Acinetobacter baumannii종의 Mur 효소 계열에 대한 구조 및 생화학적 연구

정경호 중앙대학교 대학원 2024 국내박사

Structural and Biochemical studies of Mur enzyme Family in Acinetobacter-baumannii Kyoung ho jung Major in Global Innovative Drugs Department of Global Innovative Drugs The Graduate School of Chung-Ang University During bacterial cell wall biosynthesis, MurE ligase catalyzes the attachment of meso-diaminopimelic acid to UDP-MurNAc-L-Ala-D-Glu using ATP, producing UDP-MurNAc-L-Ala-D-Glu-meso-A2pm. Due to the critical role of this enzyme, MurE is considered an attractive target for antibacterial drugs. Despite extensive studies on MurE ligase, the structural dynamics of its conformational changes are still elusive. In this study, we present the substrate-free structure of MurE from Acinetobacter baumannii, an antibiotic-resistant super bacterium that poses a threat to global public health. The structure revealed that MurE adopts a wide-open conformation and undergoes dynamic conformational transitions between wide-open, intermediate-closed, and fully closed states. Elucidating the structural dynamics of MurE will aid in understanding the operational mechanism of this ligase and in designing next-generation antibiotics targeting MurE. The second chapter is about the putative hexameric glycosyltransferase functional unit revealed by the crystal structure of Acinetobacter baumannii MurG. Lipid II, the main component of the bacterial cell wall, is synthesized by the addition of UDP-N-acetylglucosamine to the UDP-N-acetylmuramic acid pentapeptide catalyzed by the glycosyltransferase MurG. Due to its critical role in cell-wall biosynthesis, MurG is considered to be an attractive target for antibacterial agents. Although the Mur family ligases have been extensively studied, the molecular mechanism of the oligomeric scaffolding assembly of MurG remains unclear. In this study, MurG derived from the human pathogen Acinetobacter baumannii (abMurG) was characterized, and its hexameric crystal structure was unveiled. This is the first homo-oligomeric structure described in both the MurG family and the Mur family. Homogeneous protein samples were produced for structural studies using size- exclusion chromatography, the absolute molecular mass was calculated via multi-angle light scattering, and protein-protein interactions were analyzed using the PDBePISA server. It was confirmed that abMurG forms homo- oligomeric complexes in solution, which may serve as functional units for the scaffolding activity of MurG. Furthermore, analysis of this structure revealed the molecular assembly mechanism of MurG. This structural and biochemical study elucidated the homo-oligomerization mechanism of MurG and suggests a new potential antibiotic target on MurG. 세균 세포벽 생합성 중에 MurE 는 ATP를 사용하여 UDP-MurNAc-LAla-D-Glu에 meso-다이아미노피멜릭산을 결합시켜 UDP-MurNAc-LAla-D-Glu-meso-A2pm을 생성한다. 이 효소의 중요한 역할로 인해 MurE는 항균제의 유망한 대상으로 간주됩니다. MurE에 대한 광범위한 연구에도 불구하고, 구조적 변화와 동역학적 메커니즘은 여전히 알려지지 않았다. 본 연구에서는 전 세계적 공중보건에 위협을 가하는 항생제 내성 박테리아인 Acinetobacter baumannii로부터 유래한 MurE의 기질이 없는 구조를 제시한다. MurE 구조는 넓게 열린 형태를 취하고, 넓게 열린, 중간적으로 닫힌, 그리고 완전히 닫힌 상태 사이를 동적으로 형태가 변화한다는 것을 보여준다. MurE의 구조적 역학을 명확히 밝히는 것은 이 효소의 작동 메커니즘을 이해하는 데 도움이 되며, MurE를 대상으로 하는 차세대 항생제를 설계하는 데 도움이 될 것이다. 두 번째 장은 Acinetobacter baumannii MurG의 결정 구조에 의해 밝혀져 추정되는 헥사머 글리코실 전달효소 기능 단위에 관한 것이다. 세균 세포벽의 주요 구성 요소인 지질 II는 MurG 글리코실전달효소에 의해 촉매 되는 UDP-N-아세틸글루코사민 UDP-N-아세틸뮤라믹산 펜타펩타이드에 첨가됨으로써 합성된다. 세포벽 생합성에서의 중요한 역할로 인해 MurG는 항균제로서 매력적인 대상으로 간주된다. Mur 계열 효소들은 광범위하게 연구되어 왔지만, MurG의 올리고머릭 스캐폴딩 조립의 분자적 메커니즘은 여전히 불명확하다. 본 연구에서는 병원균인 Acinetobacter baumannii로부터 유래한 MurG (abMurG)가 특성화되었으며, 육면체 결정 구조가 공개되었다. 이는 Mur 계열 모두에서 기술된 최초의 호모-올리고머의 구조이다. 구조 연구를 위해 균일한 단백질 샘플이 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 생산되었으며, 절대 분자량은 다중 각도 광 산란을 통해 계산되었으며, 단백질 간 상호작용은 PDBePISA 서버를 사용하여 분석되었다. abMurG는 용액에서 호모 올리고머 복합체를 형성하는 것으로 밝혀졌으며 이는 MurG의 스캐폴딩 활동을 위한 기능적 단위로 작용할 수 있다. 또한, 이 구조를 분석하여 MurG의 분자 조립 메커니즘을 밝혀냈다. MurG의 구조 및 생화학적 연구는 호모-올리고머화 메커니즘을 규명하며 이는 새로운 잠재적 항생제 표적을 제시한다.

Acinetobacter baumannii에 대항하는 숙주면역 반응에서 톨유사 수용체 2 및 4의 역할 : Role of Toll-like Receptor 2 and 4 in Host Immune Response against Acinetobacter baumannii

김창환 서울대학교 대학원 2014 국내박사

Interest in the genus Acinetobacter, from both the scientific and public community, has risen sharply over recent years. Toll–like receptors (TLRs) are the most studied pattern recognition receptors (PRRs) and TLR2 and TLR4 play important roles in the recognition of bacterial pathogen. TLR2 is a membrane sensor for bacterial lipoprotein and TLR4 has been identified as a sensor for LPS, a major cell wall component of Gram-negative bacteria. In these studies, we investigated in vitro and in vivo innate immune mechanism against Acinetobacter baumannii focusing on TLR2 and TLR4. In the first study, we studied the role of TLR2 and TLR4 on innate immune responses of immune cells against A. baumannii. Bone marrow-derived macrophages (BMDMs) and bone marrow-derived dendritic cells (BMDCs) were isolated from wild type (WT), TLR2- and TLR4-deficient mice and infected with A. baumannii. Enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) were performed revealing that the production of interleukin-6 (IL-6) and tumor necrosis factor-α (TNF-α) by A. baumannii was impaired in TLR4-deficient macrophages. In addition, TLR4 was required for the optimal production of IL-6, TNF-α, and IL-12 in BMDCs in response to A. baumannii. However, the absence of TLR2 did not affect A. baumannii-induced cytokines production in BMDMs. Western blot analysis showed that A. baumannii leads to the activation of nuclear factor-kappa B (NF-κB) and mitogen-activated protein kinases (MAPKs) in macrophages via TLR4-dependent pathway. mRNA expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS) and nitric oxide (NO) production was elicited in WT BMDMs in response to A. baumannii, which was abolished in TLR4-deficienct cells. Although TLR4 deficiency did not affect phagocytic activity of macrophages against A. baumannii, bacterial killing ability was impaired in TLR4-deficient BMDMs. In addition, A. baumannii induced apoptosis in BMDMs via TLR4-independent pathway. In the second study, WT, TLR2- and TLR4-deficient mice were infected intranasally with A. baumannii to determine the role of TLR2 and TLR4 in host defense against A. baumannii infection. Body weight, pulmonary bacterial load, cytokine and chemokine levels in bronchoalveolar lavage fluid (BALF) and lung histopathology were examined after infection. Body weight loss of TLR2-deficient mice was comparable to WT mice but that of TLR4-deficient mice was significantly less than WT mice. Pulmonary bacterial loads of TLR2-deficient mice were only increased at 1 day and those of TLR4-deficient mice were higher than WT mice at 1, 3 and 5 days after infection. In TLR2-deficient mice, there was a significant increase in pulmonary IL-6 and chemokine (C-X-C motif) ligand 2 (CXCL2) at 1 day after infection. When compared with WT mice, cytokine and chemokine concentrations of TLR4-deficient mice were significantly increased at day 1 but decreased thereafter. The histopathological features of lung tissue were comparable between WT and TLR2-deficient mice but inflammation was marked alleviated in TLR4-deficient mice compared with WT mice at 5 days after infection. In conclusion, our studies demonstrated that TLR4 was essential for inducing innate immune response in immune cells and host against A. baumannii and TLR2 contributed to the host defense against A. baumannii at an early stage of infection. 최근 수년에 걸쳐 Acinetobacter 속에 대한 과학적 혹은 대중적 관심이 급격하게 증가하고 있다. 톨유사 수용체 (toll-like receptors, TLRs)는 가장 많이 연구된 패턴인식 수용체 (pattern recognition receptors, PRRs)이며 TLR2와 TLR4는 병원성 세균의 인식에 매우 중요한 역할을 한다. TLR2는 세균의 지질단백을 인식하며 TLR4는 그람음성균의 주요 세포벽 구성물인 LPS의 인식수용체이다. 본 연구들에서는 TLR2 및 TLR4를 중심으로 A. baumannii에 대한 면역세포 및 숙주의 선천면역 기전을 연구하였다. 첫 번째 연구에서는 A. baumannii에 대항하는 면역세포의 선천면역반응에서 TLR4 및 TLR2의 역할을 조사하였다. 이를 위하여 야생형 혹은 TLR 결핍 마우스에서 골수유래 대식세포 및 수지상 세포를 분리한 후, A. baumannii를 감염시켰다. ELISA 분석시 A. baumannii에 의한 IL-6 및 TNF-α의 생산이 TLR4 결핍 대식세포에서 감소하는 것이 확인되었다. 그러나, TLR2의 결핍은 골수유래 대식세포에서 A. baumannii에 의한 사이토카인 생성에 영향을 미치지 않았다. 또한, TLR4는 골수유래 수지상 세포에서 A. baumannii에 의한 IL-6, TNF-α 및 IL-12의 생산에 필요하였다. Western blot 분석을 통하여 A. baumannii가 대식세포에서 TLR4 의존적인 경로로 NF-κB와 MAPK (p38, ERK 및 JNK)의 활성을 유도하는 것이 확인되었다. 야생형 골수유래 대식세포에서 A. baumannii에 반응하여 iNOS의 mRNA 발현 및 NO 생산이 유도되었으나 TLR4 결핍 세포에서는 대부분 소실되었다. TLR4가 결핍된 골수유래 대식세포에서 A. baumannii에 대한 탐식 능력은 야생형과 비교하여 차이가 없었으나 사멸 능력은 현저하게 감소하였다. 또한, A. baumannii에 의해 유도되는 골수유래 대식세포의 자연사는 TLR4와 무관한 기전으로 유도되는 것이 확인되었다. 두 번째 연구에서는 야생형, TLR2 및 TLR4 결핍 마우스에 비강 경로로 A. baumannii를 감염시키고 이에 대항하는 숙주방어 기전에서 TLR2 및 TLR4의 역할을 규명하였다. 세균감염 후, 체중, 폐의 세균수, 기관지 폐포액의 사이토카인과 키모카인 및 폐의 조직병리를 비교 관찰하였다. 시험기간 동안, TLR2 결핍 마우스의 체중소실은 야생형 마우스와 유사하게 나타났으나 TLR4 결핍 마우스에서는 유의적으로 적게 나타났다. 폐에서 산정된 세균 수는 TLR2 결핍 마우스에서는 감염 1일 후에, TLR4 결핍 마우스에서는 감염 1일, 3일 및 5일 후에 야생형 마우스보다 유의적으로 증가하였다. 야생형 마우스와 비교하였을 때, TLR2 결핍 마우스에서 폐의 IL-6와 CXCL2 생성이 감염 1일차에 유의적으로 증가하였다. TLR4 결핍 마우스에서는 사이토카인과 키모카인 농도가 1일차에 유의적으로 증가하였으며 이후에는 감소하였다 폐의 조직병리 관찰시, TLR2 결핍 마우스는 야생형에 비하여 주목할만한 차이를 보이지 않았으나 TLR4 결핍 마우스에서는 감염 5일차에 염증이 현저하게 감소하였다. 본 연구를 통하여 A. baumannii 감염에 대항하는 면역세포 및 숙주의 선천면역 반응에서 TLR4가 필수적이며 TLR2는 숙주방어의 초기단계에 영향을 미친다는 것이 증명되었다.

In vivo efficacy of combination of colistin with fosfomycin or minocycline in a mouse model of multidrug-resistant Acinetobacter baumannii pneumonia

구남수 Graduate School, Yonsei University 2018 국내박사

배경: Acinetobacter baumannii 는 잘 알려진 다제내성 원내세균이다. 하지만 안타깝게도 다제내성 Acinetobacter baumannii 의 치료는 상당히 어렵고 그 치료제 또한 제한적이다. 이를 극복하기 위해 항생제의 길항작용을 이용하는 방식으로 항생제 병합요법이 제안되어 왔다. 최근 예전에 사용되었던 fosfomycin 과 minocycline 이 이러한 다제내성 Acinetobacter baumannii 감염의 치료제로 다시 고려하게 되었다. 따라서, 본 연구진은 다제내성 Acinetobacter baumannii 에 의한 폐렴 마우스 모델에서 치료제로서 colistin과 fosfomycin 또는 minocycline 병합요법이 효과가 있는지 알아보고자 하였다. 방법: 세브란스 병원에서 얻어진 임상 검체에서 분리된 carbapenem 내성 Acinetobacter baumannii 를 사용하였다. 다제내성 Acinetobacter baumannii 에 의한 폐렴 마우스 모델에서 colistin, fosfomycin, minocycline, colistin과 fosfomycin, colistin과 minocycline으로 치료한 후 24시간, 48시간 폐 조직의 세균수 및 생존율을 비교하였다. 살균력은 대조군에 비해 치료 후 세균수가 3log10 이상 감소한 것으로 정의하였다. 길항력은 가장 효과가 있었던 단독 요법과 비교해서 세균수가 2log10 이상 감소한 것으로 정의하였다. 결과: 생체내 실험에서 colistin과 fosfomycin, colistin 과 minocycline 병합요법은 치료 후 24시간, 48시간에 대조군에 비해 유의하게 폐 조직의 세균수가 감소하였다 (p<0.05). 병합요법은 가장 효과가 있었던 단독요법 보다도 더 유의하게 세균수가 감소하였다 (p<0.05). 또한, 병합요법은 치료 후 24시간, 48시간에 가장 효과가 있었던 단독요법과 비교해서 의미있는 살균력과 길항력을 보였다. 생존율은 대조군과 치료군에서 차이가 없었다. 결론: 이상의 결과를 종합하여 볼 때, 본 연구는 다제내성 Acinetobacter baumannii 에 의한 폐렴 마우스 모델에서 치료제로서 colistin과 fosfomycin, colistin과 minocycline 병합요법이 효과가 있었음을 보였다. 따라서, 다제내성 Acinetobacter baumannii 에 의한 폐렴을 치료하는데 있어서 colistin과 fosfomycin, colistin과 minocycline 병합요법의 효과를 좀더 명확히 보기 위한 대규모의 임상 연구가 필요하겠다. Background: Acinetobacter baumannii is a well-documented multidrug-resistant (MDR) nosocomial pathogen. Unfortunately, the options for treating MDR A. baumannii infections are extremely limited. The administration of combination regimens has been proposed to achieve antibiotic synergy. Recently, fosfomycin and minocycline, two ‘old’ drugs, were newly introduced as a treatment option for MDR A. baumannii infection. Therefore, we investigated the efficacy of the combination of colistin with fosfomycin and minocycline, respectively, as therapeutic options in a mouse model of MDR A. baumannii pneumonia. Methods: We examined carbapenem-resistant A. baumannii isolated from clinical specimens at Severance Hospital, Seoul, Korea. The efficacy of colistin, fosfomycin, minocycline, colistin with fosfomycin, and colistin with minocycline on the bacterial counts in lung tissue were investigated in a mouse model of pneumonia caused by MDR A. baumannii. Bactericidal activity was defined as a ≥3 log10 decrease compared with the initial inoculum. Synergy was defined as a ≥2 log10 decrease caused by the combination compared with the most active single agent. Results: In vivo, colistin with fosfomycin or minocycline significantly (p<0.05) reduced the bacterial load in the lungs compared with the controls at 24 and 48 h. In the combination groups, the bacterial loads differed significantly (p<0.05) from that with the more active antimicrobial alone. Moreover, the combination regimens of colistin with fosfomycin and colistin with minocycline showed bactericidal and synergistic effects compared with the more active antimicrobial alone at 24 and 48 h. No significant difference in survival was observed among the control and antibiotic-treated groups. Conclusion: This study demonstrated the synergistic effects of combination regimens of colistin with fosfomycin and minocycline, respectively, as therapeutic options in pneumonia caused by MDR A. baumannii. Large clinical trials are needed to clarify the role of combination regimens with colistin and fosfomycin or minocycline in treating MDR A. baumannii pneumonia.

Expression, purification, crystallization, and preliminary X-ray crystallographic analysis of LpxC from Acinetobacter Baumannii : Protein crystal study of LpxC from Acinetobacter baumannii

한상준 건국대학교 대학원 2021 국내석사

다제내성(MDR)균에 의한 감염 증가는 전 세계적으로 공중 보건 및 현대 의료 시스템에 심각한 위협이 됩니다. 현재 다제내성균 감염 급증함에 비해 느린 신규 항균제 개발은 다제내성균 치료에 큰 문제입니다. 다제내성균 중 대부분은 그람 음성균이며, 특히 그람 음성균 중에 Acinetobacter baumannii는 끊임없는 문제를 야기하고 있습니다. 그람 음성균은 그람 양성균과 달리 추가적으로 외막을 가지고 있으며, 외막은 내부에 인지질, 외부에 당지질 합성물인 지질다당류 (LPS)의 비대칭 이중층 구조로 되어있습니다. LPS는 그람 음성균의 생존과 병원성에 필수적이며 LPS 합성 효소인 LpxC는 그람 음성균에 대한 중요한 항균 약물 표적입니다. 본 연구에서는 Acinetobacter baumannii에서 LpxC 유전자의 클로닝, 그 단백질의 E. coli에서 발현, 순수분리정제 및 결정화가 수행되었습니다. 순수분리 정제된 단백질은 결정화 되어 졌고, 얻어진 결정으로부터 2.5Å 해상도의 X-ray 회절 데이터가 얻어졌습니다. X-ray 회절 데이터 분석 결과 결정의 unit cell은 a = b = 82.4 Å, c = 162.8 Å의 정방형으로 공간 그룹 P422에 속함을 확인하였습니다. 단백질 결정은 2.5 Å Da-1의 Vm과 37.2%의 용매 함량을 가지며, asymmetric unit 내에 두 개의 protomer가 존재할 것으로 예상됩니다. 본인은 LpxC 단백질에 기질 analog를 결합시켜 결정화를 시도함으로써 높은 해상도로 회절하는 X-ray 회절 데이터를 성공적으로 확보하였고, 이를 통한 AbLpxC의 분자수준 삼차원 구조는 새로운 작동기작을 가지는 항생제 개발에 중요한 정보를 제공할 것이다. The increasing infections by multidrug-resistant (MDR) bacteria are a serious threat to public health around the world. There are limited treatment options due to the surging MDR bacteria and the slow development of new antimicrobial agents. Among the MDR bacteria, Acinetobacter baumannii, a Gram-negative bacterium, has been notorious for a hospital-derived nosocomial infection. LPS is essential for the survival and pathogenicity of Gram-negative bacteria. LpxC is the key enzyme to synthesize LPS and an important antibacterial drug target against Gram-negative bacteria. In this study, LpxC gene from Acinetobacter baumannii is cloned, and its protein is expressed in E. coli, purified, and crystallized. The crystal belongs to the tetragonal space group P422 with unit cell parameters of a = b= 82.4 Å and c = 162.8 Å. Two protomers are presented in the asymmetric unit and a solvent content of 37.2%.

Genetic and Phenotypic Characterization of Atypical Antimicrobial Resistance in Acinetobacter baumannii

조정우 성균관대학교 일반대학원 2024 국내박사

항생제 내성은 전세계적으로 인류의 건강을 위협하는 심각한 문제로 떠오르고 있다. 게다가, 최근 연구들은 항생제 의존성이나 이종 내성과 같은 비정형적인 항생제 내성 표현형들 역시 항생제 치료의 실패를 야기할 수 있음에 주목하고 있다. 항생제 의존성은 특정 항생제에 의해 균의 성장이 좌우되는 특성을 의미하며, 이종 내성은 내성 수준이 다른 소집단을 포함하는 비균질 세균 집단을 말한다. 임상 환경내에서는 이러한 비정형적인 내성 표현형들을 정확하게 판별하기 어렵기 때문에, 이는 결국 항생제의 오용으로 이어질 수 있다. 본 연구는 최후 항생제인 타이지사이클린과 콜리스틴에 대한 아시네토박터 바우마니균의 비정형적인 내성 표현형들을 유전적 및 표현형적 측면에서 분석했고, 최종적으로 이에 대한 효과적인 치료 전략을 확립하는데 목표를 두고 있다. 아시네토박터 균 종은 현재까지 콜리스틴 의존성을 발생시킬 수 있는 유일한 균 종으로 알려져 있다. 세포 외막에 존재하는 리포올리고당의 소실은 콜리스틴에 대한 고도 내성을 발생시키는 반면, 다른 대부분의 항생제들을 감수성으로 변하게 만든다. 이러한 점에서 착안하여 콜리스틴과 감수성으로 변하는 항생제들을 이용한 치료 전략이 고안되었고, 콜리스틴 의존성을 발생시킬 수 있는 아시네토박터 바우마니균에 대한 이들의 뛰어난 병용 효과가 검증되었다. 이종 내성 세균은 항생제 치료가 진행되는 동안 내성 돌연변이를 빠르게 발생시킴으로써 치료 실패를 야기한다. 하지만, 이종 내성의 임상적 중요도에 대한 연구 외에 이종 내성 세균에서 발생하는 내성 돌연변이의 근원에 대한 연구는 거의 이루어지지 않았다. 본 연구는 타이지사이클린 이종 내성을 모방하는 실험 방법과 유세포 분석법을 이용해 이종 내성 세균에서 발생한 내성의 출처를 추적했다. 이를 통해, 본 연구는 이종 내성 세균으로부터 형성되는 내성 돌연변이의 발생 기전에 대한 실험적인 근거를 제시했다. 타이지사이클린은 아시네토박터 바우마니균을 포함한 다재 내성 세균들에 대한 최후 항생제로 사용되고 있다. 따라서, 타이지사이클린의 작용 기전 및 치료 효능 측면에 대한 수많은 연구들이 수행되었으나, 그에 비해 타이지사이클린의 이종 내성은 거의 주목을 받지 못해 왔다. 본 연구는 임상 환경내의 타이지사이클린 이종 내성 아시네토박터 바우마니균의 분포를 조사했고, 이들의 유전적 및 표현형적 특성들을 밝혔다. 놀랍게도, 타이지사이클린과 콜리스틴에 대해 동시에 이종 내성을 나타내는 다제 이종 내성은 아시네토박터 바우마니 임상 균주의 흔한 특징이었다. 이를 이용해 두 항생제의 병용을 기반으로 하는 치료 전략이 수립되었다. 결론적으로, 본 연구는 아시네토박터 바우마니균의 콜리스틴 의존성 및 타이지사이클린 이종 내성이 가지는 특성들을 다양한 측면에서 밝혔으며, 이를 바탕으로 이들의 임상적 의의와 효과적인 치료 전략들을 확립했다. Antimicrobial resistance has surfaced as an urgent threat to human health globally. Furthermore, some atypical phenotypes of antibiotic resistance, including antibiotic dependence and heteroresistance, have been recently recognized as a cause of antibiotic treatment failure. Antibiotic dependence refers to a highly antibiotic-resistant phenotype exhibiting growth resilience on a certain antibiotic, whereas antibiotic heteroresistance is a term used to describe an existence of subpopulations with different resistance levels. These atypical phenomena can contribute to the misdiagnosis due to difficulty in detection in clinical settings, hence leading to inappropriate use of antibiotics. However, despite the importance of clinical trials, studies on these phenomena are not sufficient. In this project, the characteristics of heteroresistance and dependence phenotypes for the last-line antibiotics, tigecycline and colistin, were studied by genomic and phenotypic analysis with the goal of assisting in the establishment of effective therapeutic approaches. Acinetobacter spp. are the only bacterial species that develop colistin dependence since they can persist in the absence of lipooligosaccharide (LOS). The removal of LOS results in extremely high colistin resistance, while also causing re-sensitization to almost all antibiotics. In this regard, an effective therapy regimen was devised based on colistin and re-sensitized antibiotics. In vitro time-killing assay and Galleria mellonella infection assay demonstrated the combined efficacy of colistin and re-sensitized antibiotics against colistin dependence-developing A. baumannii. Antibiotic heteroresistance has been reported to involve treatment failure through the ability to rapidly develop a resistant population during antibiotic exposure. However, the genesis of those resistant mutants remains unclear. This study traced the source of post-exposure resistance in heteroresistant bacteria using a methodology modeling tigecycline heteroresistant A. baumannii and a flow cytometric analysis. This investigation provides an experimental basis for the mechanism of post-exposure resistance development within heteroresistant bacteria. Tigecycline is considered the last-line antibiotic against MDR bacterial pathogens, including A. baumannii, due to its effectiveness. Although numerous studies have already been conducted on tigecycline regarding to its molecular mechanisms and therapeutic efficacy, tigecycline heteroresistance has received little attention. This study revealed the prevalence of tigecycline heteroresistance among A. baumannii in clinics and characteristics of them both in genetic and phenotypic terms. Interestingly, multiple heteroresistance to tigecycline and colistin was a common feature of A. baumannii clinical isolates, which led to the establishment of combination treatment with both antibiotics. In conclusion, this project uncovered several aspects of colistin dependence and tigecycline heteroresistance in A. baumannii clinical isolates, emphasizing their clinical relevance and effective therapeutic approaches.

High-throughput screening of small molecules exhibiting potent antimicrobial activity and anti-virulence activity against multi-drug resistant Acinetobacter baumannii strains : 고속대량 스크리닝법을 이용한 다약제 내성 Acinetobacter baumannii에 활성을 가지는 항균제 및 항

나석현 경북대학교 대학원 2016 국내석사

Acinetobacter baumannii는 다양한 질병을 일으키는 중요한 병원 내 감염 균주이다. 현재 상용화되어 사용되고 있는 항생제들은 박테리아를 죽이거나 박테리아의 성장을 저해하여 질병을 치료하도록 작용한다. 이러한 살균 및 정균 작용은 인위적인 선택압을 일으키게 되고, 이러한 작용은 항생제 내성 균주의 확산 및 다약제 내성균주의 등장을 초래하게 되었다. A. baumannii 역시 다약제 내성 균주들이 확산되면서 전 세계적으로 임상현장에서의 치료에 어려움을 겪고 있다. 따라서 본 연구에서는 다약제 내성 A. baumannii 균주에도 작용할 수 있는 항균작용 물질 혹은 항병원성작용 물질을 찾기 위한 고속대량스크리닝을 실시하였다. 특히 A. baumannii의 대표적인 독성요소로 알려져 있는 외막단백질 A(outer membrane protein A, OmpA)를 표적으로 작용하는 항병원성작용 물질을 찾는다면, 감염균주의 살균 및 정균작용에 의한 선택압의 발생을 막으면서 균주의 발병기작을 차단할 수 있을 것으로 기대한다. 이 연구에서는 340,000여개의 화합물을 대표하는 7,520개의 대표화합물 라이브러리에서 A. baumannii 표준군주에 대하여 항균 활성을 가지는 물질을 탐색하였다. 그 과정에서 높은 항균 활성을 가지는 2개의 4H-4-oxoquinolizine 구조를 가지는 물질을 발견하였고, 그 유도체 70개를 대상으로 한 추가 탐색을 통하여 광범위 약제내성 A. baumannii 분리주에서도 항균활성을 가지는 7개의 4H-4-oxoquinolizine 물질을 발견하였다. 이 물질들은 GyrA와 ParC 부위에 있는 quinolone resistance-determining region (QRDR)에 돌연변이를 가지고 있음을 확인한 퀴놀론 내성 A. baumannii 분리주에 대해서도 항균활성을 가지고 있었으며, 1-cyclopropyl-7-fluoro-4-oxo-4H-quinolizine-3-carboxylic acid 구조를 기본으로 하고 C-8과 C-9에 moiety를 가지고 있었다. 새로운 4H-4-oxoquinolizine 물질은 다약제 내성 A. baumannii에 의한 질병을 치료하는 새로운 항생제를 개발하는 데에 도움을 줄 수 있을 것이다. 또한 ompA 유전자 프로모터 부위에 직접 혹은 간접적으로 작용하여 유전자 발현을 억제할 수 있는 물질을 찾기 위한 reporter strain을 제작하였으며, 그것을 이용하여 앞 과정에서 사용한 것과 동일한 7,520개의 대표화합물 라이브러리에서 항병원성 활성을 가지는 물질을 탐색하였다. 그 과정을 통해 항병원성 활성을 가지는 4개의 물질이 선택되었고, 그 4물질의 유도체 399개를 재탐색하였다. ompA 유전자 프로모터 억제 효과 및 인간 단핵구 세포와 세균에 나타나는 독성을 고려하여, 가장 활성이 뛰어난 물질 CC-62520을 최종선택 하였다. CC-62520을 A. baumannii ATCC 17978 균주에 2.5 μM로 처리하였을 때, ompA mRNA 발현이 대조군에 비해 63.5%, OmpA 단백질 발현이 58.2%, 바이오필름 형성능이 56.6%로 줄어드는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 CC-62520은 병원성 세균에 대해서 직접적인 살균효과를 나타내지 않으면서 병원성 단백질인 OmpA의 유전자 및 단백질의 발현을 저해하므로, 다약제 내성 A. baumannii 감염 질환을 치료하는 새로운 항병원성 제제 개발의 선도물질로 이용될 수 있을 것이다.

Screening of nuclear targeting proteins in Acinetobacter baumannii and their cytopathologic effect : Acinetobacter baumannii 균의 숙주 세포내 핵 타깃팅 단백질 규명과 분자병원성

문동찬 경북대학교 대학원 2011 국내박사

Acinetobacter baumannii균은 중요한 기회감염균으로서 다양한 원내감염을 일으키고 있지만 아직까지 정확한 병리기전은 알려지지 않고 있다. 숙주세포내에서 특히 숙주세포의 핵안에서 Acinetobacter baumannii ATCC 17978T 단백질의 병리기전을 연구하기 위해서 3,367종의 단백질 발현부위 중 37 종의 가상의 핵 타깃팅 배열을 가지는 단백질이 선별되었다. 이중 31 종의 단백질이 Gateway 유전자 재조합 시스템에 의해 만들어졌고 14종의 녹색형광단백질이 붙은 Acinetobacter baumannii 단백질이 핵안에 위치하는 것이 형광현미경에 의해 확인되었고 나머지 17 종은 세포질에 위치하는 것을 확인하였다. Acinetobacter baumannii 의 리보솜 단백질인 S21, L20, L32와 transposase 단백질에서는 nuclear export signal (NES)가 확인되었으나 오직 transposase 단백질의 NES 만이 기능을 발휘할 수 있는 것이 확인되었다. Acinetobacter baumannii 단백질이 숙주세포의 핵으로 이동 후 11종의 단백질이 세포독성을 일으키거나 숙주세포에서 암 관련 유전자인 hMLH1, P16, E-cadherin 의 프로모터 부위에서 CpG methylation을 유도하는 것이 확인되었다. Acinetobacter baumannii 단백질의 세포내 핵 타깃팅에 의한 분자병원성 연구는 일반적인 세균의 병리기전에 대한 지식을 발전 및 확장시킬 것으로 사료된다. Acinetobacter baumannii is an important nosocomial pathogen that causes a variety of human infections, but pathogenic mechanisms of this microorganism are not fully understood. To investigate A. baumannii pathogenesis regarding the nuclear targeting of A. baumannii proteins and subsequent host cell pathology, I screened nuclear targeting proteins in A. baumannii and determined their cytotoxicity and DNA methylation in the CpG regions in host cells. Thirty-seven functional or hypothetical proteins were predicted to carry the putative nuclear localization signal (NLS) sequences among 3,367 open reading frames of A. baumannii ATCC 17978T. Of the 31 clones generated by the Gateway recombinational cloning system, 14 A. baumannii proteins labeled with green fluorescent protein (GFP) targeted to the nuclei of host cells, whereas 17 GFP-labeled proteins localized in the cytoplasm. Four nuclear targeting proteins, S21, L20, and L32 ribosomal proteins and transposase, were predicted to carry nuclear export signal (NES) sequences, but only transposase harbored the functional NES. After translocation to the nuclei of host cells, 11 A. baumannii proteins induced cytotoxicity and/or DNA methylation in the CpG regions. My data provide a novel insight into A. baumannii pathogenesis regarding nuclear targeting of bacterial proteins, and extends our knowledge of bacterial pathogenesis.

Studies on the Chemistry and Biology of Acinetobactin, The Major Siderophore of Acinetobacter Baumannii

WoonYoung Song 고려대학교 대학원 2020 국내박사

Owing to the rapid increase in nosocomial infections by antibiotic-resistant Acinetobacter baumannii and the paucity of effective treatment options for such infections, interest in the virulence factors involved in its successful dissemination and propagation in the human host have escalated in recent years. Acinetobacin, a siderophore of A. baumannii, is responsible for iron acquisition under nutritional depravation and has been shown to be one of the key virulence factors for this bacterium. In this dissertation, my research findings regarding various chemical and biological aspects of acinetobactin metabolism closely related to the fitness of A. baumannii at the infection sites are described. In the first chapter, I briefly summarized a recent phenomenon of Acinetobacter baumanii infection threatening public health as well as virulence factors contributing its successful infection of human hosts. Among these virulence factors, the acinetobactin, a major siderophore used by A. baumannii, was specifically entailed including its first discovery and an issue associated with structural uncertanity of acinetobactin proposed by Walsh group. In the second chapter, I first described a successful synthesis of acinetobactin allowing to secure a large amount of thermodynamically unstable acinetobactin oxaoline form (Ab-Oxa). Next, the physicochemical properties of acinetobactin were described in detail. Particularly, it was found that the protonation state of hydroxamate in Ab-Oxa has an important effect on the isomerization of Ab-Oxa. In the third chapter, my investigation on the siderophore acitivity of acinetobactin were described. Specifically, the growth promoting activity of acinetobactin for A. baumannii was probed under various conditions. In particular, on the basis of the differences in the activities between oxaoline form of acinetobactin (Ab-Oxa) and isoxazolidinone form of acinetobactin (Ab-Isox), I proposed that the genuine siderophore utilized by A. baumannii between two acinetobactins would be Ab-Oxa. In Chapter 4, I proposed a thermally stable surrogate of Ab-Oxa acinetobactin. structurally, this surrogate has thiazoline instead of acinetobactin oxazoline. This compound was originally known to as a siderophore, anguibactin, used by Vibrio anguillarum 775. To investigate the possibility of anguibactin as a thermally stable surrogate of Ab-Oxa, I conducted gene cluster analysis of Ab-Oxa and anguibactin sideropohore followed by iron binding ability and iron delivery activity of anguibactin to A. baumannii 19606 were tested. Lastly, the most important issue of anguibactin isomerization was confirmed that anguibactin does not isomerize to its cognate isoxazolidinone compound. I was also revealed that through computational analysis, in the case of anguibactin, the activation energy for isomerization is much higher than that of Ab-Oxa. These findings are anticipated to provide valuable information on basic chemical and biological properties of acinetobactin, which may have a significant impact in the development of acinetobactin-based antibiotic delivery system.

Acinetobacter baumannii의 내인성 항균제 내성에서 외막단백 OmpA의 역할

권효일 경북대학교 대학원 2017 국내석사

Acinetobacter baumannii outer membrane protein A (AbOmpA) is involved in the bacterial pathogenesis. However, the role of AbOmpA in the antimicrobial resistance of A. baumannii has not been fully elucidated. This study aimed to investigate the role of C-terminal domain of AbOmpA in antimicrobial resistance of A. baumannii. The minimum inhibitory concentrations (MICs) of antimicrobial agents against the wild-type A. baumannii ATCC 17978, ∆ompA mutant (HDK14), single-copy ompA-complemented strain (OH3), C-terminal domain-truncated (amino acids 223-356) AbOmpA mutant (OH171), A. baumannii clinical isolate 1656-2 and ∆ompA mutant (HDK15) were determined by the E-test method. The HDK14 was more susceptible to trimethoprim (> 5.33-fold) and other antimicrobial agents tested (< 2.0-fold), except tigecycline, than the A. baumannii ATCC 17978 wild-type strain. The MICs of all antimicrobial agents tested against the OH3 were the same as or similar to those of the wild-type strain (0.8- to 1.0-fold), indicating that the single-copy complementation of the ompA gene in the ∆ompA mutant strain restores the MICs to those of the wild-type strain by recovering AbOmpA in the outer membrane. The MICs of gentamicin, imipenem and nalidixic acid against the wild-type and HDK14 were decreased in the presence of an efflux pump inhibitor. The OH171 was more susceptible to substrates of the RND efflux pumps, including aztreonam, gentamicin, imipenem and trimethoprim, than the A. baumannii ATCC 17978 wild-type strain. In addition, The HDK15 was more susceptible to trimethoprim (4.0-fold), tetracycline (2.28-fold) and other antimicrobial agents tested (< 2.0-fold), except aztreonam, ceftazidime, ciprofloxacin, gentamicin and nalidixic acid, than the A. baumannii clinical isolate 1656-2 strain. The MICs of imipenem, tetracycline and nalidixic acid against the wild-type and HDK15 were decreased in the presence of an efflux pump inhibitor. In conclusions, this study demonstrates that AbOmpA contributes to the antimicrobial resistance of A. baumannii through the C-terminal domain.

Role of guanosine tetraphosphate (ppGpp) in antibiotic susceptibility and biofilm formation of Acinetobacter baumannii : Acinetobacter baumannii의 항생제 suseptibility 및 biofilm 형성에 guanosine tetraphosphate (ppGpp)의 역할

정혜원 경북대학교 대학원 2019 국내석사

Acinetobacter baumannii는 병원에서 기회주의적 병원균이며 중요한 다 약제 내성 미생물로 잘 알려져 있다. A. baumannii 병원 내 균주에 의한 감염 치료는 항생제 내성 때문에 점점 더 문제가 되고 있다. 또한, A. baumannii 균주가 생물 막으로 성장하는 능력이 항생제 내성에 중요한 역할을 한다고 여겨진다. 항균 펩타이드 1018 처리는 ppGpp를 통해 다양한 병원성 박테리아의 생물막 형성을 감소시켰다 14. (p)ppGpp는 박테리아의 성장 조절 및 다양한 스트레스 반응에 관여하는 2 차 메신저이다. ppGpp가 A. baumannii의 병인에 관여하는지 여부를 biofilm assay를 통해 조사 하였다. 항생제 감수성 검사도 ppGpp와 항생제 내성 사이의 연관성을 결정하기 위해 수행되었다. ppGpp 결핍 A. baumannii 균주는 생물 막 형성 수준을 3 배 이상 감소 시켰고 대부분의 항생제에 더 민감했다. 우리는 초기 biofilm 형성을 위한 중요한 pili 생합성 유전자 인 csu operon의 발현이 ppGpp가 결핍 된 균주에서 현저히 감소되었음을 발견했다. 또한 항균제 감수성 검사에서 trimethoprim의 수준이 가장 크게 나타났으며 유출 펌프와 관련된 유전자 발현의 차이를 알 수 있었다. 결과적으로, ppGpp는 생물 막 형성 및 항생제 저항성에 대한 유전자 발현을 조절한다. 이 연구는 A. baumannii에서 ppGpp와 항생제 감수성 사이의 연관성을 처음으로 입증하는 데 의미가 있다. MDR A. baumannii에서 새로운 항균제가 없기 때문에 ppGpp는 합리적인 약물 설계를 위한 새로운 치료 목표 일 수 있다.