Tandem Duplex dPCR 및 ID-LC-MS/MS을 이용한 DNA 정량 분석

김지현 과학기술연합대학원대학교 2020 국내석사

Tandem Duplex dPCR 및 ID-LC-MS/MS을 이용한 DNA 정량 분석 DNA 총량을 측정하게 될 경우는 질병 진단이나 식품 위생, 제약이나 생화학적 연구 분야 등 여러 분야에 이용된다. 일반적으로 사용되는 DNA 정량 방법은 UV 흡광도와 형광 측정에 기반을 둔다. 또한 DNA를 쪼갠 단위체인 뉴클레오타이드나 인이 제거된 뉴클레오사이드의 경우 LC-MS로도 측정이 가능하다. 이 논문에서는 DNA 정량 방법으로 형광을 측정하는 PCR 기법인 탠덤 듀플렉스 디피시알과 뉴클레오사이드를 측정하는 ID-LC-MS/MS를 이용하였다. 기술된 DNA 정량 방법 중 탠덤 듀플렉스 dPCR은 뉴클레오소머 DNA 잘린 부분 관측과 DNA 정량을 동시에 가능하게 하며, DNA 정량은 잘린 위치와 무관하게 될 수 있다 예측하였다. 질량 분석은 내부 표준 물질인 안정 동위원소가 표지 된 DNA를 통해 바이오 의약품 내 잔류 DNA를 측정하였으며, 기존에 보정이 불가능했던 DNA 추출 효율을 포함하여 보정된 값으로 DNA 정량이 가능하게 하였다. 세부 1. 탠덤 듀플렉스 디피시알을 이용한 잘린 위치와 무관한 뉴클레오소머 DNA 정량 뉴클레오소머 DNA는 DNA 형태 중 하나로 크기는 140-160 베이스 페어이다. 이는 피나 체액 등에서 나타나기에 암을 검진하는 액체 생검 시료로 이용되거나, 다운 증후군 등을 검진하는 비침습성 산전 검사에서 이용되는 시료이기도 하다. 뉴클레오소머 DNA는 일정하게 잘려 있으나, 기존 PCR의 경우 뉴클레오소머 DNA의 잘린 부분에 PCR의 프라이머나 형광을 표지 하는 프로브가 있을 경우 아예 PCR이 되지 않아 정보를 얻기 어려웠다. 또한 PCR이 잘 되는 자리가 잘린 부분에 위치할 수 있다는 문제점 또한 있었다. 따라서 본 논문에서는 뉴클레오소머 DNA가 잘려 있는 자리와 상관없이 PCR을 진행했을 경우 정량이 가능한 피시알을 탠덤 듀플렉스 디피시알로 명명하고, 이를 검증하였다. 첫번째로 탠덤 듀플렉스 디피시알은 플라스미드 내에서 검증하였으며, 두번째로 세포와 피에서 분리된 백혈구에서 뉴클레오소머 DNA를 이용하여 정량이 되는 지를 확인하였다. 탠덤 듀플렉스 디피시알에서는 뉴클레오소머 DNA를 모사하기 위해 플라스미드 내에 연달아 80bp 길이로 만든 뒤 형광이 FAM과 HEX로 다르게 표지 되도록 계획하였다. 또한 잘린 위치가 특정된 플라스미드에서 먼저 검증 후 이들을 모두 섞은 플라스미드 혼합 시료를 사용하여 정량 법을 검증하였다. 잘린 위치가 특정된 플라스미드에서는 제한 효소로 잘린 위치를 따라 형광이 특정하게 나타나는 현상을 관측하였으며, 정량을 직접 형광을 재는 카운팅 기법과 비교 확인하였을 때 80-90%임을 확인하였다. 또한, 특정 위치가 잘린 플라스미드들을 모두 섞은 혼합 시료의 경우, 정량 성을 카운팅 기법과 함께 보정하면 마찬가지로 80-90%로 되는 모습을 관측하였다. 다음으로, 세포 및 피에서 분리된 백혈구에서 추출한 뉴클레오소머 DNA를 시료로 이용하였다. PCR 유전자로는 수많은 후보군 중 염색체 21번에 위치한 RCAN1을 선택했다. 세포에서는 뉴클레오소머 DNA로 예상되고 일정하게 형광 패턴이 나오는 모습을 확인하였으나, 형광 측정 시 시료 내에서 300-500 베이스 페어가 있어 150 베이스 페어 크기의 뉴클레오소머 DNA를 정확히 정량 하기란 어려웠다. 백혈구에서 추출한 뉴클레오소머 DNA를 정량할 때 예상된 DNA 카피 수를 계산하여 기준으로 선정하였고, 예상된 DNA 카피 수의 70-80%인 점을 확인하였다. 또한, 뉴클레오소머 DNA가 잘려 있는 위치를 형광의 유무로 파악하여 뉴클레오소머 DNA 특이적인 방법임을 확인하였다. 단, 제시된 탠덤 듀플렉스 디피시알은 세포에서 예상된 DNA copy가 70-80%가 되는 정량 기법이라고 할 수 있어 상대적인 정량법이라고 할 수 있다. 제안된 기술을 뉴클레오소머 DNA의 잘린 위치와 관계 없이 절대 정량법으로 활용하기 위해서는 DNA copy가 80-90% 이상으로 될, 조건에 맞는 유전자 및 프라이머를 찾는 연구가 추가 수행되어야 할 것으로 판단된다. 세부 2. 안정동위원소가 표지된 DNA를 내부 표준 물질로 활용하는 질량 분석 기술에 의한 의약품 내 잔류 DNA 정량분석 바이오 의약품은 효모, 바이러스나 다른 동물 세포 등 다양한 숙주세포에서 생산된다. 따라서 바이오 의약품 내에는 숙주세포 유래 잔류 DNA가 존재할 수 있고 이러한 잔류 DNA는 암이나 감염, 면역 조절 등에 문제를 일으킬 수 있는 것으로 우려되고 있다. 이러한 이유로 EU나 WHO, FDA에서 잔여 DNA 제한을 10 ng / dose 또는 100 pg / dose로 지정하고 있으며, 잔류 DNA를 측정하는 방법으로 qPCR 및 threshold 방법 등이 주로 이용된다. 잔류 DNA 정량을 위해서는 시료 로부터 DNA를 추출 및 정제하는 과정이 반드시 필요한데 이 과정은 추출 및 정제 방법, 키트, 시료 특성에 따라서 변동성이 매우 높다. 기존의 잔류 DNA 측정 방법에서는 변동성이 높은 추출 및 정제 효율을 정확하게 측정하거나 보정할 수 없기 때문에 ‘추출된 DNA 양’이 아닌 ‘바이오 의약품 내 잔류하는 DNA 양’을 정확하게 측정하는데 어려움이 있다. 우리는 이 문제를 해결하기 위해 안정동위원소 표지 DNA를 내부표준물질로 활용하는 질량분석기술을 제안하였다. 안정 동위원소 표지 DNA 내부표준물질은 시료 DNA와 DNA 표준물질의 양을 비교할 때 질량 분석의 공통 분모로 활용될 뿐만 아니라 추출, 정제, 가수분해 및 질량분석으로 이루어지는 정량분석 전 과정의 변동성과 편향성을 보정하는 기능을 할 것으로 예측되었다. 제안한 방법의 유효성을 검증하기 위해 바이오 의약품에 활용되는 버퍼 용액에 알고 있는 양의 인간 DNA, E. coli DNA 및 단일 가닥의 M13 DNA를 0.2 – 20 ng/dose가 되도록 첨가하여 가상의 바이오 의약품 시료를 제조한 후 제안된 방법으로 잔류 DNA 양을 측정하였다. 가상 시료와 DNA 표준 물질에 안정동위원소 표지 DNA를 내부표준물질로서 동량 첨가한 후 DNA 추출 및 정제, 효소 가수분해 및 질량 분석을 수행하였다. 분석 결과 안정동위원소표지 DNA를 내부표준물질로 이용하는 질량분석에서는 변동성이 높은 추출 및 정제 효율이 효과적으로 보정되기 때문에 정확한 잔류 DNA 정량 분석이 가능하다는 것을 알 수 있었다. 단, 현재 활용되고 있는 DNA 추출 및 정제 효율과 질량 분석 기술의 검출 한계에 의해 0.2 ng 이하의 잔류 DNA에는 제안된 기술이 적용되기 어려운 점을 확인하였다. 따라서 제안된 기술을 바이오 의약품 내 잔류 DNA 정량 분석에 효과적으로 활용하기 위해서는 정량 분석의 한계를 더 낮추는 연구가 추가 수행되어야 할 것으로 판단된다. DNA quantification approaches have potential for using in various fields like diagnosis, safety of food, medical and research. Most common DNA quantification methods used base with fluorometric measurement and UV absorbance. DNA can be measured as monomer like nucleotide or nucleoside which remove phosphate in nucleotide structure. This study describes ‘Tandem duplex dPCR(TddPCR)’ and ‘ID-LC-MS/MS’ in nucleic acid quantification methods. Among the described DNA quantification approaches, TddPCR enables simultaneous observation of nucleosomal DNA truncation sites and DNA quantification, and predicts that DNA quantification may be independent of the truncated position. On the other hand, ID-LC-MS/MS method describe the quantification of residual host DNA in biopharmaceutical with stable isotope labeled DNA(SILD), and normalized with purification efficiency by SILD. Part 1. Fragmentation-free DNA quantification with Tandem duplex DNA Nucleosomal DNA(nDNA) is a DNA type and size is about 140 to 160 base pairs(bp). Also, it appear any site like blood, saliva or amniotic fluid. Nucleosomal DNA can act as sample on liquid biopsy which can detect disease like cancer, and on NIPT(Non-invasive Prenatal testing) that detect down syndrome, and other chromosomal defects. Nucleosomal DNA is constantly cleaved structure, but in case of conventional PCR, it is hard to obtain information because it was not PCR at all if there was a primer or probe in the truncated region. In addition, there was also a problem that site where the PCR is well can be located in the cut portion. Therefore, in this paper, when PCR was performed irrespective of where the nDNA a quantifiable PCR was named as TddPCR and verified. First, the TddPCR was validated in plasmid. Second, it was quantified and validated using nDNA from cells and leukocytes isolated from blood. TddPCR designed successively 80 bp in length with plasmid to mimic nucleosomal DNA, and the fluorescence was labeled differently with FAM and HEX to detect effectively by dPCR method in 2D amplitude difference. In addition, the quantitative method was verified using plasmid mixture sample in which all of them were first validated in a plasmid have a cleavage position specified. It was observed that fluorescence did not appear at the cleaved position with restriction enzyme in the truncated plasmid. Also, the TddPCR quantity was confirmed to 80-90% when compared with direct fluorescent counting method. On the other hand, it was observed similarly in mixed sample of plasmids, and the quantity was 80-90% at the same time. Second, nDNA extracted from white blood cell(WBC) that isolated from blood and cell was used as a sample. As a PCR gene, RCAN1 located on chromosome 21 was selected from numerous candidate groups. Specific pattern of fluorescence was confirmed in cell as nDNA, but when quantity measured, there are nDNA of 300-500 bp size in the sample so it was difficult to quantify accurately nDNA of 150 bp size. The expected copy number was concerned as reference for nDNA quantification, and it was 70-80% when compared with expected copy number. However, the TddPCR can be considered as a relative quantitative method because it can be said to be quantitative technique in which the measured copy is 70-80% comparing with expected. In order to improve this method as an absolute quantification method regardless of the position of the nDNA, it is considered that further research should be conducted like that meat proper conditions, where the DNA copy ratio will be 80-90% or more. Part 2. Quantification residual host DNA in biopharmaceutical by LC-MS with SILD as internal standard Biopharmaceuticals are produced from various hosts such as E. coli, yeast, virus, fungus and animals cells. Existence of residual host DNAs in biopharmaceutical have immune-regulatory, cancer and pathogenic danger. So EU, WHO, and the FDA have limitation for residual host DNA amount, lower than 10 ng or 100 pg / dose. The threshold assay and RT-qPCR are considered to be practical among the methods of detecting residual host DNA. DNA extraction and purification process is highly variable depending on extraction and purification methods, kits, and sample characteristics. Since the existing method of measuring residual host DNA is not be able to accurately measure or correct the efficiency of extraction and purification with high volatility, it is difficult to accurately measure the amount of DNA remaining in the biopharmaceutical rather than the amount of extracted DNA. To solve this problem, we proposed a mass spectrometry technique that uses stable isotope-labeled DNA as an internal standard. Stable isotope-labeled DNA internal standard is used as a common denominator for mass spectrometry when comparing the amount of sample DNA and DNA standard. It was expected to function as a correction. To verify the effectiveness of the proposed method, add a known amount of human DNA, E. coli DNA, and single-stranded M13 DNA to a buffer solution used in biopharmaceuticals to be 0.2 – 20 ng / dose, and then add a hypothetical biopharmaceutical sample. After preparation, the amount of residual DNA was measured by the proposed method. Stable isotope-labeled DNA was added to the virtual sample and the DNA standard as an internal standard, and then DNA extraction and purification, enzyme hydrolysis, and mass spectrometry were performed. As a result of the analysis, the mass spectrometry using stable isotope-labeled DNA as an internal standard was found to enable accurate quantitative analysis of residual DNA because the highly variable extraction and purification efficiency is effectively corrected. However, it was confirmed that the proposed technique is difficult to apply to residual DNA of 0.2 ng or less due to the current extraction efficiency and purification efficiency currently used and the detection limit of mass spectrometry. Therefore, in order to effectively utilize the proposed technology for quantitative analysis of residual DNA in biopharmaceuticals, it is judged that further research to lower the limit of quantitative analysis should be performed.

Optimization of Gene Expression Analyses Using Quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction in Various Species

박상제 부산대학교 2013 국내박사

실시간 중합효소 연쇄반응(RT-qPCR)은 기존에 사용되던 PCR의 단점인 정확한 정량분석의 어려움을 극복하기 위해 만들어졌다. 핵산에 형광물질을 입히거나 형광 프로브 (probe)를 이용해 실시간으로 증폭되는 산물의 양을 측정함으로써 정확한 정량분석이 이루어지게 된다. 그렇기 때문에, 현재 유전자의 정량분석에 가장 널리 사용되고 있는 기법이다. 그러나 RNA 추출의 효율, 양, 질의 차이, 그리고 cDNA 합성과정에서 효소의 효율과 농도의 차이에 의해 정확한 정량분석이 저해되게 된다. 이를 최소화하기 위해 표준화(normalization)과정을 거치게 되는데, 어떤 조직에서든 발현량이 안정적인 유전자를 선정해 이 유전자의 발현량으로 목적 유전자의 발현 값을 나누는 것이다. 이 유전자를 기준유전자(reference gene)라고 하고, GAPDH, ACTB, B2M과 같은 house-keeping 유전자를 전통적으로 사용해왔다. 하지만 몇몇 연구에서 이들 유전자가 조직별, 종별, 그리고 처리하는 약물 등의 다른 실험 조건에 따라 발현량이 크게 차이 남으로써 정확하지 않은 정량 데이터 값이 도출되는 문제점이 대두되었다. 그래서 최근에는 여러 후보 house-keeping 유전자들 중에서 각기 다른 종, 조직 샘플, 실험 조건에 따른 최적의 기준유전자를 선정하는 연구가 지속적으로 증가하고 있다. 본 연구에서는 정상 개(dog)와 스트렙토조토신(streptozotocin)을 투여한 알츠하이머성 질환 모델인 게잡이 원숭이(crab-eating monkey)에서 다양한 목적 유전자의 정량값을 표준화 할 수 있는 최적의 기준유전자를 선정하였고, 더 나아가 게잡이 원숭이의 트랜스크립톰(transcriptome) 분석을 통해 얻은 데이터를 이용해 전통적인 house-keeping 유전자와는 다른 새로운 기준 유전자를 선정하였다. 또한 이들 기준유전자를 이용한 RT-qPCR 기법을 이용해 실험용 쥐(mouse)의 수정란의 발달 단계별 샘플에서 retromer 복합체의 발현량과 알츠하이머성 질환의 동물 모델인 게잡이 원숭이의 뇌 조직에서 알츠하이머성 질환과 연관된 유전자들의 발현량의 정량분석을 실시하였다. 개의 13개의 뇌 조직과 10개의 일반 장기 조직에서 가장 널리 사용되는 geNorm, NormFinder, BestKeeper의 세 가지 프로그램을 이용해 16개의 후보 house-keeping 유전자들 중 가장 적합한 기준 유전자를 선정하였다. 그 결과, 개의 뇌 조직에서는 RPS5 유전자가 일반 장기 조직에서는 RPL8 그리고 RPS5의 두 유전자가 최적의 기준 유전자로 선정되었다. 알츠하이머성 질환의 게잡이 원숭이 뇌 조직에서는 RPS19 그리고 YWHAZ 유전자가 가장 좋은 기준 유전자로 선정되었다. 또한 이 두 유전자를 이용한 APP와 TAU 유전자의 정량값과 가장 좋지 않은 기준 유전자를 이용한 정량값을 서로 비교해보았을 때, 정량 데이터 값이 크게 차이 나거나 전혀 다르게 나타나는 것을 확인하였다. 이것으로 올바른 기준유전자의 선정이 정확한 데이터 값을 얻고자 할 때 매우 중요한 과정임을 알 수 있었다. 최근에는 기존의 house-keeping 유전자를 대신해 마이크로어레이(microarray)나 트랜스크립톰 분석을 통해 새로운 최적의 기준유전자를 선정하는 연구가 증가되고 있다. 선행 연구에서 진행한 게잡이 원숭이의 트랜스크립톰 분석을 통해 13개 조직에서 일정하게 발현하는 상위 12개의 새로운 후보유전자와 4개의 기존 house-keeping 유전자를 선정하였고, 위의 세 가지 프로그램을 이용해 기준유전자를 선정하였다. 그 결과, 기존에 사용되던 GAPDH, ACTB, RPS19, YWHAZ 유전자는 좋지 않은 기준유전자로 판정되었고, ARL1, ARFGAP2, MRFAP1이 정량 데이터의 표준화에 가장 적합한 새로운 기준유전자로 선정되었다. Retromer 복합체(VPS26A, VPS26B, VPS29, VPS35, SNX1, SNX2 유전자와 그의 목적 수용체인 CI-MPR)의 발현량은 선행연구에서 선정된 PPIA, H2AFZ, HPRT1의 기준유전자를 이용해 정량분석을 하였다. 이들 유전자는 VPS26A를 제외하고 2cell에서 4cell 단계에서 발현이 줄고 이후 다시 증가하는 maternal–zygotic 발현양상을 보였다. 이 결과로 비추어 보아 이들 retromer 복합체는 착상 이후 단계에서 수정란의 발달에 주요한 역할을 할 것으로 보인다. 알츠하이머성 질환모델인 게잡이 원숭이의 뇌 조직에서 APP 대사-연관 유전자(ADAM10, ADAM17, BACE1, PSEN2, NCSTN, APH1A, PSENEN) 와 TAU의 과인산화-연관 유전자(CDK5, CDK5R1, CAPN1, AKT1, GSK3β) 의 정량분석을 진행한 결과, 이들 유전자의 발현량이 쐐기앞소엽(precuneus)과 후두부의 피질(occipital cortex)에서 정상 조직에 비해 크게 증가하는 것을 확인하였다. 이는 APP의 대사량 증가로 인한 Aβ와 단백질 키나아제의 활성증가로 인한 과인산화된 TAU가 증가되어 침착됨으로써 기억력장애나 인지기능의 이상 등의 알츠하이머성 질환이 유발될 것으로 보인다. 이번 연구를 통해 올바른 기준유전자의 선정이 목적 유전자의 정확한 정량분석에 있어 매우 중요한 과정임을 확인하였다. 또한 개와 게잡이 원숭이는 인간의 질환 모델로써 각광받고 있으며, 특히 신경퇴행성 질환의 연구에 많이 이용되고 있다. 따라서 이들 동물 모델을 이용한 다양한 유전자들의 정확한 정량분석에 본 연구는 매우 유용한 정보를 제공할 것으로 사료된다. To overcome the limitation of the reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) method for deducing gene expression levels through end-point analysis, reverse transcription quantitative real-time polymerase chain reaction (RT-qPCR) for deducing the expression level through start-point analysis was developed for accurate quantification of the target gene. This method combines RT-PCR and fluorescent detection techniques (e.g., SYBR Green I and TaqMan probe) to record the accumulation of products at each cycle of PCR amplification in real time. RT-qPCR is a widely used experimental method to measure mRNA expression levels due to its specificity, accuracy, and cost-effectiveness. However, a number of parameters such as different efficiency of RNA extraction, quality of extracted RNA, enzymatic efficiency in reverse transcription, and PCR efficiency could lead to erroneous conclusions due to the inaccurate quantification of gene expression data. To minimize this problem, normalization strategies have been used by comparing the expression level of the gene of interest to that of a constitutively expressed gene, which is termed the reference gene. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) and β-actin (ACTB) are commonly used reference genes in normalization procedure for the accurate quantification of target gene expression. However, these genes have been shown to have variable expression levels across tissue types, disease states, and experimental conditions. Therefore, there has been a consistent increase in studies of the selection of suitable reference genes corresponding to specific tissue types and experimental conditions for the acquisition of accurate and meaningful biological data. In the current studies, analysis for the selection of the most suitable reference genes was performed in the brain and whole body tissues of dog, and in brain tissues of intracerebroventricular streptozotocin (icv-STZ)-induced cynomolgus monkey (Macaca fascicularis). Moreover, novel reference genes were selected by large-scale transcriptome sequencing analysis in the whole body tissues of the cynomolgus monkey using the geNorm, NormFinder, and BestKeeper programs. As a results, the ribosomal protein-encoding genes RPS5 in 13 different brain tissues, and RPL8 and RPS5 in 10 whole body tissues, were selected as the most suitable reference genes among 16 candidate genes in dog, and RPS19 and tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan 5-monooxygenase activation protein ζ polypeptide (YWHAZ) were selected in the 2 matched-pair brain samples (5 regions) of control cynomolgus monkeys and those who had received intracerebroventricular injections of streptozotocin (icv-STZ). In addition, comparison of the normalization factors (NF) of RPS19 and YWHAZ (most suitable reference genes) with that of TATA-binding protein (TBP; inappropriate reference gene) in the quantification of amyloid precursor protein (APP) and microtubule-associated protein tau (MAPT) indicated that normalization using inappropriate reference genes could lead to misinterpretation of the target gene expression level. From the transcriptome sequencing analysis, ADP-ribosylation factor-like 1 (ARL1), ADP-ribosylation factor GTPase activating protein 2 (ARFGAP2), and morf4 family-associated protein 1 (MRFAP1) were selected as suitable reference genes, whereas traditionally used genes such as GAPDH, ACTB, RPS19, and YWHAZ showed the least stable expression in 13 whole body tissues of the cynomolgus monkey. These results indicated that large-scale analysis could be a valuable method for finding novel candidate reference genes. Finally, quantitative analysis was performed using RT-qPCR experiments with retromer complex-related genes (vacuolar protein sorting-associated protein (yeast) (VPS26A), VPS26B, VPS29, VPS35, sorting nexin 1 (SNX1), SNX2, and cation-independent mannose-6-phosphate receptor (CI-MPR)) in mouse oocytes and preimplantation embryos, and with Alzheimer’s disease (AD)-related genes such as APP pathway-related genes (ADAM metallopeptidase domain 10 (ADAM10), ADAM17, beta-site APP-cleaving enzyme 1 (BACE1), presenilin2 (PSEN2), nicastrin (NCSTN), anterior pharynx defective 1 homolog A (C. elegans) (APH1A), and presenilin enhancer 2 homolog (C. elegans) (PSENEN)) and TAU phosphorylation-related genes (cyclin-dependent kinase 5 (CDK5), CDK5R1, calpain 1, (mu/I) large subunit (CAPN1), v-akt murine thymoma viral oncogene homolog 1 (AKT1), and glycogen synthase kinase 3 beta (GSK3β)) in the brain tissues of icv-STZ-induced cynomolgus monkeys. These quantifications were normalized by the NF values of 2 or 3 selected suitable reference genes. All retromer complex-related genes showed maternal-zygotic expression patterns, except for VPS26A. From these results, retromer complex-related genes could have important roles during oocyte development. However, in the preimplantation stage, they did not have significant roles. APP pathway-related and TAU phosphorylation-related genes showed that their gene expression levels were significantly increased in the precuneus and occipital cortex, compared with other brain regions. These results indicated that Alzheimer’s disease could develop due to learning and memory impairment and cognitive dysfunction because of the accumulation of Aβ and phosphorylated TAU by increased APP metabolism and protein kinase activity. The dog and cynomolgus monkey are widely used as animal models for the investigation of various human diseases, particularly neurodegenerative diseases. Therefore, studies on the selection of suitable reference genes are essential for the accurate quantification of numerous target genes using these animals. This study could provide useful and meaningful information for future studies.

현대중국어 퍼지(Fuzzy) 언어의 정량분석 : 연령, 시간 지칭어와 색채어, 어림수를 중심으로

이리 동국대학교 2017 국내박사

在信息技术迅速发展的今天,“用数据说话”在学术研究中成了有利的“砝码”。在智能化时代的某些特定的领域,对语言精确度的“苛刻”要求,是必然的,也是必不可少的。换而言之,语言的形式化,数据化,定量化在智能时代,起着举足轻重的作用。 如何将“感性”的语言,定量成为“理性”的数据,便是本文的研究重点。本文设模糊语言学中的“模糊语”为研究对象,重点对年龄词、时间词、颜色词、概数词进行了定量分析。定量方法除了采用与统计学相关的内容之外,还采用了数学中的“隶属度”及物理学中的“光学”知识。所以本文不仅仅是语言学的范畴,还涉及到统计学、数学、物理学等跨学科领域。 定量的过程如下:首先,在语言学的范畴内,采用分析、归纳、统计等方法,对模糊语进行语言学视角的定量分析。在此基础上,在数学范畴内,采用隶属度计算的方法,对模糊语进行数学视角的定量分析。在定量过程中,我们会发现,并不是所有的模糊语都能通过数学隶属度的计算方法,就可以定量成功的。这就需要我们从其它的视角继续对此进行定量。即从物理学的视角进行定量。最后,我们对定量分析在计算语言学,应用语言学等领域的价值进行了论述。 需要强调的是,本文经过复杂的定量过程,最终得出的数据化结论固然重要。但比这个更有价值的是,利用数学,物理等理工学科的知识,对语言进行定量的这种新的研究视角和研究方法。结论有可能受各种因素的影响,而有所变化。但是方法具有“唯一”的特点,并适用于广泛的领域中。对模糊语言学中的模糊语进行定量分析的新方法,便是本文研究的核心内容。

실리콘 내 Boron 정량 분석

이상원 한서대학교 대학원 화학공학과 2010 국내석사

본 연구는 실리콘 내 boron 정량 분석을 하기 위한 전처리 과정을 수행하였다. 실리콘은 태양전지 및 태양광 모듈 부품 소재로써 현재 부각되고 있는 그린 에너지 산업의 주축이 되고 있으며, 실리콘에 포함된 boron 정량 분석의 중요성이 부각되고 있다. boron은 P형 실리콘 dopant 물질로써 life time 및 모듈 효율에 큰 영향을 미치고 있다. ICP-AES 분석 과정 중 전처리 공정을 통하여 boron 정량 분석 방법에 관해 연구를 수행하였다. 실리콘 내 boron 분석을 위한 전처리 과정에서 실리콘이 과다 포함된 경우 ICP-AES의 boron 파장 249.678nm, 249.773nm에서 matrix에 영향을 주어 실제 boron 측정 값 보다 높게 측정되는 결과를 얻었으며, 실리콘을 제거하여 분석을 진행 할 경우 boron의 휘발 특성으로 인해 boron이 소실되는 것을 확인하였다. Boron의 경우 상온 및 가열 상태에서 휘발되는 특성을 제어하기 위하여 마니톨(manitol)을 사용하였다. 마니톨은 boron을 흡착하여 산 용액 상태에서 녹아 ICP-AES 분석 중 boron 정량 분석에 중요한 첨가제로써 사용이 가능했으며, 마니톨에 대한 1차 오염이 boron 정량 분석에 영향을 미치지 않는 것을 확인하였다. boron 분석 과정 중 파장의 영향을 주는 실리콘을 SiF₄형태로 제거하고 휘발되는 boron을 제어하여 정량 분석이 가능하다는 결론을 얻었다. 실제 측정 데이터에서도 95%이상의 회수율을 보였으며 실험내용을 기반으로 실리콘 내 boron 정량 분석 방법을 확립하고 고찰하였다. This study was focused on the pre-treatment of silicon which was a basic major material for the solar cells and solar modulus to analyzer quantitative precise analysis of boron in silicon with the ICP-AES. Boron in silicon is a dopant material for making P type silicon and strongly influences solar module efficiency. when the pretreated sample for ICP-AES analysis contained silicon, 249.678nm, 249.773nm of boron wavelength in the ICP-AES affected matrix so that boron analysis value of the ICP-AES was measured higher than real boron measurement. And in the processing of pre-treatment for the complete removing silicon in the sample, it was found that boron also disappeared due to its volatility. It was found that it was very important to keep a boron without silicon in the processing of sample pre-treatment for precise analysis of boron. Therefore we tried to use manitol to control boron volatility not only at room temperature but also in the heating state. It was found that manitol played important role for the quantitative precise analysis of ICP-AES, because it adsorbed boron and was melted in the pre-treatment solution of strong acid and didn't affect boron analysis of ICP-AES. In this study, it was made the conclusion that it is possible quantitative precise analysis of boron was established by removing silicon that affected wavelength as the SiF₄ and by controlling volatile boron with the manitol.

Development of an Analytical Method of Acylcarnitines in Dried Blood Spot using LC-ID-MS/MS

박수정 과학기술연합대학원대학교 2019 국내석사

아실카르니틴은 선천성대사이상질환 중 지방산 대사이상질환과 유기산 대사이상질환의 진단에 중요한 바이오마커이다. 각 검사기관에서는 질병의 진단을 위한 독자적인 차단값 (cut-off value)을 설정하여 이를 판단기준으로 삼고있으며 선천성대사이상질환은 장애를 유발하고 갑작스러운 사망의 원인이 될 수 있기 때문에 빠르고 정확한 진단이 필요하다. 아실카르니틴은 극성이 다양하고 양쪽성이온이기 때문에 여러 아실카르니틴을 동시분석시 좋은 피크모양과 적절한 분리시간을 얻는데 어려움이 있으며, 건조혈액여지는 혈액이나 혈장과 같은 일반적인 검체보다 복잡한 매질의 형태로서 추출 및 분석에서 고려해야할 사항이 많다. 따라서 본 논문에서는 물리·화학적 성질은 동일하나 질량이 다른 동위원소 표지물질을 내부표준물질로 활용한 동위원소희석방법을 이용해 건조혈액여지 내 10종의 아실카르니틴을 액체크로마토그래피-탠덤질량분석기로 정량하는 분석방법을 개발하고 이를 검증하였다. 분석법 개발을 위해 유도체화 및 다양한 추출용매와 분리조건을 시도하였으며 최종적으로 80% 아세토나이트릴을 추출용매로 선택하고 20분동안 초음파처리하여 건조혈액여지로부터 분석대상을 추출하였다. 유도체화는 가수분해로 인한 위양성의 결과를 방지하기 위해 생략되었으며 분석은 HPLC-Q-TOF질량분석기를 활용하여 ZORBAX SB-AQ컬럼 조건에서 기울기용리를 이용하여 분리한후 ESI postive모드에서 질량 대 전하비가 85인 이온을 선택하여 정량분석하였다. 분석법 검증에서는 직선성, 정량 및 검출한계, 매트릭스효과, 정밀성, 정확성, 안정성을 평가하였다. 모든 아실카르니틴을 대상으로 0.9948이상의 높은 직선성을 보였으며 정량한계는 0.331-39.132 ng/mL, 검출한계는 0.109-12.914 ng/mL였으며 회수율은 85.4-115.8%, 변동계수는 3.5-15.0%였다. 일내 일간실험의 재현성에서는 변동계수가 각각 2.8-15.5%, 4.7-15.5% 임을 확인하였다. DBS를 대상으로 한 추가적인 검증에서는 스팟의 혈액용량 및 펀칭위치에 따른 차이와 스팟간 균질성을 확인하였다. 결과적으로 혈액용량 및 펀칭위치에 따른 차이는 최대 30.1%까지 정량적인 차이가 있음을 확인하였고 스팟의 균질성은 15.4%이내임을 확인하여 전체스팟(whole spot)을 대상으로 분석하였다. 이러한 결과에 의거하여 본고는 아실카르니틴 정량분석 방법의 개발과 검증을 통한 신뢰성있고 실현가능한 분석방법을 제시한다. Acylcarnitines can act as diagnostic biomarkers for newborn screening about disorders in fatty acid oxidation and organic acid metabolism. In this study, an analytical procedure of acylcarnitines in dried blood spot (DBS) was developed and validated. The extraction efficiency using protein precipitation method was highest in 80v/v% ACN solutions with sonication for 20 minutes. Ten acylcarnitines were analyzed using HPLC-ESI-QTOF MS/MS system under 0.1% formic acid-ACN gradient condition in AQ column, and monitored at product ions of m/z 85 in positive mode. The loss during sample preparation and mass analysis were compensated by isotope dilution method (ID-MS/MS). In the derivatization process, about 12-40% of acylcarnitines were converted to free carnitine during derivatization as butyl esters, therefore, this process was skipped in this study for accurate analysis. The validation parameter for linearity, LOQ, LOD, matrix effect, accuracy, precision and stability were assessed. The analytical method was found to be linear in all acylcarntines (0.9948-1.000). In recovery tests, the accuracies obtained from the tests were in the range of 85.4-115.8% and the coefficient variation percentage (CV%) did not exceed 15.0%. For interday and intraday assays, the precision (CV%) were in the range of 2.8-15.5% and 4.7-15.5% respectively. The additional validation for DBS was tested also for the influence of punch location and loading volume and homogeneity of sample spotting. The observed result in the amount of acylcarnitines were varied up to a maximum of about 30.1%, depending on the punch location and loading volume. The result in homogeneity test did not exceed 15.4% in precision between spots. Consequently, the whole spot DBS were analyzed in this method. The method used in this study is suitable for acylcarnitine quantitative analysis in DBS with the advantage of reliable analytical method.

Quantification of Microplastics using UV-VIS Spectroscopy

이하경 서울대학교 대학원 2021 국내석사

Microplastics are sorted as emerging contaminant which has possibility of human toxicity. Their large surface area occurs active surface reaction which can make them easily adsorb to other contaminants in the water. Also, they can be the media for the contaminant transport in the water. To deal with this issue, enough database about the amount of microplastics is essential for making proper solution. Hence, whole world is collecting microplastics quantification data from watershed, water treatment plants, and even from products with water. In line with this research trend, various quantification methods are studied but simple and convenient method is required. Therefore, this research selected UV-VIS spectroscopy which has quick and accurate analysis ability with easy operation. The objective of this research is to propose UV-VIS spectroscopy as a new and potential microplastics quantification method. First, proper suspension method investigation and surfactant determination for microplastics analysis were conducted. Among surfactants, TWEEN 80, a non-ionic surfactant could suspend microplastics in the water. Also, the absorbance change by microplastics themselves was not detectable alone. TWEEN 80 worked to detect microplastics as a base substance for UV-VIS analysis. It took the role of the analysis aid. Second, the calibration curve method was employed to validate UV-VIS specstroscopy as the microplastics quantification method. It was validated with five validation parameters(LOD and LOQ, linearity, accuracy, precision, and robustness). Also, it was confirmed that this method is applicable to the density same or less than 1g/cm3. Then, by comparison with (1)visual identification, (2)Q-(H)NMR, (3)gravimetric analysis as other potential microplastics quantification methods, its application possibility was investigated. In conclusion, UV-VIS spectroscopy can be an alternative microplastics quantification method with its simplicity and convenience. The simplicity and accuracy will save the analysis period which will contribute to faster solution making for microplastics issues. This method can further be developed by developing an analysis kit or find additional proper pre-treatment methods to increase its linearity. 마이크로플라스틱은 인체 독성 발현의 가능성이 있는 신종오염물질로 분류되고 있다. 마이크로플라스틱이 가지고 있는 넓은 표면적 때문에 수중의 다른 오염물질이 쉽게 부착될 수 있다. 이 특징에 의해 수중 오염물질의 이동의 매개체가 될 수 있다. 이러한 문제를 해결하기 위한 적합한 해결책을 제시하기 위해서는 마이크로플라스틱의 양에 대한 정확하고 충분한 데이터베이스가 필요하다. 따라서, 세계적으로 자연 수계, 수처리장, 그리고 액체를 담고 있는 제품들에서 검출이 되는 마이크로플라스틱의 정량 분석 데이터를 수집하고 있다. 이러한 연구의 흐름에 따라 다양한 정량 분석 방법들이 연구되고 있으나, 간단하고 간편한 방법이 요구된다. 따라서, 본 연구에서 빠르고 정확한 분석능력을 가지고 있으며 조작이 간단한 UV-VIS 분광법을 선정하였다. 본 연구의 목표는 UV-VIS 분광법을 새롭고 잠재적인 마이크로플라스틱 정량 분석 방법으로 제안하는 것이다. 먼저, 마이크로플라스틱 분석을 위해 적합한 분산 방법을 찾고 계면활성제를 선정했다. 연구에 사용한 계면활성제들 중 비이온성 계면활성제인 TWEEN 80은 마이크로플라스틱 분산을 시킬 수 있을 뿐만 아니라 분석 보조제로의 역할도 가능했다. 마이크로플라스틱은 그 자체만으로는 검출이 되지 않기 때문에 TWEEN 80이 마이크로플라스틱에의 흡착을 통해 검출이 가능하도록 했다. 다음으로, UV-VIS 분광법의 마이크로플라스틱 정량 분석 방법으로서의 유효성을 평가하기 위해 검량선법이 적용되었다. 이 분석법은 정량한계 및 검출한계, 직선성, 정확성, 정밀성, 그리고 완건성의 총 5개 유효성 검사 항목을 통해서 검증이 되었다. 또한 이 분석법은 밀도가 1g/cm3 이하이거나 비슷한 플라스틱 종들에 적용가능할만한 방법이라는 것이 확인되었다. 이후, 현미경법, Q-(H)NMR, 무게측정법의 다른 잠재적인 마이크로플라스틱 정량 분석 방법들과의 비교를 통해, UV-VIS 분광법의 적용 가능성을 파악했다. 결론적으로, UV-VIS 분광법은 그 간단하고 편리한 조작 및 분석의 특성을 살려 대체할만한 마이크로플라스틱 정량 분석법이 될 수 있다. 이러한 분석법은 분석 기간을 단축시킬 수 있으며, 이는 마이크로플라스틱 문제의 해결책을 보다 빠르게 제시할 수 있도록 해줄 것이다. 현재 입자 사이즈의 영향 고려 불충분 및 직선성 확보의 한계점을 가지고 있다. 이 문제를 해결하기 위한 향후 연구를 진행한다면 UV-VIS 분광법은 보다 완성도있는 분석법으로 자리매김할 것이다.

면 및 폴리에스터 직물에 처리된 형광증백제 분석 및 전이현상 연구

송현주 숙명여자대학교 대학원 2021 국내박사

There are several pretreated methods for textiles such as desizing, scouring and bleaching. However, these methods have a limitation in obtaining bright and vivid white color because of the yellowish pigment component of the fiber. Thus, Fluorescent Whitening Agents(FWAs) have been applied as an whitening agent. FWAs absorb UV range of 330 ~ 380 nm and emit light in the visible range of 400 ~ 450 nm. They are treated on the fibers in the same way as a dye to increase the surface reflectance for giving visual brightening effects. They are applied to various industries including paper, plastic and textile. However, there is a controversial issue the harmfulness of FWAs to human body. Despite of this issue, the standard analytical methods for FAWs in fibers have not reported yet. Therefore, the purpose of this study is to propose methods for qualitative and quantitative analysis of FWAs treated in fibers. In this study, FWAs were treated with various concentrations on cotton (C1, C2, C3) and polyester (P1, P2, P3, P4) fabrics, respectively. The fabrics treated with FWAs were analyzed through visual evaluation, surface reflectance, whiteness and fluorescence index(FI). The FWAs migrations were tested by rubbing, washing, and perspiration. The FWAs extract from the fibers was quantitatively analyzed with a spectrophotofluorometer. Results are as follows; The cotton fabrics treated with FWAs absorb UV range of 360 ~ 380 nm and reflect visible range of 420 ~ 460 nm. The maximum reflectance wavelength is 440 nm. The reflectance, whiteness and FI are higher as the concentration of FWAs increased. In d/8 type reflectance measurement, the reflectance of untreated cotton fabric is improved from 86.3% to 129.1% by FWAs treatment. The reflectance of polyester fabrics treated with FWAs is also increased by FWAs treatment. However, the reflectance does not increase anymore from the concentration of 0.6% or more for P2, and from the concentration of 0.4% or more for P1, P3 and P4. Depending on the reflectance measurement methods, d/8 or 45/0, the measured results are differentiated from 4.5% to 5.6%, so the reflectance is suitable only for qualitative evaluation of FWAs treated fabrics. As a result of the spectrophotofluorometer measurement, C1, C2 and C3 all have the same excitation wavelength of 330 nm and emission wavelength of 438 nm. Therefore, the same quantitative method can be applied to all three FWAs for cotton fabrics. FWAs (P1, P2, P3, P4) have an excitation wavelength of 370 nm. However, the emission wavelengths are different, 442 nm for P1, 490 nm for P2, 476 nm for P3 and 449 nm for P4. The calibration curve using 0, 5, 10, 20 and 40 mg/L solutions of FWAs (C1, C2, C3, P1, P2, P3, P4) shows a high linearity of R2 = 0.999. The Soxhlet-extracted FWAs from the fabrics shows a linear relationship with the FWAs concentration on the fabrics using spectrophotofluorometer. It is concluded that this method can be used as a quantitative analysis method for FWAs contained on fibers. FWAs migration routes are evaluated by rubbing, washing and perspiration. As a result of rubbing test, FWAs are migrated on both cotton and polyester fiber and more migration is observed as the treatment concentration increased. FWAs on cotton and polyester fibers is not migrated to untreated fibers under ISO 105-C06 A1S washing conditions. However, under C1S conditions, FWAs migrate to untreated cotton and polyester fibers. The migration does not occur by the both acid and alkaline sweat. This study proposes both qualitative and quantitative analysis methods for FWAs treated on fabrics. This study would be a fundamental data for the safety standards of FWAs treated fabrics. 섬유소재의 전처리 방법에는 섬유 자체에 남아있는 불순물과 색소를 제거하는 호발, 정련, 표백 등의 방법이 있다. 그러나 이러한 방법은 섬유의 황색 색소 성분들을 완전히 제거하기는 어렵기 때문에 밝고 선명한 흰색을 얻는데는 한계가 있다. 이러한 이유로, 섬유의 옅은 황색을 보완하여 섬유를 더욱 더 흰색으로 보이게 하기 위한 방법으로 형광증백제(Fluorescent Whitening Agents, FWAs)가 사용된다. 섬유용 형광증백제란 자외선영역(330 ~ 380 nm)의 파장을 흡수하고 가시광 단파장영역(400 ~ 450 nm)에서 이 광을 방사하는 화합물 중 섬유에 친화력을 가지는 염료들을 일컫는다. 즉, 염색과 같은 방법으로 섬유에 고착되어 단파장측 반사율을 높여주어 시각적인 증백효과를 부여하는 것이다. 형광증백제는 종이, 플라스틱, 섬유분야 등 다양한 산업에서 사용되고 있으며, 적용되는 용도에 따라 다양한 형광증백제의 개발 연구도 이어지고 있다. 그러나 형광증백제는 그 유해성에 대한 논란이 지속되고 있지만 지금까지도 안전성에 대한 명확한 근거가 없으며, 안전기준 또한 마련되어 있지 않은 실정이다. 특히 섬유 제품은 인체와 장시간 접촉되는 사용환경상의 특성을 고려하여, 이에 대한 안전기준 마련이 시급하다. 그러나 섬유에 처리된 형광증백제의 안정성과 그 함유량 등에 대한 연구는 미비하며, 섬유제품 내 형광증백제의 함유량을 정량하는 표준화된 분석 방법 역시 정립되지 않고 있다. 따라서 본 연구의 목적은 섬유제품에 처리된 형광증백제를 정성·정량적으로 분석하는 방법을 제안함으로써 향후 형광증백제 처리제품의 안전규제에 대비한 기초자료를 제시하고자 한다. 또한 반복사용 과정에서 형광증백제가 섬유 외부로 전이되는 과정과 그 정도에 대해 분석함으로써, 형광증백제 처리 소재의 사용에 대한 지침을 제시하고자 하였다. 이를 위하여 대표적 의류용 소재인 면 및 폴리에스터 직물에 형광증백제 7종(C1, C2, C3, P1, P2, P3, P4)을 농도별로 처리하였다. 형광증백제 처리 직물은 육안평가, 반사율 측정, 백색도, 형광지수 측정을 통해 검토하였다. 형광증백제의 전이현상은 마찰, 세탁 및 땀에 의한 전이여부를 평가하였다. 섬유에 함유된 형광증백제의 정량은 섬유로부터 추출한 형광증백제 추출액을 형광분광광도계로 분석하였다. 이상의 과정을 통해 다음과 같은 결론을 얻었다. 형광증백제 처리된 면직물은 360 ~ 380 nm 의 자외선을 흡수하고, 420 ~ 460 nm의 가시광선을 반사하는 반사율 곡선을 나타냈으며, 440 nm에서 최대 반사율을 보였다. 이러한 경향은 형광증백제 처리 농도가 높을수록 더 뚜렷하게 나타났으며, d/8 방식 반사율 측정 시, 미처리 면직물의 반사율이 86.3 %에서 형광증백 처리에 의해 최대 129.1 % 까지 향상되었다. 형광증백제 처리한 폴리에스터직물의 표면 반사율도 처리농도가 높을수록 증가되었다. 그러나 P2의 경우 처리농도 0.6 % 이상에서, P1, P3, P4의 경우 처리농도 0.4 % 이상에서는 더이상 반사율이 증가하지 않았다. 따라서 d/8 방식과 45/0 방식의 반사율 측정방법에 따라 반사율의 차이가 4.5 ~ 5.6 % 까지 발생하므로, 반사율 측정법은 형광증백제 처리직물의 정량분석법 보다는 정성평가에 활용가능한 것으로 확인되었다. 각 형광증백제 별 최대 여기파장 및 방사파장을 형광분광광도계로 측정한 결과 면직물용 형광증백제 C1, C2, C3은 여기파장 330 nm, 방사파장 438 nm 으로 확인되었으며, 세 종류의 형광증백제에 동일하게 적용가능한 표준 검량조건으로 활용이 가능하였다. 폴리에스터직물용 형광증백제의 정량을 위한 여기 파장은 370 nm 로 고정하고 방사파장은 P1은 442 nm, P2는 490 nm, P3은 476 nm, P4는 449 nm 로 설정하였다. 형광분광광도계로 형광증백제 7종을 0, 5, 10, 20, 40 mg/L의 농도로 희석한 개별표준용액을 이용하여 검량선을 작성한 결과 R2 = 0.999 이상의 높은 직선성을 얻었다. 이 검량선을 이용하여 형광증백제 처리 직물로부터 속슬레 추출한 개별 형광증백제 추출액을 정량분석 한 결과, 처리된 농도에 비례하여 직선적인 상관관계가 확인되었으며, 면직물의 경우 16.5 % 이내, 폴리에스터직물의 경우 14.4 % 이내의 재현성을 얻었다. 따라서 섬유의 형광증백제 함유량 정량분석 방법으로, 속슬레 추출을 통해 섬유내 함유된 형광증백제의 양을 형광분광광도계로 정량분석하는 방법의 유효성을 확인하였다. 형광증백제 처리직물의 마찰, 세탁, 땀에 의한 전이현상 실험 결과, 땀에 의해서는 전이현상이 발생되지 않았다. 그러나 마찰에 의한 전이현상의 경우, 폴리에스터 섬유는 형광증백제의 종류에 따라 차이는 있으나 처리 농도가 높을수록 마찰전이 현상이 더 많이 나타났다. 면직물은 형광증백제 처리 농도에 관계없이 모든 시료에서 마찰전이 현상이 확인되었다. 세탁에 의한 전이는 면 및 폴리에스터 섬유 모두 ISO 105-C06 A1S 조건에서는 타 섬유로 전이되지 않았으나, C1S 조건에서는 동종섬유로 형광증백제가 전이됨을 확인하였다. 본 연구를 통해 의류용 소재에 처리된 형광증백제의 정성평가 및 정량평가 분석 방법을 제안하였으며, 본 연구 내용은 향후 형광증백제 처리제품의 안전기준 마련에 기초자료로 사용될 수 있을 것으로 기대된다. 또한 반복사용 과정에서 형광증백제가 섬유 외부로 전이되는 과정에 대한 실험 결과 제시를 통해 형광증백제 소재를 사용·관리하는 지침 마련에 필요한 기초자료를 제시하였다.

미세플라스틱 정량 분석 정확도 향상을 위한 전처리 방안 연구

오수림 인천대학교 대학원 2022 국내석사

With use of plastics increasing, the amount of microplastics entering the marine environment has dramatically increased. Microplastics in the marine environment which may be mistaken for food, resulting in toxicological effects on marine organisms. Thus, it is important to quantitatively analyze microplastics in the marine environment. However, the methods for microplastic quantification have not been systematically established, which may have still the difficulty to remove organic matters by chemical treatments through the existing quantification analysis. Therefore, the aim of this study is to improve the quantification accuracy of microplastics. Before proposing the new pretreatment method, this study suggested to redefine the term of “microplastics” based on the consideration of the toxicological effects and abundance of microplastics. Many studies regarding the toxicological effects of microplastics have been conducted on plastics of 100 ㎛ or less, which have more abundances in environmental samples than other sizes. Accordingly, In this study, we selected the range of microplastics between 1 to 100 ㎛. This study firstly evaluated the filtration efficiency according to filter types, and sonication treatment was applied as a pretreatment. As a result, the PCTE filter showed the best filtration efficiency, and when exposed by sonication with 90 kJ for 60 mins, the removal rate of false-positive organic particles(>10 ㎛) was 80%, which is about 15% higher than 50% H2O2 pretreatment. In addition, an image-based cell counter was used for rapid and accurate quantitative analysis, and there were no significant differences in sizes and concentrations of standard microplastics between a measured value by the cell counter and a standard value. Further, it was observed that microplastics with irregular shapes could be measured by the image-based cell counter. As the quantification methods for microplastics are still in the establishment stage, this study can add a new approach for pretreatment and quantitative analysis of microplastics. 현재 플라스틱 사용량이 증가하면서 해양 환경으로 유입되는 미세플라스틱의 양도 증가하고 있다. 여러 해양 생물들이 미세플라스틱을 먹이로 오인 섭취하여 성장 및 발달, 염증반응, 생물축적 등 다양한 독성학적 영향을 나타내고 있으며, 이에 따라 해양 환경에 존재하는 미세플라스틱 정량 분석의 중요성이 점점 커지고 있다. 그러나, 미세플라스틱 분석방법은 확립되지 않은 상황이며, 환경시료의 다양한 유기물들이 미세플라스틱 식별에 방해요인이 되고 있다. 미세플라스틱 분석을 위한 일반적인 유기물 제거 방법은 화학적 처리를 이용하지만, 완벽한 제거에 어려움이 있다. 따라서, 본 연구는 미세플라스틱 정량 분석 정확도 향상을 위한 전처리 방안을 제안하고자 한다. 전처리 방안 제시에 앞서 국제적으로 합의되지 않은 미세플라스틱 정의에 대하여 독성학적 영향을 고려하여 미세플라스틱을 재정의하고자 하였다. 이를 위해 미세플라스틱에 의한 독성학적 영향을 검토한 결과, 100 ㎛ 이하의 플라스틱을 대상으로 많은 연구가 진행되고 있었다. 또한 환경시료에 존재하는 미세플라스틱의 크기는 100 ㎛ 이하에 집중 분포되어 있는 것을 확인하였다. 이에 따라, 100 ㎛ 이하의 플라스틱에 초점을 두고 연구가 활성화될 수 있도록 크기 범위를 재정의하는 것이 적절한 것으로 판단하였다. 본 연구는 연구 대상 플라스틱 크기를 1-100 ㎛로 설정하여 여과지 종류에 따른 여과 효율성 평가를 진행하였으며, 초음파 처리를 적용하여 최적의 전처리 조건을 도출하고자 하였다. 그 결과, 여과 효율이 가장 높은 필터는 PCTE 필터이며, 초음파 처리 조건은 노출 시간 60분, 필요 에너지량은 약 90 kJ로 도출되었다. 본 연구의 초음파 처리 조건으로 전처리를 실시했을 때 10 ㎛ 이상의 유기물 등 위양성 유발 가능 물질이 80% 이상 제거되는 것을 확인하였으며, 이는 선행 연구의 전처리 방법과 비교하여 약 15% 정도 향상된 결과이다. 아직까지 미세플라스틱 정량 분석에 대한 체계적인 방법이 정립되어 있지 않은 상황이며, 본 연구를 통해서 미세플라스틱 정량 분석의 정확도 향상을 위한 새로운 접근법을 제시하였다는 점에서 유의미한 시사점이 있다.

특허 빅데이터 정량 분석을 이용한 기술 분석 연구

이제환 고려대학교 공학대학원 2019 국내석사

특허데이터는 대표적인 빅데이터의 한 부분으로 분석을 통하여 함축되거나 암시된 정보를 찾아내어 기술예측과 같은 분야에 활용할 수 있다. 이러한 분석 연구들의 결과는 데이터시각화를 거치면 중요하고 다양한 정보들을 찾아내는데 효율성을 기할 수 있음이 증명되었다. 본 논문에서는 각광받고 있는 산업 주요 기술인 롤투롤패터닝시스템 기술의 특허 분석 및 분석 데이터의 시각화 기술을 적용하여 룰투롤패터닝시스템 기술의 기술경쟁력을 기업과 국가단위로 실시하고자 한다. 기술경쟁력을 여러 기업 및 국가별로 분석하여 해당 기술의 경쟁력의 현황을 알아보기 위해 유사한 속성을 지닌 조직들 즉 동종 기업군과 국가들을 식별하여 분석하고 분석결과를 도출하는 것이 필요하다. 이러한 동종의 기업군을 식별하는 방법으로 다차원분석법을 이용하였다. 해당 기술의 경쟁력을 개선하기 위하여 특정 조직의 강점과 보완해야 할 부분에 대한 비교우위의 용이성을 제공하는 방법을 정량적 분석방법으로 제안하고자 한다.

바이오에탄올 정제 및 정량 분석법 개발

김태민 강원대학교 대학원 2011 국내석사

최근 전 세계적으로 환경문제와 더불어 매장량이 한정된 석유와 같은 천연자원의 고갈 문제가 크게 대두되고 있다. 석유와 같은 천연자원을 현재와 같은 추세로 사용하였을 경우 약 60년 후에는 모두 고갈되고, 지구 온난화 현상 등 여러 환경문제가 발생되기 때문이다. 산업화에 따른 화석연료의 사용은 대기 중의 CO₂ 농도를 증가시켜 온실효과를 일으키기 때문에 전 세계적으로 연평균 기온의 상승과 사막화 현상 및 빙하의 해빙 문제를 초래하고 있다. 이러한 두 가지 문제를 해결하고자 최근 각국의 연구진들은 천연자원을 대체할 수 있는 전분질계, 목질계, 해조류계를 이용해 바이오에탄올, 바이오디젤 등의 바이오연료를 개발하고 있다. 바이오에탄올의 생산 공정은 크게 전처리 공정, 당화 공정, 발효 공정, 정제 공정으로 나눌 수 있다. 본 연구에서는 최종 공정인 정제공정과 생산된 바이오에탄올의 함량을 구하기 위한 정량 분석법을 연구하였다. 또한, 바이오에탄올 생산에 앞서 당의 함량을 분석함으로써 바이오에탄올 생산량을 예측할 수 있는 환원당 측정공정을 연구하였다. 정제 공정에서는 재증류법과 흡착제를 사용하여 에탄올 함량을 최대로 높일 수 있는 방법을 연구하였다. 그 결과 70.0 ℃로 3회 재증류하고, 4회 재증류시 흡착제인 Zeolite를 5.0 g 사용하여 최대 에탄올 함량을 나타내었다. 이렇게 회수된 에탄올 함량은 89.6 %(v/v)였다. 바이오에탄올의 정량 분석법에서는 HPLC는 0.5~10.0 %(v/v), GC는 1.0~10.0 %(v/v), Spectrophotometer는 5.0~100.0 %(v/v)에 해당하는 에탄올의 Standard curve를 얻어 생산된 바이오에탄올의 함량을 측정할 수 있었다. 환원당 측정 공정에서는 DNS(3,5-Dinitrosalicylic acid)법을 이용한 것으로 Spectrophotometer를 사용하여 Glucose를 1.0~70.0 %(w/v)까지 정량 분석한 후 각 원료별로 환원당 함량을 측정하였다. With recent environmental problems in the world with limited oil reserves, the depletion of natural resources is becoming a controversial issue. Natural resources such as oil will be depleted within approximately 60 years, if recent rapid trend of the oil consumption keeps going on. Additionally, the industrial use of fossil fuels caused the greenhouse effect, the desertification phenomenon, the melting of glaciers and the increasing of concentration of CO₂ in atmosphere. In order to solve these problems, recently many national research teams keep focusing on developing alternative energy such as bioethanol, biodiesel from starch biomass, cellulosic biomass. The production of bioethanol involves the different steps of pretreatment, hydrolysis, fermentation, and the purification process. In this paper, the quantitative analysis for obtaining the content of bioethanol and the finalized process which is the purification process is being discussed. Potential for ethanol production using reducing sugar measurement was evaluated by DNS method and spectrophotometer. In the purification process, the method to the maximum ethanol content is discussed in order to use the re-distillation method and absorbents. As a result, the conditions with 5.0 g of Zeolite as absorbent at the fourth showed a maximum ethanol content after three times of the re-distillation processes with 70.0 ℃. The amount of this recovered ethanol was 89.6 % ethanol content. In Quantitative analysis of bioethanol, the results of standard curve were each 0.5~10.0 % with HPLC and GC, 5.0~100.0 % with Spectrophotometer. For the reducing sugar measurement process, the reducing sugar content was measured by using DNS(3,5-Dinitrosalicylic acid) and Spectrophotometer after the quantitative analysis of 1.0~70.0 % Glucose.