Establishment and characterization of the feeding RNAi system for the control of Tetranychus urticae

박지현 서울대학교 대학원 2013 국내석사

RNAi 기법과 접목한 형질전환 식물체 개발은 미래의 해충 방제 전략으로 간주된다. 이를 위해서 전 세계적으로 농작물에 심각한 피해를 주는 해충으로 알려진 점박이응애를 대상으로 dsRNA 전달 기법을 구축함과 동시에 dsRNA반응 유전자를 규명하는 것이 필요하다. 먼저 점박이응애의 치사 유전자를 선별하기 위해 강낭콩 잎절편을 통한 dsRNA 전달 기법을 개발하여 섭식 RNAi 체계를 구축하였다. 4종의 후보 유전자(subunit of coatomer protein complex, T-COPB2; M1 metalloprotease, T-M1MP; Ribosomal protein S4, T-RPS4; A subunit of V-ATPase, T-VATPase)를 feeding chamber를 통한 RNAi 검정에서 Coatomer protein complex, subunit beta 2; T-COPB2의 치사효과 (65.4%)가 가장 좋은 것으로 나타났다. 또한 qPCR을 통해 유전자의 전사량이 감소됨을 확인 하였는데 이는 dsRNA 섭식으로 인한 점박이응애의 치사를 입증하였다. 치사 유전자 선별의 효율을 높이기 위해 인공 즙액을 통한 dsRNA전달 방법을 적용하였다. 이미 치사효과가 입증된 4종 유전자를 통해 재현성 여부를 확인해 본 결과 높은 치사율을 얻지 못하였다. 이는 인공 즙액 방법이 치사 유전자 선별에 적합하지 않다는 것을 보여준다. 효율적인 치사 유전자의 선별을 위한 대안 방안으로 기존의 강낭콩 잎 절편을 이용한 24-well chamber방법을 구축하였다. 후보 유전자 20종을 추가로 검정한 결과, Coatomer protein complex군의 유전자인 subunit epsilon (T-COP_epsilon)이 높은 치사율 (24.5%, 47.9%)을 나타내었다. 높은 치사효과를 나타낸 T-COPB2와 T-COP_epsilon dsRNA의 독성을 증대시키고자 각 target dsRNA site를 2개의 단편으로 나누어 서로 혼합하여 실험을 수행한 결과, T-COPB2와 T-COP_epsilon의 단편들을 혼합해 놓은 처리구에서 단일 처리구 보다 높은 치사효과를 나타내었다. 서로 다른 유전자의 dsRNA를 혼합한 독성 상승효과는 앞으로 RNAi 효율 증대에 사용될 것으로 사료된다. 마지막으로 점박이응애가 dsRNA를 섭식할 때 반응하는 유전자들을 조사하기 위해 전사체분석을 수행하였다. RNA-seq에서 얻어진 전사체 발현양상 결과를 확인하기 위해 각 처리구별 반응 유전자를 qPCR을 통해 분석해본 결과, dsEGFP와 dsCOPB2를 처리한 처리구에서 R²값이 각각 0.703, 0.609로 RNA-seq와 qPCR사이의 상관관계를 확인하였다. dsRNA (EGFP와 COPB2)를 섭식한 처리구에서 반응하는 유전자의 개수는 각각 88개, 109개의 유전자가 과발현 또는 저발현 되었다. dsRNA (EGFP와 COPB2)에 공통적으로 반응하는 유전자는 28개로서, 그 중 24개는 저발현 되었고 4개는 과발현 되었다. Chitinase (tutur17g02930) 유전자가 가장 낮은 발현율을 보였고, hypothetical protein (tetur191g00010) 유전자가 가장 높은 발현율을 나타내었다. dsRNA에 반응하는 유전자 중에서 RdRP, Dicer 그리고 RISC 구성요소들이 발견되지 않았다. 유전자들끼리의 관계 분석과 기능적인 분석 등을 통하여 추가적인 연구가 필요할 것으로 생각된다. 요약하면, 응애와 같은 흡즙성 해충 방제를 위해 RNAi기법을 적용하여 형질전환식물체 개발에 접목한다면 방제 가능성이 높을 것으로 사료된다. RNA interference (RNAi) techniques have been considered as a potential pest control strategy when combined with the plant transgenesis. In an attempt to establish the RNAi-based control strategy against the two spotted-spider mite (Tetranychus urticae Koch), one of the most serious sucking pests, a leaf disc-mediated dsRNA delivery system was developed and used for the screening of T. urticae genes causing lethality when knocked by RNAi. The RNAi activity of four candidate genes (subunit of coatomer protein complex, T-COPB2; M1 metalloprotease, T-M1MP; Ribosomal protein S4, T-RPS4; A subunit of V-ATPase, T-VATPase) and a control gene (EGFP) were tested by feeding dsRNA. T-COPB2 caused the highest mortality (65.4%) at 120 h post-treatment. Reduction of all target gene transcripts following dsRNA treatment was confirmed by quantitative PCR, demonstrating that dsRNA feeding-based RNAi could indeed kill T. uricae. Since the leaf disc-mediated dsRNA delivery system is labor-intensive, artificial sap solution was employed to deliver dsRNA to improve the screening efficacy. In the reproducibility test using the same four genes (T-COPB2, T-RPS4, T- M1MP and T-VATPase), much reduced mortalities (3 - 11%) were observed even at 8 days post-treatment, suggesting the dsRNA delivery via artificial sap was not suitable for screening lethal dsRNA. As an alternative lethal dsRNA screening method, a 24-well multiple chamber unit was devised by modifying the leaf disc-mediated methods. When dsRNA was delivered using this system, T-COPB and T-COP_epsilon (T-COPE) caused 24.5% and 47.9% mortalities at 120 h post-treatment, respectively. In an attempt to increase the toxicity of dsRNA, both T-COPB2 and T-COPE were respectively divided into two fragments (fragments A and B) and combined each other, generating four different combinations (i.e., T-COPB2_A + T-COPE_A; T-COPB2_A + T-COPE_B; T-COPB2_B + T-COPE_A; T-COPB2_B + T-COPE_B). The mortality of combined dsRNAs generally caused higher mortality compared with intact or fragmented individual genes. The combination of T-COPB2_A+T-COPE_B dsRNA caused the highest mortality (75.7%) at 120 h post-treatment. The results demonstrated that target gene toxicity could be enhanced by combining different gene fragments together. RNA-seq was conducted to identify differentially expressed genes after feeding exongenous (dsEGFP) and endogenous dsRNA (dsCOPB2). The validation analysis revealed moderate correlations between RNA-seq data and quantitative real-time PCR resullts in the treatments of dsEGFP (r2 = 0.703) and dsCOPB2 (r2 = 0.609). In the treatment of dsEGFP and dsCOPB2, 88 and 109 genes were up- and down-regulated, respectively. In the screening of genes co-responding to both dsRNAs, 24 and 4 genes were down- and up-regulated, respectively. The chitinase (tetur17g02930) was the highest down-regulated gene (14.8 fold), whereas the hypothetical protein (tetur191g00010) was the highest up-regulated gene (3.2-fold). Genes associated with RNAi (such as RdRP, Dicer, RISC component) were not found in the category of co-responding genes. Further study would be necessary in conjunction with gene-network analysis and functional analysis. In summary, the isolated lethal gene will be utilized for the development of pest-resistant transgenic plants based on RNAi.

Development of complex RNA interference triggering structures for therapeutic applications

이태연 성균관대학교 일반대학원 2014 국내박사

RNA interference (RNAi)는 두가닥으로 이루어진 RNA (double stranded RNA)에 의해 해당 염기서열과 특정한 방식으로 표적 유전자의 발현을 억제시키는 세포 내 메카니즘이자 기술이다. RNAi는 1998년에 Andrew Fire와 Craig Mello에 의해 꼬마선충에서 처음으로 발견되었으며 그들의 공로가 인정되어 2006년에는 노벨 생리의학상을 수상하기도 하였다. 또한 RNAi가 합성된 siRNA에 의해 포유동물 세포에서도 효과적으로 일어난다는 사실이 보고되면서 이 분야의 연구는 매우 활발히 진행되었다. 표적 유전자에 대한 siRNA를 손쉽게 디자인 할 수 있고 이를 통해 특정 유전자의 발현을 효과적으로 억제할 수 있기 때문에 RNAi 기술은 유전자 기능 연구, genome-wide 연구, 신약 개발, 질병 치료 등 다양한 분야에 응용될 수 있는 매우 강력한 기술이다. 하지만 siRNA에 의한 몇가지 Off-target effect가 발견되면서 RNAi분야는 새로운 국면을 맞이하게 되었다. SiRNA의 guide strand의 일부 염기 서열이 표적이 아닌 다른 유전자의 염기서열과 일부분이 일치하여 원하지 않는 유전자 발현 억제를 이끌어 내기도 하며, passanger strand에 의한 유전자 발현 억제 현상 역시 off-target effect의 예이다. 또다른 off-target effect는 siRNA 자체 혹은 세포 내로 전달해 주기 위해 사용되는 delivery vehicle이 원하지 않는 선천성 면역 반응을 일으키는 현상이다. 이러한 다양한 off-target effect들을 줄이거나 또다른 장점들을 부여하기 위해 다양한 연구들이 진행 및 보고되고 있으며 대표적으로 chemical modification (화학적 변형)이나 structural modification (구조적 변화)을 siRNA에 도입하는 방식으로 이루어지고 있다. 이러한 modification들은 표적 유전자의 발현 억제 효율 증가, off-target effect 감소, 세포 내 전달 효율 증가 등의 장점을 부여할 수 있다고 보고 되고 있다. 본 논문에서는 structural modification을 도입함으로써 기존의 siRNA보다 더 나은 장점들을 갖는 복잡한 형태의 RNAi 유도 구조체들에 대한 연구 결과들을 설명하고 있다. 하나의 유전자를 표적으로 삼는 RNAi 유도 구조체는 치료제로의 개발에 있어서 한계가 있을 수 있다. 예를 들어 바이러스의 경우, 유전자 변이가 쉽게 일어나기 때문에 자체적으로 하나의 유전자를 표적으로하는 RNAi 기반 치료제에 대해 쉽게 저항성을 갖게 된다. 최근 연구 결과에 의하면 유전자 변이가 일어난 바이러스나 암세포는 siRNA와 표적 유전자와의 결합에 있어서 열역학적 안정성을 변화시키고 이를 통해 RNAi 메커니즘을 회피하거나 감소 시킬 수 있다고 설명하고 있다. 그러므로 암이나 바이러스에 대한 RNAi 기반 치료제의 개발을 위해서는 동시에 여러 개의 유전자를 표적으로 하는 전략을 필요로 한다. 본 논문에서는 여러 개의 유전자를 표적으로 하는 muti-target RNAi 유도 구조체들인 Tripodal interfering RNA (T-tiRNA, 표적유전자 3개), tripartite interfering RNA (tiRNA, 표적유전자 3개), quadruple interfering RNA (qiRNA, 표적유전자 4개)에 대한 연구 결과를 소개하고 있다. 이들은 3~4개의 유전자를 동시에 표적으로 하는 multi-target gene silencing이 가능하며, 뿐만 아니라 PEI와 같은 cationic delivery vehicle과 complex를 이룰 때 기존의 siRNA보다 세포 내로 효과적으로 전달이 이루어지는 것을 확인할 수 있었다. 또한 이러한 효과적인 세포 내 전달은 siRNA보다 우수한 유전자 억제 효과를 유도하는 원인이 된다는 사실도 확인하였다. RACE assay나 RISC incorporation assay 결과는 이러한 muti-target RNAi 유도체들이 비특이적인 방식이 아니라 RNAi 메커니즘을 통해서 표적 유전자의 발현을 특이적으로 억제 시킨다는 것을 확인 시켜준다. 마지막으로 RNAi 활성과 면역유도 활성을 동시에 갖는 bi-functional RNAi 유도 분자 구조체인 Long interfering RNA (liRNA)의 연구 결과가 본 논문에 소개 되었다. 기존의 연구 결과에 의하면 long dsRNA는 PKR과 OAS의 활성을 일으켜 세포의 mRNA를 분해를 유도하고 다양한 면역 관련 cytokine들의 발현을 이끈다고 알려져 있다. 이러한 long dsRNA의 특징을 이용하여 임상에서 뇌종양의 성장을 효과적으로 저해하거나 cell specific delivery를 가능하게 하여 효과적으로 암세포의 성장을 억제시켰다라는 내용의 논문이 이미 보고 되어있다. 이와 같은 연구 결과를 토대로 RNAi와 면역유도 반응에 대한 활성을 동시에 갖는 RNA 분자 구조체를 만들기 위해 guide strand와 passanger strand의 염기서열을 siRNA처럼 표적 유전자를 갖도록 하는 한편 annealing이 이루어지면 long dsRNA 구조가 만들어지도록 liRNA를 디자인하였다. liRNA는 기대했던 것과 마찬가지로 두가지 기능에 의한 시너지 효과를 나타내며 RNAi 활성만을 갖는 siRNA나 면역유도반응 활성만을 갖는 long dsRNA보다 효과적으로 암세포의 성장을 효과적으로 저해하는 결과를 보여주었다. 이렇듯 본 논문에서 소개한 복잡하고도 다양한 RNAi 유도 구조체들은 기존의 siRNA가 가지지 못한 다양한 장점들을 가지고 있다. 그러므로 이러한 구조체들을 활용한다면 RNAi 기반 치료제로의 개발에 있어서 기존의 siRNA보다 잠재성이 크며 보다 확실한 대안이 될 수 있을 것이라고 기대한다.

Establishment of ingestion RNAi-based control system against western flower thrips

한승희 서울대학교 대학원 2019 국내석사

Thrips, including Frankliniella occidentalis and Frankliniella intonsa, is one of the polyphagous pest damaging flowers and leaves of horticultural and agricultural crops. Due to its rapid development of insecticide resistance, conventional insecticides are not effective to thrips control, thus requiring an alternative control method. RNA interference (RNAi)-based control strategy has been developed to control various phytophagous chewing pests. However, no successful case of RNAi-based control was reported for sucking pests including thrips. In this study, the ingested amount of nuclei and plastids following time course in the two thrips (F. occidentalis and F. intonsa) along with two reference sucking pests (Tetranychus urticae, a cell feeder, and Nilaparvara, a cap feeder) were quantified by quantitative PCR (qPCR). The ingested amount of plastids was significantly greater than those of nuclei in the thrips and mites species. However, substantially lower and greater ratio between ingestion amount of nuclei and plastids than those in intact kidney bean leaves was identified in the two thrips and mite species, respectively, suggesting that thrips and mite has different preference for nuclei and plastids. In contrast, no plant subcellular fractions were detected in brown planthopper. These findings provide the first proof-of-concept that hairpin RNA expressed in the nucleus can be delivered to mesophyll sucking feeders such as thrips and mites. With this in mind, a total of 57 candidate genes were selected from the transcriptome data of F. occidentalis, and the double-stranded RNAs (dsRNA), targeting each candidate gene, were delivered to a susceptible strain of F. occidentalis via the leaf disc-feeding method. The dsRNA of toll-like receptor 6 (TLR6), apolipophorin (apoLp), coatomer protein subunit epsilon (COPE), and sorting and assembly machinery component 50 (SAM50) resulted in the highest mortality in both insecticide-susceptible strain and -resistant strain. The dsRNA-fed thrips showed 46%, 47%, 37%, and 22% reduced transcription levels of TLR6, apoLp, COPE and SAM50 in insecticide-susceptible strain and 71%, 36%, 27%, and 50% in -resistant strain, respectively. This result demonstrates that the observed mortality following dsRNA ingestion was due to RNAi. The efficacy of ingestion RNAi of the lethal genes was also confirmed against an insecticide-resistant strain of F. occidentalis, indicating that RNAi-based control would be effective against both susceptible and resistant populations of F. occidentalis. Development of transgenic tomato plants expressing dsRNA targeting these lethal genes is currently in progress as a practical tool to control thrips in the field. 꽃노랑총채벌레와 대만총채벌레를 포함하는 총채벌레목은 원예작물 및 농작물의 가해하는 주요 해충 중 하나이다. 살충제 저항성의 급속한 발달로 인해, 기존의 살충제는 총채벌레의 방제에 효과적이지 않기 때문에 대안적인 관리 방법이 필요한 실정이다. 현재까지 다양한 흡즙성 해충을 방제하기 위해RNA interference (RNAi)에 기반한 방제법이 개발되었으나, 총채벌레를 포함한 흡즙성 해충에 대한 RNAi 기반 방제 연구의 성공적인 사례는 보고되지 않은 상태이다. 본 연구에서는 먼저 두 종의 흡즙성 해충 (Tetranychus urticae, 점박이응애, 세포섭식해충 및 Nilaparvara lugens, 벼멸구, 수액섭식해충)과 함께 두 종의 총채벌레 (F. occidentalis 및 F. intonsa)에 대한 식물체 섭식 후 시간 경과에 따른 핵 및 색소체 섭취량을 qPCR을 통해 확인하였다. 그 결과 벼멸구의 체내에서는 핵과 색소체 모두 발견되지 않았으며, 총채벌레와 점박이응애에서는 핵보다 색소체가 더 많이 발견되었다. 그러나 점박이응애와는 다르게 총채벌레의 경우, 기존 강낭콩 잎에서 발견되는 색소체에 대한 핵의 비율보다 총채벌레 체내에서 발견되는 핵의 비율이 높으므로 총채벌레는 강낭콩 잎의 핵 및 색소체에 대한 선호도가 다르다는 것을 알 수 있다. 이 결과는 핵에서 발현된 hairpin RNA가 엽육세포를 섭식하는 해충의 구기를 통해 전달될 수 있다는 것을 증명하였다. 추가적으로, 본 연구에서는 꽃노랑총채벌레의 전사체 데이터로부터 총 57 개의 RNAi후보 유전자를 선발하고 각 후보 유전자를 표적으로 하는 double-stranded RNA (dsRNA)를 엽절편 시스템을 통해 꽃노랑총채벌레에 전달하는 실험을 진행하였다. 그 결과, Toll-like receptor 6 (TLR6), apolipophorin (apoLp), COPE (coatomer protein subunit epsilon) 및 SAM50 (sorting and assembly machinery component 50)의 dsRNA는 살충제 감수성 및 살충제 저항성 계통 모두에서 높은 치사율을 보여주었다. dsRNA를 섭식한 꽃노랑총채벌레는 감수성 계통에서 TLR6, apoLp, COPE 및 SAM50의 유전자 발현 수준이 각각 46%, 47%, 37% 및 22% 감소했으며 저항성 계통에서는 각각 71%, 36%, 27% 및 50% 이 감소하였으므로, dsRNA 섭취 후 관찰된 치사율이 RNAi에 의해 일어났다는 것이 증명되었다. 위 결과에서 나타나듯이 치사유전자 섭식 dsRNA의 총채벌레 방제력은 저항성 계통에서도 효과적으로 나타나기 때문에, 앞으로 저항성 총채벌레를 방제하기 위한 새로운 대안이 될 수 있을 것이다. 또한, 이 치사유전자 dsRNA를 발현하는 형질전환 작물체를 개발하면 이러한RNAi 시스템이 기반 총채벌레 방제 기술을 실제 농가에서 적용 가능할 것이라고 사료된다.

예쁜 꼬마 선충에 존재하는 tyrosylprotein sulfotransferase-A의 기능적 역할에 관한 연구

김태훈 연세대학교 대학원 2002 국내석사

타이로신 O-황화기작(Tyrosine O-sulfation)은 모든 진핵생물에서 일어나는 막 단백질과 분비단백질의 수식화 과정(post-translational modification)중 하나이다. 타이로신-황(tyrosine sulfate)구조를 가지는 단백질들은 inflammation과 hemostasis에 관련된 것들과 subcellular matrix proteins이 있다. 타이로신 O-황화기작은 factors VIII 과 V의 coagulation, P-selectin glycoprotein ligand-1(PSGL-1), platelet glycoprotein Ibα, complement factor C4 그리고 hirudin 등이 생물학적 기능을 수행하는데 중요한 역할을 하는 것으로 알려졌다. C. elegans의 경우 tyrosylprotein sulfotransferase-A(TPST-A)를 클로닝 하여 동물세포에서 배양을 한 후 효소 활성 측정 연구가 진행된 바 있다. 하지만 C. elegans에서 TPST-A의 생물학적 기능 역할은 보고된 바가 없다. 본 연구자는 C. elegans에서 TPST-A의 기능적인 역할을 규명하기 위해서 먼저 TPST-A가 어느 부위에서 특이적으로 발현되는지를 알아보고, 또한 TPST-A에 의해서 황화작용이 일어나지 않으면 어떠한 영향이 미치는지를 밝힘으로써 이 효소의 생물학적 기능을 알고자 하였다. TPST-A의 프로모터로 예상되는 부위를 유전자 재조합 기법을 이용해서 GFP(green fluorescent protein) 벡터에 삽입하여 얻어진 constructs를 C. elegans의 생식선에 미세 주사하였다. fusion protein이 발현된 결과 다음 세대 C. elegans의 상피 세포(hypodermal cell)에서 특이적으로 발현된 것을 확인할 수 있었다. TPST-A의 기능을 일시적으로 억제시킬 수 있는 RNAi(RNA interference)기법을 사용한 결과 다음 세대 C. elegans의 유생단계 중 허물을 벗는 과정에서 이상이 생겼으며 이는 TPST-A가 표피(cuticle) 형성에 깊이 관여하고 있음을 나타낸다. C. elegans의 표피를 형성하는데 필요한 단백질 중에 하나인 콜라겐(collagen) 단백질을 암호화하는 유전자의 5가지 돌연 변이들에게 각각 TPST-A의 기능에 대한 RNAi를 시도한 결과 돌연 변이의 형태가 달라진 표현형을 보였다. 이 결과는 TPST-A가 표피형성에 직접적으로 또는 간접적으로 매우 중요한 역할을 하는 것이다. Tyrosine O-sulfation is a kind of post-translation modification of membrane and secretory proteins that occurs in all eukaryotic organisms. Many proteins have been shown to contain tyrosine sulfate. Tyrosylprotein sulfotransferase (TPST-A) of Caenorhabditis elegans catalyzes the transfer of the sulfuryl group from 3'-phosphoadenosine 5'-phosphosulfate (PAPS) to tyrosine residue(s) within highly acidic motifs of polypeptides. Biochemical evidence indicates that the enzyme is a membrane-associated protein with a lumenally oriented active site localized in the trans-Golgi network. We obtained cDNA encoding Caenorhabditis elegans TPST-A from Dr. Yuji Kohara (National Institute of Genetics, Mishima, Japan). To gain insights regarding the biological function of TPST-A, we used the reverse genetic tool, RNA interference (RNAi), to "knock out" enzyme in C. elegans. RNAi animals showed complex phenotypes similar to those described previously in mutations that are known to affect the cuticle, an extracellular matrix. In a typical experiment >70% of RNAi animals were affected by various phenotypes. Specific phenotypes similar to pull in worm's belt in random site on body (>10% of animals) and some worms were stationary and finally died in L2, L3, and L4 stages : affected animals were either completely paralyzed or moved only the anterior region, clearing a localized swath of Escherichia coli in the vicinity of the head and were shown striking defect, an inability to shed and degrade all of the old cuticle at each of the larval molts. Phenotypes also cause an arrest of growth usually at the molt from the third to the fourth larval stage (>40% of animals). Some adults are dumpy worms with retained many eggs and larvae and finally dead (>20% of animals). In addition, whereas wild-type animals showed a dark appearance, <5% of RNAi animals were translucent (compare wild-type). Also, we used TPST-A RNAi in rol-6(su1006 and e187) and sqt-1(sc1, sc13, and e1350) mutants. RNAi animals showed slightly short or dumpy phenotypes. These phenotypes indicate that TPST-A may catalyze tyrosine O-sulfation of a variety of protein substrates involved in diverse physiologic functions.

Transcriptional Characterization of Cysteine Protease Genes against Xanthomonas oryzae pv. oryzae in Rice (Oryza sativa L.)

NINO, MARJOHN CENEZA 충북대학교 2018 국내박사

This study aimed to examine cysteine protease genes (CPs) at molecular and genetic level in rice. Gain-of-function and down-regulation analysis were performed to uncover their biological significance especially in response to biotic stress. The whole-transcriptome shotgun sequencing screen of the OsCP3 overexpression and RNAi-mediated knockdown transgenic lines revealed the intrinsic transcriptional dynamics during early interaction between Xanthomonas oryzae pv. oryzae and rice. In chapter 1, database-searching for rice cysteine protease resulted in the identification of six families of OsCPs. Each family is distinctly represented by different proteolytic enzyme, including the 51 papain-like gene members of C1 family, single calpain-2-type member of C2, 7 ubiquitinyl hydrolase-L1 members of C12, 6 legumain members of C13, 2 caspase-1 members of C14, and 7 pyroglutamyl-peptidase 1 members of C15. Subsequent in-depth molecular analysis of cysteine protease members revealed the genomic rearrangement and expansion especially of papain-like cysteine proteases (C1 family) as indicated by a large number of members distributed across 12 chromosomes of the rice genome, as well as extensive variation in intron number and phase. Further investigation of physicochemical properties, gene and protein structure, motif, and cis-element highlighted the common and distinct characteristics of members of each family. It was found that 59.2% of the total numbers of cysteine protease in rice are stable. Protein type prediction based on subcellular localization revealed that all members of C1A, C13, C14, and C15 are globular proteins, whereas single member of C2 and 2 members of C12 are membrane proteins. Highest number and most variable motifs are evident in C1 and C2 family members, while the rest of CP families shared distinct set of few motifs. Gene expression analysis of selected C1 members including OsCP2 (LOC_Os01g67980), OsCP3 (LOC_Os05g01810), and OsCP5 (LOC_Os02g27030) showed that both OsCP2 and OsCP3 are tissue-specific, while OsCP5 is constitutively expressed in all tissues. Transcripts of all three genes were highly induced by Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) race K3a, 100 μM salicylic acid (SA), and 100 μM methyl jasmonate (MeJA) at 12 hours post-inoculation. Moreover, mRNA of OsCP2 and OsCP3 were activated 6 to 12 hours after imposing salinity stress, while OsCP5 was up-regulated by both heat and salt at 6 hours after treatment. In Chapter 2, three selected papain-like cysteine protease members were cloned for functional analysis in rice. Evolutionary divergence analysis revealed that OsCP2 (LOC_01g73980.1) and OsCP3 (LOC_Os05g01810) are related (0.229) and are both associated (0.401 and 0.400) to XCP2 (At1g20850), a papain-type cysteine endopeptidase also known as xylem cysteine peptidase 2 in Arabidopsis, while OsCP5 (LOC_Os02g27030) is related (0.404) to RD19B (At2g21430). Biological investigation of cysteine protease was carried out using overexpression and RNAi transgenic lines. The total number of overexpression transgenic rice generated was six in OsCP2ox, nine in OsCP3ox, and nine in OsCP5ox. Moreover, five OsCP3RNAi transgenic rice plants were also developed. Stable inheritance of each transgene to T1 generation was verified by resistance to hygromycin for overexpression transgenic lines and phosphinothricin for RNAi lines with segregation that conformed (p<0.05) to 3:1 Mendelian ratio. Disease screening with Xoo race K3a resulted in significantly (p<0.05) shorter lesion length (OsCP2ox, 6.82 – 9.13 cm; OsCP3ox, 5.55 – 7.49 cm; and OsCP5ox, 5.40 – 5.68 cm) than that in Dongjin (16.07cm), while OsCP3RNAi lines exhibited significantly longer lesions (17.1 – 18.3 cm) than overexpression lines. Bacterial growth analysis taken at 0, 7, and 14 days post-inoculation (dpi) strongly corroborated with the phenotype data. This indicates that OsCP genes confered resistance to Xoo. Although all transgenic plants were highly sensitive to drought stress, OsCP3ox showed improved tolerance (5.0 – 5.3 score; rating scale from 1, highly tolerant to 9, highly sensitive) to salinity stress. Measurements of agronomic traits of the overexpression lines showed altered phenotype especially in plant height wherein OsCP2ox (123.8 – 132.7 cm) and OsCP5ox (117.9 – 119.6 cm) transgenic lines were significantly taller than the wild type Dongjin (109.8 cm), whereas OsCP3ox lines were significantly shorter (95.9 – 102.8 cm). In chapter 3, sufficient transcript data were generated by employing de novo transcriptome profiling to investigate changes in gene expression during early response to X. oryzae pv. oryzae infection. Early interaction with the pathogen was inferred from the cDNA library of OsCP3ox-3 overexpression transgenic line infected with Xoo race K3a for 30 min representing incompatible interaction and from the cDNA library of infected OsCP3RNAi-56 transgenic line and Dongjin which represent compatible interaction. The total number of genes identified from the clean reads matching to the reference genome is 35,666. By implementing the log2FC≥1 and p<0.05 statistical thresholds, a total of 1,597 combined differentially expressed genes (DEGs) were identified in three libraries, 1,147 of which are exclusively regulated only in OsCP3ox-3, 111 in Dongjin, and 122 in OsCP3RNAi-56 sample. In all library samples, the frequency of activated genes is higher (925 in OsCP3ox-3, 194 in Dongjin, and 191 in OsCP3RNAi-56) than suppressed ones (511, 61, and 31, respectively). The 148 common genes between three samples were found to enrich (FDR<0.05) 27 biological process; among them high number of genes was assigned to metabolic process, primary metabolic process, response to stimulus, and response to stress. Enrichment analysis of unique set of DEGs in each library revealed more over-represented biological processes that are crucial in resistance response in OsCP3ox-3 library (n=50) over Dongjin (n=12) and OsCP3RNAi-56 (n=13) samples. Interestingly, defense response, response to stress, response to osmotic stress, response to hormone, ROS metabolic process, and signal transduction are exclusively identified only in OsCP3ox-3. A total of 548 OsCP3ox-3-specific genes are assigned into 35 Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) pathways, 8 Dongjin-specific genes into 2 pathways, and 32 OsCP3RNAi-56-specific genes into 6 pathways. Mapman visualization of core biotic stress responsive genes in OsCP3ox-3 sample highlights signaling by receptor-like kinases (RLKs), calcium signals, G-proteins, and hormones, as well as transcription activity by members of ERF, bZIP, MYB and DOF as drastic early response upon infection which orchestrate downstream responses including activation of 13 putative pathogenesis-related (PR) proteins and 37 putative secondary metabolites-related genes. Moreover, high H2O2 production and elevated accumulation of free SA are integral part of defense mechanism exhibited by OsCP3ox lines. Protein-protein interaction network analysis further depicted a more significant biological connection among proteins in OCP3ox-3 line with 11,696 (p<1.0e-16) predicted interactions over 132 (p=0.0152) and 167 (p=0.00213) interactions predicted in Dongjin and OsCP3RNAi-56, respectively. In chapter 4, comparative transcriptional profile was analyzed in response to Xoo race K2 and K3a response in rice. The K2-DEG gene set was derived from the cDNA oligo microarray of RNA collected from 48-hour infected Jinbaek (representing intermediate to late incompatible interaction; R-K2) while the K3a-DEG gene set was generated using the RNA-sequencing of the 30 min post-inoculated RNA of OsCP3ox-3 overexpression transgenic line (representing early incompatible interaction, R-K3a). A huge gap in the magnitude of DEGs was found, wherein K3a, being the most recent race and more virulent induced more (n=1,355) DEGs than K2 (n=789). In both libraries, activated genes are more abundant which indicate extensive regulation of larger gene network that led to resistance. A total of 127 overlapping genes was identified, 43 of which enriched peroxidase activity (p=0.041), defense response (p=0.025), transcription factor activity (p=0.006), cell redox homeostasis (p=0.048), metal-binding (p=0.000), and secondary metabolites biosynthesis (p=0.033). Mapman provides an overview on extensive activation of signaling and transcription factor activity as conserved cellular response to both Xoo races. The number of activated genes was 45 in R-K2 and 37 in R-K3a for receptor kinase-signaling, 6 in R-K2 and 12 in R-K3a for calcium signaling, 3 in R-K2 and 3 in R-K3a for G-protein signaling, and 11 in R-K2 and 25 in R-K3a for hormone signaling. Activation of downstream mechanism in response to both races commonly rely on WRKY, however K3a infection also requires substantial activation by ERF, MYB, and DOF, whereas K2-induced response also depends on MAPK signal transduction. It also appears that activation of multiple pathogenesis-related proteins were conserved cellular and physiological responses to K2 (n=11) and K3a (n=13) infection. Interestingly, response to two races differs in terms of cell wall-related functions and lignin biosynthesis with K3a infection inducing 14 isoprenoids, 7 phenylpropanoids, 6 lignin, 1 wax, 8 flavonoids, and 2 alkaloid-like, while response to K2 only involves up-regulation of 6 terpenoids, 2 phenylpropanoids, and 2 flavonoids. In summary, the analyses presented in this dissertation provide a detailed annotation of cysteine protease genes in rice. Using gain-of-function and RNAi-mediated knockdown of PLCP, I was able to demonstrate the functional aspect of this gene particularly against bacterial blight infection in rice. The analyses presented by RNA-sequencing, which is the first transcriptional investigation ever done on PLCPs in response to pathogen infection in rice, provide a global view of the transcriptome modulation response to Xoo mediated by cysteine protease. Substantial findings revealed that overexpression of cysteine protease allowed rice to circumvent Xoo infection through extensive activation of transduction signal and transcription that orchestrate downstream responses including up-regulation of multiple pathogenesis-related proteins and biosynthesis of secondary metabolites. Thus, rice PLCPs are valuable gene resource that can be employed in rice breeding programs for biotic stress.

Therapeutic control of off-target effect in RNA-guided gene silencing and editing

구도운 고려대학교 대학원 2022 국내박사

DNA and RNA are two types of essential molecules that are vital for all living things on earth. In accordance with the central dogma, DNA acts as a template for the synthesis of RNA (transcription), and RNA directly used as a template for protein synthesis (translation). Over the past decades, researchers have been trying to control DNA, RNA, and proteins for therapeutic purposes. Most drugs, such as antibodies and aptamers, are aimed at controlling the proteins related to diseases. In the field of genetic research, regulating gene content and expression has been critical in understanding the function of genes in biological pathways and their relationship with disease phenotypes. Recent advances in technologies for controlling gene expression have improved biomedical research and expanded gene therapy possibilities. RNAi was initially discovered and widely used as a versatile tool for gene regulation via controlling mRNA stability and translation. Especially, Small interfering RNA (siRNA), a major component of RNAi, has also been widely used to control specific genes because of its ease of use based on RNA:RNA Watson-Crick base-pairings. More recently, Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) and the CRISPR-associated protein 9 (Cas9) (referred to as CRISPR/Cas9), which originates from the bacterial adaptive immune system, have emerged as a genome editing tools for targeting DNA guided by short CRISPR RNA (crRNA). Target specificity for both siRNA and CRISPR/Cas9 relies on 18-20nt RNA guided base-pairing, which have enormous possibilities for unintended target (off-target) recognitions occur via partial base-pairing. Thus, it is important to control the off-target effect in both technologies for use in therapeutic applications. Here, we develop potent therapeutic siRNAs for utilizing miRNA-like-off-target activity rather than prevent in RNAi. In contrast, we also developed a precise CRISPR/Cas9 genome editing tool by modifying crRNA since its off-target may be permanently inherited. DNA와 RNA 두 가지 모두 지구상의 모든 생명체에 필수적인 분자화합물이다. RNA는 서열번역을 통해 단백질 합성의 주형 가닥으로 사용되며, DNA는 RNA 전사에 사용된다. 지난 수십 년 동안, 이러한 특성을 바탕으로 인류는 DNA, RNA, 그리고 단백질 생성과 작용의 조절을 통해 이들을 치료적 목적으로 사용할 수 있도록 노력해 왔으며, 그 일환으로 항체나 앱타머 같은 대다수의 약물은 질병과 관련된 단백질을 조절하여 치료적 효과를 내는 것을 목표로 하고 있다. 이처럼 유전자 연구에서 특정 유전자 표현과 발현을 조절하는 것은 생물학적 관점에서 유전자와 질병 표현형의 관계를 이해하는 데 있어 매우 중요한데, 최근 유전자 발현 조절 기술의 향상으로 생물의학적 연구가 발전되어 유전자 치료 가능성이 확대되었다. 초기에 발견된 RNAi는 mRNA의 안정성을 제어하거나 단백질로 번역되는 것을 제어함으로써 유전자 조절을 가능하게 만들었다. 특히 RNAi의 주요 구성물질인 siRNA는 RNA:RNA 왓슨-크릭 염기쌍을 기반으로 타겟을 인식하므로, 사용의 편의성 덕분에 유전자를 조절하는 주요 물질로 사용되어 왔다. 최근에는 박테리아 후천면역 체계로부터 발견된 CRISPR/Cas9이 유전자 편집 도구로 널리 사용되고 있으며, 짧은 crRNA에 의해 표적을 인식한다는 점에서 siRNA와 공통점을 가진다. 이들 siRNA와 CRISPR/Cas9은 18-20nt RNA에 의한 염기결합으로 타겟 특이성을 가질 수 있는데, 이렇게 짧은 염기결합에 의한 타겟 인식때문에 의도하지 않은 타겟 (오프-타겟) 을 인식할 가능성이 크다. 따라서 위 두 기술 모두 치료제로써 사용하기 위해서는 오프-타겟을 제어하는 것이 매우 중요하다. 본 연구는, RNAi에서 발생할 수 있는 오프-타겟 효과인 miRNA-like activity를 억제하기보다 오히려 활용해 강력한 치료제로써 가능성을 가지는 siRNA를 구성하는 방법을 개발하였다. 이와 반대로 CRISPR/Cas9을 이용한 유전자 편집에서 발생할 수 있는 오프-타겟은, 한번 발생하게 되면 영구적으로 유전자 구성에 변경이 일어날 수 있으므로, 이 도구를 매우 정확하게 사용할 수 있도록 타겟 인식에 직접적으로 연관된 crRNA를 개선하는데 목적을 두었다.

Establishment of test systems for evaluating ingestion RNA interference-induced lethality against Tetranychus urticae, a representative sucking pest

이웅규 서울대학교 대학원 2017 국내석사

Double-stranded RNA-mediated interference (RNAi) has been universally applied as a specific, potent and successful technology for gene manipulation and emerged as a potential pest control strategy when combined with the plant transgenesis. To establish the RNAi-based control strategy against the two spotted-spider mite (Tetranychus urticae Koch), a worldwide notorious sucking pests in facility cultivation, test systems for evaluating ingestion RNA interference-induced lethality were established. As a prescreening tool prior to the development of transgenic crops, protocols for the agroinfiltration in the soybean and kidney bean were established and optimized. The maximum efficiency of hairpin RNA delivery in soybean was determined to be obtained by sea sand and syringe in the soybean and kidney bean, respectively. Transient expression of target hairpin RNA reached the maximum level at 24-h post-agroinfiltration in both soybean and kidney bean. The agroinfiltrated soybean plants expressing the COPA and aquaporin 9 (AQ9) hairpin RNA induced 64.1% and 39.5% mortalities of T. urticae at 144-h post-infestation. The target gene knocksown was observed in the infested mites, confirming that the observed mortality was likely resulted from RNAi. In summary, agroinfiltration was determined as an effective pre-screening tool for evaluating the RNAi-induced lethality of plants expressing target hairpin RNA prior to the generation of transgenic plants. To confirm the proof of concept that the constitutively expressed hairpin RNA in plant can also cause RNAi-induced lethality against T. urticae, a representative sucking pest, an Arabidopsis plant lines constitutively expressing the COPA hairpin RNA were generated via floral-dip method. When infested with T. urticae, the transgenic Arabidopsis resulted in T. urticae mortality and transcript downregulation. These findings strongly demonstrated that sap-feeding T. urticae can be actually killed by in planta expression of target lethal gene, such as COPA, and RNAi-based transgenic plants can be exploited as a novel alterative mean to control sucking pests T. urticae, as well.

Characterization of genes controlling ginsenoside biosynthesis and application to metabolic engineering in Panax ginseng

한정연 강원대학교 대학원 2008 국내박사

인삼 (Panax ginseng)은 예로부터 건강을 증진시키는 약재로 가장 널리 알려진 약용식물이다. 인삼 뿌리에는 트리터페노이드 사포닌이라고 불리는 진세노사이드가 함유되어 있는데 이는 인삼 생리활성 성분을 대표하는 이차대사 산물이다. 인삼 사포닌은 메발론산으로부터 이스프레노이드 생합성 사이클을 거친다. 스쿠알렌 에폭시다제는 스쿠알렌을 옥시도스쿠알렌으로 바꾸게 하는데 이과정으로부터 사포닌 및 식물스테롤의 생합성과정이 분지된다. 한편 인삼 진세노사이드의 생합성에 결정적으로 관여하는 옥시도스쿠알렌 사이클라제는 담마란다이올 II 합성 유전자이며 이로부터 담마린다이올이라는 인삼 사포닌의 전형적인 골격이 만들어진다. 본 학위논문에서는 스쿠알렌 에폭시다제와 담마란다이올 합성 유전자를 분리하고 기능을 규명하였다. 또한 3국의 삼 (wild-grown P. ginseng, P. quinquefolium, 및 P. japonicum)으로부터 부정근을 유도하고 증식하기 위한 배양조건 개발하였고 특히 메틸 자스몬 산을 처리하였을 경우 인삼 진세노사이드 생합성에 관여하는 유전자의 발현을 비교하였다. 이 결과 스쿠알렌 에폭시다제(PgSE1)는 1,609-bp로 된 유전자이며 59.1 kDa 아미노산으로 구성되어 있었다. 인삼 진세노사이드 합성 전구물질 및 메틸 자스몬산을 처리한 경우 PgSE1 mRNA의 발현이 증가함을 확인하였으며 아울러 진세노사이드 생합성이 증가되었다. 스쿠알렌 에폭시다제를 post-transcriptional gene silancing (RNAi)라는 기법으로 발현을 억제시킨 형질전환 뿌리를 유도한 결과 인삼 진세노사이드의 함량이 50% 줄어들어서 스쿠알렌 에폭시다제는 인삼 진세노사이드 생합성에 중요한 유전자임을 밝혔다. 한편 인삼 진세노사이드의 기본 골격은 담마란다이올이라는 아글리콘인데 이는 옥시도스쿠알렌 사이클라제 일종인 담마란다이올 합성 유전자가 관여한다. 담마란다이올이라고 추정되는 유전자를 인삼의 화아에서 분리한 유전자한 다음, DDS라고 명명하였다. 이 유전자는 화아에서 가장 발현율이 높았다. 메틸 자스몬산 처리시 강하게 DDS발현이 증가되었다. 또한 이 유전자를 이스트뮤탄트 (erg7)에 발현시켰을 경우 이스트에서 담마란다이올 및 하이드록시담마라논이 생성됨을 LC/APCIMS로 확인하였다. 한편 DDS 유전자를 RNA interference (RNAi) 방법을 이용하여 형질전환 인삼을 제작한 결과 형질전환체의 뿌리에 진세노사이드 함량이 84.5%가 감소됨을 확인하였다. 한편 산삼 뿌리로부터 부정근을 유도 하기위한 조건을 조사한 결과 배지에 NH4NO3를 제거해주는 것이 매우 효과적이었으며 이러한 경향은 미국삼 (P. quinquefolium) 및 죽절삼 (P. japonicum)에서도 같은 경향을 보였다. 산삼이 나이가 들수록 부정근 유도율이 현저히 감소 되었다. 산삼의 부정근을 효과적으로 증식시키기 위해서는 부정근 절편을 NH4NO3가 제거된 배지에서 2주간 배양한 후 NH4NO3가 첨가된 배지에서 배양하는 2단계 배양방법을 이용하는 경우 매우 효과적이었다. NH4NO3가 제거된 부정근의 유도를 촉진시키는 조건에서는 사포닌 생합성 유전자의 발현이 높게 나타났으며 진세노사이드 또한 생합성능이 증가되었다. Panax ginseng is one of the most highly regarded of herbal medicines in the Orient, where it has gained an almost magical reputation for being able to maintain the quality of life. Ginseng roots containing tetracyclic triterpenenoid saponins, called to ginsenosides, those are the major effective ingredients in P. ginseng. Mevalonate is the preferential precursor for triterpene biosynthesis. The enzyme squalene synthase catalyzes the first step from the central isoprenoid pathway towards triterpenoid biosynthesis. Squalene synthase catalyzes the reductive condensation of two molecules of FPP to squalene, via the intermediate presqualene diphosphate. Squalene epoxidase catalyzes the conversion of squalene to 2,3(S)-oxidosqualene which is the first oxygenation step in the sterol biosynthetic pathway. Both phytosterols and triterpenes in plants are synthesized from the product of cyclization of 2,3-oxidosqualene. The 2,3-oxidosqualene cyclases compose a family of biocatalysts that convert 2,3-oxidosqualene to polycyclic triterpenes. The step in ginsenoside synthesis involves cyclization of 2,3-oxidosqualene to oleanane and a dammarene-type triterpene skeleton. The first committed step in ginsenoside synthesis is the cyclization of 2,3-oxidosqualene to dammarenediol II by the oxidosqualene cyclase (dammarenediol synthase). In this thesis, two genes such as squalene epoxidase and dammarenediol II synthase were isolated and characterized their functions in thebiosynthesis of ginsenosides in ginseng roots. Moreover, adventitious root culture system in three Panax species (wild-grown P. ginseng, P. quinquefolium, and P. japonicum) were extablished, and expression of the genes involved in triterpene biosynthesis in the ginseng advnetitious roots was analyzed by RT-PCR after treatment with methyl jasmonate. Squalene epoxidase, catalyzes the epoxidation of squalene to 2,3-oxidosqualene, is branch points for the committed step for triterpene and phytosterol biosynthesis. In this thesis, squalene epoxidase gene (PgSE1) was isolated and the role of PgSE1 on the biosynthesis of triterpene and phytosterol was investigated. A ORF cDNA coding PgSE1 was a 1,609-bp with a predicted molecular mass of 59.1 kDa amino acids. Methyl jasmonate treatment resulted in obvious accumulations of PgSE1 mRNA in root compared with the response by the control. Three precursor treatments (mevalonate, farnesol and squalene) resulted in enhanced expression of squalene synthase (PgSS1), squalene epoxidase (PgSE1) and dammarenediol II synthase (PgDDS) but no change in the expression of cycloartenol synthase (PNX). Ginsenoside analysis revealed that squalene treatment was the most effective for accumulation of ginsenoside compared to other two precursor treatments. Post-transcriptional gene silancing (RNAi) of PgSE1 gene in transgenic P. ginseng resulted in silencing of PgSE1 expression, which resulted in reduced ginsenosides accumulation at 50% in roots. These results indicate that expression of PgSE1 is important regulator for the biosynthesis of ginsenosides in P. ginseng. The first committed step in ginsenoside synthesis is the cyclization of 2,3-oxidosqualene to dammarenediol II by the oxidosqualene cyclase (dammarenediol synthase). The expression of dammarenediol synthase gene (DDS) together with the genes involved in ginsenoside biosynthesis (SS, SE, PNX, PNY, PNY2 and PNZ) was analysed. Expression of DDS mRNA was higher in flower buds compared to root, leaf and petiole of ginseng plants. Elicitor (methyl jasmonate) treatment upregulated the expression of DDS mRNA. Ectopic expression of DDS in yeast mutant (erg7) lacking lanosterol synthase resulted in the production of dammarenediol and hydroxydammarenone, which were confirmed by LC/APCIMS. RNA interference (RNAi) of DDS in transgenic P. ginseng resulted in silencing of DDS expression, which leads reduction of ginsenosides production to 84.5% in roots. These results indicate that expression of DDS played a vital role in the biosynthesis of ginsenosides in P. ginseng. Adventitious roots were produced directly from root segments of Panax ginseng seedlings when cultured on an MS solid medium containing 3.0 mg L-1 IBA. Omitting NH4NO3 from this medium greatly enhanced both the frequency of adventitious root formation and the number of roots per explants. This frequency declined markedly with the age of the root, but could be increased through repeated sub-culturing events. A two-step procedure that included NH4NO3-free media for the first two weeks of culture, followed by transfer onto media containing NH4NO3 for another four weeks, greatly improved total fresh weights of these adventitious roots compared with a method of continuous culture over six weeks in media that always contained NH4NO3. Expression of the genes involved in triterpene biosynthesis was analyzed by RT-PCR. Ginsenoside contents were enhanced by the omission of NH4NO3 and were also greatly increased by treatment with methyl jasmonate. Adventitious root culture system in three Panax species (wild-grown P. ginseng, P. quinquefolium, and P. japonicum) was established to analyze their ginsenoside productivity. Adventitious roots were induced directly from segments of seedlings after cultured on MS solid medium containing 3.0 mg/l IBA. Omission of NH4NO3 from the medium greatly enhanced both the frequency of adventitious root formation and number of roots per explants in all the three Panax species. However, elongation of post-induced adventitious roots was enhanced on medium with NH4NO3. Two-step culture protocol: NH4NO3-free medium for first two weeks of culture, followed by NH4NO3 containing medium for further 4 weeks, greatly enhanced the fresh weight increase of adventitious roots in all the three ginseng species. The fresh weight of adventitious roots was high in P. quinquefolium and low in P. ginseng, followed by P. japonicum regardless of the composition of medium. Pattern and content of ginsenosides in adventitious roots differed among the three Panax species. Total ginsenoside content of adventitious roots in P. quinquefolium, P. ginseng, and P. japonicum was 8.03, 15.7 and 1.2 mg/g dry weight, respectively. Among the three speices, adventitious roots in P. quinquefolium produced high amount of ginsenosides. The pattern of ginsenoside fractions between P. ginseng and P. quinquefolium was similar but the amount of ginsenoside differed between the two. While, in P. japonicum, total ginsenoside content was very low and some ginsenosides such as ginsenoside Rb2 and Rf were not detected.

RNA interference(RNAi)를 이용한 혈관 내막 증식 억제에 관한 유전자 치료 효과

김준성 조선대학교 대학원 2004 국내석사

Essential roles of the adaptor complex proteins in the nematode Caenorhabditis elegans

심재갈 Graduate School, Yonsei University 2002 국내박사

Adaptor complex (AP )들은 세포 내에서 다양한 단백질의 이동에 관여한다. 지금까지 밝혀진 AP들은 모두 4종류가 존재하는데, 유사하게 4개의 소단위체로 구성되어 있다. 꼬마선충에서는 AP-1, AP-2, AP-3의 3개의 AP가 존재한다. AP의 4개 소단위체 중에서 μ라 불리는 중간크기의 소단위체가 세포 내에서 이동되는 단백질의 선택에 특히 중요한 것으로 알려져 있다. 따라서 본 연구는 μ 소단위체를 중심으로 꼬마선충에 존재하는 AP들의 발현과 기능을 이해하고자 하였다. 꼬마선충에서 AP들의 특징은 두 개의 μ1을 제외하고는 모두 하나의 소단위체만을 가지고 있다. 우선적으로 항체 염색과 녹색형광 단백질과의 합성 단백질의 발현을 통한 AP 단백질들의 발현 양상을 알아보았다. 그 결과로, 각 AP 단백질들의 발현은 조직별로 약간의 차이를 보이지만, 대체로 거의 모든 세포들에서 발현된다는 것을 알았다. 다음으로 RNAi 실험을 통한 각 유전자의 기능을 알아보았다. 그 결과로 AP-1의 RNAi가 가장 높은 배발생에서의 치사율을 보이고, AP-2와 AP-3에서는 조금 낮은 치사율을 보였다. 이것으로 보아 꼬마선충의 발생에서 AP들의 기능이 필수적임을 알 수 있었다. 꼬마선충에서 두 μ1 소단위체인 APM-1과 UNC-101은 발현과 RNAi 표현 형질에서 중복성과 특이성을 보인다. 이러한 두 유전자의 세포학적인 특성을 이해하기 위해 yeast two-hybrid screening을 실시하였다. 그 결과로 대부분의 단백질들이 APM-1과 UNC-101 모두에 상호 작용하며, 일부 단백질들만이 특이적으로 APM-1 또는 UNC-101에 특이적으로 상호 작용하는 것으로 나타났다. Clathrin - coated vesicles (CCVs) and adaptor protein (AP) complex es play important roles in trafficking and sorting of many cellular proteins. In mammals, the APs are divided into four types, and they are named AP - 1, AP - 2, AP - 3 and AP - 4. However, C. elegans has only three AP complexes unlike mammals . All the APs have hetero- tetrameric structur es composed of two large subunits (also named adaptin), one medium chain (μ), and one small chain (σ). Among the four subunits, the μ chain has been reported to be important in selection of the cargo proteins . In this thesis, I intended to understand the expression and functions of the APs, focusing on the μ chains, in the nematode C. elegans. The components of the AP complex es of C. elegans are encoded by only single copies of each subunit gene except for μ1s. The expression of APs were mostly ubiquitous and showed subtle difference in some tissues. The RNAi experiments of AP genes showed that their functions were essential in the embryogenesis and larval development. Judged from higher lethality of AP - 1 RNAi, AP - 1 seemed to be more essential than other APs. The two μs of AP - 1, APM- 1 and UNC- 101, were redun dant and distinct in development of C. elegans. To elucidate the function of two μ1s at the subcellular level, I performed yeast two- hybrid screenings. Conclusively, most proteins interacted with both of the μ1s, and several proteins interacted specifically with APM- 1 or UNC- 101.