세포벽 분해 관련 효소의 생산균주 분리 및 CMCase의 특성

이용석(Yong-Seok Lee),박인혜(In-Hye Park),쪼우위(Yi Zhou),김근기(Keun-Ki Kim),최시림(Si-Lim Choi),최용락(Yong-Lark Choi) 한국생명과학회 2008 생명과학회지 Vol.18 No.5

CMCase를 생산하는 Klebsiella sp. Sc를 부산 인근의 토양에서 분리하였다. 이 균주는 16S rDNA와 RNA polymerase B subunit (rpoB) 유전자의 유전적 계통 분석을 통하여 동정을 시행하였다. 그 결과 Klebsiella sp. 속들의 균주들과 99% 이상의 상동성을 나타내었다. CMCase 유전자는 Sc의 게놈라이브러리를 구축하여 찾았다. CMCase 유전자는 37,666 Da의 분자량을 가지는 333개의 아미노산을 암호화하고 있는 1,002개의 뉴클레오티드들로 구성된 것으로 밝혀졌다. 추정된 CMCase의 단백질 서열은 Cellulomonas uda와 단백질과 95%의 identity와 97%의 positive를 가지는 것으로 나타났으며, Erwinia chrysanthemi와는 각각 58%와 72%를 가지는 것으로 나타났다. 그리고 CMCase는 ASDGDTLIAWALLRAQ KQW와 같은 보존 영역을 가지고 있었는데, 이는 glycosyl hydrolase family 8의 보존영역(A-[ST]-D-[AG]-D-X(2)-[IM]-A-[SA]-[LIVM]-[LIVMG]-A-X(3)-[FW])와 일치하는 것으로 나타났다. 이는 Klebsiells sp. Sc의 CMCase는 glycosyl hydrolase family 8에 속한다는 것을 나타낸다. A CMCase-producing bacterium, Klebsiella sp. Sc, was isolated from Busan area's soil sample. This strain was identified on the basis of phylogenetic analysis of the 16S rDNA and rpoB (RNA polymerase B subunit) sequences. The gene encoding CMCase was cloned by genome library. The CMCase gene consisted of an open reading frame of 1,002 nucleotides and encodes 333 amino acids with a deduced molecular weight of 37,666 Da. The deduced amino acid sequence of the CMCase from Klebsiella sp. exhibits 95% identities and 97% positives to those from Cellulomonas uda and 58% identities and 72% positives to those from Erwinia chrysanthemi. The CMCase contain a conserved motif with the consensus sequence, ASDGDTLI AWALLRAQKQW. This result shows CMCase protein from Klebsiella sp. Sc belongs to glycoside hydrolase family 8, A-[ST]-D-[AG]-D-X(2)-[IM]-A-[SA]-[LIVM]-[LIVMG]-A-X(3)-[FW].

Cellulomonas sp. YE-5가 생산하는 Cellulase의 특성

최동철,김동섭,유주현,오두환 한국산업미생물학회 1992 한국미생물·생명공학회지 Vol.20 No.2

Cellulomonas sp. YE-5가 생산하는 cellulase를 분리, 정제하여 효소의 특성을 알아보았다. Avicelase, CMCase, β-glucosidase의 반응 최적온도는 각각 40, 45, 40℃이었고, 반응 최적 pH는 5.5, 6.0 그리고 6.0이었다. 효소의 열안정성은 30∼70℃에서 6시간 처리하였을 때 avicelase와 β-glucosidase는 50℃ 이상에서 거의 실활하였고, CMCase는 50℃에서 약 40%의 활성을 유지하였다. 효소의 안정성에 미치는 pH의 영향은 25℃에서 24시간 처리하였을 때 avicelase와 CMCase는 pH 5.O∼9.0 사이에서 안정하였으며, β-glucosidase는 pH 5.O∼8.0 사이에서 안정하였다. 효소활성에 미치는 금속이온의 영향은 Mn^2+와 Co^2+에 의해 avicelase의 활성이 약간 증가하였고, Cu^2+와 Zn^2+에 의해서는 세 효소가 크게 저해를 받았다. 효소의 기질친화력(K_m)은 avicel에 대한 avicelase가 4.76 ㎍/㎖, CMC에 대한 CMCase I이 27.80㎍/㎖, CMCase Ⅱ가 16.40 ㎍/㎖이었으며, PNPG에 대한 β-glucosidase는 3.51 mM이었다. Enzymatic properties of avicelase, carboxymethyl cellulase (CMCase) and β-glucosidase produced by Cellulomonas sp. YE-5 were studied. Optimal temperature and pH of avicelase were 40℃ and 6.0, and those of CMCase and β-glucosidase were 45℃ and 6.5. Avicelase and CMCase were stable between pH 5.0 and 9.5, and β-glucosidase was stable between pH 5.5 and 8.0. Avicelase and β-glucosidase were inactivated when incubated at 35℃ for 6 hrs, and CMCase was at 40℃ for 6 hrs. All cellulases were strongly inhibited by Cu^2+ and Zn^2+ K_m values of avicelase for avicel, CMCase I and CMCase Ⅱ for CM-cellulose, and β-glucosidase for p-nitrophenyl-β-D-glucoside (PNPG) were 4.76, 16.4, 16.4 ㎍/㎖ and 3.51 mM, respectively.

Characterization of Acidic Carboxymethylcellulase Produced by a Marine Microorganism, Psychrobacter equimeris LBH-10

Hye-Jin Kim(김혜진),Wa Gao(고와),You-Jung Lee(이유정),Chung-Han Chung(정정한),Jin-Woo Lee(이진우) 한국생명과학회 2010 생명과학회지 Vol.20 No.4

Carboxymethylcellulose (CMC)를 분해하는 미생물을 해수에서 분리하였으며, 16S rDNA의 염기서열을 분석하여 동정한 결과, Psychrobacter aquinaris로 학인 되어 P. aquinaris LBH-10로 명명하였다. 이 균주는 CMC, 셀로바이오스, 커드란, 여과지, p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside (pNPG), 풀루란 및 자일란을 분해하였으나, avicel 및 섬유소는 분해하지 못하였다. P. aquinaris LBH-10이 생산하는 carboxymethylcellulase (CMCase)의 최적 반응온도는 50℃이었으며, 20℃에서 50℃의 온도 범위에서 24시간이 경과한 후에도 90% 이상의 활성을 유지하였다. 또한, 이 균주가 생산하는 CMCase의 최적 반응 pH는 3.5이었으며 pH 2.5에서 pH 7.0 사이의 산성 조건하에서 24 시간이 경과한 후에도 70% 이상의 활성을 유지하였다. P. aquinaris LBH-10이 생산하는 CMCase의 최적 반응 pH는 지금까지 발견된 섬유소 분해효소 중에서 가장 낮은 pH로 판단된다. 제한된 농도의 CoCl₂, EDTA, 및 PbCl₂은 P. aquinaris LBH-10가 생산하는 CMCase의 활성을 증가시켰으나, HgCl₂, KCl, MnCl₂, NiCl₂ 및 SrCl₂는 이 균주가 생산하는 CMCase의 활성을 감소시켰다. A microorganism hydrolyzing carboxymethylcellulose (CMC) was isolated from seawater, identified as Psychrobacter aquimaris by analysis of 16S rDNA sequences, and named P. aquimari LBH-10. This strain produced an acidic carboxymethylcellulase (CMCase), which hydrolyzed carboxymethylcellulose (CMC), cellobiose, curdlan, filter paper, p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside (pNPG), pullulan, and xylan, but there was no detectable activity on avicel and cellulose. The optimal temperature for CMCase produced by P. aquimari LBH-10 was 50℃ and more than 90% of its original activity was maintained at broad temperatures ranging from 20 to 50℃ after 24 hr. The optimal pH of the CMCase was 3.5, and more than 70% of its original activity was maintained under acidic conditions between pH 2.5 and 7.0 at 50℃ after 24 hr. The optimal pH of CMCase produced by P. aquimaris LBH-10 seems to be lower than those produced by any other bacterial and fungal strain. CoCl₂, EDTA, and PbCl₂ at a concentration of 0.1 M enhanced CMCase-produced P. aquimaris LBH-10, whereas HgCl₂, KCl, MnCl₂, NiCl₂, and SrCl₂ inhibited it.

Glucoamylase 분비신호서열의 돌연변이에 의한 효모에서 세균의 Endo-1,4-β-D-glucanase의 분비능 증진

이준원,강대욱,김보연,오원근,민태익,이상원,변유량,안종석 한국산업미생물학회 2000 한국미생물·생명공학회지 Vol.28 No.4

S. diastaticus에서 이종단백질의 분비에 대한 GSP의 이용성을 증대시키기 위하여 CMCase 구조 유전자를 GAL7 terminator, GAP promoter, 그리고 STA 유전자의 변이형 GSP (ml : Pro^-18→Leu^-18, m2 : Tyr^-13→Leu^-13, m3 : Ser^-9→Leu^-9, m4 : Asn^-5→Pro^-5)에 재조합하여 secretion vector를 제작하였다. 변이형 m1, m2, 그리고 m3 은 야생형보다 아미노 말단과 소수성 구역에 더 높은 소수성을 가지도록 하였다. 변이형 m4은 극성 아미노산을 제거하고 단백질의 2차 구조를 파괴하는 proline으로 대체하였다. 배양시간에 따른 CMCase 활성측정과 Western blot 분석 결과 변이형 m4를 제외한 모든 변이형의 경우 Leu으로 대체된 변이형 GSP에 의한 CMCase의 분비가 본래의 야생형 GSP에 의한 분비보다 높았으며 특히 m2와 m3에서 약 2배 높았다. 효모 숙주 세포를 제외한 재조합 플라스미드를 가지고 있는 야생형과 변이형들의 모든 효모세포에서 당쇄로 인하여 증가된 이종의 분자량이 큰 단백질들이 (90-100 kDa) 분비되었다. 효모 세포내에서 발현된 CMCase는 약 60, 52, 그리고 46 kDa의 분자량을 보였다. Glucoamylase of Saccharomyces diastaticus is produced as a large precursor composed of signal peptide (21 amino acid residues), Thr and Ser-rich region and functional glucoamylse. To evaluate the utility of the glucoamylase siganl peptide (GSP) for the secretion of foreign proteins, four types of GSP mutants (ml : Pro^-18→Leu^-18, m2 : Tyr^-13→Leu^-13, m3 : Ser-9→Leu^-9, m4 : Asn^-5→Pro^-5) were constructed and secretion efficiency of each mutant was compared with that of native GSP by the expression and secretion of Bacillus subtilis CMCase under the control of GAP promoter and GAL7 terminator in S. diastaticus. Mutants 1,2 and 3 had a higher hydrophobicity than wild type GSP in N-terminal domain and hydrophobic domain. In mutant 4, a polar amino acid was replaced by a helix - breaking Pro residue. CMCase activity assay and Western blot analysis revealed that CMCase secretion by GSP mutants replaced by Leu were increased compared with native GSP. In the case of m2 and m3, the substitution of Leu for Tyr^-13 and Ser^-9 in the hydrophobic region resulted in a twofold increase in the extracellular CMCase activity.

Xylanase와 CMCase의 생산성이 높은 Bacillus sp.의 분리 및 동정

김창원,송민동,정원형,양시용 건국대학교 동물자원연구센터 2000 動物資源硏究誌 Vol.21 No.-

CMCase와 xylanase를 동시에 분비하는 미생물을 얻기 위해 1차적으로 111균주를 분리한 후, 활성이 가장 우수한 1-5균주를 선발하였다. 선발된 균을 API 20과 API 50 CHB kit를 이용하여 동정한 결과 Bacillus licheniformis로 동정되었다. Nutrient broth를 배양배지로 하여 growth와 효소역가를 측정한 결과 cell growth growth는 20시간 후에 stationary phase에 도달하였으며 xylanse는 8시간 배양 후 최대의 역가를 나타냈고, CMCase는 28시간 후 최대의 역가를 나타냈다. A bacterium producing xylanase and CMCase was isolated from soil, has been identified as Bacillus sp. The isolate, named Bacillus sp.1-5, was shown to be very similar to Bacillus licheniformis on the basis of its biochemical and physiological properties. In culture time, xylanase and CMCase production reached to the plateau after 8hr and 28hr of cultivation in the nutrient broth.

우분으로부터 Bacillus subtilis CH-10의 분리 및 균주가 분비하는 Cellulase의 특성에 관한 연구

김태일,한정대,전병수,하상우,양창범,김민균,Kim, Tae-Il,Han, Jung-Dae,Jeon, Byoung-Soo,Ha, Sang-Woo,Yang, Chang-Bum,Kim, Min-Kyun 한국미생물학회 1999 미생물학회지 Vol.35 No.4

우분으로부터 cellulase를 생산하는 미생물을 congo red 염색과 활성측정을 통해 선발하여 cellulase 활성이 우수한 균을 분리하였다. 분리균은 생화학적, 형태학적, 균체 지방산 조성을 근거로 Bacillus subtilis CH-10으로 동정하였다. 분리균이 분비하는 효소학적 특성 중 효소생산 조건은 초기 pH7.5 및 배양돈도 50${\circ}C$ 그리고 48시간 배양이 가장 적합하였다. 조효소액에서 CMCase 최적 온도는 75${\circ}C$이었고, 온도안정성은 50${\circ}C$까지 70%의 효소활성을 유지하였다. 조효소액에서 CMCase 최적 pH는 7.5이었고, pH 안정성은 pH7.5~9.0 영역에서 70%의 효소활성을 유지하였다. 분리균을 CMC 배지에서 37${\circ}C$, 24시간 배양시 나타난 CMCase와 Fpase 활성은 각각 1.13 U/㎖와 0.16U/㎖ 였으나 avicelase와 ${\beta}$-glucosidase의 활성은 검출되지 않았다. CMC-SDS-PAGE 방법으로 3개의 효소활성 band를 확인하였고, Cel 1 및 2 그리고 Cel 3의 분자량은 각각 약 39 및 41 그리고 57kDa이었다. A bacterium producing the extracellular cellulase was isolated from cattle feces and screened as cellulase activity was excellent upon congo red straining method and activity measurements. Isolate was identified as Bacillus subtilis CH-10 on the basis of morphological and biochemical properties as well as cellular fatty acids composition. The enzyme which the isolate secretes had the optimum initial pH and temperature for its induction was 7.5 and 50${\circ}C$, respectively. The maximum CMCase activity in crude enzyme solution was observed at pH 7.5 and 75${\circ}C$ and was stable for pH 7.5 to 9.0 to maintain 70% activity. When the isolate was cultured in CMC media at 37${\circ}C$ for 24 hrs, CMCase and FPase activity was 1.13 U/㎖and 0.16U/㎖, respectively whereas Avicelase and ${\beta}$-glucosidase activity was not detected. When crude supernatant was used for zymogram, three major bands, cel 1, cel 2 and cel 3, were detected approximately 39, 41 and 57 KDa, respectively on CMC-SDS-PAGE.

Protease와 CMCase를 동시에 분비하는 Bacillus sp. SY8-24의 분리 및 대량 생산 조건

양시용,김창원,박근규 건국대학교 동물자원연구센터 1998 動物資源硏究誌 Vol.19 No.-

A bacterium producing protease and CMCase was isolated from soil, has been identified as Bacillus sp. The isolate, named Bacillus sp. SY8-24, was shown to be very similar to Bacillus subtilis on the basis of its biochemical properties. Medium optimization for mass production of Bacillus sp. SY8-24 was performed. The optimum condition for the mass production of Bacillus sp. SY8-24 was attained in a culture medium composed of 1%(w/v) soybean meal and 2%(w/v) molasses.

느티만가닥버섯의 신품종에 대한 endo-, exo-cellular 효소 활성도의 비교

Chang-Yun Lee(이창윤),Ho-Sung Song(송호성),Hyeon-Su Ro(노현수),Ju-Ri Woo(우주리),Young-Hyun You(유영현),Jong-Guk Kim(김종국) 한국생명과학회 2012 생명과학회지 Vol.22 No.6

본 연구는 새롭게 개발된 느티만가닥버섯의 6개 품종에 대한 형태적, 생리적 특성을 조사하고 endo-, exo-cellular 효소 활성을 측정하기 위해서 수행되었다. 국내 야생종인 Hm3-10과 일본 재배종인 Hm1-1과의 단핵균사 교배를 통하여 343개의 교배 균주를 획득하여 재배를 실시하여 58개 균주를 1차 선발하고 2차로 6개 균주를 선발하였다. 6개 선발 균주를 대상으로 배양 일수 별로 재배를 실시한 결과 배양일수가 80일 이상에서는 재배일수가 19~20일로 단축되어 최적 배양일수를 80일로 결정하였다. 80일 배양일수에서 각 품종별 형태적 특성을 검증한 결과 Hm15-3, Hm15-4, Hm17-5의 3균주가 재배에 적합한 균주로 판명되었다. 각 균주의 endo-cellular 효소 활성도를 측정한 결과, α-amylase의 효소 활성도가 73.9~102,2 unit/㎎ protein으로 가장 높았으며, chitinase 의 효소활성도가 8.1~13.1 unit/㎎ protein으로 측정되었다. Exo-cellular효소 활성도를 측정한 결과, α-amylase의 효소활성도가 5,292~1,184 unit/㎎ protein으로 가장 높았으며, CMCase와 Xylanase의 효소 활성도가 각각 1,140~245 unit/㎎ protein, 94~575 unit/㎎ protein으로 측정되었다. 그러나 β-glucosidase와 chitinase의 활성도는 비교적 낮은 활성도를 나타내었다. This study was carried out to investigate the morphological and physiological characteristics of six new cultivars of Hypsizygus marmoreus (Hm) and measure endo-, exo-cellular enzyme-specific activity. The domestic wild stain (Hm3-10) and commercial strain in Japan (Hm1-1) were mated by crossing monokaryon mycelia. We gained 58 strains from one of 400 crosses through the 1<SUP>st</SUP> cultivation experiment, and selected six strains from one of 58 strains through the 2<SUP>nd</SUP> cultivation experiment. When six of the selected new strains were grown during several spawn culture periods (60, 70, 80, 90, and 100 days), a spawn culture period of more 80 days was considered to be excellent as being shorter than 19~20 days. Therefore, we determined the period of spawn culture as 80 days. Three strains such as Hm15-3, Hm15-4, and Hm17-5 showed an excellent result. When endo-cellular enzyme activity measured eight strains, we obtained a result of that specific activity of α-amylase at the highest as 73.9~102.2 unit/㎎ protein, and chitinase is lower than α-amylase at 8.1~13.1 unit/㎎ protein. When exo-cellular enzyme activity measured eight strains, we determined the result of that specific activity of α-amylase is the highest at 5,292~1,184 unit/㎎ protein, and CMCase and xylanase were 1,140~245 unit/㎎ protein, 94~575 unit/㎎ protein, compared to each other. However, the enzyme activity of β-glucosidase and chitinase is low.

합성(合成) 배지(培地)에서 느타리속(屬)이 생산(生産)하는 섬유소(纖維素) 분해효소(分解酵素)에 관한 연구(硏究)(제2보) -비타민류(類), 무기(無機) 염류(鹽類)와 배양(培養) 조건(條件)의 영향(影響)-

홍재식,이종배,고무석,김정숙,이극로,정기태,Hong, Jai-Sik,Lee, Jong-Bae,Koh, Moo-Seok,Kim, Jeong-Sook,Lee, Keug-Ro,Jung, Gi-Tae The Korean Society of Mycology 1986 韓國菌學會誌 Vol.14 No.1

Pleurotus spp.중 섬유소(纖維素) 분해효소(分解酵素) 생산력(生産力)이 가장 강한 Pleurotus sajor-caju JAFM 1017을 합성배지(合成培地) 상에서 vitamin류(類), 무기염류(無機鹽類)와 배양조건(培養條件)의 영향을 검토(檢討)한 결과(結果)는 다음과 같다. 섬유소(纖維素) 분해효소(分解酵素) 생산(生産)은 folic acid와 thiamine-HCI에 의해 촉진되었고 $KH_2PO_4$와 $MgSO_4$의 최적농도(最適濃度)는 각각 0.2%, 0.04%(w/v)이었으며 그 밖의 무기염류(無機鹽類)는 효과(效果)가 없었다. 효소생산(酵素生産)에 최적(最適)인 배양온도(培養溫度)와 배지(培地) pH는 avicelase가 $25^{\circ}C$, 5.5이었고, CMCase는 $30^{\circ}C$, 5.0이 였으며, ${\beta}-glucosidase$는 $30^{\circ}C$, 6.5이었다. The production of cellulolytic enzymes by Pleurotus sajor-caju JAFM 1017 was stimulated by folic acid and thiamine-HCl. Among the inorganic salts, optimum concentrations of $KH_2PO_4$ and $MgSO_4{\cdot}7H_2O$ were 0.2% (w/v) and 0.04% (w/v), respectively, but other inorganic salts were not effective for the production of the enzymes. The optimum culture temperature and pH for the production were $25^{\circ}C$ and 5.5 for avicelase, and $30^{\circ}C$ and 5.0 for CMCase, and $30^{\circ}C$ and 6.5 for ${\beta}-glucosidase$, respectively.

Glucoamylase 유전자의 promoter 와 분비신호서열을 이용한 Bacillus subtilis Endo-1-4$\beta$-D-Glucanase 의 효모에서 분비

안종석,강대욱,황인규,박승환,박무영,민태익 한국미생물학회 1992 미생물학회지 Vol.30 No.5

STA1 유전자의 promoter 와 분비신호서열을 이용하여 B. subtilis 의 CMSase 를 분비하는 재조합 효모균주를 육성하였다. STA1A 유전자의 promoter, 분비신호서열, TS region 및 mature glucoamylase N-말단부위의 아미노산 98개와 B. subtilis 의 CMCase 구조유전자가 차례로 연결된 재조합플라스미드 pYESC24 를 제작한후 효모에 형질전환하였으나 CMCase 가 세포외로 분비되지 않았다. 반면에 STA1 의 TS region 및 mature glucoamylase N-말단 아미노산 98 개를 제거하여 CMMase 구조유전자갸 STA1 의 분비신호서열에 바로 연결된 재조합 플라스미드 pYESC11 에 의한 효모형질전환 균주는 CMCase 분비능이 아주 우수하였다. 이 형질전환 균주를 YPD 배지에서 4 일간 배양한 후 세포부위 별 CMCase 역가를 측정한 결과 배양액 1 m/당 총역가 44.7 unit 존재하였으며 이중 93% 이상이 배양상등액에서 관찰되었다. For the development of a glucanolytic yeast strain. the seceretion of endo-1.4-$\beta$-D-glucanase (CMCase) of Bacillus subtilis was performed in yeast using glucoamylase gene (STA1) of Saccharomyces diastaticus. A 1.7 kb-DNA fragment of STA1 gene containing authentic promoter, signal sequence, threonine serine-rich (TS) region and N-terminal region (98 amino acids) of mature glucoamylase was ligated to YEp 24. E. coli-yeast shuttle vector. And then. CMCase structural gene of B. subtilis was fused in frame with the 1.7 kb-DNA fragment of STA1 gene, resulting in recombinant plasmid pYES('24. Yeast transformant harboring pYESC24 had no CMCase activity. So. we deleted TS region and N-terminal region of mature glucoamylase existing between signal sequence and CMCase structural gene in pYESC24. consequently constructed recombinant plasmid pYESC11. The yeast transformed with the newly constructed recombinant plasmid pYESC11 efficiently secreted CMCase to extracellular medium. After 4 days culture. total CMCase activity of this transformant was 44.7 units/ml and over 93% of total CMCase activity was detected in culture supernatant.