Cancer Targeting Phage-based Photodynamic Therapy for Pancreatic Cancer Treatment

김경진 아주대학교 2022 국내석사

Bacteriophage application against reptile-associated bacterial zoonoses

권준 서울대학교 대학원 2022 국내박사

This study was conducted to develop the antimicrobial agents to prevent reptile-associated bacterial disease. The target disease was determined to salmonellosis. Bacteriophages are bacterial virus. These particular viruse can infect and lyse specific bacterial cells that they target on. For more than one century after discovery of phages, previous studies isolated many phages and revealed a lot of biological and genomic features of phages. As more phages have been discovered, researchers have tried to classify them by morphologies and then by their genomes. Jumbo-phage is the phage which has genome size larger than 200kbp. As their genome size is big and comprises many putative genes, jumbo-phages are highly diverse. However, the functions of these phage genes are not clear. The study of these genes will provide profound understandings of bacteriophages. Bacteriophage therapy is a therapeutic strategy that uses bacteriophage or phage products as biocontrol agents. As antimicrobial resistances arise, phage therapy has been regarded as a most promising alternative because of several characteristics of phages. First, phages have entirely different mechanism to lyse bacteria. Therefore, phages are able to infect and kill antibiotics resistant bacteria, and make synergetic effects when used in combination with antibiotics. Secondly, phages have specific host range. Because of narrow host range, it is possible to target on and lyse bacterial pathogens without disturbance of normal flora. Most of all, phages exist and distributed in environment. It means that we should isolate phages from environment in developing phage antimicrobial agents. Therefore, it is less expensive and time-consuming than new antibiotic developments. However, phage therapy has also limitations. Because phages have specific host range, it is important to figure out which bacteria is causative agent or whether bacteria are causative. Therefore, phage therapies frequently need isolation of pathogen and its identification. It makes hard to apply phage therapy in emergence situation before pathogens identified. So, in these cases, antibiotic applications are much better treatment strategy. And, although causative bacteria were identified, we need bacteriophages to apply. Some phages can infect various bacterial strains, or rarely species, but most of them are able to cover only one species or a few subtypes. Therefore, it is important to isolate, characterize and select various phages before phage application. In this study, we isolated and characterized three novel Salmonella infecting phages. For phage isolation, author used Salmonella strains isolated from reptiles. First phage was designated as pSal-SNUABM-01. Transmission electron microscopy demonstrated that the phage is C3 morphotype, Podoviridae morph possessing an elongated head. The close relatedness of phage pSal-SNUABM-01 and 7-11 were revealed by genomic comparison. Previous study described that the phage 7-11 is close to genus Kuravirus. However, as much more phages have been isolated worldwide, some taxonomic descriptions which have done in the early days became to need corrections. Genomic comparison demonstrated that phage pSal-SNUABM-01 and 7-11 are strongly likely to be a novel genus. A novel jumbo-phage, pSal-SNUABM-04, was isolated and characterized. For profound understading of the phage, we investigated not only genomic features but biologic charactristics, such as infection kinetics and host infectivity. The phage was classified as Myoviridae and involved in genus Machinavirus. We isolated a novel Salmonella phage pSal-SNUABM-02. The biological features of the phage were investigated. The phage was Ackermannviridae and showed vigorous lytic effects towards Salmonella host strain. Most of all, the phage showed stablility in pH 5-9, 4-37℃, and ultravioletA/ultravioletB exposure which are environmental conditions of reptile cage. The author selected the phage, pSal-SNUABM-02, as biocontrol agent against reptile-associated Salmonella. 본 연구는 파충류 관련 세균성 질병을 예방하기 위한 항균제 개발을 목적으로 수행되었습니다. 대상 질병은 살모넬라증으로 결정되었습니다. 박테리오파아지는 세균을 감염하는 바이러스입니다. 이 바이러스는 표적이 되는 특정 박테리아 세포를 감염시키고 용해시킬 수 있습니다. 파지가 발견된 후 1세기 이상의 선행 연구에서는 많은 파아지를 분리하고 파아지의 생물학적, 유전자적 특징을 많이 밝혀냈습니다. 따라서, 연구자들은 처음에는 파지를 형태학적으로, 그 다음엔 유전자 분석을 통하여 파아지를 분류하였습니다. Jumbo-phage는 200kbp 이상의 유전자를 가진 파아지입니다. 이들의 유전자의 크기가 크고 많은 putative gene으로 구성되어 있기 때문에 jumbo-phage는 큰 다양성을 지니고 있습니다. 그러나 이러한 파아지 유전자의 기능은 명확하게 밝혀져 있지 않습니다. 이러한 유전자에 대한 연구는 박테리오파아지에 대한 깊은 이해를 제공할 것입니다. 박테리오파아지 요법은 생물학적 방제제로 박테리오파아지 또는 파아지의 생산 단백질들을 사용하는 치료 전략입니다. 항균제 내성이 발생함에 따라 파아지 요법은 파아지의 여러 특성 때문에 가장 유망한 대안으로 여겨져 왔습니다. 파아지는 항생제와는 완전히 다른 박테리아를 용해하는 메커니즘을 가지고 있습니다. 따라서 파아지는 항생제 내성균을 감염시키고 사멸시킬 수 있으며, 항생제와 함께 사용하면 시너지 효과를 낼 수 있다. 둘째, 파아지는 특정 숙주 범위를 가지고 있습니다. 숙주 범위가 좁기 때문에 정상 세균총을 교란하지 않고 특정 병원체만을 표적으로하여 용해하는 것이 가능합니다. 무엇보다 파아지는 주위 환경에 존재하고 분포합니다. 따라서 파아지 항균제의 개발은 새로운 물질의 개발이 아닌 환경에서의 분리를 통하여 이루어 지므로, 비용이 저렴하고 시간이 적게 소요됩니다. 그러나 파아지 치료에도 한계가 있습니다. 파아지는 특정한 숙주 범위를 가지고 있기 때문에 어떤 박테리아가 원인균인지 또는 박테리아가 발병의 원인인지 파악하는 것이 중요합니다. 따라서 파아지 요법의 대다수가 병원체의 분리 및 식별이 필요합니다. 병원체 식별되기 전에 치료가 급한 상황에서 파아지 요법을 적용하는 것은 어렵습니다. 따라서 이러한 경우 항생제를 사용하는 것이 훨씬 더 나은 치료 전략입니다. 그리고 원인균이 확인되었다 하더라도, 적용할 파아지가 준비되어 있어야 합니다. 일부 소수의 파아지는 다양한 박테리아 균주를 감염시키거나 드물게 여러 종을 감염시킬 수 있지만, 대부분은 한 종 또는 소수의 하위 아종만을 감염할 수 있습니다. 따라서 파아지 적용 전에 다양한 파지를 분리, 특성 분석 및 선택하는 것이 중요합니다. 이 연구에서 우리는 살모넬라를 감염하는 세 가지의 새로운 파아지를 분리하고 특성분석을 했습니다. 파아지 분리를 위해 저자는 파충류에서 분리된 살모넬라 균주를 사용했습니다. 첫 번째 파아지는 pSal-SNUABM-01로 명명되었습니다. 투과전자현미경으로 파아지가 C3 형태의 Podoviridae인 것으로 판명되었으며, 특징적으로 긴 머리를 가지고 있습니다. 파아지 pSal-SNUABM-01 및 7-11의 밀접한 관련성은 유전자 비교에 의해 밝혀졌습니다. 선행 연구에서는 파아지 7-11이 Kuravirus속에 가깝다고 설명했습니다. 그러나 전 세계적으로 훨씬 더 많은 파아지가 분리됨에 따라 초기에 수행되었던 일부 분류학적 기술은 수정이 필요하게 되었습니다. 유전자 비교는 파아지 pSal-SNUABM-01 및 7-11이 새로운 속일 가능성이 매우 높다는 것을 보여주었습니다. 새로운 jumbo-phage pSal-SNUABM-04가 분리되고 특성분석이 되었습니다. 해당 파아지에 대한 이해를 위해 우리는 유전자적 특징뿐만 아니라 감염 동역학 및 숙주 감염성과 같은 생물학적 특성을 조사했습니다. 파지는 Myoviridae로, Machinavirus 속에 포함되는 것으로 분석되었습니다. 우리는 새로운 살모넬라 파아지 pSal-SNUABM-02를 분리하고, 파아지의 생물학적 특징을 조사하였습니다. 파아지는 Myoviridae으로 판명되었으며, Salmonella 숙주 균주에 대해 활발한 용해 효과를 보였습니다. 무엇보다 해당 파아지는 pH 5-9, 4-37℃, 파충류 케이지의 환경조건인 UVA/UVB 노출에서 안정한 양상을 보였습니다. 저자는 파충류 관련 살모넬라균에 대한 생물학적 방제제로 파아지 pSal-SNUABM-02를 선택했습니다.

Accelerating the evolution of bacteriophages targeting Acinetobacter baumannii in host range expansion and determination of its background genetic mechanisms

Vu Thao Nguyen Graduate School, Yonsei University 2024 국내박사

Prior to the discovery and widespread use of antibiotics, bacteriophages (phages) were a potential solution for preventing and treating bacterial infections (1, 2). With the emergence of antimicrobial resistance, there has been a renewed interest in phages (3). However, a major limitation to using phage as therapy is their narrow host range, limiting their effectiveness to specific bacterial strains of the same species (4). To address this limitation, phage training, such as Appelmans protocol, has been proposed as a strategy for expanding the host range of phages (5). Despite its potential, there are currently no reports of the protocol being applied to phages targeting Acinetobacter baumannii, an opportunistic pathogen responsible for a variety of hospitalacquired infections with high mortality rate (6). The aims of my dissertation were to apply the Appelmans protocol for expanding the host range of a phage cocktail targeting A. baumannii and evaluate the therapeutic potential of the expanded host range phages generated from the protocol. Additionally, the genetic mechanism underlying the protocol was also investigated to gain insights into its effectiveness. Chapter I provides a brief overview of Acinetobacter baumannii and highlights the significant global concern surrounding carbapenem-resistant A. baumannii (CRAB) strains. Furthermore, it introduces the fundamental background on bacteriophages and phage therapy, along with their limitations and discusses various approaches to overcome these challenges. Chapter II describes the application of the Appelmans protocol as a host range expansion method to broaden the host range of a phage cocktail targeting CRAB. The assessment of the host range expansion covered both the output cocktail and individual phage clones generated from the method. While the protocol consistently demonstrated the capability to expand the host range of the cocktail, it faced challenges when dealing with CRAB strains. Chapter III delves into the screening and characterization process used to identify potential therapeutic phages. The focus was on evaluating individual phage clones generated from the Appelmans protocol for therapeutic applications. Throughout the evaluation, key factors such as host range stability,lytic growth, transduction potential, and the absence of toxin genes were rigorously examined. However, it is noteworthy that the expanded host range phages obtained from this protocol exhibited limited stability, raising concerns about their suitability for therapeutic purposes. Chapter IV discusses the genetic insights into the Appelmans protocol’s mechanism, not only based on previous studies involving phages targeting different bacterial species but also when applied to the phage cocktail targeting CRAB. A bioinformatics workflow was established to analyze the ancestral of the expanded host range generated from the protocol and the finding revealed that they were recombinant derivatives of prophages induced from encountered bacterial strains. Favorable conditions and explanations for prophage induction during this protocol were proposed to support this genetic mechanism. In conclusion, this dissertation focused on the potential and challenges of a phage training method, especially, the Appelmans protocol in expanding the host range of phages for therapeutic applications. The findings emphasize the importance of understanding the genetic mechanisms underlying phage-host interactions to optimize phage therapy strategies for combating antibioticresistant bacterial infections. Parts of this dissertation are adapted from Vu TN, Clark JR, Jang E, D'Souza R, Nguyen LP, Pinto NA, et al. Appelmans protocol - A directed in vitro evolution enables induction and recombination of prophages with expanded host range. Virus Res. 2023;339:199272.

Discovery and development of KL001-13 therapeutic antibody: an anti-PD-L1 immune checkpoint inhibitor for immune-based cancer therapy : Choi Jong Rip

Choi Jong Rip Kangwon National University 2021 국내박사

Isolation and Characterization of Novel Bacteriophages KPP2018 and KPP2020 infecting Klebsiella pneumoniae and Development of a Phage Cocktail as a Biocontrol Agent in Food

정수현 서울대학교 대학원 2023 국내석사

Klebsiella pneumoniae is a well-known opportunistic human pathogen causing chronic pulmonary obstruction and primarily infects the immunocompromised individuals in nosocomial environment. This pathogen can produce extended-spectrum beta-lactamases (ESBL), which are resistant to almost all beta-lactam antibiotics, and nowadays carbapenem-resistant strains are increasing. Recently, Klebsiella pneumoniae is detected in food samples, especially in poultry products or in raw vegetables. Therefore, the development of new agent is urgently needed and to control this pathogen, 12 Klebsiella-infecting phages were isolated from sewage samples. The analysis of host range revealed that the isolated phage KPP2020 has high host specificity among them, inhibiting only K. pneumoniae. The phage KPP2018 infects K. pneumoniae mainly, also infects Shigella spp., and Salmonella serovars. Morphological observation using TEM showed that both phages belong to the family Siphoviridae. The stability of KPP2020 and KPP2018 was maintained for 12 h under stress conditions (-20~60℃ and pH 3~11 for KPP2020 and -20~65℃ and pH 3~12 for KPP2018). Bacterial challenge assay of KPP2020 showed 3.51 log reduction of K. pneumoniae KCTC 2242 within 2 h. The complete genomes of KPP2020 and KPP2018 were analyzed and revealed that KPP2020 consists of 49,044 bp containing 95 ORFs with a GC content 51.33%, while KPP2018 consists of 137,988 bp DNA with 228 ORFs. Subsequent bioinformatics analysis revealed no toxin genes or virulence factor, suggesting the safety for human applications. Comparative genome analysis about tail gene cluster was conducted and there was no identity between KPP2020 and KPP2018 tail-related genes, indicating that differences in host range results may related to this. Application of KPP2020 using cutting board showed about 4 log reduction for at least 7 h, indicating that KPP2020 has potential to control K. pneumoniae effectively. Food application of the phage cocktail consisting of KPP2020 and KPP2018 in a 1:1 ratio using chicken meat showed higher lytic activity (4.35 log reduction within 2 h) and phage resistance of indicator strain developed slower than that of single phages. KPP2020 can lower the secretion of pro-inflammatory cytokines of K. pneumoniae infected RAW 264.7 cells, suggesting that KPP2020 has therapeutic effect against bacterial infection. KPP2020 does not induced inflammatory response of RAW 264.7 cells and not involved in the response induced by LPS, suggesting that KPP2020 can be an effective therapeutic agent against bacterial infection. Therefore, these two novel bacteriophages KPP2020 and KPP2018 can be used as natural food preservatives for food safety, and KPP2020 can be a therapeutic agent against K. pneumoniae infection. 클렙시엘라 뉴모니애는 만성 폐 장애를 일으키는 균주로, 선택적으로 병원성을 가지는데 주로 병원 환경에서 면역이 약화된 개인을 감염한다. 이 병원균은 대부분의 베타-락탐 항생제에 내성이 있는 ESBL을 생성할 수 있고, 최근에는 식품, 특히 가금류나 야채에서 클렙시엘라 뉴모니애가 검출되는 사례가 증가하고 있어서 이를 제어하기 위한 새로운 제제의 개발이 시급하다. 이를 제어하기 위해서 클렙시엘라를 감염하는 파지를 하수 처리장에서 분리했다. 각 파지의 감염 범위를 분석한 결과, KPP2020은 클렙시엘라 뉴모니애만을 억제하는 아주 높은 숙주 특이성을 보이는 것을 확인했고, KPP2018은 주로 클렙시엘라 뉴모니애를 감염하며, 시겔라 속, 살모넬라도 감염하는 것을 확인하였다. 투과 전자 현미경을 사용한 형태학적 관찰을 통해, 두 파지 모두 Siphoviridae 과에 속한다는 것을 알 수 있었다. 다양한 스트레스 조건에서 KPP2020과 KPP2018의 안정성을 확인해본 결과, KPP2020의 경우, -20℃에서 60℃ 그리고 pH 3에서 11까지, KPP2018의 경우, -20℃에서 65℃ 그리고 pH 3에서 12까지 범위 안에서 12시간 동안 안정적이었다. KPP2020의 숙주 제어 능력을 확인한 결과, 클렙시엘라 뉴모니애를 2시간 이내에 3.51 로그 감소시키는 것을 확인하였다. KPP2020 및 KPP2018의 유전체를 분석하였고, 파지 꼬리 부분에 해당하는 유전자군을 비교 분석한 결과, KPP2020과 KPP2018 사이에는 상동성이 없었으며, 이는 두 파지의 감염 범위의 차이와 연관이 있음을 확인하였다. 클렙시엘라 뉴모니애가 오염된 도마에 KPP2020을 적용하여 균주 저해 효과를 확인한 결과, 최소 7시간 동안 지속적으로 4 로그 이상의 균을 감소시키는 것을 확인하였다. 식품에서 파지를 더 효과적으로 적용하기 위해 KPP2020과 KPP2018을 1:1 비율로 혼합하여 파지 칵테일을 제작하였고, 이를 닭고기에 적용해 보았을 때, 단일 파지보다 더 높은 용균 활성을 보였고 (2시간 내 4.35 로그 감소), 파지에 대한 균주의 저항성이 더 느리게 생성되었다. KPP2020은 클렙시엘라 뉴모니애가 감염된 RAW 264.7 세포에서 전 염증성 사이토카인의 분비를 낮출 수 있어 KPP2020이 세균 감염에 대한 치료 효과가 있음을 시사한다. KPP2020을 RAW 264.7 세포에 처리하였을 때 전 염증성 사이토카인이 발현되지 않았고, LPS로 인해 염증 반응이 활성화된 RAW 264.7 세포에 파지를 처리하였을 때 사이토카인의 발현에 관여하지 않기 때문에 KPP2020은 더 효과적인 치료제로서 사용될 수 있다. 본 연구를 통해 새로운 박테리오파지 KPP2018과 KPP2020은 식품 안전을 위한 천연 식품 첨가제로 사용될 수 있으며, KPP2020은 세균 감염에 대한 치료제가 될 수 있음을 확인하였다.

Studies on antibiotic resistance and the biocontrol potential of bacteriophages against zoonotic pathogens and their biofilms

김상근 서울대학교 대학원 2022 국내박사

Antibiotic resistance is a major concern from the perspective of global public health. Since the emergence of antibiotic resistance bacteria, such as methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA), vancomycin-resistant enterococci (VRE), and carbapenem-resistant Enterobacterales (CRE), there have been a growing number of reports describing novel mechanisms of antibiotic resistance in zoonotic bacterial pathogens. In particular, since the bacteria existing inside the biofilm structure are protected from antibiotics by the bacteria located at the outermost part of the biofilm, it is difficult to control bacterial cells in biofilms with conventional antibiotic agents when they are in planktonic status. Chryseobacterium is a bacterial species associated with antibiotic resistance issue. Although they are prevalent in different environments, low pathogenicity and slow disease progression have been neglected. Considering their significance in immunocompromised patients, the exact antibiotic resistance profiles and mechanisms should be elucidated. In this study, we isolated C. cucumeris SKNUCL01, which shows severe antibiotic resistance from the pond loaches, that are generally consumed as tonics in East Asia. The strain revealed extensive drug resistance (XDR) to the tested antibiotics, such as trimethoprim/sulfamethoxazole, levofloxacin, and ciprofloxacin, which are known to be effective drugs against the strain. Furthermore, SKNUCL01 was resistant to carbapenems, which are considered the last resort for drug-resistant pathogenic infections. Phenotypic examinations for antibiotic resistance verified that the resistance of SKNUCL01 stems from metallo-beta-lactamases (MBLs) and efflux pumps. Genotypic analysis suggested that the antibiotic resistance of the strain could originate from novel mechanisms. In this study, we suggest bacteriophages to combat biofilms that are difficult to control with conventional antimicrobial agents. We isolated S. pseudintermedius strains, a major zoonotic pathogen between humans and companion animals, and two novel siphophages that specifically infect S. pseudintermedius. The pathogens exhibited multidrug resistance, including methicillin resistance and biofilm-forming capacity. The two phages, pSp_SNUABM-J and pSp_SNUABM-S, were isolated from canine pet parks in South Korea, and their complete genomes were sequenced and analyzed. The biological features of the phages were examined, and they were able to infect most methicillin-resistant S. pseudintermedius (MRSP) strains. The phages were highly stable under normal body environment, i.e. ~37°C and pH 7. The lysis kinetics of the two phages and their cocktail against planktonic bacterial cells showed that they have the potential to control S. pseudintermedius. We found that the phages could prevent or degrade biofilms at low and high doses, respectively. We could not find any genes related to antibiotic resistance or virulence of staphylococci, which guarantees the safety of the phages. These results suggest that the two novel phages can be used as biocontrol agents for treating both methicillin-susceptible and methicillin-resistant S. pseudintermedius strains. We isolated and characterized a jumbo myophage that infects Vibrio alginolyticus, a major zoonotic pathogen in aquatic animals and humans. It causes mass mortality in aquatic animals and is localized to systemic infections in humans. The phage isolated from the seawater of the aquaculture farm was designated as pVa-21, and its complete genome was sequenced (231,998 base pairs). Furthermore, pVa-21 did not harbor antibiotic resistance, virulence, or temperate phage-related genes. pVa-21 was stable at various temperatures (4-35°C) and pH (5.0-9.0) range and was effective in inhibiting bacterial growth. Furthermore, the biofilm-degrading efficacy of phage pVa-21 was verified for 48 h. These data may promote the application of bacteriophages for the control of Vibrio biofilms. 공중보건의 관점에서 항생제 내성 문제는 전 세계적인 주요 관심사 중 하나이다. 메티실린 내성 황색 포도상구균(MRSA), 반코마이신 내성 장구균(VRE), 카바페넴 내성 장내 세균(CRE)과 같은 항생제 내성 세균의 출현 이후 인수공통전염병 원인균의 새로운 항생제 내성 기전을 설명하는 보고가 증가하고 있는 실정이다. 특히, 생물막 구조체 내부에 존재하는 세균은 항생물질로부터 생물막의 가장 바깥쪽에 위치한 세균에 의해 보호되기 때문에 기존 방식(항생제)으로 생물막성 세균감염을 제어하는 것은 어렵습다. Chrysoebacterium은 항생제 내성 관련 문제와 관련되어있는 세균 종 중 하나이다. 그들은 다양한 환경에 널리 퍼져 있지만 낮은 병원성과 느린 질병 진행으로 인해 많은 주목을 받지 못하고 있는 실정이다. 그러나 면역 저하 환자에서 이들의 중요성을 고려할 때 정확한 항생제 내성 프로파일과 기전이 밝혀져야할 필요가 있다. 본 연구에서는 동아시아에서 강장 목적으로 널리 소비되는 미꾸라지에서 항생제 내성이 심한 C. cucumeris SKNUCL01을 분리하였다. 이 균주는 trimethoprim/sulfamethoxazole, levofloxacin, ciprofloxacin 등 일반적으로 효과적인 약물이라고 알려진 다양한 항생제에 광범위한 약물 내성을 나타냈다. 또한 SKNUCL01은 약제내성 병원성 감염 사례의 최후의 수단으로 여겨지는 carbapenem 계열 항생제에 내성을 보였다. 항생제 내성에 대한 표현형 검사를 통해 SKNUCL01의 내성이 metallo-beta lactamase 및 유출 펌프에서 비롯된 것으로 확인되었다. 그리고 유전형 분석은 균주의 항생제 내성이 새로운 메커니즘에서 비롯된 것일 수 있음을 시사하였다. 본 연구를 통하여 우리는 기존의 항균제로 제어하기 어려운 생물막을 제어하기 위해 박테리오파지를 제안한다. 우리는 인간과 반려동물 사이의 주요 인수공통 병원체인 S. pseudintermedius 균주와 S. pseudintermedius를 특이적으로 감염하는 2개의 새로운 siphophage를 분리하였다. 병원균은 메티실린 내성을 포함한 다제 내성과 생물막 형성 능력을 나타내었다. 두 개의 파지 pSp_SNUABM-J와 pSp_SNUABM-S는 한국의 개 애완동물 공원에서 분리되었으며 이들의 전체 유전체 서열을 시퀀싱하였고, 분석하였다. 파지의 생물학적 특징을 조사한 결과, 파지는 대부분의 메티실린 내성 S. pseudintermeidus 균주를 감염시키는 능력을 갖추었다. 파지는 정상적인 신체 환경, 즉 ~37°C 및 pH 7에서 매우 안정적이었다. 두 파지의 용해 역학과 플랑크톤 박테리아 세포에 대한 칵테일은 S. pseudintermedius를 제어할 가능성이 있음을 보여주었다. 그리고 우리는 파지가 각각 저용량 또는 고용량에서 생물막을 예방하거나 제거할 수 있음을 발견했으며, 박테리오파지의 안전성을 해할 수 있는 항생제 내성이나 포도상구균의 독성과 관련된 유전자는 찾을 수 없었다. 이러한 결과는 두 개의 새로운 파지가 메티실린 감수성 또는 내성에 상관없이 S. pseudintermedius 균주를 모두 치료하기 위한 생물학적 방제제로 사용될 수 있음을 시사한다. 우리는 수생 동물과 인간 사이의 주요 인수공통 병원균인 Vibrio alginolyticus를 감염시키는 점보 myophage를 분리하고 그 특성을 분석하였다. V. alginolyticus는 수생 동물에서 대량 사망을 유발하고 인간에서 국소감염부터 전신 감염에 이르기까지 다양한 질병을 일으킨다. 양식장 해수에서 신규 분리한 박테리오파지 pVa-21의 전체 유전자 염기서열을 분석하였고, 231,998 염기쌍 크기의 유전체에는 항생제 내성, 독성 또는 temperate 박테리오파지 관련 유전자가 검출되지 않았다. pVa-21은 다양한 온도(4-35°C) 및 pH(5.0-9.0) 범위에서 안정하였고 세균 증식 억제에 효과적이었다. 또한, 48시간 동안 파지 pVa-21의 바이오필름 분해 효능을 검증하였다. 이러한 데이터는 Vibrio 생물막 제어를 위한 박테리오파지의 적용을 촉진할 것으로 판단된다. 종합적으로 본 연구에서는 인수공통전염병균의 항생제 내성과 이들의 생물막 형성 특징을 조사하였다. 또한, 항생제 내성 균주 및/또는 이들의 생물막에서 새로 분리된 파지를 처리한 결과, 박테리오파지의 생물 제어제로서 가능성을 입증하였다.

THERAPEUTIC EFFICACY OF PHAGE-MEDIATED GROUP BEHAVIOR INHIBITION IN PSEUDOMONAS AERUGINOSA

심누리 차의과학대학교 대학원 2013 국내석사

Phage therapy against bacterial pathogens has been resurfaced as an alternative and supplementary anti-infective modality which has the potential of antibiotic-resistance. Here, I observed that bacterial group motilities were affected in Pseudomonas aeruginosa strain PA14 lysogens for some temperate siphophages; the PA14 lysogens for DMS3 and MP22 were impaired in swarming motility, whereas the PA14 lysogen for D3112 was impaired in twitching motility. The presence of MP22 and D3112 also affected the swarming and twitching motilities of PA14. I observed similar in vitro killing activities of D3112 and MP22 toward PA14. And either did in vivo persistence in the absence of bacterial infections in mice as well as in flies. Nevertheless, administration of D3112, not MP22, significantly reduced the mortality and the bacterial burdens in murine peritonitis-sepsis and Drosophila systemic infection caused by PA14. Taken together, I suggest that a temperate phage-mediated twitching motility inhibition might be comparably effective to control the acute infections caused by P. aeruginosa. 병원성 세균에 대한 항생제 내성 문제가 심각해짐에 따라, 파아지 요법이 다시금 주목 받고 있다. 본 논문에서는 Pseudomonas aeruginosa (녹농균) PA14을 숙주로 하는 몇몇 Siphoviridae 파아지 용원균의 군집 운동을 관찰하였다. 그 결과로 DMS3와 MP22 용원균의 swarming 운동성이 저해되는 반면, D3112의 용원균은 twitching 운동성이 저해되었다. 용원균이 아닌 배지에 MP22와 D3112 파아지 자체를 첨가하였을 때 녹농균 PA14의 swarming과 twitching 운동성이 각각 저해됨을 관찰할 수 있었다. 이들 두 파아지 경우 녹농균 PA14에 대한 살상 능력은 차이가 없었으며, 복강이나 근육주사로 생쥐에 주입하거나, 초파리에 먹였을 때 독성이 관찰되지 않았고, 약물 동태학적인 특성에서도 차이가 없었다. 하지만 MP22와는 다르게 D3112는 Drosophila melanogaster, 초파리 전신감염모델과 생쥐 복막염 및 패혈증 모델에서 녹농균 감염에 의한 생존율을 급격히 증가시키는 것을 확인할 수 있었다. 위의 모든 결과들을 종합해 보면 D3112 용원성 파아지가 녹농균의 twitching 운동성을 저해하여 급성 감염에 대한 항균효과를 보임을 알 수 있다. 핵심되는 말 : 파아지 요법, 녹농균

Streptococcus parauberis의 선택배지 개발 및 박테리오파지 특성 분석

허영웅 부경대학교 2023 국내석사

Isolation and characterization of novel Myoviridae and Straboviridae-like bacteriophages specific to carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae : 카바페넴 내성 Klebsiella pneumoniae 를 감염하는 신규 박테리오파지의 분리와 특성 분석

김보경 경북대학교 대학원 2024 국내석사

Klebsiella pneumoniae은 그람 음성 및 기회성 감염균으로 알려져 있다. 임상 환경에서 K. pneumoniae는 카바페넴 계열 항생제에서도 내성을 나타내며, 그 비율이 점점 증가하고 있다. 카바페넴 내성 문제가 심각해지면서 항생제 대체제 개발에 대한 관심이 높아지고 있으며, 그 중 하나가 박테리오파지를 사용한 ‘파지테라피’이다. 본 연구는 K. pneumoniae 임상균주의 특성을 분석하고 임상 균주를 숙주로하는 박테리오 파지를 분리하여 특성화함으로써 Phage library를 구축하는 것을 목적으로 한다. 경북대학교 병원체 자원은행으로부터 총 23주의 Carbapenem-resistant K. pneumoniae (CRKP) 임상 균주를 분양받았다. CARBA-NP test, capsule typing, string test 및 Multi-locus Sequence Typing (MLST)을 통해 임상 균주의 특성을 확인했다. 2022년 4월부터 2022년 9월까지 경북대학교 병원에서 총 15개의 하수 샘플을 수집했다. 하수 샘플로부터 파지를 분리했고 분리된 파지의 표현형질 및 유전자형질은 spot assay, plaque assay, random amplification of polymorphic DNA-PCR (RAPD-PCR), 전자 현미경 (TEM) 및 전체 유전체 서열 분석 (WGS)을 통해 확인되었다. MLST를 통해 23개의 K. pneumoniae 임상 균주가 9개의 유형(ST11, ST15, ST48, ST133, ST307, ST336, ST392, ST789 및 새로운 ST)으로 분류되었다. 모든 임상 균주는 imipenem과 meropenem에 대한 내성을 가지고 있으며, 20주는 CARBA NP test에서 양성 반응을 나타냈다. 총 37개의 용균성 파지가 K. pneumoniae KCTC 2208, K. pneumoniae KBN10P05309 (임상 균주) 또는 K. pneumoniae ATCC 13883을 숙주 박테리아로 사용하여 분리 및 증폭되었다. 파지는 숙주 스펙트럼 및 RAPD-PCR 결과를 통해 각각 9개 그룹으로 하위 분류되었다. 하위 분류 결과에 따라 13개의 파지가 TEM 및 WGS 분석을 위해 선별되었고 TEM 분석 결과, 모든 파지가 Myoviridae의 형태를 보였다. 파지의 전체 유전체 서열은 53.3 kb에서 170 kb의 길이를 가졌으며, GC 함량은 33%에서 41.4% 사이였다. 13개의 분리된 파지에 대한 비교 유전체 분석 결과, 한 파지 (vB_KpnM_W12-3)는 Alcyoneusvirus와 밀접한 관련이 있으며, 다른 파지들은 Straboviridae에 속했다. 파지는 계통 분석에 따라 3개 그룹으로 클러스터링할 수 있었다. 각 클러스터에서 파지를 한 개씩 선별하여 (vB_KpnM_W9-2, vB_KpnM_W10-2, vB_KpnM_W12-3) adsorption assay, one-step growth curve, 그리고 온도 및 pH 안정성 test를 통해 특성을 확인한 결과 모든 파지가 25분 이내에 99% 이상 흡착률을 보였고 33~400의 burst size를 가졌다. 또한 -20℃부터 60℃까지 안정적으로 파지가 생존했으며 pH 4-10 사이에서도 안정성을 보였다. Meropenem과 colistin을 파지 vB_KpnM_W10-2와 병용 사용시 임상 균주 KBN10P07398에 시너지 효과가 있었다. 이러한 결과들을 통해 13개의 잘 특성화된 파지가 CRKP에 대한 파지 치료의 중요한 자원으로 사용될 것으로 기대한다.

Phage Selection against Antibiotic Resistance or Virulence in Opportunistic Bacterial Pathogens

Kortright, Kaitlyn E ProQuest Dissertations & Theses Yale University 2021 해외박사(DDOD)