酸加水分解 돼지胎盤의 添加給與가 離乳仔豚의 成長에 미치는 影響

노하영 건국대학교 농축대학원 2009 국내석사

본 연구에서는 산가수분해된 돼지태반을 단백질대체제로 제조하여 이유자돈 사료의 단백질원 대체제로서의 가능성 실험을 수행하였다. 3원교잡종[(Landrace X Yorkshire) X Duroc] 이유자돈 252두를 공시하여 대조구(control), 처리구 T1(돼지태반 1% 첨가급여구) 및 처리구 T2(돼지태반 2% 첨가급여구)로 3개 처리를 하였다. 일당증체량은 실험 2∼4주 구간이 대조구가 435g이었고, 처리구 T1은 412g, 처리구 T2는 468g으로 증체되어 돼지태반 2% 첨가급여구가 대조구보다 오히려 더 높았다. 사료 요구량은 대조구가 1.64kg, T1이 1.603kg, T2가 1.459kg으로 이유자돈 체중 1kg을 늘리는데 T2의 사료 요구율이 가장 낮았다. 사료효율은 0∼2주간을 조사하였을 때 대조구가 1.16이었고 처리구 T1이 0.75, 처리구 T2가 0.93이었다. 2∼4주간 사료효율은 각각 0.445, 0.57 및 0.595이었고, 총 구간의 사료효율은 각각 0.609, 0.623, 및 0.68로 T2가 높은 경향을 나타내어 산가수분해 돼지태반의 첨가급여가 식물성 단백질 대체제로 사용될 수 있음을 시사하였다. 바이러스 감염을 조사한 결과 대조구와 처리구들간의 차이점이 없었다. 자돈의 혈액성분을 분석한 결과 Total protein과 albumin이 돼지태반으로 단백질을 대체한 처리구에서 유의성 있게 높게 나타났다. 분변내의 휘발성 지방산 성분을 분석한 결과 대조구보다 T1과 T2 처리구가 보다 감소하였다. 분변내의 β-glucuronidase 활성을 측정한 결과 대조구에서 24.5 Unit이었고 T1에서는 22.1 Unit이었으며, T2에서는 18.4 Unit로 낮았다. 분변의 샘플로부터 LB와 MRS배지에서의 총세균수의 경우 대조군에 비하여 처리군에서 약간 높게 나타났다. 대장균인 E. coli의 수는 4주차에서는 처리군에서 현격한 감소를 나타났으나, 이것이 산가수분해 돼지태반 첨가효과인지는 앞으로 보다 상세한 실험이 요구된다고 사료된다. 본 연구 결과는 산가수분해된 돼지태반을 이유자돈 사료의 단백질원으로 긍정적으로 사용될 수 있다는 것을 시사하였다. In this study, dietary acid hydrolyzed pig placenta additives were prepared and tested for the possibility of alternative feed protein sources on the growth performance of weaning piglets. Two hundred fifty-two crossbred[(Landrace X Yorkshire) X Duroc] weaning piglets were used for the Control, T1[Acid hydrolyzed pig placenta additives, 1%(w/w)], and T2[Acid hydrolyzed pig placenta additives, 2%(w/w)] groups. Average daily weight gains were Control: 435g, T1: 412g, and T2: 468g during 2∼4 weeks, indicating that T2[Acid hydrolyzed pig placenta additives, 2%(w/w)] group was higher than the Control. Feed conversion ratio was Control: 1.64, T1: 1.603, and T2: 1.459 during the experiment, showing that T2 group was most low. Feed efficiency was Control: 1.16, T1: 0.75, and T2: 0.93 during 0∼2 weeks and 0.445, 0.57, and 0.595 during 2∼4 weeks, respectively. Feed efficiency for 4 weeks was 0.609, 0.623, and 0.68, respectively, suggesting that dietary acid hydrolyzed pig placenta additives will be used as alternative plant protein sources. No significant difference was found in virus infection among three groups. From the analysis of serum ingredients, total protein and albumin of T1 and T2 groups were significantly higher than the Control. The concentration of volatile fatty acids in feces of T1 and T2 was decreased compared to the Control. β-glucuronidase activities in the feces were Control: 24.5, T1: 22.1, and T2: 18.4 units. Bacterial counting was measured from the piglet feces. CFU in T1 and T2 groups were slightly higher than Control on LB and MRS media. CFU for E. coli was surprisingly decreased in T2 compared to Control at the fourth week. It should be further characterized that acid hydrolyzed pig placenta additivesthe will decrease a pathogenic bacteria. In conclusion, this research suggests that acid hydrolyzed pig placenta additives can be used as a protein sources for the piglets feed.

Porcine placenta로부터 기능성화장품 소재 개발

김보영 인제대학교대학원 2010 국내석사

國文抄錄 Porcine placenta로부터 기능성화장품 소재 개발 金 甫 映 (指導敎授 : 金 東 昱 ) 仁濟大學校 大學院 食醫藥生命工學科 製藥工學 專攻 본 연구에서는 기존의 소재와는 다른 미백, 주름 등을 억제하는 물질을 탐색하는 중 돼지 태반을 이용해 돼지의 태반에서 유효성분을 추출, 정제하여 효능효과 시험을 통하여 기능성 화장품소재로서의 가능성을 검토하고자 하였다. 돼지 태반은 경남 함양에서 구입하였으며 물로 세척하여 혈액을 제거한 뒤 알칼리 가수분해와 단백질분해효소 처리를 하였다. MTT assay로 소재에 대한 세포독성을 알아보고 DPPH free radical scavenging assay로 소재의 항산화 능력을 평가하였다. 미백효능을 시험하기 위해 L-tyrosine과 DOPA를 기질로 한 tyrosinase inhibition assay를 실험하였고 Melanoma cell에서의 melanin 생합성 저해율을 측정하였다. 주름개선효능 측정으로 elastin을 기질로 한 elastase inhibition assay와 collagen synthesis assay를 실험하였다. 항균효과는 피부상재균인 Staphylococcus aureus 등을 사용한 disc diffusion method를 사용하였다. 단백질 함량분석결과 효소로 처리한 돈 태반 추출물이 13.5 mg/ml 로 가장 높은 단백질 함량을 보여주었다. MTT assay의 결과 알칼리 가수분해 처리 후 pH 9로 조절한 추출물의 경우 20 μg/ml 농도까지 세포 생존율이 90% 이상 매우 안전성이 우수하였다. 항산화실험결과 효소처리 2시간 200 μg/ml 의 추출물농도에서 79%의 항산화력을 보여주어서 vitamin C와 유사한, 매우 우수한 결과를 보여주었다. Tyrosinase inhibition assay 결과 알칼리가수분해 처리 중 pH 9은 200 μg/ml에서 37.2%의 저해활성을 나타내었다. 주름개선 효능 측정으로 elastase 저해활성을 측정한 결과 효소처리 2시간, 16시간의 경우400 μg/ml에서 62, 65%로 ursolic acid와 비교하였을 때 매우 우수하였다. 이상의 결과로 미루어 보아 돈태반 추출물은 항산화 및 주름개선 효과가 우수함을 알 수 있었고, 기능성 화장품 소재로의 가능성을 확인할 수 있었다. Key word : 돼지 태반, 항산화효과, 미백효과, 주름개선효과 Abstract Development of functional cosmetic agent from Porcine placenta Bo Young Kim (Advisor : Prof. Donguk Kim) Department of Smart Foods & Drugs Pharmaceutical Engineering Major Graduate School, Inje University In this research, Porcine Placenta was tested to see the possibility as functional cosmetic agent. Porcine Placenta from Hamyang-gun, Gyongnam was linsed with fresh water, and treated with either alkali solution or protease. Total protein content was analyzed with BCA protein assay kit. MTT assay was done using CCD-986sk human fibroblast cell. Anti-oxidation effect was measured by DPPH free radical scavenging assay and whitening effect was determined by tyrosinase inhibition assay and Melanogenesis inhibition assay. Anti-wrinkle effect was measured by elastase inhibition assay and collagen synthesis assay. Antibacterial effect was measured by disc diffusion method using Staphylococcus aureus. From the experimental data, Porcine Placenta extracts treated with protease showed highest protein content of 13.5 mg/ml. Cell viability from MTT assay was over 90% at pH 9, 20 μg/ml concentration for alkali treatment. Anti-oxidation effect from DPPH free radical scavenging assay was 79% at 200 μg/ml concentration for 2 hour enzyme treatment, which was similar with vitamin C. Whitening effect by tyrosinase inhibition assay showed 37.2% inhibition at pH 9 and 200 μg/ml. Anti-wrinkle effect from elastase inhibition assay showed 62 and 65% inhibition respectively at 2 hour and 16 hour protease treatment for 400 μg/ml concentration. From the result, Porcine Placenta extracts showed good anti-oxidation and anti-wrinkle effect, and have strong possibility for functional cosmetic agent. Key word : Porcine placenta, Anti-oxidation, Whitening, Anti-wrinkle effect

Development of new functional cosmetic agent from porcine placenta and amniotic fluid

김타곤 인제대학교대학원 2011 국내석사

본 연구에서는 돈 태반 및 양수로부터 유효성분을 추출하여 기능성화장품소재로서의 가능성을 알아보고자 하였다. 돈 태반을 단백질 분해효소를 사용하여 가수분해 하여 추출물을 얻었고, 양수는 5,000rpm으로 원심분리 한 후 상등액을 여과 건조시켜 시료를 얻었다. 소재의 안전성 평가를 위해 MTT assay와 단회투여독성시험, 피부1차자극시험, 안점막자극시험을 실시하였다. 항산화 능력을 평가하기 위해 DPPH free radical scavenging assay실시하였고, 미백효과를 알아보기 위해 L-tyrosine과 DOPA를 기질로 한 tyrosinase inhibition assay를 실험하였고, 피부미백에 영향을 주는 mouse melanoma cell의 활성에 영향을 주는 정도를 알아보았다. 주름개선의 효과를 알아보기 위해 elastase와 collagenase효소의 억제 정도를 평가하였고, collagenase생성 억제 정도와 collagen 생성 유도 정도를 평가하였다. MTT assay 결과 500 ㎍/㎖ 농도의 돈 태반 추출물 및 양수 모두 90% 이상의 세포 생존을 보였고, 동물실험결과 자극이 없음을 보여 기능성 소재로서 안전성을 확인 할 수 있었다. 항산화효과는 미미하였고 미백 효과는 B16F10 mouse melanoma cell의 활성을 감소시킴을 알 수 있었다. 주름개선 효능 시험에서는 태반추출물과 양수의 500 μg/ml 농도에서 elastase 저해율이 각각 35% 와 33% 보인 반면 adenosine은 14% elastase inhibition을 보였다. 돈 태반 추출물 및 양수 500 μg/ml 농도에서 collagen 합성률이 40%와 50%로 향상 각각 향상되었다. collagenase inhibition을 확인한 결과 1,000 ㎍/㎖ 농도에서 35%, 30%였고, 2,000 ㎍/㎖ 농도에서 65%, 40%로 의존적으로 증가함을 알 수 있었다. 따라서 돈 태반 추출물 및 양수는 우수한 주름개선 효과 및 안전성, 안정성을 보여서 기능성화장품 소재로서 가능성이 매우 높음을 알 수 있었다. In this research, porcine placenta and amniotic fluid were tested to see the possibility as functional cosmetic agent. Porcine Placenta was treated with protease to obtain extract. Amniotic fluid was obtained by centrifugation at 5,000 rpm and filteration. Cell toxicity test for porcine placenta extracts and amniotic fluid was done in 50-1,000 μg/ml concentration using human fibroblast cell(CCD-986sk) and B16F10 mouse melanoma cell. Porcine placenta extracts and amniotic fluid did not show significant toxicity. Animal test was done for single dose toxicity test, single patch test and ocular irritation test. Porcine placenta extracts and amniotic fluid did not indicate any malfunction for mouse and rabbit. Anti-oxidation test was done by DPPH free radical scavenging assay and antioxidation effect of porcine placenta extracts and amniotic fluid was relatively mild compared with vitamin C. Whitening effect was tested by tyrosinase inhibition assay, DOPA oxidation inhibition assay, Melanogenesis inhibition assay and DOPA staining effect. In Melanogenesis inhibition assay and DOPA staining effect, porcine placenta extract and amniotic fluid showed good whitening effect. Anti-wrinkle effect was studied by elastase inhibition assay, collagen synthesis assay, collagenase synthesis inhibition assay and collagenase inhibition assay. In elastase inhibition, porcine placenta extract and amniotic fluid showed excellent anti-wrinkle effect to be cosmetics ingredients. Collagen synthesis of porcine placenta extracts and amniotic fluid showed maximum effect at 500 μg/ml. Collagen synthesis of both porcine placenta extracts and amniotic fluid was outstanding. Cream containing 1% amniotic fluid was prepared to examine stability of the ingredient. The appearance, viscosity and pH did not change significantly, and amniotic fluid was very stable in cream formulation. Porcine placenta extract and amniotic fluid also indicated excellent safety and stability. Porcine placenta extract and amniotic fluid has strong potential for functional cosmetic agents

Gene and Protein Expression Profiling of Term Placenta and Umbilical Cord from Somatic Cell Nuclear Transfer-derived Pigs

박종이 경상대학교 대학원 2006 국내박사

체세포를 이용하여 형질전환 복제동물을 생산하는 목적은 동물의 유전형질을 개량이나 질환모델 동물의 생산 그리고 의약품 생산을 위한 바이오리엑터의 개발 등 산업적, 의학적으로 활용하는데 있다. 그러나, 복제동물의 생산은 그 효율이 매우 낮을 뿐만 아니라, 임신 중 유산, 뇌수막염, 간울혈 등 내장기 이상현상이나 분만 후 저체중 산자 생산, 조기 사망 등과 같은 많은 문제점들이 보고 되고 있지만 그 원인에 대한 연구는 아직까지 미비한 실정이다. 따라서, 본 논문에서는 복제동물의 보다 효율적인 생산과 발육부전 현상을 보이는 복제돼지의 태반과 제대에 있어 유전자 및 단백질의 발현양상을 real-time RT-PCR, oligonucleotide DNA chip과 Two-DE gel 및 Western blot 분석 등을 통하여 그 원인을 규명하고자 하였다. 체세포를 이용한 핵치환 유래 돼지 산자는 대부분 114일에서 121일 사이에 태어난다. 체세포 핵치환 복제돼지의 태반 무게는 대조군에 비하여 현저히 적으며, 두드러진 융모층 손상들로는 cytotrophoblast cell이 부족하고, 모양이 불규칙하며, vasculosyncytal membrane이 불충분 하였다. 체세포 핵치환 유래 태반들에 있어서는 Flt-1 type VEGF receptor 그리고 Flk-1 type VEGF receptor mRNA 발현은 현저하게 증가하는 반면 Met protooncogene, transcriptional enhancer factor-5, vascular endothelial growth factor, angiopoietin-1, angiopoietin-2, matrix metalloprotease 9 과 tyrosine kinase Tie-2 mRNA의 발현은 감소하였다. 단백질 네트워크에 대해 좀더 깊은 통찰을 얻고자 체세포 핵치환 및 대조군의 분만 후 태반에서의 다양한 단백질 발현양상을 평가하였다. 체세포 핵치환 유래 분만 후 태반들에서는 14-3-3 epsilon 과 zeta 와 같이 신호와 관련하거나, tropomyosin isoform이나 annexin II와 V 같이 인지질과 결합하는 단백질처럼 세포 이동 또는 구조에 기능 하는 43개의 상이하게 발현되는 단백질이 나타났다. 또한 galactokinase와 alpha-enolase와 같은 대사 관련 단백질들의 down-regulation도 관찰되었다. Flow cytometry와 Western blot 분석에서 체세포 핵치환 유래 태반의 p53은 미토콘드리아 매개 괴사 동역학을 경유하여 영양막세포층 세포들의 괴사를 유도하며, 두드러진 융모층 손상들은 자궁태반의 국소빈혈에 2차적으로 작용함을 확인하였다. 부적합한 태반 유래의 체세포 핵치환 돼지 산자들은 결론적으로 심각한 폐와 간의 울혈 또는 뇌에서의 neutrophilic inflammation을 일으켰다. 탯줄은 일반적으로 하나의 정맥과 두개의 동맥으로 구성되어 있다. 발육부전성 제대동맥은 아마도 태아의 기형이나 유전적 이형, 조산, 저체중 출산과 관련이 있을 것으로 예상되며, 체세포 핵치환 유래 돼지산자의 제대내에서 동맥의 발육부전 유발이 출생 후 조기사망과 깊은 관련이 있을 것이라고 생각된다. 제대 시료는 3개의 정상 대조군과 65개의 체세포 핵치환 유래의 돼지에서 확보하였다. 65개의 체세포 핵치환 유래의 돼지 제대에서, 8개는 제대 동맥의 심각한 손상으로 인해 여러 장기에 이상을 유발하였다. 체세포 핵치환 유래의 돼지들(0.80+0.29g, n=8)은 일반적인 돼지들(1.27+0.30g, n=18)보다 제대의 무게가 적었다. 조직학적으로 관찰했을 때는 신장과 태반에서 부분적으로 석회화가 일어나고 있었으며, 간 혈관에 있어서는 peliosis 현상이 나타나고 있었다. 그리고 폐에서는 비정상적으로 stroma cell 이 증식하고, 신장의 관들이 퇴화되어 있는 것도 관찰할 수 있었다. 제대동맥의 기형에 관여하는 후보유전자를 찾기 위해 oligonucleotide DNA chip과 Two-DE gel을 이용했다. 그 결과 체세포 핵치환 유래의 돼지 제대에서는 발육부전성 동맥(hypoplastic arteries), 혈관신생관련 유전자(angiogenesis-related gene), 대사관련 유전자(metabolism-related gene), 항산화관련 유전자(antioxidant-related gene), 세포사관련 유전자(apoptosis-related gene)들에 이상이 있음을 발견하였다. 이런 제대에서 영양분을 받고 태어난 돼지들은 태어난 지 1주일 이내에 대부분 사망 하였는데, 이런 현상의 원인은 오랜 시간 모체와 태아 사이의 혈액순환에 문제가 있었기 때문이라고 예상된다. 결론적으로 본 연구의 결과는 부적합한 태반은 VEGF/MET 경로에 의한 세포 사로부터 유래되고, 체세포 핵치환 유래의 대부분 돼지에서 저체충 출산과 기형은 제대 동맥 발육부전과 관련이 있는 것을 확인하였다. 따라서 발육부전성 제대 동맥을 가지고 태어난 체세포 핵치환 유래의 돼지 산자는 출생 후 조기사망 등과 관련이 있다고 추측할 수 있으며, 태반 및 제대에서의 유전자 및 단백질 발현에 대한 proteomic map은 태반 부적합과 병리학에 있어서 향후 연구를 위한 중요한 기술이 될 수 있을 것으로 사료된다.

돼지 태반 열수 추출물의 면역 조절인자 탐색과 사료첨가제로서의 활용에 관한 연구

임규섭 건국대학교 대학원 2011 국내박사

In this study, 3 experiments were performed to (1) investigate the in vitro immunological activities and cytotoxicities of various fractions extracted from porcine placenta and (2) evaluate the dietary effects of raw aqueous porcine placental extract obtained 80℃ on the growth performance of weaning piglets and their corpuscle profile, especially with regards to leukocytes, immunoglobulins, and cytokines. Experiment 1 evaluated the effects of various fractions extracted from porcine placenta with respect to immunological bioactivity and cytotoxicity. Aqueous, alkaline, and organic solvent extracts were obtained from porcine placentas. The aqueous extracts were divided according to the time taken for extraction and the temperature at which it was performed. Alkine and organic solvent extracts were obtained using NaOH and Folch solution, respectively. J774A.1 macrophages obtained from mice were stimulated by the fractions and were assessed for nitrite content by using Griess solution. The cytotoxic effect of porcine placental extracts on mouse macrophages was evaluated using the MTT[3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)2, 5-diphenyl tetrazolium bromide)] method and a LDH(lactate dehydrogenase) non-radioactive cytotoxicity assay kit. Macrophages activated using raw aqueous porcine placental extract obtained at 80℃, raw aqueous porcine placental extract obtained at 60℃, or raw NaOH extract fraction containing IFN(interferon)-γ had increased nitrite secretion; this increase was dose-dependent in the case of exposure to the extract obtained at 80℃. An increased level of ROS(reactive oxygen species) release was observed in J774A.1 macrophages challenged using raw aqueous porcine placental extract obtained at 80℃. However, supplementation with 1mg/ml raw aqueous porcine placental extract obtained at 80℃ or at 100℃ had no cytotoxic effect on the mouse macrophages. Thus, the results indicate that raw aqueous porcine placental extract obtained at 80℃ had immunological activity and were not cytotoxic effect, and they can therefore be used an in vivo test as an immuno-modulating agent. Experiment 2 was performed to investigate the effects of oral administration of raw aqueous porcine placental extract obtained at 80℃ on the immune response in mice. The corpuscle profiles of blood were tested for 120 female Balb/C mice that were randomly segregated to 12 treatments of 10 mice each for 7 d. Whole blood samples were obtained from mice at the end of this experiment. The mice were provided water containing 1mg/ml of PBS(phosphate buffer saline); 1mg/ml of medium(RPMI-1640); and 1, 10, or 20 mg/ml of raw aqueous porcine placental extract obatined at 80℃, raw aqueous porcine placental extract obtained at 100℃, or raw NaOH extract, respectively. Immunoglobulin and cytokine secretion were measured in 140 female Balb/C mice that were randomly segregated into 7 groups of 20 mice each and were orally administered porcine placental extract obtained at 80℃ for 21 d. Whole blood samples were obtained from mice at days 4, 7, 14, and 21. The mice were provided water containing 1mg/ml of medium(RPMI-1640); 1 mg/ml of ovalbumin; and 10, 20, 50, or 75 mg/ml of raw aqueous porcine placental extract obtained at 80°C. The blood leukocyte and erythrocyte levels for the groups that had been administered raw aqueous porcine placental extract obtained at 80°C and raw NaOH extract were significantly higher than those for the control group(P < 0.01). About leukocyte and erythrocyte, they are in a dose dependent manner. The IgG values on day 4 and the IgM vleues on d 14 and 21 were significantly different for the group that had been administered 20 mg/ml raw aqueous porcine placental extract obtained at 80°C and the group that had been administered 50 mg/ml of this extract(P<0.01). In addition, the levels of the cytokines IL(interleukin)-1β, IFN-α, and TNF(tumor necrosis factor)-α in murine sera significantly increased on treatment with raw aqueous porcine placental extract obtained at 80°C. Thus, the results indicate that raw aqueous porcine placental extract obtained at 80°C can be used as feed supplement for immune-stimulation in pigs. In experiment 3, 200 crossbred (Yorkshire × Large White × Duroc; castrated male piglets, 100; female piglets, 100) weaning piglets (initial body weight, 5.01 ± 0.12 kg) were segregated into 4 groups of 50 pigs each; for 21 d, each group was fed 1 of the 4 experimental diets that contained 0%, 0.1%, 0.3%, or 0.5% of raw aqueous porcine placental extract obtained at 80°C. Six pigs were randomly selected from each group, and ear tags were attached to each pig for identification with regard to blood sampling. The body weights, corpuscle profiles with respect to leukocytes, and immunoglobulins and cytokines levels were measured on days 0, 7, 14, and 21. Significant differences were observed in the body weights of piglets fed the experimental diets(P < 0.01). The leukocyte counts and the proportion of neutrophils in the leukocytes were not influenced by dietary treatment. However, the proportions of eosinophils, basophils and monocytes on day 21 were affected by supplementation with 0.3% raw aqueous porcine placental extract obtained at 80°C(P < 0.01). The IgG levels were significantly higher(P<0.01) at day 14 on treatment with the raw 0.1% aqueous extract obtained at 80°C than on treatment with the control, whereas for the 0.3% extract, the levels obtained on days 7 and 21 were significantly higher than those obtained with the control. However, no significant difference was observed in the serum IgE concentrations. The IL-1β and IFN-γ concentrations obtained after treatment with 0.3% raw aqueous extract obtained at 80°C were significantly higher than those obtained after treatment with the control. These results suggest that raw aqueous porcine placental extract obtained at 80°C can act as immuno-modulators in weaning piglets, without any adverse effects. Therefore, it can be concluded that raw aqueous porcine placental extract obtained at 80°C will be a good candidate as an immunomodulator that can be used as a feed supplement for piglets.

Human placenta derived mesenchymal stem cells enhance bone regeneration in porcine mandibular defect

이의석 서울대학교 대학원 2009 국내박사