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Paenibacillus sp. JB-13 Cyclodextrin Glucanotransferase 유전자의 E. coli 에서의 발현 및 최적 생산
김해윤,이상현,김해남,민복기,백형석,전홍기,Kim, Hae-Yun,Lee, Sang-Hyeon,Kim, Hae-Nam,Min, Bok-Kee,Baik, Hyung-Suk,Jun, Hong-Ki 한국미생물학회 2008 미생물학회지 Vol.44 No.1
L-ascorbic acid (AA)의 2번 위치의 수산기에 부위 특이적 활성을 갖는 Paenibacillus sp. JB-13 유래의 cyclodextrin glucanotransferase (CGTase, EC 2.4.1.19) 유전자(cgt gene)를 pEXP7 발현 vector에 클로닝하여 재조합 균주를 구축하였다. 재조합 균주의 CGTase생산 최적 조건을 검토하여 본 결과 LB 배지에 0.5% glucose, 3.0% polypeptone, 0.3% $K_2HPO_4$, 0.5% NaCl이 되도록 추가하고, 초기 pH 7.0, 접종량 2%, 통기량 0.1 vvm, 배양 온도 $37^{\circ}C$, 배양 시간 14시간의 조건에서 최대 활성을 나타내었다. 재조합 균주와 기존 균주의 CGTase 활성을 비교한 결과 재조합 균주는 배양 14시간째 640 units/ml의 활성을 가져 기존 균주에 비해 70%의 활성을 나타내지만 배양 시간을 1/4로 단축시킬 수 있다는 이점이 있음을 확인하였다. 재조합 균주가 생산한 CGTase를AA-2G합성에 적용하여 AA-2G를 합성하고 HPLC로 분석한 결과 단일 peak를 확인할 수 있었고 ${\alpha}$-glucosidase를 처리하여 확인한 결과 AA와 glucose로 분리됨을 확인할 수 있었다. The purpose of this study is to clone cgt gene from Paenibacillus sp. JB-13 and to overexpress the protein in E. coli. For this purpose, the cgt gene was amplified from Paenibacillus sp. JB-13 genomic DNA by PCR using degenerate oligonucleotide primers. The sequence analysis results showed that the cgt gene from Paenibacillus sp. JB-13 has 98% homology with the cgt gene of Bacillus sp. To overexpress the protein, the cgt gene was cloned into pEXP7 expression vector and transformed into E. coli. The production of CGTase by recombinant E. coli was optimized under following conditions: 0.5% glucose, 3.0% polypeptone, 0.3% $K_2HPO_4$, 0.5% NaCl, and 7.0 of initial pH, 2.0% of inoculum, $37^{\circ}C$ of culture temperature for 14 hr. And the optimal agitation was found at 0.1 vvm. The synthesis of 2-O-${\alpha}$-D-Glucopyranosyl L-Ascorbic acid (AA-2G) using the CGTase expressed in E. coli was identified as AA-2G by HPLC and HPLC confirmed that treating AA-2G made by cloned CGTase with ${\alpha}$-glucosidase substantially produced AA and glucose.
김해남,권도훈,김해윤,전홍기,Kim Hae-Nam,Kwon Do-Hoon,Kim Hae-Yun,Jun Hong-Ki 한국생명과학회 2005 생명과학회지 Vol.15 No.2
손바닥선인장 추출물은 한의학에서 항염증 작용, 화상, 부종, 소화 불량 등 몇 가지의 생리학적 기능이 확인되었다. 본 연구에서는 손바닥선인장 줄기를 메탄올을 이용하여 추출한 후 그 추출물을 이용하여 항균활성을 확인한 결과 병원균 등 일반 세균에서 항균활성을 확인하였다. 특히, 약제내성균 및 혐기성 균인 여드름 원인균 뿐만 아니라 효모, 곰팡이 등 진균류에서도 항균활성을 나타내어 넓은 항균 스펙트럼을 가지고 있음을 확인할 수 있었다. 또한 열 처리, 저장온도 및 저장기간이 항균활성에 영향을 미치지 않았으므로 온도 및 기간에 안정함을 확인할 수 있었고, 식품 보존제로서의 가능성 확인 시험에서도 기존의 식품 보존제보다 안전성이 있는 항균활성 물질로 평가되었다. The Opuntia ficus-indica var. saboten Makino (Cactus) is a tropical or subtropical plant, which is cultivated or grows naturally in Jeju island. It has been widely used as folk medicine for burned wound, edema and indigestion. In addition, its extract has been claimed to have several biological activities including anti-inflammation in oriental medicine. In this study, we examined the antimicrobial activities of the methanol extract of Opuntia ficus-indica var. saboten Makino. The extract showed a broad spectrum of antimicrobial activity against pathogenic bacteria, including antibiotics resistant bacteria (MRSA, R-P. aeruginosa, VRE) and Propionibacterium acnes, yeast, and fungi. The extract retained the activity after heat treatment for 15 min at $100^{\circ}C$ and $121^{\circ}C$ and after extended storage, up to 10 weeks storage period at $4^{\circ}C$ and $25^{\circ}C$, also stably retained its activity. It showed a better inhibitoring effect to the growth of E. coli than sodium benzoate did it at the same concentration. Addition of various salts or metal ions did not affect on its antimicrobial activity. Therefore, the antimicrobial characteristics of the extract can be applicable as a natural preservative and an antimicrobial agent for bacterial disease.