내독소 투여로 유발된 흰쥐의 급성 폐 손상에서 표면활성제 투여가 Interleukin(IL)-lβ와 IL-6에 미치는 효과

송준섭 건국대학교 대학원 2003 국내석사

Purpose : Acute lung injury(ALI) induced by endotoxin is known as associated with inflammation, alveolarcapillary injury, surfactant dysfunction, and altered lung mechanics. Intratracheal endotoxin instillation results in the rapid recruitment of activated white blood cells(WBC) to the lungs and production of proinflammatory cytokine such as tumor necrosis factor(TNF)-α, interleukin(IL)-1β, IL-6. Among them, IL-1β and IL-6 are known as primary important mediator in initial lung injury. ALI has been challenged by many therapeutic approaches including surfactant therapy to improve the outcome. In present study, We evaluated the effects of surfactant therapy in ALI induced by E. coli lipopolysaccharide(LPS) endotoxin. Methods : ALI was induced by intratracheal administration of E.coli serotype 0111:B4(Sigma-Aldrich, USA) LPS edotoxin in rats. Surfactant instillation group(the study group) was treated with E. coli LPS endotoxin(40mg/kg) and Newfactan(Yuhan co., Seoul : 100mg/kg) intratracheally. Surfactant no instillation group(the control group) was intratracheally injected with LPS endotoxin and same dose of 0.9% normal saline instead of Newfactan. Before and after endotoxin instillation, We estimated body weight, respiratory rate(RR), heart rate(HR). The WBC counts had estimated in blood and bronchoalveolar lavage(BAL) fluid, and the total protein values was measured in BAL fluid. And also, We examined IL-1β, IL-6 values in BAL fluid and serum. Finally, the histopathologic changes were confirmed with hematoxylin and eosin(H & E) staining and electron microscopic study. Results : In the study group, the WBC counts had decreased in BAL fluid(P<0.05) and the IL-1β and IL-6 values had decreased in serum and BAL fluid(P<0.05). But, there were non-significant decrement in white cell counts of blood and the total protein values in BAL fluid(P>0.05). The RR and HR changes after instillation were also non-significant(P>0.05). Morphologically, the light microscopic examination denoted pathological finding such as infiltration of neutrophils and alveolar macrophages, vascular congestion. In electron microscopic study, there were various sized and shaped lamella bodies, and vacuolization of lamella bodies in alveolar type Ⅱ cell. Conclusion : The results of present study indicate that surfactant protects effectively the ALI caused by LPS endotoxin in vivo and the protective effects of surfactant may be related to anti-inflammatory action.

Regulation of lysyl oxidase and fibroblast growth factor 23 gene expression in hepatocytes by orphan nuclear receptor ERRγ

판이완 전남대학교 2023 국내박사

The estrogen-related receptor (ERR) family consists of three members: ERRα, ERRβ, and ERRγ, which are orphan nuclear receptors involved in regulating gene expression in various cellular processes. Three isoforms possess a highly conserved DNA binding domain (DBD), and their transcriptional functions are similar in co-expressed tissues the kidney, skeletal muscle, and kidney. ERRs regulate the transcription of target genes by binding to the classical estrogen response element (ERE) and the extended half-site core sequence (TCAAGGTCA)either as monomers or dimers. They are predominantly expressed in tissues with high metabolic demands, including muscle, pancreas, heart, and liver, where they participate in physiological and pathophysiological conditions. In the liver, ERRγ plays a crucial role in regulating lipid, glucose, alcohol, and iron metabolism by modulating the expression of numerous target genes involved in different metabolic pathways. These target genes encode various proteins, particularly secretory proteins like fibrinogen, fibroblast growth factor (FGF) 21, lipin1, and 2-arachidonoylglycerol. Through its regulation of these proteins, ERRγ contributes to metabolic homeostasis in the liver and other organs. ERRα and ERRβ have been extensively studied, ERRγ is the most recently discovered member of the ERR family, its transcriptional function remains incompletely understood. This dissertation aims to expand our understanding of the transcriptional function of ERRγ in the expression of secretory proteins in hepatocytes. The study focuses on two main subjects, as illustrated in the graphical abstract. Estrogen related receptor (ERR) family 는 ERRα, ERRβ, ERRγ 3 개의 member 로 구성된 고아핵수용체로 다양한 cellular process 과정에서의 유전자 발현을 조절합니다. ERRα 와 ERRβ 는 그동안 광범위하게 연구가 진행되었습니다. ERRα, ERRβ, ERRγ 는 보존된 DNA binding domain (DBD)를 가지고 있으며 신장, 골격근과 같은 동시에 발현하는 몇몇 조직에서 비슷한 transcriptional function 을 지니고 있습니다. 반면 ERRγ 는 간에서 대사를 조절하는 별개의 역할을 합니다. ERRγ 는 표적 유전자의 estrogen response element (ERE)와 확장된 half-site core 시퀀스 (TCAAGGTCA)에 단량체 혹은 이량체로 결합합니다. ERRs 는 주로 근육, 췌장, 심장, 간과 같이 높은 대사가 요구되는 조직에서 발현하며, 이 조질들은 생리학적, 병태생리학적으로 관여합니다. 간에서 ERRγ 는 다양한 대사과정에 관여되는 유전자들의 발현을 조절함으로써 지방, 포도당, 알코올 그리고 철 대사 조절에 중요한 역할을 합니다. 이러한 표적유전자는 fibrinogen, fibroblast growth factor (FGF) 21, lipin1, 2-arachidonylglycerol 과 같은 다양한 종류의 단백질을 코딩합니다. 이러한 단백질 조절을 통해 ERRγ 는 간 및 다른 기관의 대사 항상성에 관여합니다. 비록 생체내에서 ERRγ 가 ERR family 중 가장 늦게 발견됐지만, 그 transcriptional function 은 아직 전부 밝혀지지 않았습니다. 이 논문은 간세포에서 발현되고 분비되는 단백질에서의 ERRγ 의 transcriptional function 을 이해하고자 합니다. 이 논문은 두가지 주제를 다루고 있으며 첫째로, 쥐 간세포주 AML12 에서 interleukin 6 (IL-6) 시그널에서 ERRγ 가 lysyl oxidase (LOX)의 유전자 발현을 조절하는 기전에 초점을 두었습니다. RNA-seq 데이터 분석을 통해 간세포에서 ERRγ 를 과발현 시 LOX family 를 포함한 다양한 분비단백질의 유전자 발현을 증가시킨다는 사실을 확인했습니다. 그 중 LOX 가 mRNA 수준에서 가장 유의미하게 증가했습니다. LOX 가 간세포에서 발현이 증가하지만 핵수용체가 조절하는 기전은 불분명하기에 저는 LOX 유전자 발현에 대한 ERRγ 의 영향을 입증하기 위해 LOX 를 117 표절유전자로 선택했습니다. 저는 전염증성 사이토카인 IL-6 가 AML12 세포주에서 LOX 의 유전자 발현을 증가시키는 것을 확인했습니다. 저희 실험실에서 이전에 IL6 가 AML12 세포주에서 ERRγ 의 유전자 발현을 증가시킨다는 것을 밝혔습니다. 더욱이, 저는 IL-6 에 의해 유도된 ERRγ 가 LOX 프로모터 활성을 증가시킴으로써 LOX 유전자 발현을 증가시키는 것을 확인했습니다. 또한, ERRγ 역작용제인 GSK5182 가 IL-6 에 의해 증가된 LOX 의 유전자 발현을 증가시킵니다. 두번째로 저는 사람 간세포주에서 chenodeoxycholic acid (CDCA)가 FGF family 중 하나인 fibroblast growth factor 23 (FGF23)의 유전자 발현을 증가시키는 신호매개체임을 조사했습니다. 쥐 간세포에서 ERRγ 의 과발현이 FGF23 의 유전자 발현을 증가시킨다는 것을 근거로, 우리 실험실에서는 ERRγ 가 쥐 간세포에서 FGF23 의 유전자 발현을 증가의 조절에 관여한다는 것을 밝혔습니다. 저는 사람 간세포에서 CDCA 매개 FGF23 의 유전자 발현을 ERRγ 가 조절한다는 사실을 조사했습니다. 저는 CDCA 에 의해 ERRγ 의 유전자 발현이 증가하고 결과적으로 FGF23 의 프로모터 활성이 증가한다는 것을 확인했습니다. 더욱이, GSK5182 를 처리했을 때, FGF23 의 유전자 발현이 감소했습니다. 이러한 연구들은 특정한 세포 외 자극에 의해 간세포에서 ERRγ 가 분비단백질 LOX 와 FGF23 의 유전자 발현을 조절하는 메커니즘을 밝혔습니다. 이 두 분비 단백질의 발현에 대한 ERRγ 의 자극 효과는 LOX 혹은 FGF23 에 의해 조절되는 생리학적 및 병태생리학적 과정에 ERRγ 가 연관된다는 것을 보여줍니다.

Regulation of Mycoplasma pneumoniae lysate-induced IL-8 expression in human airway epithelial cells

김경원 Graduate School, Yonsei University 2009 국내박사

The potential role of Mycoplasma pneumoniae infection in the pathogenesis of asthma has been suggested with accumulating evidence. Interleukin (IL)-8 plays a central role in the coordination and persistence of the inflammatory process in the chronic inflammation of the airways in asthma. I investigated the mechanism whereby M. pneumoniae lysate (MPL) triggers IL-8 release from human airway epithelial cells.Chemical inhibitors were pretreated before addition of MPL for promoter activity and protein synthesis of IL-8. The transcriptional activity of IL-8 promoter was analysed by mutational and deletional anaylsis and electrophoretic mobility shift assay (EMSA).Stimulation of H292 cells, human airway epithelial carcinoma cell line, with MPL resulted in a time- and concentration-dependent induction of IL-8 transcription and protein synthesis. IL-8 promoter deletion analysis indicated that position -132 to +41 was essential for MPL-induced IL-8 transcription, and mutants with substitutions in activator protein (AP)-1, nuclear factor (NF)-IL6 and NF-kB binding sites revealed a requirement for NF-kB and NF-IL6, but not AP-1, in MPL-induced activation of the IL-8 promoter. The DNA-binding activities of NF-kB and NF-IL6 were induced by MPL, as determined by EMSA. The chemical inhibition of extracellular signal regulated kinase (ERK) attenuated MPL-induced transcriptional activity and protein synthesis.I conclude that MPL-induced IL-8 expression is regulated by transcriptional activation of NF-kB and NF-IL6 coordinating with the ERK pathway in human airway epithelial cells. 목적: Mycoplasma pneumoniae는 기도 점막의 상피세포에서 증식하면서 호흡기 질환을 일으키며 기관지 천식의 발생이나 악화에 관여한다고 알려져 있다. IL-8은 기도에서 염증부위로의 세포이동을 매개하는 chemokine으로 호중구와 호산구에 대한 화학주성을 가지며 기관지 천식의 알레르기 염증 반응에 밀접한 관련을 가진다. 본 연구에서는 기관지 상피세포에 M. pneumoniae 항원을 자극했을 때 IL-8 유전자 발현과 신호전달경로를 밝히고자 하였다.방법: M. pneumoniae 추?물을 기관지 상피 세포주인 H292 세포에 노출시켜 시간과 농도에 따른 IL-8 단백질 생성과 mRNA 발현을 측정하였다. IL-8 발현을 위한 transcriptional activity는 IL-8 promoter contructs를 제작하고 deletional analysis와 mutational analysis를 통해 각각 조사하였다. Mitogen-activated protein (MAP) kinase의 연관성 여부와 활성화되는 전사인자들을 확인하기 위해 chemical inhibitor를 처리하거나 electrophoretic mobility shift assay (EMSA) 방법을 이용하였다.결과: H292 세포에 M. pneumoniae 항원을 노출시켰을 때 시간과 농도가 증가함에 따라 IL-8 단백질 생성과 mRNA 발현이 증가됨을 관찰할 수 있었다. 또한 ERK inhibitor인 PD98059, U0126을 전처치했을 때 IL-8 생성이 감소하였고, MAPK 활성 분석에서도 p44/42 MAPK의 활성도가 증가되었다. 또한 luciferase assay를 이용하여 deletional analysis를 실시한 결과 IL-8 promoter의 -132/+41에 해당하는 부위가 IL-8 발현에 밀접한 연관이 있음을 알 수 있었으며, mutational analysis와 chemical inhibitor 전처치를 통해 NF-IL6와 NF-kB의 translocation을 확인하였으며 ERK inhibitor 전처치를 한 경우 이들이 translocation이 감소함을 알 수 있었다.결론: M. pneumoniae 항원은 기관지 상피 세포에서 ERK pathway를 통해 IL-8 promoter 내 NF-IL6와 NF-kB를 활성화시키고 이들을 통해 IL-8 유전자 발현을 조절하는 것으로 사료된다.

Regulation of German cockroach extract-induced interleukin-8 expression in human airway epithelial cells

이경은 Graduate School, Yonsei University 2007 국내박사

Cockroaches have been implicated as a cause of respiratory allergies such as asthma. Interleukin (IL)-8 plays an integral role in the coordination and persistence of the inflammatory process in the chronic inflammation of the airways in asthma. We investigated the mechanism by which German cockroach extract (GCE) triggers IL-8 release from human airway epithelial cells.Chemical inhibitors were pretreated before addition of GCE for promoter activity and protein synthesis of IL-8. Transcriptional activity of IL-8 promoter was analyzed by mutational, deletional anaylsis and electrophoretic mobility shift assay (EMSA).Stimulation of H292 cells with GCE resulted in a time- and concentration-dependent induction of IL-8 transcription and protein synthesis. IL-8 promoter deletion analysis indicated that position -132 to +41 was essential for GCE-induced IL-8 transcription. And mutants with substitutions in activator protein (AP)-1, nuclear factor (NF)-IL6 and NF-κB binding sites revealed a requirement for NF-κB and NF-IL6, but not AP-1, in GCE-induced activation of the IL-8 promoter. The DNA binding activities of NF-κB and NF-IL6 were induced by GCE, as determined by EMSA. The chemical inhibition of extracellular signal-regulated kinase (ERK) attenuated GCE-induced transcriptional activity and protein synthesis. In addition, through aprotinin treatment and PAR2 small interfering (si) RNA transfection, it was proven that protease of GCE is consistent with the regulation of GCE-induced IL-8.We conclude that GCE with protease activity induced IL-8 expression is regulated by transcriptional activation of NF-κB and NF-IL6 coordinating with ERK pathway in human airway epithelial cells. 목적: 바퀴는 알레르기 질환을 유발하는 중요한 기인항원으로 가옥 내에 널리 퍼져 분포하며 잔류물이 집먼지 속에 남아 호흡기를 통하여 흡입되어 알레르기항원으로 작용한다고 알려지고 있다. 본 연구에서는 독일바퀴항원이 기관지 상피세포 내에서 염증작용을 일으키는 사이토카인인 Interleukin-8 (IL-8)을 유도하는지와 바퀴항원이 사이토카인 발현에 관여하는 조절기작을 밝히고자 하였다.방법: 배양한 호흡기상피세포에 바퀴항원농도와 반응시간들을 달리하여 처리하였다. IL-8 발현을 위한 transcriptional activity는 IL-8 promoter constructs를 제작하고 delectional analysis와 mutational analysis를 통해 각각 조사하였다. Mitogen-activated protein (MAP) kinase의 연관성여부와 활성화되는 전사인자들을 확인하기 위해 chemical inhibitor를 처리하거나 electrophoretic mobility shift assay (EMSA) 방법을 이용하였다.결과: H292 세포에 독일바퀴 항원을 노출시켰을 때 시간과 농도가 증가함에 따라 IL-8의 생성이 증가되었으며, ERK inhibitor인 PD98059를 전처치했을 때 IL-8 생성이 감소하였으나 p38과 JNK inhibitor 를 각각 전처치 하였을 때는 의미있는 감소를 보이지 않았다. 또한 luciferase assay를 이용하여deletional analysis를 실시한 결과 IL-8 promoter의 -132/+41 에 해당하는 부위가 IL-8 발현에 밀접한 연관이 있음을 알 수 있었으며, mutational analysis와 chemical inhibitor 전처치를 통해 NF-IL6와 NF-κB 전사인자가 독일바퀴에 의한 IL-8 발현에 관여하고 있음을 확인할 수 있었다. EMSA 결과를 통해 NF-IL6와 NF-κB의 translocation을 확인하였으며 ERK inhibitor 전처치를 한 경우 이들의 translocation이 감소함을 알 수 있었다.결론: 독일바퀴 항원은 기관지 상피 세포에서ERK pathway를 통해 IL-8 promoter 내 NF-IL6와 NF-κB를 활성화시키고 이들을 통해IL-8 유전자 발현을 조절하는 것으로 사료된다.

생체내 신호전달에 관여하는 Pleckstrin Homology(PH) Domain 의 IL-6 Signal Transduction에 대한 특성규명

송현근 江原大學校 大學院 1996 국내석사

The pleckstrin homology (PH) domain is a protein module of approximately 100 amino acids, which has been found in signaling molecules, including serine/threonine kinase, GTPase-activating protein, phospholipase, and some cytoskeletal proteins. Although the specific function of PH domain hase not been defined yet, it is belived that this domain is involved in the regulation of signal transduction pathway. To produce the polyclonal antibody against PH domains of PLCγ1, Glutathione S-trnaferase(GST) fusion proteins containg PH domains, were expressed in E. coli, Fusion proteins of GST-PH domains were purified from E. coli cell lysate by glutathion sepharose4B column bead, and digested by thrombin to gain purified PH domains. These purified PH domains were used to immunize rabbit.. After third boosting, polyclonal antibodies that recongnize each of GST, NC(fusion protein of N-terminal and C-terminal of PH domain), and NSSC(splited PH domain and sarcoma homology domains)were produced, respectively. Polyclonal antibodies against NC and NSSC showed very high binding affinity to each antigen with the titer of 1:1000. NC polyclonal antibody showed about two-fold higher binding affinity than NSSC polyclonal antibody. To study the roles of PH domains in signal transduction, IL-6- dependent B9 cells were treated with 10 unit/ml IL-6 and the cell lysates were immunoprecipited with GST-PH doman fusion proteins or polyclonal antibodies against PH domains. ln vitro kinase studies demonstrated that p38 (38KDa) protein was coprecipitated with NC fusion protein, but IL-6 had no effect on it. When S-methaionine labelled cell lysates were used for immunoprecipitation, the same result was observed, which is confirming the association of p38 with NC motive of PH domain. The characteristics of this protein kinase need to be analyzed further. In addition, expression plasmids of human PLCγ2 PH domains were constructed to see the roles of them in IL-6 signal transduction. When these expression plasmids were transfected into B9 cells, only N-terminal of PH domain inhibited IL-6-induced B9 cell proliferation. These results suggest that N-terminal of PH domain is critical for IL-6 signal transduction in B9 cells. In summary, polyclonal antibodies against PH domain (NC, and NSSC) of PLCγ1 were made. Using these antibodies and fusion proteins, it was found that p38 was associated with NC motive of PH domain. Furthermore, it was also found that PH domain of PLCγ2 was involved in IL-6 signalling of B9 cells.

綠膿菌 感染이 마우스의 IL-2 및 IL-6 生産과 其他 免疫反應에 미치는 影響=

林錫煥 全北大學校 1992 국내박사

알콜이 IL-2 및 IL-6 生産과 體液性 및 細胞性 免疫反應에 미치는 影響=

朴炳淑 全北大學校 1991 국내박사

패혈성 흰쥐의 혈청 및 심근에서 흡입산소 농도에 따른 IL-6, IL-8 및 TNF-α의 변화

전홍주 부산대학교 2004 국내박사

알콜給食이 마우스의 IL-2 및 IL-6生産과 腫瘍發生 그리고 其他 免疫反應 潛在力에 미치는 影響=

金希宣 全北大學校 1992 국내박사

Mouse L cell에서의 human NF-IL6 生産에 關한 硏究

최윤희 서울大學校 大學院 1992 국내석사