세침흡인물의 면역세포화학적 검사법에 대한 연구

정재훈 전남대학교 대학원 1999 국내석사

면역조직화학적 염색은 종양세포의 기원이나 성상을 알 수 있는 보조적인 진단방법으로 널리 이용되고 있다. 세침흡인세포 검사는 종양의 진단에 있어서 그 역할이 점차 증대되고 있지만, 조직학적 구조를 얻을 수 없기 때문에 세포의 형태학적 특징과 성상에 의존해야 하고 유사한 형태학적 특징을 보인 경우들이 많아서 진단에 어려움이 있다. 이러한 어려움을 극복하고자 일반 염색 외에 면역세포화학 검사, 전자현미경 검사, 형광현미경 검사와 같은 보조적인 진단법이 시도되고 있다. 이 중 면역세포화학적 검사는 조직 검체에서만큼은 널리 사용되고 있지는 않으나, 최근 많은 세포병리 학자들에 의해서 시도되고 있다. 세침흡인물을 이용한 면역세포화학적 검사는 수술 전 종양의 진단 및 예후와 관련된 중요한 정보들을 제공해 줄 수 있는 장점을 가지고 있다. 그러나 파라핀 포매괴를 이용한 면역조직화학적 염색과는 방법상의 차이점들로 인해 보고자들마다 그 방법의 적정성에 대해 이견이 많은 실정이다. 이에 저자는 수술적으로 적출된 유방, 갑상선, 폐, 타액선, 림프절 및 위암종의 신선한 조직 60례를 대상으로 세침흡인물을 얻어 면역세포화학적 염색시 주요 고려대상이 되는 세포 형태 및 항원의 유지에 대한 고정액의 효과와 세포질 및 핵 항원의 발색을 위한 전 처치의 방법, 항원 노출 단계의 필요성 등을 관찰하여 적절한 면역세포화학적 염색법을 개발하고자 본 연구를 시도하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 1. 95% 에탄올에 고정한 경우는 비특이적인 배경염색이 나타나서 고정액으로서 적합하지 않은 것으로 사료되었다. 2.5% formalin-Histochoice(Amresco)에 고정한 경우는 2분에서 5분간 고정하는 것이 세포 형태 유지와 항원성 유지에 가장 적절하였다. 2. 세포막 항원에 대한 면역세포화학적 염색시 항체의 막 투과성을 항진시키는 침투제는 불필요하었다. 세포질 항원은 침투제를 사용하지 않아도 양성반응이 관찰되었으며, 침투제를 사용한 경우에는 강한 양성반응을 보였다. 핵 항원에 대해서는 Universal buffer에 1시간 동안 반응시키는 것이 종양세포에서 전반적으로 뚜렷하고 균질한 핵의 발색을 보여 가장 적절한 침투제임을 알 수 있있다. 3. 면역조직화학적 염색시 항원 노출에 필요한 단백 분해 효소의 전처치나 전자렌지를 이용한 처치는 세포 검체물에서는 비특이적인 배경염색을 초래하여 부적절함을 알 수 있었다. 이상의 소견으로 적절한 고정액과 침투제를 사용한다면 세포막, 세포질 항원뿐만 아니라 핵 항원에 대해서도 세침흡인물의 면역세포화학적 염색이 가능함을 알 수 있었고 이를 이용한다면 수술전 종양의 진단뿐만 아니라 예후를 예측하는데 많은 도움을 줄 수 있을 것으로 사료되었다. Immunochemistry is an well-established ancillary diagnostic method in the histopathology. Recently, Fine Needle Aspiration (FNA) cytology has played an increasingly important role in the diagnosis of neoplasia. However, cytodiagnosis has limitation that it should be only based on morphologic characteristics and nature of cells, because the histologic architecture can not be obtained in cytologic specimens, Cytodiagnosis may be confused in cases showing similar morphology. In these problematic cases, routine stain as well as ancillary methods such as immunocytochemistry, electromicroscopy, fluorescent microscopy have been tried. Although immunocytochemistry has not used as widespread as immunohistochemistry, it has been tried by many cytopathologists, Immunocytochemistry in aspirates has advantage that it can give informations about the preoperative diagnosis and prognosis. The optimum of immunocytochemical method depends on the reports due to the different methodologies of the immunohistochemistry to paraffin block. To develop the optimal method of immunocytochemistry, the effectiveness of fixatives on the preservation of cellular morphology and antigenicity, the method of pretreatment for detection of cytoplasmic and nuclear antigen, and the necessity of antigen retrieval step were examined to the aspirates. The resected fresh 60 cases of breast, thyroid, lung, salivary gland, lymph node, and stomach, which were diagnosed of benign or malignant tumors in our hospital, were used for aspirates. The results were as follows: When ninety five percent ethanol was used as a fixative, the nonspecific background was shown. The FNA specimens were fixed optimally for 2 to 6 minutes in formalin-Histochoice(Amresco). Membranous antigens were well detected irrespective of permeation agents. Although immunostaining results were good without permeation agents for cytoplasmic antigens, they were better with pretreatment of the agents. When Universal buffer was used as a permeation agent, the positive reaction were the most strong and homogeneous for nuclear antigens. For the antibodies that need the antigen retrieval system in immunohistochemistry, non-specific staining were shown in background. It was suggested that immunocytochemical stain to FNA specimens with the optimal fixative and the permeation agent is possible for membranous and cytoplasmic antigens as well as nuclear ones, and that accurate diagnosis and prediction of prognosis could be done by aid of immunocytochemistry.

(The) differences in immune cells engaged in cell mediated immunity around chemotherapy of far advanced pancreatic cancer

방승민 Graduate School, Yonsei University 2005 국내석사

췌장암은 10% 이하의 2년 생존률을 보이는 예후가 매우 불량한 악성 종양이다. 이처럼 불량한 췌장암의 예후는 대부분의 환자가 진단 당시 근치적 수술이 불가능한 상태로 발견된다는 것과 기존의 항암제 및 방사선 치료에 불량한 반응을 보이는데 기인한다. 이처럼 기존의 항암치료에 대한 불량한 반응은 새로운 치료 방법의 개발에 대한 강력한 동기를 부여하고 있으며, 현재 유전자 치료 또는 면역치료 등의 새로운 치료법이 시도되고 있다. 특히 수지상 세포를 중심으로하는 세포면역치료는 기존의 항암치료에 반응하지 않는 악성종양에 있어 보다 종양세포에 특이적인 세포독성을 유발할 수 있다는 점등으로 인해 주목 받고 있으며, 최근 기존의 항암약물치료 또는 방사선 치료가 세포 매개 면역반응을 강화시킬 수 있음이 밝혀지고, 이러한 근거를 토대로 한 항암약물치료와 세포면역치료의 병행이 보다 양호한 치료 성적을 보일 수 있음이 보고되고 있다. 그러나 현재까지 항암약물치료가 악성종양 환자의 실제 면역체계에 미치는 영향에 대한 연구 및 항암약물치료와 병행하는 면역치료의 최적의 시기에 대한 연구는 부족한 실정이다. 이에 본 연구는 gemcitabine 및 cisplatin 병합요법으로 치료 받은 진행성 췌장암 환자들의 세포 매개 면역상태의 변화를 분석하여, 약물치료와 면역세포치료를 병용하기에 적합한 시기를 알아보고자 하였다.2004년 2월부터 2004년 8월까지 진행성 췌장암을 진단받고, gemcitabine 및 cispaltin 병합약물치료를 받은 환자들(n=13)과 악성종양의 병력이 없는 건강한 성인(n=7)을 대상으로 환자-대조군 연구를 시행하였다. 환자군은 28일의 gemcitabinecisplatin 병합요법 1주기를 기준으로 약물치료전, 치료중간(제 15일), 및 1주기 치료 후(제28일)에 걸쳐 3회 말초혈액을 채취하였으며, 대조군은 1회 채취하였다. 환자군의 약물치료 전과 대조군의 말초혈액내 면역세포들(수지상세포, T림프구, NK세포)을 유세포 분석을 통한 비교에서 환자군의 말초 혈액 단핵구 및 세포매개 면역반응에 관여하는 수지상세포, CD4+ T림프구, CD8+ T림프구 및 NK세포 등이 정상 대조군에 비해 감소되어 있음을 규명하였으며, 또한 NK세포의 K562 세포주에 대한 세포독성능이 정상 대조군에 비해 억제되어 있음을 확인하였다. 뿐만 아니라, 체내 면역반응을 억제하는 것으로 알려진 VEGF, IL-10의 혈청 농도도 정상 대조군에 비해 췌장암 환자군에서 유의하게 증가되어있음을 확인하였다.Gemcitabine 및 cisplatin 병합화학치료를 시행받은 췌장암 환자에게서 면역세포군들의 치료전 수적인 감소는 회복되는 양상을 보였으며, 특히 수지상세포는 28일간의 항암약물 치료 후 정상 대조군보다 수적팽창이 유도됨을 확인하였다. 또한 NK세포 및 T림프구도 항암 치료 전 수치까지 회복하는 것을 확인하였다. 이러한 면역세포들의 수적인 회복과 함께 억제되어 있던 세포기능들도 회복되는 양상을 보여, K562세포주에 대한 NK세포의 세포독성능은 약물치료와 더불어 지속적으로 향상되는 양상을 보였다. 또한 치료전 정상 대조군에 비해 증가되어 있던 혈청 VEGF, IL-10농도도 약물치료에 따라 감소하는 결과를 보였다. 이상의 결과에서 전이성 췌장암 환자의 세포매개 면역반응은 정상 대조군에 비하여 양적, 질적으로 억제되어 있으며, 이러한 세포매개 면역반응의 억제는 약물치료를 통해 회복되는 경향을 보임을 확인하였다. 특히 수지상세포의 빠르고 증폭된 수적 회복은 진행성췌장암에 있어 면역세포치료를 위한 수지상세포의 모집에 있어 적절한 시기를 결정하는데 중요한 근거가 될 것이며, 나아가 항암약물치료와 더불어 췌장암 환자들의 면역저하가 점차 개선되는 양상을 보이는 것으로 고려할때, 항암약물치료와 병용하게되는 세포면역치료의 효과를 극대화 하기 위해서는 항암약물치료를 통하 면역저하의 회복이 최대화 된 시점에 시행하는 것이 보다 강력한 종양 면역반응을 유도할 수 있을 것으로 생각된다. Pancreatic cancer is one of the most dreadful malignancies and the 2 year survival rate is only less than 10%. The poor prognsis of pancreatic cancer is related to the poor response for systemic chemotherapy andor radiotherapy. The poor outcomes of conventional treatments require some new therapeutic modalities, such as gene therapy or immunotherapy. Recently, the combination of chemotherapy and immunotherapy is suggested to augment the effect of immunotherapy. However, little is known about possible effects of chemotherapy on the immunity of cancer patients. So, we tried to evaluate the effect of the combined chemotherapy with gemcitabine and cisplatin on the cell mediated immunity of pancreatic cancer patients.Thirteen patients of far advanced pancreatic cancer were enrolled and 7 sex and age matched healthy volunteers were included as control group. The number of immune cell subpopulations engaged in cell mediated immunity of patient group was lower than that of control, and the cytotoxicity of natural killer cells was impaired in patients group. And the concentrations of serum vascular endothelial growth factor and interleukin-10 in patients group were higher than control. After one cycle of the combined chemotherapy with gemcitabine and cisplatin, the immunologic impairments of pancreatic cancer patients were generally recovered. In numberic aspect, the decreased cell number of dendritic cells, T cells and natural killer cells were restored after completion of chemotherapy. Especially, the count of dendritic cells after chemotherapy returned to and exceeded the value of healthy control. With the numeric recovery, impaired cytotoxicity of natural killer cells showed to be restored and the elevated vascular endothelial growth factor, interleukin-10 concentration were decreased with chemotherapy.Taken these data into accounts, when the patient of pancreatic cancer receives one cycle of chemotherapy is one of the ideal timing of dendritic cells collection for immunotherapy. And to maximize the effect of immunotherapy, it is important to evaluate when the immunosuppression of pancreatic cancer patients is improved maxi- mally with systemic chemotherapy.

역형성 갑상선암과 전이성 분화 갑상선암에서 면역세포 프로파일링

안종화 울산대학교 대학원 2022 국내박사

배경: 면역세포 프로파일링은 종양 내 미세환경을 반영하여 암의 진행을 예측하거나 치료의 표적을 선정하는데 중요하지만, 갑상선암에서 이에 대한 연구는 부족한 실정이다. 이에 갑상선암 중 치료가 어렵고, 치명률이 높은 역형성 갑상선암과 전이성 분화갑상선암(전이성 분화암)에서 림프구 대 단핵구 비율(LMR)과 형광 다중 면역조직화학 염색법(F-MIHC) 및 다중 분광 영상 시스템(MSI)을 이용하여 면역세포 프로파일링을 실시하였다. 연구방법: 1994년에서 2020년까지 서울아산병원에서 수술 혹은 조직검사를 시행한 18세 이상의 역형성 갑상선암과 전이성 분화암 환자를 대상으로 하였다. LMR 분석은 기저 전혈구계산이 가능한 역형성 갑상선암 환자 및 소라페닙 치료를 받는 방사성 요오드 치료에 반응하지 않는 진행성 분화암 환자들을 대상으로 하였으며, receiver operating characteristic 곡선 분석을 통해 LMR 4를 기준으로 낮은 LMR군과 높은 LMR군을 분류하였다. 조직의 면역세포 프로파일링은 조직 슬라이드의 검토를 통해 추가적인 조직 블록 제작하고, 분석이 가능한 환자들을 대상으로 F-MIHC와 MSI를 이용하여 진행되었다. F-MIHC가 한번에 최대 6가지의 항원을 검출할 수 있어, 1차는 프로그램된 세포사멸 리간드(PD-L1)를 포함하는 T 림프구를 중점으로 분석하였고, 2차는 T 림프구 및 대식세포 및 이와 관련한 세포들을 중점으로 분석하였다. PD-L1에 대한 지표로 tumor proportion score(TPS)와 combined positive score(CPS)를 이용하였고, PD-L1 양성과 강양성의 기준은 각각 1이상과 50이상, 1이상과 20이상으로 정의하였다. 결과: 말초 혈액에서 역형성 갑상선암 환자 총 35명의 LMR을 분석한 결과, 낮은 LMR군에서 전체생존율의 중앙값이 3개월로 높은 LMR 군의 9.5개월에 비해 유의하게 낮았으며(p=0.004), 전체사망률에 대한 단변량 분석에서 hazard ratio(HR) 3.04(95 % confidence interval (CI) 1.37-6.77, p=0.007), 다변량 분석에서 HR 2.55(95% CI 1.08-6.00, p=0.032) 로 모두 유의하였다. 소라페닙 치료를 받는 방사성 요오드 치료에 반응하지 않는 진행성 분화암 환자 40명을 대상으로 한 분석에서도 낮은 LMR이 전체생존율 및 질병 무진행 생존에 유의한 감소 (p=0.015, p=0.019)를 보였으며, 전체사망률 및 질병의 진행에 대한 다변량 분석에서도 HR 2.64 (95% CI 1.04-6.72, p=0.041), 2.69 (95% CI 1.02-7.04, p=0.045) 로 모두 유의한 예후 인자로 확인되었다. 총 28명의 환자(역형성 갑상선암 16명, 전이성 분화암 12명)를 대상으로 한 PD-L1을 포함하는 1차 면역세포 프로파일링에서 PD-L1을 발현하는 종양세포를 비롯하여, 단위면적당(mm2) 총 T 림프구, 세포독성 T 림프구, 조절 T 림프구 세포 수가 모두 역형성 갑상선암에서 전이성 분화암에 비해 유의하게 높았다(모든 p<0.001). 각각의 림프구에서 PD-1과 PD-L1의 발현을 세분화하여 비교하였을 때에도 역형성 갑상선암에서 그 수가 유의하게 높았다(모든 p<0.001). TPS, CPS에서 양성인 경우는 역형성 갑상선암에서 81%, 94%로 모두 음성으로 확인된 전이성 분화암과 큰 차이를 보였다. 총 19명의 환자(역형성 갑상선암 12명, 전이성 분화암 7명)를 대상으로 한 2차 면역세포 프로파일링에서도 총 T 림프구(p=0.006), 자연살해세포((p=0.038), 대식세포(p<0.001), 골수유래 억제세포(p=0.003), 수지상세포(p=0.002) 모두 역형성 갑상선암에서 그 수가 유의하게 증가된 것이 확인되었다. 2차 분석에서 남녀 성별 및 말초 LMR에 따른 면역세포 프로파일을 분석하였는데, 여성에서 수지상세포의 수가 유의하게 높았으며(p=0.044), 낮은 LMR 군에서 대식세포의 수가 유의하게 증가되어 있음이 확인되었다(p=0.012). 결론: 말초혈액에서의 LMR 값은 역형성 갑상선암과 전이성 분화암에서 예후인자로 고려될 수 있다. 암조직에서 F-MIHC와 MSI를 이용한 면역 프로파일링을 통해 PD-L1의 발현 및 림프구 및 대식세포를 포함하는 면역세포들의 침윤이 역형성암에서 유의하게 높음을 확인하였고, 이를 통해 역형성암에서 암 면역을 표적으로 한 치료가 좀 더 효과적일 수 있음을 예측할 수 있다. 추가적인 면역 프로파일링을 통해 진행성 갑상선암의 새로운 치료 표적을 찾는 것이 필요하겠다. Background: Analysis of the tumor microenvironment is a fundamental step in uncovering the details of tumor-host interactions that can lead to the development of novel therapies. Advanced thyroid cancers, including differentiated thyroid carcinoma (DTC) with distant metastasis, poorly differentiated thyroid carcinoma, and anaplastic thyroid carcinoma (ATC), are associated with poor clinical outcomes and limited treatment options. This study aimed to determine the immune profiles of advanced thyroid cancers using the lymphocyte-to-monocyte ratio (LMR) and fluorescent multiplex immunohistochemistry (F-MIHC) and multispectral imaging (MSI). Method: We included patients aged over 18 years old who had pathologically confirmed diagnoses of DTC with distant metastasis or ATC between 1994 and 2020, at the Asan Medical Center, Seoul, Korea. We retrospectively analyzed patients with ATC or progressive radioactive iodine-refractory (RAIR) DTC who were treated by sorafenib with available baseline complete blood cell count (CBC) data. By ROC analysis, we sub-classified the patients into two groups: the low LMR group with LMR < 4 and the high LMR group with LMR ≥ 4. We assessed the response rate, progression-free survival (PFS), and overall survival (OS) according to the LMR. To analysis of immune profiling, we included patients who could make additional tissue blocks through review of tissue slides by endocrinology pathologist. The samples were assessed using F-MIHC and MSI with antibodies against the cell surface molecules, cluster of differentiation (CD) 4, CD8, programmed cell death (PD-1), PD ligand 1 (PD-L1), forkhead box protein (Foxp)3, and cytokeratin (CK) for first analysis and CD3, CD11c, CD56, CD68, CD33 for second analysis. The expression of PD-L1 was evaluated using tumor proportion (TPS) and combined positive (CPS) scores. Results: Among 35 patients with ATC, the OS curves were significantly different based on the LMR values, and the median OS of the low and high LMR groups was 3.0 and 9.5 months, respectively (p=0.004). In multivariate analysis, low LMR was also an independent risk factor for all-cause mortality in patients with ATC (HR, 2.55; 95% confidence interval (CI): 1.08-6.00, p=0.032) after adjusting for sex, tumor size and distant metastasis status. In 40 patients with progressive RAIR DTC, low LMR was associated with poor response rate and shorter disease control duration with sorafenib. The PFS curves differed significantly based on the LMR values and the median PFS of the low and high LMR groups (p=0.019). The OS curves also differed significantly based on the LMR. The median OS of the low LMR group was 24.3 months and that of the high LMR group was not reached until the end of observation period (p=0.015). In multivariate analysis, low LMR was an independent risk factor for all-cause mortality in patients with progressive RAIR DTC (hazard ratio [HR], 2.64; 95% confidence interval [CI]: 1.04–6.72, p=0.041). In first analysis of immune profiling including PD-L1, total 28 patients (16 ATC, 12 DTC) were included. Significantly more PD-L1-positive tumor cells (CK+PD-L1+) per mm2 were found in ATC than in DTC samples (183.5 vs. 0.03, p<0.001). Lymphocyte infiltration was significantly increased in ATC compared with DTC with significantly more PD-L1 or PD-1-positive lymphocytes in ATC than in DTC samples. Notably, TPS and CPS indicated that PD-L1 expression was negative in all DTC samples but positive in 81% and 94% of ATC samples, respectively. In second analysis of immune profiling including macrophage, total 19 patients (12 ATC, 7 DTC) were included. Significantly more T lymphocytes (p=0.006), natural killer cells (p=0.038), macrophage (p<0.001), myeloid-derived suppressor cells (p=0.003) and dendritic cells (p=0.002) were found in ATC than in DTC samples. There was no significant difference of immune cell according to sex, except dendritic cell. Dendritic cell was significantly increased in female compared with male (107 vs. 13, p=0.044). More macrophages were found significantly in low LMR than in high LMR (706 vs. 149, p=0.012), whereas lymphocyte was no significantly different according to LMR. Conclusion: Low LMR is associated with poor survival in patients with ATC and progressive RAIR DTC. LMR could be a simple and stable prognostic biomarker reflecting host immunity in patients with progressive thyroid carcinoma. Immune profiling revealed significant differences between advanced DTC and ATC, particularly in terms of PD-L1 expression and lymphocyte infiltration. Therefore, immune profiling using F-MIHC and MSI can provide invaluable information regarding tumor microenvironments, which could help select candidates for immunotherapy and create new targeted treatments for thyroid cancer.

후코이단 함유 나노섬유에서 3 차원 배양한 면역세포의 활성

이지현 아주대학교 2021 국내석사

후코이단은 갈조류에서 정제된 황산화 다당류이며 항원 흡수 촉진, 항염증, 항바이러스 및 항종양 효과 등 다양한 면역 조절 효과에 대해 연구되고 있다. 본 연구는 체내 유사 환경인 3차원 나노섬유에서 후코이단에 대한 면역세포의 활성과 활성화된 면역세포에서 분비되는 사이토카인을 알아보고, 3차원 환경과 2차원 환경에서 배양된 면역세포의 차이를 비교하는 것을 목표로 한다. 2차원 환경에서 배양된 세포는 생체 내 환경과 약간의 차이가 있는데 이를 보완하기 위해 체내 환경과 비슷한 3차원 환경의 나노섬유 지지체가 개발되고 있다. 그 중 생체 적합성과 생분해성 등 우수한 특성과 다양한 용도로 활용되고 있는 합성 고분자 polyvinyl alcohol (PVA)을 이용한다. 3차원 환경의 나노섬유를 제작하기 위해 전기방사(electrospinning)를 이용하고 갈조류 Fucus vesiculosus 에서 정제된 후코이단 (Fucoidan)을 사용하여 후코이단을 함유한 polyvinyl alcohol (PVA) 나노섬유를 제작한다(이하 Fucoidan-PVA). 후코이단을 농도별로 처리하여 면역세포의 활성도를 측정한 후, 후코이단의 적정 처리 농도를 결정한다. 나노섬유에서 후코이단을 통한 면역세포의 활성을 알아보기 위하여 Fucoidan-PVA 나노섬유에서 세포를 배양하고 세포의 활성도를 바탕으로 세포의 배양일을 결정한다. 그 후 Fucoidan-PVA 나노섬유에서 배양된 면역세포에서 분비되는 사이토카인을 측정한다. Fucoidan-PVA 나노섬유에서 후코이단은 면역세포의 CD86 발현을 유도하여 활성화시키고 TNF-α, IL-6, IL-1β 사이토카인을 분비시킨다. 이를 바탕으로 3차원 나노섬유에서 배양된 면역세포의 활성은 후코이단에 대한 효과 연구에 활용될 수 있다.

딥러닝 기반의 모델을 통한 Pan-cancer 데이터의 면역세포 구성비율 예측

장현숙 숙명여자대학교 대학원 2021 국내석사

최근 암을 치료하기 위한 면역화학요법이 기존 방법으로 치료가 어려운 환자에 대안으로 제시되고 있다. 이를 위해 종양 내에 존재하는 다양한 면역세포의 유형의 비율을 파악하는 것이 중요하다. 종양의 내부는 암세포를 비롯한 다양한 세포 유형으로 복잡하게 구성되어 있으며 이러한 환경을 종양미세환경이라 한다. 현재 디컨볼루션 기반의 다양한 면역세포의 구성비율을 예측 도구들이 개발되고 있다. 그러나 각각의 도구들은 서로 다른 특징을 갖고 있고 예측하는 면역세포의 유형도 차이가 존재한다. 본 논문에서는 각기 다른 특징을 갖는 도구의 통합하여 포괄적인 분석을 하고자 기존에 개발된 3종류의 면역세포 예측 도구의 결과값을 결합하여, 다층퍼셉트론학습을 통해 4종류의 면역세포와 2종류의 기질 세포를 예측하는 딥러닝 기반의 모델을 개발하였다. KL divergence를 통해 흑색종 싱글셀 데이터를 평가한 모델의 예측 성능이 기존 도구보다 향상되었음을 확인할 수 있었다. 전체 33종류의 Pan-cancer 데이터를 개발한 딥러닝 기반의 모델을 통하여 면역세포의 구성비율을 예측하였고, 암의 유형에 따라 면역세포 구성비율의 차이가 존재하였다. 7종류의 암에서 T세포의 비율이 높았으며, B세포의 비율이 높은 암이 4종, 대식세포의 비교적 높은 암이 5종, 기질 세포의 비율이 높은 암이 6종으로 나타났다. 대식세포의 비율이 높게 나타난 중피종의 경우 발병 후 예후가 좋지 않으며, 종양 내 대식세포를 제거할 경우 예후가 좋아진다는 관련 연구를 볼 수 있었다. 모델을 통해 예측한 종양 내 면역세포의 구성비율을 기반으로 Pan-cancer의 통합적 분석은 암의 면역화학요법 개발에 활용될 수 있을 것으로 생각한다. Recently, Immunotherapy to treat cancer has been presented as an alternative to patients who are difficult to treat with conventional methods. For this reason, it is important to know the proportion of various types of immune cells in the tumor. The inside of a tumor is composed of various cell types including cancer cells, and such an environment is referred to as a tumor microenvironment. Currently, tools are being developed to predict the proportion of various immune cells based on the deconvolution method. However, each tool has different feature, and there are also differences in the types of immune cells that are predicted. In this paper, we try to integrate and comprehensively analyze tools with different feature by concatenation the result values ​​of three existing immune cell prediction tools through multi-layer perceptron learning. We have developed a deep learning based model that predicts four types of immune cells and two types of stromal cells. It was evaluated that the prediction performance of the model evaluated via KL divergence was improved compared to the conventional tool. The proportion of immune cells was predicted through the DNN model for which Pan-cancer data was developed, and there was a difference in the proportion of immune cells depending on the type of cancer. In 7 types of cancer, the proportion of T cells was high, 4 types of cancers with a high proportion of B cells, 5 types of cancers with a relatively high proportion of macrophages, and 6 types of cancers with a high proportion of stromal cells were found. We were able to see a related study in which the prognosis after the onset of mesothelioma with a high proportion of macrophages was poor, and the prognosis was improved when macrophages were deleted. We believe that an integrated analysis of Pan-cancer based on the proportion of immune cells in the tumor predicted using the model can be used for the development of immunotherapy for cancer.

밀리타리스동충하초(Cordyceps militaris)와 눈꽃동충하초(Paecilomyces japonica) 복합물이 흰쥐의 면역능에 미치는 영향

임예롬 연세대학교 대학원 2006 국내석사

This study was performed to evaluate immunomodulatory effect of Cordyceps militaris and Paecilomyces japonica in the rats raised with nutritionally unballanced diet including 1% cholesterol, high proportion of animal lipids(lard:corn oil = 8:2), sub-optimal levels of vitamin and mineral mixture along with 0.5% for 5 weeks. Normal rats were fed the AIN-93G diet for 5 weeks, and nutritionally unbalanced rats were divided into 9 groups: 1) control diet 2) 0.75M group (control + 0.75% militaris-supplemented diet) 3) 0.75J group(control + 0.75% japonica-supplemented diet) 4) 0.75MM group (control + 0.75% militaris and mixture-supplemented diet) 5) 1.5MM group (control + 1.5% militaris and mixture-supplemented diet) 6) 3.0MM group (control + 3.0% militaris and mixture-supplemented diet) 7) 0.375MJM group (control + 0.375% militaris + 0.375% japonica and mixture-supplemented diet) 8) 0.75MJM group (control + 0.75% militaris + 0.75% japonica and mixture-supplemented diet) 9) 1.5MJM group (control + 1.5% militaris + 1.5% japonica and mixture-supplemented diet). The body weight of 3.0MM, 0.375MJM and 1.5MJM rats were significantly lighter than that of control rats(p<0.05). The food efficiency ratio(FER) of 0.375MJM, 0.75MJM and 1.5MJM rats significantly lowered than the value for control(p<0.05).$$a$$aFeeding 1.5MJM diet for 5 weeks significantly increased lymphocyte percentage of CD4+ T-cell(17% increase) along with CD4+/CD8+ ratio(21% increase) of lymph nodes compared to those for control(p<0.05).$$a$$aThe amounts of IL-2 in cultured splenocytes stimulated with Con A of 0.75M(54% increase), 0.75J(57% increase), 0.75MM(53% increase), 1.5MM(59% increase), 3.0MM(55% increase), 0.75MJM군(31% increase) and 1.5MJM군(61% increase) was significantly increased compared to that in control rats(p<0.05). The amounts of IFN-γ in cultured splenocytes stimulated with Con A of control was significantly decreased compared to those for normal(p<0.05). There were no other significant Ig changes in all groups.$$a$$aIn conclusion, high level dose(1.5 MJM) of Cordyceps militaris and Paecilomyces japonica largely affected the aspect of T-cell mediated immunity in the rats.$$a$$a 본 연구에서는 면역기능 저하가 예상되는 영양불균형 동물모델을 대상으로 밀리타리스동충하초와 눈꽃동충하초 복합물이 면역능에 미치는 영향을 규명하고자 시도되었다. 일주일간 실험실 환경에 적응시킨 생후 6주령의 Sprague-Dawley종 수컷 흰쥐 80마리를 10군으로 분리하여 5주간 사육하였다: 1) 정상식이군(normal diet) 2) 반건강대조식이군(control diet) 3) 0.75M군 (control + 0.75% militaris-supplemented diet) 4) 0.75J군(control + 0.75% japonica-supplemented diet) 5) 0.75MM군 (control + 0.75% militaris and mixture-supplemented diet) 6) 1.5MM군 (control + 1.5% militaris and mixture-supplemented diet) 7) 3.0MM군 (control + 3.0% militaris and mixture-supplemented diet) 8) 0.375MJM군 (control + 0.375% militaris + 0.375% japonica and mixture-supplemented diet) 9) 0.75MJM군 (control + 0.75% militaris + 0.75% japonica and mixture-supplemented diet) 10) 1.5MJM군 (control + 1.5% militaris + 1.5% japonica and mixture-supplemented diet), mixture는 한약재, 0.35%와 베타빔 3.5%로 구성되어 있다. 면역 관련 지표로 면역관련 장기 무게, 비장의 면역세포 수, 활성화된 비장세포에서의 cytokine 분비능 및 혈청 면역글로블린 농도 등을 측정하였다.$$a$$a그 결과 본 실험에 사용된 반건강대조식이군이 정상군에 비해 비장에 존재하는 NK 세포수 및 Con A로 활성화된 비장세포로부터 분비되는 T-cell mediated 사이토카인(IL-2 & IFN-γ) 생성량이 유의하게 감소하여(P<0.05), 식이성 면역능저하 동물모델이 성공적으로 유도된 것으로 사려되었다. .식이섭취량은 0.375MJM, 0.75MJM 및 1.5MJM군에서 대조군에 비해 유의적으로 감소하였고, 체중증가량 역시 3.0MM, 0.375MJM 및 1.5MJM군에서 대조군에 비해 유의적으로 감소하였다(p<0.05). 비장의 면역세포수 측정 결과는 1.5MJM군에서 반건강대조군에 비해 비장의 CD4+ T-세포 분포 및 CD4+/CD8+ 비율이 유의적으로 증가하여(p<0.05), 고용량의 밀리타리스동충하초+눈꽃동충하초 복합물이 가장 유효한 세포성면역 증강효과를 나타냈음을 알 수 있었다. NK 세포수는 모든 실험군에서 대조군보다 증가하는 경향을 보였으나, 통계적 유의성이 나타나지는 않았다(p>0.05). 비장의 CD8+ T-세포수 역시 대조군과 비교해 모든 실험군에서 유의한 차이를 보이지 않았다. Con A로 활성화된 비장세포로부터 분비되는 T-cell mediated 사이토카인으로 IL-2 및 IFN-γ 생성량을 측정한 결과, IL-2의 경우 대조군과 비교해 0.75M, 0.75J, 0.75MM, 1.5MM, 3.0MM, 0.75MJM군 및 1.5MJM군에서 유의하게 증가하였다(p<0.05). 한편, IFN-γ 생성량은 정상식이군에 비해 반건강대조군에서 통계적으로 유의한 감소를 보였다(p>0.05).. 복부대동맥에서 채취한 혈액의 IgG 및 IgM 농도를 측정한 결과, 모든 실험군에서 대조군과 유의한 차이를 나타내지 않았으며, B 세포수에서도 역시 유의적인 차이를 보이지 않았다. 따라서 동충하초복합물은 체액성 면역능에는 영향을 미치지 않은 것으로 사려된다.$$a$$a마지막으로 면역관련 세포인 비장세포와 암세포와 같은 종양항원을 혼합배양하여 CTL을 유도하고 기능성분을 부가함으로써 동충하초복합물의 면역능을 평가해보았다. P-815 mast mastocytoma 세포와 mouse 비장세포 혼합배양하여 CTL을 유도한 후, 동충하초복합물을 0 μg/mL, 50 μg/mL, 500 μg/mL의 농도로 첨가하여 cytotoxicity(%)를 측정하여 동충하초복합물이 CTL의 activity에 영향을 미치는지를 평가해 본 결과 가장 높은 농도인 500 μg/mL(96.3%)농도에서 유의적으로 높았으며(P<0.05), 이는 고농도(500 μg/mL)에서 target cell인 P-815 세포를 killing하는 능력이 가장 높다고 할 수 있다.$$a$$a이상의 결과로써 면역능저하 동물모델이 성공적으로 유도된 것으로 사려되며, 실험물질은 세포성 면역능에 미치는 효과로써 밀리타리스동충하초 및 눈꽃동충하초를 단일 물질로 섭취시킨 결과 비장세포에 의한 IL-2 분비능을 유의하게 증가시켰고(p<0.05), 밀리타리스동충하초+눈꽃동충하초복합물은 고용량(1.5% MJM군)에서 IL-2 농도 뿐만아니라 CD4+ T-세포수 및 CD4+/CD8+ 비율을 모두 유의하게 증가시켰다(p<0.05). 반면 체액성 면역반응에는 영향을 미치지 않는 것으로 판단된다. 따라서 본 실험을 통해 밀리타리스동충하초 및 눈꽃동충하초 단일물질보다는 1.5% 수준의 밀리타리스동충하초+눈꽃동충하초복합물이 세포성 면역반응을 매개로 한 면역증진효과가 가장 우수함을 알 수 있었다.$$a$$a

지구성 운동전·후의 L-Glutamine 투여가 면역세포에 미치는 영향

나재철 東亞大學校 大學院 1998 국내박사

본 연구의 목적은 트레드밀을 이용한 점증적 최대부하운동시 혈장글루타민 농도와 면역세포간의 관계를 살펴보고, 장시간 지구성운동전·후의 글루타민 투여가 혈장글루타민 농도와 면역세포에 어떠한 영향을 미치는 가를 비교·검토하는데 있다. 이러한 본 연구의 목적을 효과적으로 수행하기 위해 다음과 같은 일련의 실험을 순차적으로 실시하였다. 실험 Ⅰ에서는 6명의 피검자를 대상으로 트레드밀을 이용한 점증적 최대부하운동시 혈장글루타민 농도와 면역 세포간의 관계를 살펴보고, 실험 Ⅱ와 Ⅲ에서는 14명의 트라이애슬론선수와 10명의 피검자를 대상으로 지구성운동(올림픽코스 트라이애슬론)전과 지구성운동(60%VO_(2)max, 자전거 에르고미터운동)후 글루타민투여가 글루타민 농도와 면역기능에 미치는 영향을 살펴보았다. 채혈은 전완정맥에서 하였으며, 실험 Ⅰ의 경우는 안정시, 운동직후, 회복기 30분, 실험 Ⅱ의 경우는 경기전 공복시와 경기직후에, 실험 Ⅲ의 경우는 안정시, 운동중, 운동직후, 회복기 60분, 회복기 120분에 채혈된 혈액(각 시기에 10㎖)은 실험실에 운반, 보관 및 검사하였다. 혈장글루타민은 Biochrome 20 Amino Acid Analyzer로 분석하였고, 면역세포 중 WBC 및 CBC dift count는 Cell Counter 기기로, 유세포분석은 FACScan과 분석용 Software인 LYSYSⅡ를 사용하여 분석하였다. 혈중글루타민 농도와 면역세포의 측정치를 분석한 결과는 다음과 같다. 첫째, 단기간의 점증적 최대부하운동은 혈장글루타민 농도와 면역세포의 절대수를 증가시켰다. 둘째, 올림픽코스 트라이애슬론 경기전 L-글루타민투여는 혈장글루타민 농도와 면역세포에 영향을 미치지 못한 것으로 나타났다. 셋째, 경기직후에 글루타민투여군에서 혈장글루타민 농도와 세포성 면역세포의 비율과 절대수는 유의한(p<0.01) 감소가 나타났다. 넷째, 장시간 지구성운등(60%VO_(2)max, 70분)직후와 회복기 1시간후의 캡슐글루타민의 투여는 Placebo 투여와 비교하여 혈장글루타민의 농도와 면역세포의 비율과 절대수를 유의하게(p<0.01) 증가시켰다. 이상의 결과에서, 지구성운동 즉 triathlon 실전 경기전 글루타민 투여는 혈액 글루타민 농도와 면역기능에 부정적인 결과를 가져왔으나 자전거에르고미터운동(60%VO_(2)max, 70분)후 글루타민 투여는 긍정적인 영향을 준 것으로 시사하였다. In an effort to consider possible effect of exercise on changes in immune function resulting from alteration of glutamine metabolism, plasma glutamine concentrations and immune parameters were determined when L-Glutamine was supplied before and after prolonged endurance exercise. Three independant experiment were desiged for fulfillment of above purpose, in experiment I, changes of plasma glutamine concentrations and immune cell population were determined in rest, right afer exercise, and in recovery 30 minutes following graded maximal exercise by using treadmill in 6 male subjects. In experiment Ⅱ, the effects of L-Gln administration on plasma glutamine concentrations and immune cells were found to have a variety of changes by adminstration, L-Glutamine into human body before triathlone race about 7 elite male triathletes and 7 male glutamine supplemented groups. The last experiment Ⅲ, the effects both plasma glutamine concentrations and immune cells were found to have a lot of changes by supplementing L-Glutamine into human body in right after the exercise and recovery-60 min of cycle erogometer exercise 70 minutes at V˙O_(2)max of 60% in the 10 healthful male collegians. It was concluded that from above results as follows 1. The graded maximal load exercise of short term was found to increase plasma glutamine concentrations and absolute numbers of immue cells. 2. L-Glutamine supplementation, before olympic course triathron race, was found not to effect on plasma glutamine concentrations and immune cells. 3. Plasma glutamine concentrations and cellular immune cell's percentage and absolute numbers were found to have a significant decrease(P〈0.01) in gutamine supplemented groups, right after olympic course triathlon race. 4. The supplementation of capsule glutamine, compared with that of placebo, was found to have a significant(p〈0.01) increase plasma glutamine concentrations and immune function right after prolonged endurance exercise (60% V˙O_(2)max, 70min), and after recovery-60min, respectively. It was considered that supplementation of capsule glutamine after prolonged endurance exercise was found to be an alternative energy source both in muscle and immune cells after the depletion of muscle glycogen and immune suppressant. As a result it is thought that capsule glutamine supplementation will be regarded as an effective supplementing regimen after exercise.

메뚜기(Euprepocnemis shirakii)의 혈구 분화와 세포성 면역반응

장병수 檀國大學校 1993 국내박사

등검은메뚜기(Euprepocnemis shirakii) 혈구의 분화 경로와 조혈기관의 미세구조 및 이물질 주입에 의한 혈구의 면역반응 양상을 관찰하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 혈구는 미세구조적 특징에 따라 원시혈구, 무정형혈구, I형 과립혈구, II형 과립혈구, 소구혈구 및 편도혈구로 구분되었다. 원시혈구는 순환혈구 중에서 가장 작은 혈구로 핵이 세포질의 대부분을 차지하고 있었다. 무정형혈구는 방추형 또는 많은 세포질돌기를 형성하고 있는 다형으로 세포질에는 리소조옴과 식포가 관찰되었으며, 식포의 융합에 의해서 형성된 multivesicular body가 존재하고 있었다. I형 과립혈구는 구형으로 세포질에 약 0.2-0.3㎛ 크기의 과립을 함유하고 있었으며, 특히 원형질막 가장자리에 세포의 골격을 유지하는 미세소관 다발을 가지고 있었다. II형 과립혈구는 난형 또는 방추형으로 세포질에 약 0.5-0.8㎛의 과립이 세포질의 대부분을 차지하고 있었다. 소구혈구는 장방형으로 세포질에 비교적 전자밀도가 낮은 소구들로 채워져 있었다. 편도 혈구는 구형이고 직경이 25-30㎛ 정도로 혈구 중에서 가장 크며, 세포질에는 환상의 미토콘드리아와 polyribosome이 존재하고 있었다. 조혈기관은 복부 등쪽 익상근 위에 존재하고 있었으며, 복부 첫번째 마디에서부터 여덟번째 마디 사이에 배판을 따라 분포되어 있었고, 망상세포, 시원세포 및 분화중인 혈구들로 구성되어 있었다. 망상세포는 불규칙적인 그물모양의 많은 세포질돌기를 가지고 있었으며, 조면소포체, 골지체 및 pinocytotic vesicle 등이 잘 발달되어 있었다. 시원세포는 핵이 세포질의 대부분을 차지하고 있었으며, 세포소기관은 발달되어 있지 않았다. 분화중인 혈구는 조혈기관내에서 집단을 형성하고 있었으며, 시원세포에서부터 원시혈구, 무정형혈구, 소구혈구 및 과립의 크기가 0.2-0.3㎛인 I형 과립혈구와 0.5-0.8㎛인 II형 과립혈구가 각각 분화되었다. 조혈기관에서 분화된 각각의 혈구는 익상근의 분지된 가지 사이를 통해서 혈림프로 방출되거나, 조혈기관을 성글게 덮고 있는 위심세포들 사이로 방출되었다. 이물질로 주입한 gold 입자와 세균(Bacillus subtilis)에 대한 혈구의 면역반응은 식세포작용의 형태로 확인되었다. Gold 입자는 무정형혈구에 의해서만 포식되었고, 세균은 무정형 혈구와 I형 과립혈구 및 II형 과립혈구에 의해서 포식되었다. 식세포작용의 초기 반응은 혈구의 세포질돌기가 돌출되면서 이물질을 둘러싼 후, 원형질막의 융합에 의해 식포가 형성되었고, 이런 과정은 이물질 주입 후, 10분 이내에 완료되었다. Gold입자를 주입한 경우, 혈구내에 형성된 식포는 초기에 전자밀도가 낮은 막상 또는 섬유상의 내부구조를 가지고 있었으나, 일차 리소조옴의 융합에 의해 전자밀도가 높은 과립상으로 된 후, 결정상의 내부구조로 변형되었으며, 그 이후의 단계에서 multivesicular body 형태의 이차 리소조옴을 형성하였다. 세균을 주입한 경우, 일차 리소조옴은 식포의 한계막과 융합하여 이차 리소조옴을 형성하였으며, 소화된 이물질은 외포작용에 의해서 배출되었다. 화학섬유사(polyester spun)에 대한 혈구의 피낭형성은 주로 I형 과립혈구와 II형 과립혈구에 의해 이루어졌으나, 무정형혈구도 일부 관여하는 것으로 확인되었다. 이물질에 대한 최초의 인식은 I형 과립혈구에 의해 이루어진 후, 이 혈구가 용해됨으로써 II형 과립혈구의 부착이 유도되었으며, 완성된 피낭은 구성하는 혈구의 종류와 구조적 변형, 그리고 혈구간의 연접에 따라 세 부위로 구분되었다. 내층은 이물질에 부착된 후 용해된 I형 과립혈구와 변형된 II형 과립혈구로 구성되어 있었고, 중간층은 I형 과립혈구, II형 과립혈구 및 무정형혈구에 의해 조밀한 층상구조가 형성되어 있었으며, 조직을 이룬 혈구들은 intermediated junction, gap junction 및 desmosome-like structure에 의해 연접되어 있었다. 피낭의 최외각을 둘러싸고 있는 외층은 구조적 변화가 거의 일어나지 않은 II형 과립혈구로 이루어져 있었고, 이 혈구의 자유면에서는 혈림프와 경계를 이룬 약 35nm 두께의 outer sheath가 관찰되었다. 조혈기관의 면역반응을 확인하기 위해서 체내에 주입한 세균(Escherichia coli)은 망상세포의 식세포작용에 의해서 신속하게 제거되었다. 주입된 세균은 30분 이내에 망상세포의 세포질내에 형성된 식포에서 관찰되었으며, 한 개의 세포내에 다량의 식포를 형성하였거나, 한개의 식포내에 수십 개의 세균들이 포식되어 있었다. 이들 식포는 일차 리소조옴과 융합되면서 소화를 진행시켰으며, 세포내에 댜량의 식포를 형성한 일부 망상세포는 자기용해 되었다. 망상세포는 혈구형성에 관여할 뿐만 아니라 식세포작용 능력을 지니고 있는 세포라는 것이 확인되었다. Morphological and ultrastructural characteristics of the hemocytes, the hemopoietic organ, the pathway of hemocytic differentiation and the cellular immune responses from the grasshopper, Euprepocnemis shirakii Bolivar were described using phase contrast microscope, scanning and transmission electron microscope. The hemocytes were of six types: prohemocytes, plasmatocytes, granulocytes I, granulocytes II, spherulocytes and oenocytoids. The prohemocytes were small and spherical cell with large nucleus. The plasmatocytes were spindle-shaped or polymorphic cells which shown numerous cytoplasmic processes on the cell surface and they had lysosomes and vesicles that may be invloved in phagocytic function. Especially, multivesicular bodies were observed in the polymorphic cells. The granulocytes I were spherical-shaped cells. They were characterized by a number of electron dense granules measuring 0.2-0.3 ㎛ in average diameter and marginal bundles of microtubules which were always in close proximity to the cell membrane. The granulocytes II were oval or spindle-shaped cells. They contained large electron dense granules measuring 0.5-0.8 ㎛ in average diameter. Their cytoplasm was filled with numerous granules. The hemopoietic organs located on the upper surface of the alary muscle between 1st and 8th segments, and generally consisted of 3 kinds of cells: the reticular cells, stem cells and differentiating hemocytes. The reticular cells had numerous cytoplasmic processes and formed a complex network. Characteristically, pinocytotic vesicles and rough endoplasmic reticulum were well developed in this cell. The stem cells gave rise to differentiating hemocytes of the different cell lineages: prohemocytes, plasmatocytes, granulocytes I, granulocytes II and spherulocytes. Hemocytic immune responses to the injection of foreign materials such as colloidal gold solution containing gold particles with average diameter of 10 nm into the hemocoel of grasshopper, Euprepocnemis shirakii Bolivar were examined using electron microscope. Only the plasmatocytes which consist of about 28% of total hemocytes participated in this response by the form of phagocytosis, but the other kinds of hemocytes were not reacted. The initial phagocytic response of plasmatocytes was composed of both the first projection of cytoplasmic processes and the second formation of phagocytic vesicles by the surface reaction of the plasma membrane. And this procedure was finished within 10 min after injection. The phagocytic vesicles within the plasmatocytes were comprised electron lucent fibrous or membranous inner structure initially, changed to electron dense granular form after fusion of the primary lysosome, and then developed to secondary lysosome composed of multivesicular body in the next stage. The injection of bacterial suspension(5x10^6 cell/ml) led to the rapid formation of phagocytosis in plasmatocytes, granulocytes I and granulocytes II within 10 min, but nodule formation did not occure. Phagocytosis was accompanied by an initial reaction of forming numerous cytoplasmic process on the cell surface. After recognition of the hemocytes to the bacteria, cytoplasmic processes surrounded the bacteria and fused with the plasma membrane within 10 min after inoculation. As they formed phagocytic vesicle which moved to the interior of the cell. Active primary lysosome accumulated around the phagocytic vesicle and fused with limiting membrane of phagocytic vesicle, then developed to secondary lysosome within 1 hr. Digested bacterial residues were finally released from the cell by exocytosis within 9 hr after injection. In hemocytic encapsulation response after implantation of the spun polyester, multilayered capsule around the spun was formed within 6 hr after injection and three types of hemocytes - granulocytes I, granulocytes II and plasmatocytes - were involved in this response. The initial response by the blood cells was the lysis of granulocytes I on the surface of the implant. Next the granulocytes II attracted to the reaction sites envelope the implants, and form a multilayered capsule composed of three morphologically distinct regions. The inner layer of the capsule attached on the surface of the spun was composed of lysed granulocytes I and compressed granulocytes II. The middle layer of the capsule was comprised of three types of flattened hemocytes composed of granulocytes I, granulocytes II and plasmatocytes. Adjacent plasma membranes of these hemocytes were attached by desmosome-like structure, intermediate junctions and gap junctions. The outer layer of the capsule was composed of 1-2 layers of granulocytes II identical to normal free hemocytes found in the circulation, and along the boundary region to hemolymph 35 nm thick "outer sheath" representing termination of the capsule was identified. The injection of live Escherichia coli(ATCC29622) into the hemocoel of adults of grasshopper, Euprepocnemis shirakii, resulted in a phagocytosis of the number of reticular cells and differentiating hemocytes in the hemopoietic organ. Injected bacteria were rapidly phagocytosed by reticular cells 10 min after the injection. The phagocytic vesicles interacted with the primary lysosome so that a range of enzymes discharged onto the ingested bacteria. The digested bacteria in phagocytic vesicles were changed to electron dense debris. The reticular cells had considerable phagocytic activity to engulfe a large number of bacteria. As a results, many reticular cells undergone lysis, whereas others have engulfed fewer bacteria, succeeded in breaking down the bacteria.

노화쥐의 해마형성체와 내후각뇌피질에서 세포사 관련물질들의 변화에 대한 면역세포화학적 연구

신수진 梨花女子大學校 2000 국내박사

본 연구는 학습과 기억에서 중요한 역할을 담당하는 해마형성체(hippocampal formation)와 내후각뇌피질(entorhinal cortex)에서 노화에 따른 세포사 관련물질들의 변화를 비교분석하여, 노화에 따른 중추신경계의 기능적 변화를 유발하는 기전을 추정하는데 필요한 형태학적 기초 자료를 제공하고자 시행되었다. 연구방법은 노화쥐와 대조군에 4% paraformaldehyde를 심장을 통해 관류하여 고정시키고, 뇌를 적출한 후 40μm 두께로 냉동절단하여 면역세포화학 염색을 하였다. NOS, VIP, c-fos bcl-2, bax, p53에 대한 항체를 각각 희석하여 사용하였고 avidin-biotin peroxidase 용액에서 반응시켰다. 그 다음에 peroxidase를 포함한 3,3'-diamino benzidine 용액에서 발색시키고 gelatin-coated slide에서 말린 후 광학현미경하에서 관찰하였다. NOS와 bcl-2의 경우는 면역세포화학 염색이 선명하지 않아 in situ hybridization도 함께 시행하였다. 연구결과는 다음과 같다. 1. NOS 면역반응 신경세포는 노화쥐의 내후각뇌피질에서 대조군에 비해 현저히 감소하였고(>30%), 수상돌기의 수가 감소하고 길이도 단축되었다. 또한 해마형성체에서 in situ hybridization 시행한 결과 NOS mRNA 양성 신경세포는 노화쥐에서 현저히 감소하였다. 2. VIP 면역반응 신경세포는 주로 양극성 세포이었으며, 노화쥐에서 감소하였고 신경세포에서 수상돌기의 수가 감소하고 길이도 단축되었다. 3. c-Fos의 면역세포화학 염색에서는 핵만 염색되는 것이 특징이었으며, c-fos 면역반응 핵의 수와 염색성이 노화쥐에서 감소하였다. 4. In situ hybridization을 시행한 bcl-2 mRNA 양성 신경세포가 노화쥐에서 감소하였다. 5. Bax 면역반응세포는 대조군과 노화쥐에서 비슷한 분포를 보였고, 염색성이 노화쥐에서 약간 감소하였다. 6. P53 면역반응세포는 대조군에서는 염색이 되지 않았고 노화쥐의 해마 CA1에서만 관찰되었다. 요약하면, 해마형성체와 내후각뇌피질에서 노화와 연관된 NOS, VIP, c-fos 면역반응세포 및 bcl-2 mRNA 양성 신경세포가 감소되었으며 그 중 NOS 면역반응세포가 노화에 따라 가장 현저한 변화를 보였다. 또한 다른 세포사 관련물질들과는 달리 노화에 따른 p53 면역반응세포의 증가가 특징적 소견이었다. Free radicals, neurotrophic factors and protooncogenes were associated with neuronal survival and apoptosis. In this study, the changes of cell death-controlling factors in the hippocampal formation and entorhinal cortex were investigated by immunocytochemical staining in the aged and control rats. Major findings were as follows : 1. The number of nNOS-immunoreactive(IR) neurons in the entorhinal cortex was significantly decreased in the aged rats(>30%). Morphologically, the number of dendritic branches seemed to be decreased and the length of dendrites showed a tendency to shorten in aged group. A major loss of nNOS mRNA positive neurons was observed in the hippocampal formation of the aged rats(>30%). 2. VIP-IR neurons were predominantly bipolar cell. VIP-IR cells were mildly decreased in the hippocampus and subiculum(<15%), and moderately decreased in the dentate gyrus and entorhinal cortex of the aged rats(15-30%). The number and length of dendritic branches also appeared to have decreased and shortened in the aged group. 3. c-Fos immunoreactivity at cellular level was restricted to only the nucleus. c-Fos-IR nuclei were moderately decreased in the hippocampus(15-30%), and severely decreased in dentate gyrus, subiculum and entorhinal cortex of the aged rats(>30%). 4. Bcl-2 mRNA positive neurons were moderately decreased in the hippocampus, subiculum and entorhinal cortex(15-30%), and severely decreased in dentate gyrus of the aged rats(>30%). 5. Bax-IR neurons were similarly distributed between the control and the aged rats, but bax-IR neurons of the aged group than the control group were more weakly immunostained. 6. P53-IR neurons were only observed in hippocampal CA1 region of the aged rats. These results indicate the involvement of neuronal system containing NOS, VIP, c-fos, bcl-2 and p53 in the brain aging process, and provide the morphological evidence for the changes in immunoreactivity of cell-death controlling factors in the hippocampal formation and entorhinal cortex of aged rats.

人胎盤絨毛에서의 Placental lactogen 生成細胞에 對한 免疫組織化學的 및 免疫細胞化學的 硏究

박주현 全南大學校 大學院 1986 국내박사

Human placental lactogen(hPL)은 胎盤에서 分泌되는 hormone의 하나로서 妊娠年齡(gestational age) 6週부터 母體의 血淸에서 檢出되며 妊娠年齡과 더불어 점차 增加되어 36週에는 最高値에 達한다. 母體 血淸內 hPL値는 胎盤容積과 正比例的 關係에 있으므로 fetal wellbeing과 成長遲延의 豫見擔標로 利用되어 왔다. 最近에는 測定法의 發達로 妊娠 早期診斷에의 利用 可能性도 示唆되었으나 그 銳敏度는 受精卵의 着床 直後부터 母體 血淸內에서 檢出되는 human chorionic gonadotropin(hCG)의 銳敏度에 미치지 못하고 있다. hPL은 mammotropic, luteotropic, diabetogenic, growth-hormonelike activity 및 免疫抑制作用을 갖는다고 알려져 있다. 그러나 hPL의 免疫抑制作用이 胎盤에 局所的으로 발휘되는지 아니면 hPL이 母體血液內로 流入되어 全身的으로 발휘되는지에 對하여는 異見이 있다. 著者는 사람의 胎盤組織에서 hPL을 免疫組織化學的 및 免疫細胞化學的으로 觀察하여 hPL生成細胞의 出現樣態와 同細胞의 妊娠年齡에 따른 變化를 調査하였으며 hPL과 微細構造 사이의 關係를 調査하여 다음과 같은 結論을 얻었다. 1. hPL 陽性反應은 合胞營養膜에서 觀察되었고, 細胞營養膜과 그外의 間質細胞 및 母體의 子宮內膜 細胞는 陰性反應을 보였다. 滿期胎盤組織에서 볼 수 있는 合胞結節은 hPL 陽性反應을 보였으나 類纖維樣 物質은 陰性이었다. 2. 姙娠 第一期의 營養膜은 hPL 陽性反應인 合胞營養膜 外에도 相當數의 陰性反應인 合胞營養膜으로 構成되었다. 妊娠年齡이 增加할수록 hPL 陽性反應인 合胞營養膜의 數나 染色度가 增加하였으나 姙娠 第二期의 胎盤絨毛에서는 陰性反應인 合胞營養膜을 少數 觀察할 수 있었다. 그러나 滿期胎盤組織의 合胞營養膜은 大部分 强한 陽性反應을 보였다. 3. hPL 陽性物質은 合胞營養膜 租面內形質網의 權內에서 主로 出現하였고 그外 核周圍槽와 絨毛間腔쪽의 小胞內에서 觀察되었다. 合胞營養膜의 細胞膜에 沿한 陽性反應은 認定되지 않았다. 以上의 成績으로 미루어 母體 血淸內 hPL値는 營養膜塊外에도 合胞營養膜의 hPL 陽性度와도 密接한 關係가 있을 것으로 思料되었다. 또한 hPL의 生理的 作用은 胎盤에서 局所的으로 發揮되기 보다는 母體 全身에 걸쳐 發揮될 것으로 示唆되었다. Maternal serum levels of human placental lactogen ( hPL ) are regarded to reflect the total amount of trophoblastic mass because it is well know that hPL is synthesized and secereted by the syncytiotrophoblasts. Hence, serum hPL levels are measured to predict fetal well-being and growth retardation. However, hPL positivity of the syncytiotrophoblasts in different gestational periods and ultrastructural location of hPL are scarcely reported. In this paper, hPL-producing celles in human placental tissue of 14 cases at various gestational periods (6 weeks to full-term) were examined with juconjugated immunoperoxidase staining at light and electron microscopic levels. The results were as follows. 1. Throughout the gestational periods, hPl-positive reaction was observed in the cytoplasm of syncytiotrophoblasts. Cytotrophoblasts, and endothelial cells and other cells in th villous stroma as well as the cells of maternal origin gave negative reaction. Syncytial knots, observed in the placentae of the full-term, showed strong positive reaction whereas 'fibrinoid' material showed negative reaction. 2. In the first trimester, a considerable portion of the chorionic villi were covered by the hPl-negative syncytiotrophoblasts. As the pregnance progressed, more uniform and stronger positive reaction for hPL was observed, but the hPL-negative syncytiotrophoblasts were observed still in the chorionic villi of the second trimester. most syncytiotrophoblasts in the full-term were strongly positive for hPL. 3. hPL-positive reaction products were present mainly in the cisternae of the rough endoplasmic reticulum, in some vesicles in the cytoplasm facing the intervillous spaces, and in the perinuclear cisterna of the syncytiotrophoblasts. Positive reaction along the cell membrane of the sycytiotrophoblasts was not observed. These results indicate that maternal serum levels of hPL may be dependent on not only the trophoblastic mass but also the positivity of the syncytiotrophoblasts. Also considered is that hPl may display in the biological effects systemically rather than locally in the plecental tissue.