Hydroxyapatite 인산염 가용화 균 Klebsiella sp. DA 71-1의 분리와 가용화특성

이진우,정연주,이경아,최시림,김영길,최용락 한국생명과학회 2004 생명과학회지 Vol.14 No.1

난용성 인산염을 가용화시키는 균주를 염류직접 및 인산과다처리 재배지로부터 다수 분리하였다. 다수의 균들은 대다수가 tri-calcium phosphate의 가용화능을 가진 균주들이 었고 hydroxyapacte의 가용화능을 가진 균주가 소수있었다. 본 연구는 hydroxyapatite 가용화능을 가진 분리균주 Klebsiella sp. DA7l-1의 배양특성에 따른 난용성 인산염(hydroxyapatite, tri-calcium phosphate, aluminium phosphate), pH변화 및 배양온도에 따른 인산염의 가용화특성 등을 조사하였다 인산 가용화능은 유기산 생성과 밀접한 관련이 있다고 많이 보고되어 졌지만 아직 pH저하에 따른 인산 가용화의 정확한 기작은 확인이 되지않은 상태이며 배지내의 pH저하는 균주의 유기산 생성에 따른 것으로 사료되어진다. 조사한 결과 배양시간 12 이후부터 pH 저하를 나타냈으며 pH저하는 균생육에 영향을 미치지 않는 범위내에서 이루어졌으며 pH가 저하된 상태의 배지 조건에서 균의 생육이 계속될수록 인산가용화능이 높게 이루어졌다. 또한 DA7l-1은 초기 pH에 영향을 크게 받지 않았으며 일반 토양의 온도와 비슷한 조건의 온도에서도 가용화 능력이 뛰어난 것으로 나타났다. To develop high effiency biofertilizer, a bacterium having ability to solubilize inorganic phosphate was isolated from cultivated soils, using a sucrose minimal agar-hydroxyapatite medium. The strain was identified as Klebsiella sp. DA7l-1, based on the physiological and biochemical properties. The activity of solubilizing inorganic phosphate of Klebsiella sp. DA7l-1 against three types of insoluble phosphate such as tri-calcium phosphate, aluminium phosphate, hydroxyapatite were quantitatively determined. The results indicated that the strain solubilized hydroxyapatite. The MPS (mineral phosphate solubilizing) conditions of Klebsiella sp. DA7l-1, were measured to determine the optimal conditions. The optimal temperature and initial pH to solubilize insoluble phosphate in sucrose minimal medium were $30^{\circ}C$ and pH 6.0, respectively.

세포벽 분해 관련 효소의 생산균주 분리 및 CMCase의 특성

이용석(Yong-Seok Lee),박인혜(In-Hye Park),쪼우위(Yi Zhou),김근기(Keun-Ki Kim),최시림(Si-Lim Choi),최용락(Yong-Lark Choi) 한국생명과학회 2008 생명과학회지 Vol.18 No.5

CMCase를 생산하는 Klebsiella sp. Sc를 부산 인근의 토양에서 분리하였다. 이 균주는 16S rDNA와 RNA polymerase B subunit (rpoB) 유전자의 유전적 계통 분석을 통하여 동정을 시행하였다. 그 결과 Klebsiella sp. 속들의 균주들과 99% 이상의 상동성을 나타내었다. CMCase 유전자는 Sc의 게놈라이브러리를 구축하여 찾았다. CMCase 유전자는 37,666 Da의 분자량을 가지는 333개의 아미노산을 암호화하고 있는 1,002개의 뉴클레오티드들로 구성된 것으로 밝혀졌다. 추정된 CMCase의 단백질 서열은 Cellulomonas uda와 단백질과 95%의 identity와 97%의 positive를 가지는 것으로 나타났으며, Erwinia chrysanthemi와는 각각 58%와 72%를 가지는 것으로 나타났다. 그리고 CMCase는 ASDGDTLIAWALLRAQ KQW와 같은 보존 영역을 가지고 있었는데, 이는 glycosyl hydrolase family 8의 보존영역(A-[ST]-D-[AG]-D-X(2)-[IM]-A-[SA]-[LIVM]-[LIVMG]-A-X(3)-[FW])와 일치하는 것으로 나타났다. 이는 Klebsiells sp. Sc의 CMCase는 glycosyl hydrolase family 8에 속한다는 것을 나타낸다. A CMCase-producing bacterium, Klebsiella sp. Sc, was isolated from Busan area's soil sample. This strain was identified on the basis of phylogenetic analysis of the 16S rDNA and rpoB (RNA polymerase B subunit) sequences. The gene encoding CMCase was cloned by genome library. The CMCase gene consisted of an open reading frame of 1,002 nucleotides and encodes 333 amino acids with a deduced molecular weight of 37,666 Da. The deduced amino acid sequence of the CMCase from Klebsiella sp. exhibits 95% identities and 97% positives to those from Cellulomonas uda and 58% identities and 72% positives to those from Erwinia chrysanthemi. The CMCase contain a conserved motif with the consensus sequence, ASDGDTLI AWALLRAQKQW. This result shows CMCase protein from Klebsiella sp. Sc belongs to glycoside hydrolase family 8, A-[ST]-D-[AG]-D-X(2)-[IM]-A-[SA]-[LIVM]-[LIVMG]-A-X(3)-[FW].

Klebsiella sp. Sc가 생산하는 β-xylosidase의 분리, 정제 및 특성

Yong-Seok Lee(이용석),In-Hye Park(박인혜),Soon-Cheol Ahn(안순철),Yong-Lark Choi(최용락) 한국생명과학회 2010 생명과학회지 Vol.20 No.12

Klebsiella sp. Sc로부터 birchwood xylan을 분해하는 β-xylosidase를 분리하였다. 이 β-xylosidase는 63 kDa의 분자량을 가지는 559개의 아미노산을 암호화하며 1,680개의 뉴클레오타이드로 구성 되는 것으로 밝혀졌다. 기존에 밝혀진 세균성 β-xylosidase와 상동성을 비교해 보았을 때, Klebsiella oxytoca (KOX)와 90% identities와 95% positives를 나타내었으며 Lactobacillus lactis (LAC, 82%, 90%), Bacillus longum (BLON, 69%, 81%) 그리고 Escherichia coli (ECOLI, 47%, 63%)를 나타내었다. 분리된 β-xylosidase는 GST-fusion 정제 시스템을 이용하여 순수 정제하였다. 이 효소 활성의 최적 pH는 6.6이었으면 최적 온도는 55℃였다. TLC를 통해 효소 분해 산물을 관찰한 결과, xylobiose를 분해하여 xylose를 생산하는 것을 관찰 할 수 있었다. A β-xylosidase encoding gene from Klebsiella sp. Sc was cloned in Escherichia coli. The β-xylosidase gene consisted of an open reading frame of 1,680 nucleotides and encodes 559 amino acids with a deduced molecular weight of 63 kDa. The deduced amino acid sequence of the β-xylosidase from Klebsiella sp. Sc exhibits 90% identities and 95% positives compared to those from Klebsiella oxytoca (KOX), Lactobacillus lactis (LAC, 82%, 90%), Bacillus longum (BLON, 69%, 81%) and Escherichia coli (ECOLI, 47%, 63%). The β-xylosidase was purified by GST-fusion purification system. The pH and temperature optima of the enzyme were 6.6 and 55℃, respectively. The β-xylosidase hydrolyzes xylobiose to xylose.

Klebsiella sp. DA71-1/pLYJ의 난용성 인산염 가용화 특성

류아름,이진우,이용석,이상철,정수열,최용락,Ryu, Ah-Reum,Lee, Jin-Woo,Lee, Yong-Seok,Lee, Sang-Cheol,Chung, Soo-Yeol,Choi, Yong-Lark 한국생명과학회 2006 생명과학회지 Vol.16 No.4

To develop high efficiency biofertilizer solubilizing insoluble phosphates, lactate dehydrogenase (ldh) gene was isolated from Staphylococcus sp. LJ2. Genetic constructions were carried out using the pGEM-T-easy vector and pHSG398. Recombinant DNA plasmids containing the ldh gene were transferred to Klebsiella sp. DA71-1 by electroporation. The selected transformant was named as a DA71-1/pLYJ. The insoluble phosphates solubilization activity of DA71-1/pLYJ was higher than that of DA71-1 at various culture conditions. Glucose was the best carbon source for insoluble phosphates solubilization among the used carbon sources. Maximal insoluble phosphates solubilizing was found in sucrose minimal (SM) medium containing 3% glucose. The solubilizing activity of DA71-1/pLYJ against three types of insoluble phosphates, such as tri-calcium phosphate, hydroxyapatite, aluminium phosphate, were quantitatively determined. The optimal temperature and initial pH to solubilize insoluble phosphates in the SM medium was $37^{\circ}C$ and pH 5.0, respectively. 친환경형 미생물제제의 난용성 인산염 가용화능의 향상을 위하여 Staphylococcus sp. LJ2로부터 분리된 ldh gene을 Klebsiella sp. DA71-1에 도입하였고, 이를 DA71-1/pLYJ라고 명명하였다. 배지에 glucose를 3% 첨가했을 때 다른 탄소원을 첨가했을 때보다 DA71-1/pLYJ 균주의 난용성 인산염 가용화능이 월등히 우수하였다. 각기 다른 난용성 인산염 tri-calcium phosphate, hydroxyapatite, 그리고 aluminium phosphate에 대하여 그 가용화능이 DA71-1 균주보다 적게는 1.2배, 많게는 2.3배 이상 향상된 결과를 보였다. 그리고 DA71-1/pLYJ 균주는 DA71-1 균주에 비해 배양 온도에 비교적 관계없이 높은 인산가용화능을 나타낸 것이 특징적이었고, 배양초기 pH가 5.0일 때 그 능력이 가장 뛰어났다. 이러한 모든 결과들을 종합해볼 때 DA71-1/pLYJ 균주는 여러면에서 DA71-1 균주보다 난용성 인산염 가용화능이 월등히 뛰어나며 따라서 효율적이고 친환경적인 미생물제제의 개발에 큰 역할을 할 수 있는 발판을 마련했다 할 수 있다.

Purification and Characterization of High Viscous Hyaluronic Acid Complex from Klebsiella sp. L-10 NTG 50

Lee, Hyang Sook,Kim, Na Mi,Ann, Young Geun,Lee, Jong Soo 한국식품영양학회 1996 韓國食品營養學會誌 Vol.9 No.3

Klebsiella sp. L-10 의 N-methyl-N'-nitro-N''-nitrosoguanidine 변이주인 Klebsiella sp. L-10 NTG-50으로부터 생산된 고점성의 히알우론산 복합체를 이상계 추출법으로 정제하여 물리화학적 성질을 조사하였다. 정제된 히알우론산 복합체의 점도는 온도와 염농도가 높아짐에 따라 낮아졌고 pH 5.0 이하와 11.0 이상에도 매우 낮았다. 정제된 히알우론산 복합체의 굳기(hardness)는 1.20kg, 응집성(cohesiveness)은 1.92, 점착성(adhesiveness)은 0.62 이었다. 또한 보수력은 g당 6.9ml이었다. High viscous hyaluronic acid complex from Klebsiella sp. L-10 NTG 50 mutant was purified by two-phase extraction system using PEG-K_2HPO_4 and its physicochemical properties were investigated. Viscosity of the purified hyaluronic acid complex was decreased as temperature and salts concentration were increased and also showed low viscosity at below pH 5.0 and above pH 11.0. Hardness, cohesiveness and adhesiveness of the purified hyaluronic acid complex were 1,20kg, 1.91 and 0.62, respectively. Water holding capacity was 6.9ml per gram of the purified hyaluronic acid complex powder.

Lipase gene의 도입에 의한 유류분해세균 Klebsiella sp. KCL-1의 표면활성과 유화력 향상

정수열 한국생명과학회 2004 생명과학회지 Vol.14 No.5

To improve and oil degrading activity, the lipase gene from Pseudomonase sp. was transformed into Klebsiella sp. KCL-l, an oil degrading bacterium. The selected trasformant was named as a KCL-1/pET-Lip. The surface tension of culture broth of KCL-1/pET-Lip was decreased to 33 dyne/cm from 55 dyne/cm using 4% (v/v) soybean oil as sole carbon source. The surface tension were 44 and 37.5 dyne/cm, to 2% (w/v) glucose and 4% (v/v) kerosene medium, respectively. The emulsification activity of the biosurfactant solution containing lipase of KCL-l/pET-Lip improved better than wild type KCL-l. The soybean oil was most efficient carbon source and substrate for surface activity and emulsification activity of KCL-1/pET-Lip. The expression of lipase was confirmed by SDS-PAGE. 원유 분해능이 강력한 해양균주 Klebsiella sp. KCL-1의 표면활성 능력과 유화활성의 향상을 위하여 An et. al.이 보고한 Pseudomouas sp. SW-3균주로부터 cloning된 pET-Lip을 KCL-1에 도입하였다. KCL-1/pET-Lip은 2% glucose, 4% soybean oil, 4% kerosene 각각의 탄소원에 대하여 야생형균주 KCL-1과 비교하여 우수한 표면장력 저하 능력을 가지게 된 것을 알 수 있다. KCL-1/pET-Lip은 4% soybean oil를 유일한 탄소원으로 배지에 첨가한 경우 표면장력이 55 dyne/cm에서 32 dyne/cm로 줄어들었다. 세포의 성장은 2% glucose가 탄소원으로 사용된 경우 성장이 최대로 확인되었다. 0.2% glucose와 2% soybean oil을 복합적으로 첨가한 경우 2% glucose를 탄소원으로 사용한 경우에 비해 균의 생육도는 별 차이를 보이지 않으나 표면 장력에는 뚜렷한 차이를 보였다. 4% soybean oil을 사용한 경우와 비교할 경우 균의 생육도는 월등히 높으며, 표면장력의 저하능은 96시간째에 차이가 2 dyne/cm로 비슷해진다. 따라서 탄소원으로서 glucose는 세포의 성장과 관련이 있고, soybean oil 경우는 표면 장력 저하와 관계가 있는 것으로 예상된다. 또한 유화활성의 경우 사용된 모든 기질에 대하여 유화활성이 증가하는 것을 확인하였다. 특히 대두유를 기질로 사웅한 경우 유화활성이 가장 높았다 대두유를 탄소원으로 사용하여 KCL-1/pET-Lip 을 48, 72, 96시간 배양한 세포 추출물에서 42 kDa의 lipase로 추정되는 단백질이 발현됨을 확인하였다. 결과적으로 lipase를 도입한 KCL-1/pET-Lip의 표면활성 변화 능력이 월등히 향상된 것으로 추정된다.

향신료와 야채류가 세균의 성장에 미치는 영향(Ⅰ)

이건일,정영건,권오진 효성여자대학교 부설 한국환경위생연구소 1992 환경위생연구 Vol.2 No.1

본 실험은 일반가정의 식탁에서 흔히 볼 수 있는 향신료 및 야채류 14종에 대해 3주의 gram양성 및 4주의 gram 음성균의 성장에 미치는 영향을 조사하였다. 공시균의 NaCl에 대 한 내성은 Lactobacillus casei, Staphylococcus aureus, Enterobacter aeroge-nes는 7%의 NaCl에서도 성장하여 내성이 강하였고, 그외의 공시균은 5-7%의 NaCl에서 성장저해효과가 있었다. 열저항성은 75℃이상%서 공시균의 성장이 억제되어 85℃에서는 Bacillussubtilis, Enterobacter aerogenes를 제외한 공시균은 성장이 완전히 저해되었다. 항생물질의내성은 Pseudomonas aeruginosa가 본 실험에 이용된 모든 항생물질에서 MIC가 400 mg/ml로나타나 개성이 가장 강하였으며 Shigella sp.은 MIC가 100 mg/ml로 내성이 가장 약하였다.마늘에서는 Pseudomonas aeruginosa를 제외 한 모든 공시균에서 , 엽차에서는 Bacillus subtilis,Klebsiella pnewmoniae, Shigella sp.에서, 쑥에서는 Staphylococcus aureus, Enterobacter aeroge-nes, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Shigella sp.에서 각각 항균작용이 있었으며, 생육저해 농도는 마늘은 0.5-0.4%, 엽차는 4.0-5.0%, 쑥은 2.0-10.0%로 나타났다. This study was carried out to investigate the influence of food spi-ces and vegetables, which are commonly avaible on the dining table everyday,on bacteria growth. Total 14 kinds of food spices and vegetables were sampledin Kyungsan market in Kyungsan city. 7 strains of bacteria were used in thisexperiment as test strains which were 3 strains of Gram positive bacteria (Bacil-lus subtilis,Lactobacillus casei and Staphylococcus aureus) and Gram negative4 strains (Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aerugi-nosa and Shigella sp.) . The results summerrzed were as ronows: 1. The growth of all test strains except Pseudomonas aeruginosa was inhibi-ted by water extracts of raw garlic with concentrations ranging 0.5% to 4.0%. 2. Bacilus subtilis, Klebsiella pnewmoniae and Shigella sp. where not grownin tea with concentrations ranging 4.0% to 5.0%. 3. Water extracts of wormwood also interfered all strains growth exceptBacillus subtilis of which inhibitory concentrations were ranged 2.0% to 10.0%. 4. In susceptibilities of test strains to NaCl solutions the most sensitivestrain was Bacillus subtilis while Enterobacter aerogeneg was showed strongresistance to each different concentration of this solution. Almost the growthof test strains except Enterobacfer aerogenes were inhibited in over 4% of thissolution. 5. GeneraIBy all of test strains were resisted to penicillin G whereas theyall were susceptible only to streptomycin. Shigella sp. was markedly sensitiveto all of antibiotics used in this experiment and MIC of this strain to them was100 mg/ml while Pseudomonas aeruginosa was strongly tolerable to the all ofantibiotics and its MIC to them was 100+ mg/ml. 6. Bacillus subtilis and Enterobacter aerogenes were able to grow until85℃ in gradually increasing temperature.

해양에서 분리된 Klebsiella sp. KCL-1에 의한 원유분해 특성의 규명

차재영,정선용,조영수,최용락,김범규,이영춘 한국산업미생물학회 1999 한국미생물·생명공학회지 Vol.27 No.6

유류오염 지역으로부터 원유 분해능이 있는 해양균주를 crude oil을 탄소원으로 이용하여 분리하였다. 분리된 균주 중 원유분해능 및 성장속도면에서 가장 우수한 균주를 선별하여 KCL-1으로 명명 하였으며, 형태학적, 생화학적 및 생리학적 특성을 조사한 후 Klebsiella sp.로 동정하였다. KCL-1 균주의 원유 분해를 위한 최적 배양조건은 배양온도 32℃∼37℃ 이였으며, 초기 pH는 7.0 이였다. 또한, 이 균주의 성장은 3.0% 염분농도에서 최대의 성장을 보여주어 해양유래의 균주임을 확인할 수 있었다. n-Alkane계 탄화수소 중에서 C_18∼C_28의 비교적 장쇄의 탄화수소를 탄소원으로 이용하였다. 원유분해시 C_18의 첨가에 의해 균생육 및 원유 분해능이 촉진되는 것으로 나타났다. KCL-1 균주의 유화활성은 37℃, pH 7.0의 배양조건에서 배양 3일째에 가장 높게 나타났다. Several bacterial strains utilizing crude oil as their sole carbon and energy sources were isolated from marine. One of the strains named KCL-1 showed the highest degradative activity for crude oil and the best growth rate. This strain was identified as a Klebsiella sp. based on the morphological, biochemical, and physiological characteristics. The optimum cultural conditions were as follows; 32℃∼37℃ for temperature and 7.0 for initial pH. Additionally, the optimal concentration of sodium chloride was 3.0%, indicating that this strain was derived from sea water. KCL-1 could use several kinds of n-alkane hydrocarbons from octadecane to hexacosane as a sole carbon source. The degradation of crude oil by KCL-1 was stimulated by addition of octadecane in the culture. The emulsifying activity by KCL-1 was highest after 3 days of cultivation under the condition of 3.0% sodium chloride, pH 7.0 and 37℃.

Engineering of <i>Klebsiella oxytoca</i> for production of 2,3-butanediol via simultaneous utilization of sugars from a <i>Golenkinia</i> sp. hydrolysate

Park, Jong Hyun,Choi, Min Ah,Kim, Yong Jae,Kim, Yeu-Chun,Chang, Yong Keun,Jeong, Ki Jun Elsevier Applied Science 2017 Bioresource technology Vol.245 No.2

<P><B>Abstract</B></P> <P>The <I>Klebsiella oxytoca</I> was engineered to produce 2,3-butanediol (2,3-BDO) simultaneously utilizing glucose and galactose obtained from a <I>Golenkinia</I> sp. hydrolysate. For efficient uptake of galactose at a high concentration of glucose, <I>Escherichia coli</I> galactose permease (GalP) was introduced, and the expression of <I>galP</I> under a weak-strength promoter resulted in simultaneous consumption of galactose and glucose. Next, to improve the sugar consumption, a gene encoding methylglyoxal synthase (MgsA) known as an inhibitor of multisugar metabolism was deleted, and the <I>mgsA</I>-null mutant showed much faster consumption of both sugars than the wild-type strain did. Finally, we demonstrated that the engineered <I>K. oxytoca</I> could utilize sugar extracts from a <I>Golenkinia</I> sp. hydrolysate and successfully produces 2,3-BDO.</P> <P><B>Highlights</B></P> <P> <UL> <LI> Production of 2,3-BDO by <I>Klebsiella oxytoca</I> using <I>Golenkinia</I> sp. hydrolysates. </LI> <LI> Engineering of <I>Klebsiella oxytoca</I> for simultaneous utilization of mixed sugars. </LI> <LI> Optimization of gene expression using synthetic promoters. </LI> </UL> </P>

유류오염 지역에서 분리된 Klebsiella sp. KCL-2에 의한 원유분해 특성

차재영,김혜선,조영수,이영춘,최용락 한국생명과학회 2000 생명과학회지 Vol.10 No.3

원유 분해능이 강력한 해양균주를 얻고자 유류오염 지역으로부터 crude oil을 탄소원으로 이용하는 수집 종을 분리하였다. 분리된 균주중 원유분해능 및 성장속도면에서 가장 우수한 균주를 선별하여 KCL-2로 명명하였으며, 형태학적, 생화학적 및 생리학적 특성을 조사한 후 Klebsiella sp.로 동정하였다. KCL-2 균주의 원유 분해를 위한 최적 배양조건은 배양온도 27$^{\circ}C$~37$^{\circ}C$였으며 초기 pH는 7.0이였다. 또 한, 이 균주의 성장은 3.0% 염분농도에서 최대의 성장을 보여주어 해양유래의 균주임을 확인하였다. 비 교적 장쇄인 n-alkane 계 탄화수소의 C18~C28의 탄화수소를 탄소원으로 이용하였다. 원유분해시 C18 의 첨가에 의해 균생육 및 원유 분해능이 촉진되는 것으로 나타났다. KCL-2 균주의 유화활성은 32$^{\circ}C$, pH 7.0의 배양조건에서 배양 3일째에 가장 높게 나타났다. Several bacterial strains utilizing crude oil as their sole carbon and energy source were isolated from polluted marine by crude oil. One of the strains, named KCL-2 showed strong degradation activity for crude oil. This strain was identified as a Klebsiella sp. based on the morphological, biochemical, and physiological characteristics. The optimum cultural conditions were as follows; $27^{\circ}C$~$37^{\circ}C$ for temperature and 7.0 for initial pH. Additionally, the optimal concentration of sodium chloride was 3.0%, confirming indicating that this strain was derived from sea water.The strain KCL-2 could use several kinds of n-alkane hydrocarbones from octadecane to octacosane as a sole carbon source. The emulsifying activity by KCL-2 was the highest after 3 days of cultivation under the condition of 3.0% sodium chloride, pH 7.0 and 32$^{\circ}C$. This strain had several criptic plasmids.