리하여 균사체를 완전히 제거시키고 상등액만을 조효소액으로 사용하였다. DEAE Sephadex A-50 ion exchange column, Sephadex G-75 gel filtration column, 그리고 Sephadex G-50 gel filtration column chromatography를 수행하여 정제도는 약 67.2배 증가하였으며 약 2.8%의 수율을 보였다. 정제된 효소를 SDS-PAGE 상에서 perfect protein marker와 함께 전기영동 하여 단일 band를 얻었다. Coomassie 염색에서 정제된 혈전용해효소는 약 17.0kDa임이 확인되었고 zymography 상에서 fibrin이 분해되어 투명 환이 생기는 것을 알 수 있었다. 효소의 최적 pH와 활성온도는 각각 pH6과 45℃로 나타났고 pH는 산성에서는 대체로 안정하고 염기성에서는 약간 불안정하였으나 대체로 넓은 범위의 pH에서 안정하였으며 40℃까지 안정된 활성을 보였다. 또한 본 효소는 대부분의 금속이온에 의해 효소 활성이 약간 저해되거나 아무런 영향을 미치지 못하였으나 이중 Co^(2+)와 Zn^(2+)에 의해 효소 활성이 증가되었으며 Hg^(2+)대해서는 강하게 저해되었고 각종 protease inhibitor를 적용한 결과 EDTA와 phosphoramidon에 의해 현저하게 저해를 받는 것으로 보아 metalloprotease일 것으로 추측된다. 또한 다양한 protease 기질에 대한 분해 반응을 조사한 결과 fibrin에서 특이적으로 분해되었으며, red blood agar plate와 그 외 단백질 기질에 대해서는 분해반응이 일어나지 않았다. 특히 red blood agar plate 분해능에서도 확인되었듯이 적혈구 용해반응이 나타나지 않는 것으로 보아 혈관 내에서의 사용 가능성도 보여지고 있어 인체 내에서도 사용 가능하리라 추측된다. 혈전 분해능에 있어서도 plasminogen이 존재하는 fibrin plate에서는 fibrin을 분해하는 반면, plasminogen을 제거한 fibrin plate에서는 약한 활성을 보이는 것으로 보아 plasminogen activator type으로 추측되어진다. 그리고 tryptic digestion으로 부분적인 아미노산 서열을 분석한 결과 -SSLIEYYIVES-로 확인되었다. The diseases related to a circulation system of blood largely arise from blood clots, fibrin leading to thrombosis. The studies of fibrinolysis for their therapeutic purposes have extensively progressed. The current fibrinolytic drugs include urokinase from human urine, staphylokinase from Staphylococcus sp., streptokinase from Streptococcus haemolyticus, tissue plasminogen activator(tPA) from a malignant tumor melanoma cell. However, they showed significant side effects such as hemorrhage, short half-life and high cost. Recently, the studies for the safety of a fibrinolytic agent have been attracted to fermented soybean foods such an Doen-Jang and Chungkook-Jang. This presentation is a continued study of the previous reports, describing a fibrinolytic enzyme excreted during a liquid culture of an edible mushroom. To obtain an effective substance for prevention and treatment of treatment of blood circulation system-related disease, a fibrinolytic enzyme was produced by the liquid culture of mycelium of a mushroom Schizophyllum commune W130. The optimal culture conditions for the production of fibrinolytic enzyme was determined to be 1.5% corn steep liquor, 2% dextrose, and 1% soytone. Initial pH and temperature were pH6.0 and 25℃, respectively. The intramycelial production of the fibrinolytic enzyme by the culture of the Schizophyllum commune W130 mycelium was approximately 6-fold higher than the extramycelial production. The enzyme was purified by DEAE Sephadex A-50 ion exchange column chromatography, Sephadex G-75 and G-50 gel filtration column chromatography. Compared to the crude enzyme extract, the specific activity of the enzyme increased 67.2 fold with a recovery of 2.8%. Homogenously purified enzyme was confirmed by single-band on SDS-PAGE. The purified has approximate molecular weight of 17 kDa, and its activity was confirmed by zymography. The optimum pH and temperature for the enzyme activity was pH6.0 and 45℃, respectively. The enzyme activity was pH6.0 and 40°C and over a pH range of 3∼6. The fibrinolytic activity was increased by co^(2+) and Zn^(2+) while it was strongly inhibited by Hg^(2+). In addition, the enzyme was highly inhibited by EDTA, indicating that the enzyme is a metalloprotease. Very importantly, the fibrinolytic enzyme showed a strong substrate specificity for fibrin. Substrates except fibrin, such as the red blood agar plate and some other protease substrates, were not degraded up to 4 hrs at 37°C by the purified enzyme. We have identified a partial amino acid se quence of the purified enzyme, which is -SSLIEYYIVES-, by tryptic digestion.

혈전용해효소를 생산하는 미생물 및 효소에 관한 연구

김형욱 全州大學校 大學院 1996 국내석사

혈전 용해효소를 생산하는 미생물을 탐색하기 위해 장류(된장, 청국장, 고추장, 간장) 및 토양시료로부터 미생물을 분리하여 그 중 fibrin 용해활성이 높고 기질 특이성이 우수한 S7-16균주를 선발하였다. 선발된 미생물은 Gram 양성의 간균으로 운동성이 있고, catalase 양성이었으며 포자를 형성하는 것으로 관찰되어 Bacillus sp.로 동정하였으며 Bacillus sp. S7-16으로 명명하였다. Bacillus sp. S7-16의 효소생산조건을 검토한 결과, 0.5% polypeptone, 0.5% yeast extract, 0.3% NacCl, 0.1% KH_2PO_4,0.3% K_2HPO_4, 0.01% MgSO_4.7H_2O (pH 7.0)의 배지조성하에서 35℃, 180rpm에서 24시간 회전 진탕배양하였을 때 fibrin 용해효소 생산이 최대를 보였으며 이 때 casein 분해활성은 나타나자 않았다. Fibrin 용해효소의 효소적 특성을 조사하기 위해 이 조건하에서 얻어진 배양상징액에 20-60% ammonium sulfate 분획침전을 행하여 조효소액을 조제하였으며, 얻어진 조효소액은 pH4-11의 범위에서 안정하였으며, 50℃까지 비교적 활성이 유지되는 열안정성을 보여주었다. 효소활성의 최적 pH와 온도는 각각 7.4-7.8, 40℃이었다. 금속 이온의 영향을 검토한 결과, Mg^++과 Na^+ 이온에 의해 fibrin 용해활성은 약간 증가되었으며, Mn^++ 이온에 의해 fibrin 용해활성은 완전히 저해되는 특성을 보여주었다. A bacterium having a large of fibrinolytic activity, S7-16 strain, was screened and selected from soil. The selected bacterium was identified and named as Bacillus sp. S7-16. The optimal composition of the medium for the production of the fibrinolytic enzyme by Bacillus up. S7-16 was 0.5% polypeptone, 0.5% yeast extract, 0.3% sodium chloride, 0.1% KH_2PO_4, 0.3% K_2HPO_4, AND 0.01% MgSO_4 . 7H_2O. The optimum temperature and initial pH of the medium for the production of the enzyme were 35℃ and pH 7.0, respectively. The maximum production of the fibrinolytic enzyme was obtained after 24 hours of the incubation. During culture under the above conditions, the culture supernatant showed strong fibrinolytic activity, but almost no caseinolytic activity. Within pH4-11, the crude fibrinolytic enzyme was stable. The enzyme was stable up to 50℃, but was inactivated above 60℃. The optimum pH and temperature for the enzyme activity were around 7.5 and 4.0℃, respectively. The enzyme activity was increased by Mg^2+ and Na^+ ions, but slightly inhibited by Cd^2+, Cu^2+ and completely by Mn^2+ ions.

Property of a Fibrinolytic Enzyme Produced by Bacillus amyloliquefaciens CH86-1 Isolated from Cheonggukjang

이애란 경상대학교 대학원 2009 국내석사

청국장에서 분리한 Bacillus amyloliquefancies CH86-1의 혈전용해특성을 규명하고, 혈전용해유전자를 순수 분리하는 것을 목적으로 하여 이 실험을 진행하였다. 일반적으로 Bacillus 균주배양에 사용되는 BHI, LB, NB, TSB 배지를 이용하여 Bacillus amyloliquefancies CH86-1를 배양하였고, 흡광도값을 측정한 결과 18시간이 경과하면서 다른 배지에 비하여 LB배지에서의 흡광도 값이 증가하였다. CH86-1을 다른 배지에서 배양하여 얻은 배양상등액을 Fibrin plate법을 이용하여 혈전용해능을 측정한 결과 역시 시간이 경과함에 따라 LB에서 역가가 높아짐을 알 수 있었다. 그래서 이 후의 실험은 Bacillus amyloliquefancies CH86-1을 LB 배지에 배양하여 실험을 진행 하였다. 시간대별로 배양한 배양상등액을 80% ammonium suifate 침전한 후 투석하고, 농축하여 SDS-PAGE와 fibrin zymogram을 실시한 결과 모든 시간대의 sample에서 약 200 kDa과 약 17 kDa 부위에서 혈전용해 역가를 보였고, 100시간 sample에서 약 25 kDa 부위에 고 역가를 확인하였다. Two-Dimensional Gel Electrophoresis (2D-gel)를 이용하여 시간대별로 변화하는 단백질 패턴을 확인한 결과 24시간 배양 sample보다 100시간 배양 sample에서 더 많은 spot을 확인 할 수 있었다. 2D-zymogram을 이용하여 혈전용해효소의 패턴을 알아본 결과 pH 7, 75 kDa 부위에서 혈전용해역가를 가지는 spot을 확인 할 수 있었으나 2D-SDS-PAGE gel상에서는 상응하는 부위에 spot를 확인 할 수 없었다. 혈전용해효소를 부분적으로 정제하기 위해서 3L의 LB배지에 Bacillus amyloliquefancies CH86-1을 배양한 후, 배양상등액을 80% ammonium suifate를 이용하여 침전하였다. 침전하여 얻은 단백질은 CM-Sephadex column chromatography 을 이용하여 1차 정제 하였고, 혈전 용해역가를 가진 fraction 만 모아 Phenyl-sephadex column chromatography를 이용하여 2차 정제 하였다. 각 정제 단계별로 회수한 fraction 중 혈전용해역가를 가진 fraction 만 모아 SDS-PAGE와 zymogram을 실시 한 결과 SDS-PAGE gel상에서는 약 27 kDa 부위에 정제된 뚜렷한 band를 확인 할 수 있었으나 zymogram gel상에서는 그 상응하는 부위에 혈전용해 band를 확인할 수 없었다. 정제된 약 27 kDa 부위의 band를 잘라 tandom mass 분석을 통해 아미노산 서열을 확인한 결과, gene bank에 등록된 Bacillus amyloliquefaciens FZB42 의 aprE 유전자와 동일한 것으로 동정 되었다. 정제된 혈전용해효소를 aprE86-1로 명명하였고, aprE86-1의 정제도는 약 26배 증가 하였으며, 회수율은 약 1.2% 였다. aprE86-1을 cloning 하기 위해 Bacillus amyloliquefaciens FZB42의 aprE 서열을 기초로 하여 PCR primer를 제작하였고, CH86-1 chromosome 을 이용하여 PCR 을 통해 예상되는 증폭산물의 크기인 1.5 kb DNA fragment 즉, aprE86-1 fragment 를 얻어 pGEM-T Easy vector에 ligation 시킨 후 E. coli DH5에 transformation 시켜 pTaprE86-1로 명명하였다.

제조의 血栓 溶解 酵素 分離 및 그 特性에 關한 硏究

홍시내 東國大學校 大學院 1996 국내석사

A thrombus is a mass formed from the constituents of the blood within the vessels or the heart during life. The process of its formation is known as thrombosis. It has been generally accepted that Holotrichia is an useful medicine for thrombosis. The fibrinolysis rate of Holotrichia extracts was concomitantly increased with incubation time. The maximum fibrinolytic activity of the extracts was detected after 52 days of incubation in 37℃. Heat and pH stabilities of the extract on fibrinolysis. is highly dependent on temperature. The optimum activity was observed in pH ranges between pH 4 and pH 12 at 37℃ Optimum pH of the crude enzyme activity was in ranges between pH 7.0 and pH 8.5, suggesting that pH range of the enzyme is relatively broad. On the other hand, when the various protease inhibitors available were, assayed, SBTI and aprotinin showed strong inhibitory effects on fibrinolytic activity of the crude enzyme preparation. However, DFP and t-AMCHA showed a little inhibitory effects, and no inhibitory effects were detected in PSMB and TLCK. These results clearly indicated that the fibrinolytic enzymes of Holotrichia extract are belonged to serine protease group. When fibrinolytic pattern of Holotrichia extract on fibrinogen using a scanning electron microscopy, it showed a partial erosive-shaped fibrinolytic pattern. After isolation of the fibrinolytic enzymes by column chromatography and electroelution, each enzyme was applied on SDS-PAGE and 3 protein bands having the fibrinolytic activity were detected with molecular weights of 30,000, 45,000 and 60,000 dalton, respectively. A thrombus is a mass formed from the constituents of the blood within the vessels or the heart during life. The process of its formation is known as thrombosis. Holotrichia is accepted useful medicine for thrombosis. The rate of fibrinolysis of Holotrichia extracts increase as incubation times. Especially 52 days, the effect on the extracts has an maximum increased fibrinolytic activity. Heat-and-pH-stability of the extract on fibrinolysis is relative to temperature. At 37℃, it has activating effect between pH 4 and pH 12. At higher temperature, especially 80℃, an excessive increase in temperature has a deactivating. effect on the extracts. Optimal pH of the extract on fibrinolysis is between pH 7.0 and pH 8.5, it is effective within a relatively broad pH range. In experiments of various inhibitors of Holotrichia extracts fibrinolytic activity, there are strong inhibitive effect on SBTI and Aprotinin, and a few inhibitive effect on DFP and t-AMCHA, no effect on PSMB and TLCK. Holotrichia extracts mixing with fibrinogen are observed Electron microscopy, it shows partially erosive-shaped fibrinolytic activity. In a SDS-PAGE of the extract having the fibrinolytic activity. three bands are found, protein 1, 2 and 3 having a molecular weight of 30.000, 45,000 and 60.000 Dalton.

Properties of a Fibrinolytic Enzyme produced by Bacillus amyloliquefaciens CH51 Isolated from Chunggukjang : 청국장으로부터 분리한 Bacillus amyloliquefaciens CH51이 생산하는 혈전용해효소의 특성

김경민 경상대학교 대학원 2008 국내석사

우리나라 전통발효 식품인 청국장으로부터 강한 혈전용해능을 가지는 Bacillus amyloliquefancies CH51을 분리하였다. CH51은 Baciilus 균의 배양에 사용되는 여러 배지들 중에서 TSB 배지에서 생육이 가장 우수하였고, 높은 혈전용해능을 나타내었다. CH51을 TSB 배지에서 배양하면서 세포외로 방출하는 혈전용해효소는 배양 상등액을 80% ammonium sulfate 침전으로 1차적으로 회수를 하였고, 다음 CM-sephadex ion-exchange column chromatography를 통해 부분정제를 하였다. 각 단계별로 회수한 효소들의 혈전용해 역가는 fibrin plate 법으로 측정하였다. SDS-PAGE와 fibrin zymography를 이용하여 혈전용해효소의 크기가 약 80, 90 kDa 인 것으로 확인되었다. 이 혈전용해효소를 동정하기 위해 tandem mass spectrometer analysis를 시행하였고, 그 결과 두 band 는 B. amyloliquefaciens FZB42 가 세포외로 방출하는 전체 383개의 아미노산으로 이루어진 27 kDa 크기의 AprE 효소로 동정이 되었다. CH51이 생산하는 AprE51을 부분정제한 후, pH 안정성을 측정하였다. 이 혈전용해효소를 암호화하는 aprE51 유전자는 PCR 방법을 통해 증폭을 하였고, 증폭된 산물은 pGEM-T vector 에 cloning 하였다. 이를 이용하여 유전자 sequencing을 하였고, 이를 토대로 발현되는 아미노산 서열을 확인하였다.

토양에서 분리한 Bacillus sp. WRD-1, WRD-2가 생산하는 Extracellular protease의 특성 및 혈전용해효소의 생산

옥민 東亞大學校 大學院 2000 국내석사

토양시료로부터 저온에서 높은 활성의 protease를 생산하는 미생물을 수십종 분리하였다. 산업적으로 우수한 균종을 선별하기 위하여 분리된 미생물중 protease활성과 성장속도면에서 가장 우수한 2균주를 선별하여 WRD-1, WRD-2로 명명 하였으며, 형태학적, 생화학적 및 생리학적 특성을 조사한 후 Bacillus sp.로 동정되었다. WRD-1 유래의 pretense는 20℃ 배양 및 pH 9.0에서 배양된 균주로부터 높은 활성을 나타내어 비교적 저온에서 높은 활성을 가지는 알칼리성 pretense로 판명되었고, protease생산을 위한 최적배양조건은 배양온도 10~4O℃, 초기 pH 6.0~8.0 및 배양시간은 10시간 이상으로 나타났다. WRD-1 유래의 protease 최적활성은 pH 9.0, 온도는 30℃였다. 이상의 결과에서 WRD-1 유래의 protease는 알칼리성의 특성을 가지면서 넓은 온도 범위에서 비교적 높은 활성을 가지고 있어 산업적으로 널리 사용하고 있는 세제용이나 피혁 가공시 이용될 수 있는 효소제개발에 우수하리라 판단되어졌다. WRB-2 유래의 pretense는 최적 pH 6.0, 최적온도가 40℃였고, pH 6~9일때 상대활성도는 70%이상을 나타냄 으로서 중성 protease로 판단하였다. protease생산을 위한 최적 배양조건은 초기 pH 6~8일 때 상대활성도가 80% 이상을 나타내었고, 배양 12시간째에 가장 높은 활성도를 나타내었다. Fibrin plate를 이용한 혈전용해능을 확인한 결과 높은 혈전용해능을 가지고 있었다. 이상의 결과로 WRD-2 유래의 pretense는 사람의 혈액 pH수준인 7, 체온 37℃로 대비하여 우수한 혈전용해제의 개발이 가능하리라 사료되어진다. In order to protease, psychrotrophiz abcterium which have enzyme activity at low temperature, was isolated by using unrichment culture from soil sample and identified as genus Bacillus sp. WRD-1. WRD-2 1. Characterization of extracellular protease was produced by Bacillus sp. WRD-1 Time of highest cell growth were 8 hours and the optimal initial pH of culture condition for enzyme was pH 7 and culture time 10 hours. Temperature range of high enzyme activity were 10∼40℃, The optimal pH and temperature for the enzyme activity were pH 9 and 30℃. 2. Characterization of extracellular protease was produced by Bacillus sp. WRD-2 Time of highest cell growth were 15 hours and the optimal initial pH of culture condition for enzyme was pH 6 and culture time 12 hours. Temperature range of high enzyme activity were 20∼50℃. The optimal pH and temperature for the enzyme activity were pH 6 and 40℃. Bacillus sp. WRD-2 which produces a novel protease with fibrinolytic enzyme activity.

Enterococcus faecalis BRCA-5 가 생산하는 혈전용해 효소에 관한 연구

심관섭 연세대학교 대학원 2002 국내석사

Enterococcus faecalis BRCA-5, which produces a fibrinolytic enzyme, was screened from a fermented-soybean sauce. The enzyme was purified from culture broth of E. faecalis BRCA-5 using the ammonium sulfate fraction and phenyl sepharose 6 Fast Flow chromatgraphy. The SDS-PAGE analysis revealed that the purified enzyme, named tempase, was found to have a molecular weight of 38 kDa. The enzyme displayed a very broad optimal pH and its pI value was 4.8. Tempase was easily inhibited by metal-chelating agents, but not by serine protease inhibitors, suggesting that the enzyme belongs to a member of metalloenzyme family. Among several human plasma proteins tested as possible substrates for the protease reaction, the tempase hydrolyzed specifically fibrin and fibrinogen without affecting other proteins such as serum albumin, plasminogen, plasmin, thrombin and urokinase. The N-terminal amino acid sequence of 19 residues, Val - Gly - Ser - Glu - Val - Thr - Leu - Lys - Asn - Ser - Phe - Gln - Val - Ala, had 98% homology with that of coccolysin(EC 3.4.24.30). The mature protein-coding region was amplifed by PCR and cloned into the pET22b vector, and the resulting plasmid was used to transform BL21(DE3) Escherichia coli cell. The gene encoding this tempase was cloned and sequenced. Culture of the transformants at 37℃ led to the overexpression of an insoluble and inactive 38 kDa protein after 1.0 mM IPTG induciton./ 혈전용해 활성이 우수한 균주를 분리하기 위하여 국내외 전통 발효식품 76종을 수집하여 fibrin plate method를 통한 혈전용해 활성을 탐색하였다. 그결과 발효식품 5종에서 혈전용해 활성을 가지는 균주 14종을 분리하였고 그 중 상대적으로 활성이 좋은 6종의 균주를 대상으로 한 실험을 통하여 최종적으로 혈전용해 우수 균주를 선정하였다. 선정된 균주는 형태학적, 생리학적, 분자생물학적 특성을 조사한 결과 Enterococcus faecalis로 동정되어 안전성이나 식품 공전의 허가사항 등에 매우 적합한 균주로 판명되었다. 이 균주는 M17배지에 1% glucose를 첨가한 배지에서 최대성장 및 최대 활성을 나타냈으며 혈전용해활성은 배양시간 2시간부터 균체생육과 동시에 급격히 증가하였다. 이 균주가 생산하는 혈전용해효소는 배양상등액으로 부터 ammonium sulfate 침전법, phenyl sepharose 6 fast flow로 분리·정제하였으며, 이 효소를 tempase라 명명하였다. Tempase는 50℃미만에서 최대활성을 나타내며, pH는 7.0-9.0에서 최적활성을 나타내었다. Protease inhibitor에 의한 효소활성억제 결과 EDTA에 의해 억제되어 metalloprotease로 판명되었다. 주요 혈장단백질에 대한 영향 조사결과 fibrinogen과 fibrin에만 특이적으로 반응한 것으로 판명되었다. Tempase의 N-terminal 아미노산 배열을 분석하여 19잔기의 아미노산 배열을 결정하였고, 이를 SWISS - PROT program을 통하여 분석한 결과 E. faecalis가 생산하는 coccolysin (EC 3.4.24.30)과 98%의 상동성을 나타내었다. 이 아미노산 배열부터 primer를 제작하여 E. faecalis BRCA-5 genomic DNA를 주형으로 PCR을 수행하였으며, DNA 염기서열을 결정, 분석하였다. PCR product를 pGEM T-easy vector를 이용 cloning 하고 이를 pET22b(+) expression vector에 lig

Studies on Function and Activity of Fibrinolytic Enzymes from Bacillus spp. and Staphylococcus sp. Strains : 바실러스 균주와 스타피로코커스 균주로부터 분리한 혈전용해효소의 기능 및 효소활성에 대한 연구

Choi, Nack-Shick 忠南大學校 大學院 2005 국내박사

Bacillus 균주와 Staphylococcus 균주들로부터 5 종류의 세포외 혈전용해효소 (2종류의 스브틸리신, Vpr, peptidase T, and AJ)를 분리하고 이들효소의 기능을 특성화하였다. 첫째, Bacillus sp. DJ-4로부터 우수한 혈전용해능을 가진 스브틸리신 DJ-4를 분리하였다. 스브틸리신 DJ-4의 유전자를 증폭한 후, 이 유전자의 nucleotide와 아미노산 서열을 결정한 결과, B. amyloliquefacens에 의해 분비되는 스브틸리신 BPN’과 79%의 유사성을 보였다. 대장균을 통해 전체- 스브틸리신 DJ-4와 성숙-스브틸리신 DJ-4를 발현시킨 후, 이들의 혈전용해능 및 플라스미노겐 활성인자 효과를 연구하였다. 재조합 전체-스브틸리신 DJ-4의 경우, Bacillus sp. DJ-4에 의해 자연적으로 분비되는 스브틸리신 DJ-4와 비교했을 때, 열 (60oC)과 산성조건 (pH 3.0-4.0)에서 보다 높은 안정성을 보였다. 재조합 전체-스브틸리신 DJ-4의 플라스미노겐 활성인자 효과는 플라스민 보다 2.75배의 높은 활성을 나타내었다. 그리고, 기질 특이성 (카제인 분해능에 대한 혈전분해능)을 스브틸리신 BPN’와 스브틸리신 Carlsberg등과 비교한 결과, 각각 2.67배와 3.97배의 높은 기질 특이성을 보였다. 재조합 성숙- 스브틸리신 DJ-4은 사람 섬유소 단백질의 구성 성분인, Aα-, Bβ-, 그리고 γ-사슬,을 5분내에 모두 분해하였다. 그러나, 아주 낮은 농도 (50ng)에서는 스브틸리신 BPN’와는 달리 γ-사슬은 분해하지 않았다. 반면에, 재조합 성숙-스브틸리신 DJ-4의 경우는 효소활성이 없었다. 재조합 스브틸리신 (스브틸리신 BPN’와 Carlsberg)의 효소활성을 확인하기위해, 서로 다른 zymography 방법, SDS-fibrin zymography (SDS-FZ), reverse fibrin zymography (RFZ), 그리고 isoelectric focusing-fibrin zymography, 을 사용하였다. 재조합 스브틸리신 BPN’와 Carlsberg의 경우, Laemmili 완충용액 조건에서는 분해 젤 상으로 이동하지 않고 젤 상단 부분에 걸려 있는 “binding mode”를 형성하는 것을 SDS-FZ와 RFZ 방법을 통해 알았다. 이런 문제를 3에서 10의 pH 범위를 가진 IEF-FZ 방법을 이용함으로써 해결할 수 있었다. 둘째, Bacillus subtilis KCTC 3014의 배양액으로부터 세 종류의 세포외 효소 (Vpr, PepT, 그리고 스브틸리신)을 확인하였다. 세 종류 모두 DEAE-셀룰로즈 음이온 교환수지를 이용하여 성숙된 단백질 형태로 부분적으로 분리 되었다. Zymography와 밀도측정계를 이용하여 그들의 효소활성을 측정하였다. Vpr과 PepT 단백질의 상대적인 분자량은 SDS 젤과 zympgraphy를 이용하여 각각 68과 48 kDa으로 결정되었다. 하지만, 스브틸리신의 경우, 분해 젤의 상단 부위에 “binding mode”를 형성하였다. 100oC에서 5 분간 변성한 후, 스브틸리신의 분자량을 29 kDa로 결정할 수 있었다. 반면에, 효소활성은 띄지 않았다. Vpr, PepT, 그리고 스브틸리신의 효소활성의 최적 pH는 각각 9.0, 6.0-7.0, 그리고 7.0-8.0 이었다. 그리고, 최적 온도는 각각 40, 50, 그리고 40oC 였다. 효소 저해제 실험결과, Vpr과 스브틸리신은 serine계 효소, 그리고 PepT는 metal계 효소로 분류되었다. 세 종류의 유전자, vpr, pepT, 그리고 apr (스브틸리신을 인지하는 유전자)를 증폭하여 그들의 nucleotide와 아미노산 서열을 결정하였다. 마지막으로, 한국의 젓갈로부터 분리한 Staphylococcus 균주로부터 새로운 혈전용해효소 (AJ)를 분리하였다. AJ 단백질의 상대적인 분자량은 SDS 젤과 zympgraphy를 이용하여 26 kDa으로 결정되었다. AJ의 효소활성의 최적 pH와 온도는 각각 2.5-3.0과 85oC 였다. AJ를 100oC에서 20 분간 가열한 후 효소 활성을 측정한 결과, 초기 활성의 85%를 유지하였다. AJ는 사람 섬유소 단백질의 구성 성분인, Aα-, Bβ-, 그리고 γ-사슬 중, Aα-사슬만 선택적으로 분해하였다. 이 결과는 AJ의 경우 α-fibrinogenase 계열에 속하는 단백질을 의미한다. 효소 저해제 실험결과, AJ는 serine계 효소 저해제인 diisoproryl fluorophosphate에 의해 효소 활성이 저해되는 즉, AJ는 serine계 효소로 분류되었다. 흥미로운 것은, AJ는 강산 조건 및 100oC에서도 아주 안정성을 보였다. 반면에 중성과 알칼리 조건에서는 쉽게 분해되는 특징을 보였다. 특히, pH 7.0에서 8.0 범위에서는 효소활성을 가진 dimer 형태를 이루었다. 현재까지 AJ와 같은 강산과 열에 대한 안정성을 가진 혈전용해효소에 대한 내용은 보고되어 있지않다. Five extracellular fibrinolytic enzymes (two subtilisins, Vpr, peptidase T, and AJ) from Bacillus spp. Strains and Staphylococcus sp. strain were isolated and their enzymatic properties were characterized. First, we purified a strong fibrinolytic enzyme (subtilisin DJ-4) from Bacillus sp. DJ-4 and characterized its enzymatic activity. We cloned the gene subtilisin DJ-4, and determines its nucleotide sequence, which showed 97% identity with subtilisin BPN’ from B. amyloliquefacens. Recombinant full-subtilisin DJ-4 (rf-subDJ-4) and mature-subtilisin DJ-4 (rm-subDJ-4) were expressed using a pET29 vector system, and their fibrin(ogen)olytic and plasminogen activator activities were studied. Rf-subDJ-4 was found to have a higher stability to heat (60oC) and to acidic conditions (pH 3.0-4.0) than the native subtilisin DJ-4 of Bacillus sp. DJ-4. The plasminogen activator activity of rf-subDJ-4 was 2.75 times greater than that of plasmin on a molar basis. And its specific activity (F/C, the ratio of fibrinolytic activity to caseinolytic activity) was 2.67 and 3.97 times higher than those of subtilisin BPN’ and subtilisin Carlsberg, respectively. Rf-subDJ-4 rapidly hydrolyzed the Aα-, Bβ-, and γ-chains of fibrinogen within 5 min. But, unlike subtilisin BPN’ at a very low concentration (50 ng), the γ-chain was not cleaved. On the other hand, rm-subDJ-4 did not show enzyme activity. To identify the activity of recombinant subtilisins (subtilisin BPN’ and subtilisin Carlsberg), three different zymography methods, SDS-fibrin zymography (SDS-FZ), reverse fibrin zymography (RFZ), and isoelectric focusing-fibrin zymography (IEF-FZ), were used. The recombinant subtilisins BPN’ and Carlsberg did not migrate into the electrophoretic field based on a Laemmili buffer system, instead forming a “binding mode” at the top part of the separating gels with the SDS-FZ and RFZ techniques. This problem was resolved when using IEF-FZ with a pH range from 3 to 10. Secondly, three extracellular proteases (Vpr, peptidase T, and subtilisin) from the culture supernatant of Bacillus subtilis KCTC 3014 were identified. All proteins were partially purified by using a DEAE-cellulose ion exchange column chromatography as a mature form. Their activities were determined by using zymography and densitometer. The relative molecular masses of Vpr and peptidase T (PepT) were determined to be 68 and 48 kDa by SDS-PAGE and zymography, respectively. However, subtilisin formed a “binding mode” at the top part of the separating gel. After denaturation by boiling at 100oC for 5 min, its molecular mass was determined to be 29 kDa, whereas its activity was disappeared. The optimal pH of Vpr, PepT, and subtilisin were at pH 9.0, 6.0-7.0, and 7.0-8.0, respectively. And, the optimal temperature of Vpr, PepT, and subtilisin were exhibited at 40, 50, and 40oC, respectively. With inhibitor test, Vpr and subtilisin were classified as a serine protease, and PepT was a metalloprotease. Three genes, vpr, pepT, and apr (encoding subtilisin protein), were cloned and their nucleotide and deduced amino acid sequences were determined. Lastly, a new fibrinolytic enzyme, designated as AJ, was purified from Staphylococcus sp. strain AJ screened from Korean salt-fermented Anchovy-jeot. Relative molecular weight of AJ was determined as 26 kDa by using SDS-PAGE and fibrin zymography method. AJ exhibited optimum pH and temperature at 2.5-3.0 and 85oC, respectively. AJ kept 85% of the initial activity after heating at 100oC for 20 min on the zymogram gel. It cleaved the Aα-chain of fibrinogen but did not affect the Bβ-and γ-chains, indicating that AJ is a α-fibrinogenase. The fibrinolytic activity was inhibited by diisopropyl fluorophosphate, indicating AJ is a serine protease. Interestingly, AJ was very stable at acidic condition and heat (100oC), whereas it was easily degraded at neutral and alkaline conditions. In particular, in the pH range from 7.0 to 8.0, AJ formed a dimer, showing an activity on SDS gel and fibrin zymogram gel. AJ showed an exceptional activity at extremely low pH and was thermoacid-stable. To our knowledge, a similar combination of acid and heat stability has not yet been reported for other fibrinolytic enzymes.

청국장에서 分離한 Bacillus sp.가 生産하는 血栓溶解酵素의 特性에 關한 硏究

김용택 世宗大學校 1995 국내박사

Bacillus subtilis BK-17을 이용한 혈전용해효소의 생산

최원아 부산대학교 대학원 1998 국내석사

The production of fibrinolytic enzyme from Bacillus subtilis BK-17 was studied in flask and bioreactor. In the flask culture, soybean flour was the best nitrogen source and the concentration of 1.5% gave the best enzyme production. For carbon source and inorganic salt, 0.5% D-glucose and 0.05% Na_(2)HPO_(4)gave the best enzyme production. Optimal temperature and initial pH were 37℃ and 9, respectively. Enzyme production was greatly enhanced with increasing agitation speed in the range of 100∼300rpm or decreasing flack working volume in the range of 25∼100ml. the maximum enzyme production under tne optimal flask culture condition was 1200 unit/ml with urokinase as the standard. In the bioreactor culture, cell growth, enzyme activity, glucose concentration, pH and DO were monitored. With proper preculture no lag phase was observed in cell growth. During exponential phase, DO and pH rapidly decreased and then slowly slowed down. The enzyme production started at last exponential phase and continued for 5∼6hr. During this production period rapid glucose consumption was observed. When the medium concentration was increased by two- or three-fold the enzyme production was increased. With high glucose concentration, agitation speed and air flow fate, enzyme production was enhanced. The maximum enzyme production under the optimal bioreactor culture condition was 1050 unit/ml and some further investigation was needed to enhance the enzyme production.