간섭적 효과를 회피하는 직접적 글루코즈 산화를 위한 다공성 금 양극 및 산소 환원을 위한 빌리루빈 옥시다제 음극에 관한 연구

조상은 전북대학교 대학원 2009 국내박사

본 연구는 PAA-PVI-[Os(dcl-bpy)2Cl]^(+/2+)와 BOD 효소가 전선연결된 BOD 음극에서의 촉매적 산소 환원반응의 비활성화를 초래하는 유레이트의 영향을 극복할 수 있는 새로운 전극수식법에 대하여 수행한 결과이다. BOD 음극과 수식층의 전하분위기를 조절하는 원리를 이용하여 양이온 분위기의 BOD 효소층 위에 음이온 유레이트와 전하반발력을 일으킬 수 있는 음이온막인 나피온을 도입하고자 하였다. 그 결과 나피온 코팅처리는 유레이트에 대한 차단은 효과적이었으나 음이온막인 나피온 자체로 인해 BOD 음극의 활성을 잃게 한다는 것을 확인하였다. 이를 보완하기 위하여 BOD 음극과 나피온막 사이에 양이온 분위기의 BOD 음극을 보호할 수 있도록 양이온 분위기의 양이온 중간막을 도입하였다. PAA-PVI가 적합한 후보 물질임을 확인하였으며, 이후 유레이트 영향을 최소화 하면서 최대의 산소 환원전류를 얻을 수 있는 PAA-PVI 층의 코팅부피를 결정하였다. 최종적으로 25 mg/mL PAA-PVI 15 μL와 1 wt% 나피온 6 μL 순으로 이중막 코팅처리한 BOD 음극을 사용하여 체내 조건과 유사한 pH 7.4, 0.15 M NaCl, 포스페이트 완충용액에서 유레이트의 부정적인 영향을 피한 성공적인 결과를 얻을 수 있었다. 한편 PAA-PVI/나피온-BOD 음극을 세룸에 적용할 경우 3시간 정도에 산소 환원 활성을 잃는 것을 확인하였으며, 이로 인하여 유레이트 이외에도 여러 방해물질의 존재 가능성을 제안하였다. 따라서 유레이트 이외에 세룸 구성 성분인 글루타티온, NADH, SCN^(-), Br^(-), 락테이트, 피루베이트, 하이드로부틸레이트, 아세토아세테이트, 타우린의 영향을 조사하였다. 그 결과 글루타티온, NADH, SCN^(-)이 추가적으로 BOD 음극의 비활성화를 초래하는 물질로 판명되었다. 이들 중 음이온인 NADH와 SCN^(-)은 PAA-PVI/나피온 이중막 코팅처리로 영향을 차단할 수 있었다. 하지만 중성인 글루타티온은 제안한 수식전극에서 50 %에 달하는 전류감소 현상을 야기시켰으며, 이는 글루타티온이 BOD 음극의 비활성에 책임이 있는 세룸 성분 중 하나임을 의심하게 한다. 현단계에서 PAA-PVI/나피온 수식 BOD 음극이 음이온 방해물질의 차단에 효과적임을 알 수 있었으며, 중성 방해물질의 손상 영향을 방지하기 위한 추가적인 연구가 이루어져야 할 것이다. The electrocatalytic glucose oxidation and oxygen reduction reactions have been studied extensively because of their potential applications to sensors and glucose-oxygen biofuel cells. For most results, enzyme electrodes were generally employed. Glucose oxidase or glucose dehydrogenase for the glucose anode, and laccase or bilirubin oxidase for the oxygen cathode have been used. The enzyme electrodes, however, have some disadvantages of a complicated fabrication and insufficient stability due to the instinct enzyme natures. Interfering effects of some electro-oxidizable biological components such as ascorbic acid, urate, and acet- aminophen should be also overcome. This dissertation includes the studies of the direct glucose oxidation at noN^(-)enzymetic porous gold electrodes in part I-1 through I-3 and an anioN^(-)excluding bi-layer protecting the wired-bilirubin oxidase cathode against anioic interfering species in part II. In part I-1, glucose oxidations avoiding the interfering effect of ascorbate at porous gold electrodes after amalgamation treatments were studied. The amalgamation treatment produced a highly porous structure at a gold electrode surface and catalytic effects of reducing overpotential and increasing oxidation currents were resulted. With these effects, a good selectivity for glucose oxidation against ascorbate, which is a common interfering species, could be obtained. With a gold electrode with a 60s amalgamation treatment, an optimal condition was determined and two glucose calibration curves at different potentials were made in a normal human glucose concentration range in the presence of 0.1 mM ascorbate. Sensitivities of 16 Acm^(-2)mM and 32 Acm^(-2)mM at -0.1 V and +0.25 V, respectively, were evaluated. In part I-2, EQCM studies were carried out during the glucose oxidations at a gold surface, on which gold nanoparticles were electrochemically deposited. In an open circuit potential condition, glucose was injected and mass change was detected by the QCM experiments. A spontaneous adsorption of glucose at the electrode surface with the gold nanoparticles attached was observed by the surface mass increase while no mass change was measured at a bare gold electrode. During the oxidation of the adsorbed glucose, the EQCM measurements indicated desorption of the product from the surface. As the surface became inactive, the glucose seemed not to adsorb on the surface any more. In part I-3, an effect of different size of gold nanoparticles in the direct glucose oxidation was investigated. Gold nanoparticles of 7.2, 17.3, and 30.7 nm diameters were prepared and characterized by size distribution analyzer, uv-vis spectroscopy, and FE-SEM. They were spontaneously adsorbed on the EPG surface, which was employed for the glucose oxidation. In the comparison of the glucose oxidation current vs. the microscopic surface area of the gold nanoparticles among different sizes, size effect was observed. As the size of the gold nanoparticles became smaller, higher glucose oxidation current was measured. In part II, studies regarding to the protecting bi-layer against biological components damaging the wired-BOD cathode for the electrocatalytic reduction of O₂ were carried out. The anioN^(-)excluding membrane, Nafion, can not be directly used because of its de-wiring effect in the electrostatic binding of the BOD enzymes with the redox polymer chains. An intermediate layer of cationic polyacrylamide-poly-N^(-)vinylimidazole between the BOD cathode and the anionic Nafion was introduced. With this bi-layer, the BOD in a phosphate buffer solution could be protected from the Nafion layer and influxes of anionic interfering species, such as urate, NADH, and SCN^(-), could be successfully prohibited. The bi-layer over-coated BOD cathode was also examined in a bovine serum, and its activity was still lost in a few hours, which suggests the existence of other damaging species in addition to the anionic interfering species.

PAA-b-LCP functionalized cholesteric liquid crystal droplet prepared by microfluidics for application to glucose biosensor : 마이크로플루이딕스를 이용한 PAA-b-LCP 기능화 된 콜레스테릭 액정 액적 제조 및 글루코즈 바이오센서로의 응용

이현규 경북대학교 대학원 2016 국내석사

액정은 외부자극에 민감하게 반응하고, 광학적 특성으로 인하여 센서로 응용하는데 적합하다. 본 연구에서는 마이크로플루이딕스 기술과 콜레스테릭 액정을 이용하여 균일한 크기의 액적을 제조하였다. 네마틱 액정인MLC-2132 (Merck) 에 카이랄 도판트인 CB15 (Synthon) 을 첨가하여 콜레스테릭 액정을 만들어 사용하였다. 액적의 안정성을 유지하는 동시에 배향변화를 유도하는 polyvinyl acid (PVA) 와 sodium dodecyl sulfate (SDS) 를 사용하여 배향변화에 따른 구조를 관찰할 수 있었다. PAA-b-LCP로 코팅된 콜레스테릭 액정 액적은 pH 반응성이 있었다. PAA체인의 카르복실기 때문에 높은 pH와 낮은 pH에서는 서로 다른 헬리칼 구조와 반사되는 빛 패턴의 변화를 관찰할 수 있었다. 글루코즈 옥시다제와 콜레스테롤 옥시다제가 고정이 된 액적에서는 각각 글루코즈와 콜레스테롤만을 검출할 수 있었다. 글루코즈 옥시다제가 고정이 된 액정은 매우 높은 민감도, 좋은 선택성, 그리고 빠른 반응 속도의 특징을 가지고 있었다. 콜레스테릭 액정 바이오센서는 네마틱 액정 센서와는 달리 편광현미경 없이도 색 패턴의 변화를 확인할 수가 있기 때문에 편리하다는 장점이 있다. Using a microfluidic method, we prepared uniformly sized cholesteric liquid crystal (CLC) droplets from MLC-2132 doped with (S)-4-cyano-4′-(2-methylbutyl)biphenyl (CB15). We studied the helical structures and reflecting color patterns of high- and low-dopant CLC droplets coated with poly(vinyl alcohol) (PVA) and sodium dodecyl sulfate (SDS). One central large spot with reflecting color in the CLC droplets (initially coated with PVA for planar anchoring) changed to many small spots with the same reflecting color (chicken-skin pattern) when an SDS aqueous solution was introduced to increase the homeotropic anchoring power. These small spots subsequently merged into several spots (flashlight pattern) with time. The CLC droplets coated with poly(acrylic acid)-b-poly(4-cyanobiphenyl-4-oxyundecylacrylate) (PAA-b-LCP) (CLCPAA droplets) were pH-responsive. Their helical structure and the reflecting color pattern changed because of protonation (at low pH) and deprotonation (at high pH) of the carboxylic group of PAA, which causes the planar (tangential) and perpendicular (homeotropic) orientations, respectively. The CLCPAA droplets immobilized with glucose oxidase (GOx) and cholesterol oxidase (ChO) (CLCPAA-GOx and CLCPAA-ChO droplets, respectively), for glucose and cholesterol detection, exhibited high sensitivity (0.5 M and 2.5 M for the CLCPAA-GOx and CLCPAA-ChO droplets, respectively), good selectivity, and fast response (4 s). Further optimization will enhance their performance as biosensors. With this novel approach, detection is possible by observing the coloring pattern of CLC droplets, without the crossed polarizers that are necessary for nematic LC biosensor systems.

여러 가지 표면처리법이 금 전극에서의 글루코즈 산화반응에 주는 효과에 관한 연구

조상은 全北大學校 大學院 2004 국내석사

The electrochemical oxidation of glucose at a gold electrode with different treatments was examined in a neutral solution. Electro-oxidation of glucose was performed without using a glucose oxidase enzyme. The different treatment methods were annealing, mechanical polishing with alumina powder (0.05 ㎛, 0.3 ㎛), and amalgamation by simply immersing in murcury for different times (10 s, 30 s, 60 s). The amalgamation of the gold electrode gave large surface area, rough surfaces, and high catalytic sensitivity. The O_(2) reduction, the presence of the chloride ion, and unwanted oxidations of interfere materials such as ascorbic acid, acetamidophenol and uric acid, gave problems for an amperometric glucose oxidation. To determine the glucose concentration, a glucose calibration curve with a range between 0 and 60 mM was obtained using chronoamperometry avoiding oxidations of ascorbic acid, acetamidophenol, and uric acid.

Immobilization of glucose oxidase in mesoporous gels by entrapment method

한기철 Graduate School, Yonsei University 2005 국내석사

A glucose oxidase (GOD) is immobilized in mesoporous gels derived from tetraethoxysilane (TEOS) and organosilanes (i.e., methyltriethoxysilane (MTES), vinyltriethoxysilane (VTES), propyltriethoxysilane (PTES), and phenyltri- ethoxysilane (PhTES)) through a two-step sol-gel process without any templating agent. To find an optimal condition that maximizes the activity of the entrapped GOD, the effects of the organosilane precursor and the aging and drying temperature on the activity of the entrapped GOD are investigated. Experimental results demonstrate that the activity of the entrapped GOD is highest when the gel is aged and dried at 4℃ (except for the PhTESTEOS gels), while it is lowest when the gel is aged and dried at room temperature. It is found that the use of organosilane does not significantly improve the activity of the entrapped GOD. These findings suggest a sol-gel route that can maximize the activity of the entrapped enzyme. 본 연구의 목적은 크게 세 가지로 요약할 수 있다. 첫 번째는 솔-젤 공정을 이용한 효소의 한 종류인 글루코즈 옥시다제(Glucose Oxidase : 이하 GOD)의 고정화이고 두 번째는 솔-젤 공정에서 반응과 건조단계의 온도를 제어함으로써 고정화 된 GOD 활성의 차이를 비교하는 것이다. 그리고 본 연구의 세 번째 목적은 솔-젤 공정에 유기 작용기를 가진 전구체를 도입하여 유-무기 복합재료에 고정화 된 GOD의 활성을 고찰하였다.알코올이나 산에 의해 손상을 입을 수 있는 GOD의 특성을 고려하여 pH 5.8의 버퍼용액에 GOD를 가한 후 솔-겔 공정을 수행하였다. 그리고 각기 다른 온도과정을 거친 솔-젤 공정은 고정화 된 GOD 활성에 어떠한 영향을 미치는 고찰하기 위하여, i)냉장반응 후 냉장건조, ii) 냉장반응 후 상온건조, iii) 상온반응 후 상온건조와 같이 세 가지의 온도변수로 고정화 된 GOD의 활성을 비교해 보았다. 또한 무기 전구체로는 TEOS(tetraethoxysilane)를 사용하고, 유기 작용기로는 MTES(methyltriethoxysilane), VTES(vinyltriethoxysilane), PTES(n-propyltriethoxy- silane) 및 PhTES(phenyltriethoxysilane)를 사용하였다. 솔-젤 공정에 의해서 고정화된 GOD는 Glucose 산화반응의 촉매로 작용하여 산(Gluconic acid)을 생성하므로 이를 36.5℃, pH 5.8 에서 NaOH로 적정하여 GOD의 활성을 측정하였다. 그리고 젤의 표면 물성 및 기공 구조를 파악하기 위해 질소 기체의 흡·탈착법을 사용하였다.실험 결과 솔-젤 공정을 이용하여 GOD를 균일하게 고정화 할 수 있었으며, 고정화 된 GOD의 활성은 반응과 건조를 모두 냉장온도(4℃)에서 진행시킨 젤이 가장 높았다 (단, PTESTEOS 젤 제외). 반면, 반응과 건조를 모두 상온에서 진행시킨 젤에서는 고정화 된 GOD 활성이 가장 낮은 값을 나타내었다. 또한 유기 작용기를 도입한 솔-젤 공정은 그렇지 않은 솔-젤 공정에 비해서 GOD의 활성을 높이는 측면에서는 적절치 않은 공정임을 알 수 있었다. 따라서, 본 연구는 고정화 된 GOD의 활성을 최대화 할 수 있는 최적의 솔-젤 공정을 발견할 수 있었다.

Brevibacterium flavum 글루코즈 특이성 Phosphotransferase System 효소 II 유전자의 클로닝과 분자생물학적 분석

권일 建國大學校 大學院 1993 국내석사

1. B. flavum염색체의 부분절단에 의해 genomic library를 제조한 후, pUC9을 vector로 하여 PTS-EⅡ 변이주인 E. coli ZSC113에 형질전환 시킴으로서 결손부위의 complementation에 의해 돌연변이를 복구시키는 EⅡ 유전자를 클로닝하고, 분리된 재조합 plasmid를 pBFT93으로 명명하였다. 2. 재조합 plasmid, pBFT93을 소유한 E. coli ZSC113은 1%의 glucose가 포함된 Maccoey agar base에서 당 발효에 따른 붉은색 균락을 형성하였으며 단일 탄소원으로 glucose 또는 mannose가 주어진 최소배지에서 생장하였고, 농도가 높을 수록 glucose를 첨가한 배지에서 높은 생장율을 보였다. 3. E. coli ZSC113(pBFT93)을 탄소원으로 0.2% glycerol이 포함된 최소배지에서 생장시키면서 non-metabolizable 당 유사체인 MeGlc와 2-DG를 첨가한 결과, PTS-mediated repression에 의해서 9-10시간에 걸친 지속적인 생장 억제효과가 나타났다. 4. [^(14)C]-MeGlc와 [^(14)C]-2DG에 대한 transport 실험에 의해서 기질특이성을 정량적으로 측정한 결과, E. coli ZSC113(pBFT93)은 [^(14)C]-MeGlc 흡수율이 포화점에 이를때 [^(14)C]-2DG의 포화점 농도보다 약 1.5배가 높은 것으로 나타남으로서 클로닝된 유전자는 glucose에 대한 기질특이성이 높은 EⅡ^(Glc)(ptsG) 유전자인 것으로 밝혀졌으며, B. flavum은 [^(14)C]-2DG에 대한 지속적인 흡수율을 나타냈지만 세포내에 존재하는 permease에 의한 비특이적인 흡수에 따른 결과로 추측되었다. 5. 클로닝된 EⅡ^(Glc) 유전자의 염기서열을 결정한 결과, 2025bp 길이의 1개의 open reading frame(ORE)과 종결 codon의 약 40bp 뒤쪽에서, 32bp로 구성된 ρ-independent 전사 종결부위가 발견되었으며, 이로부터 전사되는 polypeptide는 675개의 아미노산으로 구성되어 있고, 분자량이 71,963 dalton에 이르는 것으로 추정되었다. 또한, 추론된 아미노산 서열에서 EⅡ/EⅢ complex의 연결부위로 알려져 있는, PAPA linker로 추측되는 PAGAGAGAAA GAA의 서열이 발견되었고, EⅢ-like domain에서 인산화 부위로 여겨지는 histidine잔기가 579 번째에서 발견됨에 따라서 클로닝된 유전자는 단순한 EⅡ가 아닌 EⅡ/EⅢ complex를 암호화 하고있는 유전자인 것으로 추정되었다. In Brevlbacterium flavum, an industrial bacterium producing amino acids, phosphoenolpyruvate(PEP)-dependent sugar phosphotransferase system(PTS) is involved in the uptake and concomitant phosphorylation of sugers such as glucose, mannose, fructose, and glucosamine. In order to characterize the sugar-PTS of B. flavum, the gene encoding enzyme Ⅱ(EⅡ) protein of PTS which is a membrane-bound permease, specific for glucose is cloned by complementing Escherichia coli mutation affecting ptsG(so-called EⅡ) gene with B. flavum genomic library. The complementation of E. coli mutation was tested by checking the red colony on the MacConkey agar base supplemented with 1% glucose as a carbon source. A recombinant plasmid, designated as pBFT93 containing a 3.6-kilobase DNA fragment of B. flavum was identified to contain a gene that enables an E. coli ZSC113(ptsG, ptsM) to use glucose or mannose as a sole carbon source in minimal medium. The E. coli ZSC113 harboring pBFT93 showed PTS-mediated repression of growth on minimal medium by methyl-α-D-glucopyranoside(MeGlc) or 2-deoxy-D-glucose(2-DG) while the mutant without the recombinant did not. Evidence was obtained to elucidate that the cloned gene is more specific for the uptake of glucose than mannose by [^(14)C] -MeG1c and [^(14)C] -2DG transport experiment. The result showed that the uptake rate of [^(14)C]-MeGlc by E. coli ZSC113(pBFT93) is 1.5 times as high as the uptake rate of [^(14)C]-2DG by E. coli ZSC113(pBFT93). The cloned gene was sequenced by the dideoxy chain-termination method, identifing that an open reading frame(ORF) of the ptsG gene encoding EⅡ protein of B. flavum PTS is 2,025bp long in size. The sequence from -12 to -7bp represents a putative ribosome binding si to(shine-dalgarno sequence) and ρ-independent transcription termination site was found at the down stream of TAA termination codon. According to the resulting DNA sequence, the deduced polypeptide was found to consist of 675 amino acid residues with molecular weight of 71,963, which is similar to EⅡ^(Glc) of Bacillus subtilis PTS. A potential phosphorylation site, the conserved histidine region was found at the 579th and a presumed PAPA linker was found from 495th to 509th of amino acid sequences.

Saccharomyces diastaticus glucoamylase의 분비신호서열 분석과 효모에서 defensin의 분비

이준원 연세대학교 대학원 2001 국내박사

Saccharomyces diastaticus의 glucoamylase 유전자인 STA의 signal peptide (GSP)를 이용한 효모에서 이종단백질의 분비효율을 높이고자 GSP의 변이형을 제조하고 Bacillus의 CMCase에 대한 분비효율을 조사하였다. Bacillus CMCase 구조 유전자를 GAL7 terminator, GAP promoter, 그리고 STA 유전자의 변이형 GSP (ml : Pro-18→Leu-18, m2 : Tyr-13→Leu-13, m3 : Ser-9→Leu-9, m4 : Asn-5→Pro-5)에 재조합하여 효모에서 CMCase를 분비시킬 수 있는 secretion vector를 제작하였다. 변이형 m1, m2, 그리고 m3 은 야생형보다 아미노 말단과 소수성 구역 (h-region)에 더 높은 소수성을 가지도록 하였다. 변이형 m4은 극성 아미노산을 제거하고 단백질의 2차 구조를 파괴하는 proline으로 대체하였다. 배양시간에 따른 CMCase 활성측정과 Western blot 분석 결과 변이형 m4를 제외한 모든 변이형의 경우 Leu으로 대체된 변이형 GSP에 의한 CMCase의 분비가 본래의 야생형 GSP에 의한 분비보다 높았으며 특히 m2와 m3에서 약 2배 높았다. 따라서, GSP의 소수성 구역에 소수성을 가진 아미노산을 첨가하였을 때 분비효율이 증가함을 알 수 있었다. 야생형과 변이형 GSP를 포함하고 있는 재조합 플라스미드를 가지고 있는 모든 효모 형질전환세포에서 당쇄로 인하여 이종의 분자량이 증가된 큰 단백질들이 (90-100 kDa) 분비되었고 효모 세포내에서 발현된 CMCase는 약 60, 52, 그리고 46 kDa의 분자량을 보였다. STA 유전자를 구성하는 threonine-serine rich region (TS region)이 효모 세포에서 단백질의 분비효율에 미치는 영향을 조사하기 위하여 TS region을 부분적으로 제거한 STA 유전자를 재조합 플라스미드로 제작하였다. STA promoter, signal peptide, 부분적으로 제거된 TS region에 STA의 구조 유전자를 Bacillus CMCase로 교체하여 재조합하고 효모에서 CMCase의 분비효율을 조사하였다. 그 결과 일반적으로 yeast에서 짧은 TS region을 가진 플라스미드가 긴 TS region을 가진 플라스미드보다 높은 CMCase 분비능을 보였다. 따라서, STA 유전자의 TS region은 단백질의 세포외로의 분비와는 관계가 없다고 추정하였다. Glucoamylase signal peptide와 효모 S. cerevisiae의 분비계를 이용하여 쉬파리에서 유래된 defensin을 항균활성이 있는 활성형의 재조합 defensin 생산계를 구축하고 재조합 효모로부터 생산된 defensin의 특성을 조사하였다. STA promoter, signal peptide 그리고 MF α1의 prosequence에 defensin 유전자를 재조합하여 발현벡터 pSMF1을 제조하여 S. cerevisiae에서 효율적으로 defensin을 발현 분비시킬 수 있었다. 효모에서 분비된 defensin의 분자량을 확인하고 액체배양시의 항균활성력을 조사하기 위해 defensin의 정제를 시도하였다. 분비된 defensin은 Streptococcus aureus와 Listeria mononocytogenes에 활성을 보였다. 대체적으로 열에 안정하며 pH 2.0과 12.0사이에서 안정하였고 proteases에 의해 불활성화 되었다. Defensin을 부분 정제한 시료와 M. luteus를 혼합하여 배양하였을 때 항균활성은 모두 단백질 농도에 비례하여 증가하였다. 정제한 defensin을 6%∼20% gradient Tricine/Tris/SDS-PAGE에서 항균활성을 조사한 결과 약 4.5 kDa에 해당되는 진한 밴드가 항균활성을 보임으로 defensin이 성공적으로 효모에서 발현 분비됨을 확인할 수 있었다. Glucoamylase of Saccharomyces diastaticus is produced as a large precursor composed of signal peptide (21 amino acid residues), Thr and Ser-rich region (TS region) and functional glucoamylase. To evaluate the utility of the glucoamylase signal peptide (GSP) for the secretion of foreign proteins, four types of GSP mutants (ml : Pro-18→Leu-18, m2 : Tyr-13→Leu-13, m3 : Ser-9→Leu-9, m4 : Asn-5→Pro-5) were constructed and secretion efficiency of each mutant was compared with that of native GSP by the expression and secretion of Bacillus subtilis CMCase under the control of GAP promoter and GAL7 terminator in S. cerevisiae. Mutants 1, 2 and 3 had a higher hydrophobicity than wild type GSP in N-terminal domain and hydrophobic domain. In mutant 4, a polar amino acid was replaced by a helix breaking Pro residue. CMCase activity assay and Western blot analysis revealed that CMCase secretion by GSP mutants replaced by Leu were increased compared with native GSP. In the case of m2 and m3, the substitution of Leu for Tyr-13 and Ser-9 in the hydrophobic region resulted in a twofold increase in the extracellular CMCase activity. The secreted CMCase was heterogenously hyperglycosylated, resulting in the increase in molecular weight (90-100kDa). For the investigation of the role of TS region in the secretion of heterologous protein, a hybrid plasmid was constructed by ligating YEp24, CMCase structural gene of B. subtilis, and DNA fragment containing STA1 promoter, signal sequence and the entire TS region. The TS region was partially deleted by Ba131 treatment and followed by religation. The deleted nucleotide sequences were analyzed and the secretion level was examined by activity assay and Western blot analysis. Yeast transformants 9 clones with different CMCase activity were selected. About 65-80% of total CMCase activity was detected in the supernatants except for pYESC 24C. Generally, yeast cells transformed with plasmid containing short TS region had higher secretion of CMCase than those containing long TS region. Yeast transformants harboring pYESC 11 without TS region had the highest secretion of CMCase. To evaluate the utility of the glucoamylase signal peptide for the secretion of foreign proteins, biologically active defensin of insect was tried in yeast, S. cerevisiae c13ABYS86. The defensin of flesh fly could be secreted in yeast by the combination of STA1 promoter, signal peptide of STA1, and pro MFα1. The secreted defensin in yeast was also active against St. aureus and L. monocytogenes and was resistant to heating for up to 30 min, pH range from 2.0 to 12.0, amylases and cellulase but sensitive to proteases. The defensin was purified to homogeniety. Tricine/Tris/SDS PAGE revealed that the molecular weight of purified defensin was estimated to be 4,500 Da.

Properties of novel thermostable glucoamylase from the hyperthermophilic archaea, Sulfolobus solfataricus, in relation to glucose production

김미선 서울대학교 대학원 2004 국내석사

Application of novel electrode for cofactor regeneration and enzyme fuel cell

김희진 서울대학교 대학원 2008 국내석사

Penicillium verruculosum<KFCC no.10023>에 의한 Glucose oxidase에 관한 연구

이홍수 建國大學校 1987 국내석사

고분자 플루란 생산을 위한 최적 발효조건

김정화 부경대학교 대학원 2001 국내석사