PCR 및 RT-PCR을 이용한 하천수 중 Giardia Lamblia 검출

조은주(Eun Ju Cho),이목영(Mok Young Lee),변승헌(Seung Heun Byun),한선희(Sun Hee Han),안승구(Seoung Koo Ahn) 大韓環境工學會 2007 대한환경공학회지 Vol.29 No.8

병원성 원생동물인 지아디아 람블리아는 수인성 질병을 야기하는 주요 원인이 되고 있다. 본 연구는 PCR 및 RT-PCR 기법을 적용하여 한강본류 하천수 시료에서 사람감염성 종인 지아디아 람블리아를 동정하고, 활성 여부를 판별하여 현 표준시험방법을 보완하고자 하였다. PCR과 RT-PCR에는 지아디아의 복부 흡반 구성 유전자를 증폭하는 giardin primer를 사용하였으며, DNA/RNA 추출 및 PCR/RT-PCR 과정에서의 민감도 검사를 수행한 결과, 1포낭까지 검출가능한 것으로 나타났다. 또한 한강본류 및 유입지천 시료 48점에 적용하여 면역형광항체법과 PCR 및 RT-PCR 방법을 비교하였다. 면역형광항체법을 이용한 현미경관찰 결과 48개 시료의 지 아디아 총포낭수의 평균 농도는 6.3 cysts/10 L이었고 양성율은 62.5%였으며, 속빈 포낭을 제외한 지아디아의 평균 농도는 4.5 cysts/10 L이었고 양성율은 52.1%였다. PCR 수행결과 48개 시료 중 24개(50%)의 시료에서 지아디아 람블리아가 검출되었으며, RT-PCR 수행결과 10개(21%) 시료가 살아있는 G. lamblia를 포함한 것으로 나타났다. 본 연구를 통해 PCR/RT-PCR 기법이 지아디아 포낭을 저농도로 포함하고 있는 하천수 시료에 적용가능하며 원생동물 표준시험방법을 보완하여 종(species) 및 활성에 대한 정보를 제공할 수 있을 것으로 결과되었다. The protozoan pathogen Giardia lamblia has been major cause of waterborne enteric disease. In this study, we tried to identify G. lamlbia of human infectious species and to detect viable G. lamblia in river water samples including three sites of Han River mainstream and an its creek using PCR and RT-PCR technique. The PCR/RT-PCR methods were performed by using giardin primer based on the giardin gene targeting ventral disk of Giardia. Sensitivity testing in the DNA/RNA extraction and PCR/RT-PCR amplification steps showed that it was possible to detect a single cyst of G. lamblia and viable G. lamblia. The PCR/RT-PCR methods were compared with immunofluorescence(IF) assay by analyzing 48 samples collected from the mainstream water and the creek water. The mean concentration of the total cysts were 6.3 cysts/10 L(arithmetic mean, n = 48) and the positive detection rate were 62.5%(30/48). And the mean concentration of the cysts excluding empty cysts were 4.5 cysts/10 L and the positive detection rate were 52.1%(25/48). It resulted that 24 of 48 samples included Giardia lamblia by PCR assay and 10 of 48 samples included viable G. lamblia by RT-PCR assay. It resulted that the PCR/RT-PCR technique would be available to river water samples with low concentration of Giardia cysts. And it could support the Korean protozoan standard method, which provides useful information for species and viability.

Real-time RT-PCR을 이용한 Feline Calicivirus 불활성화의 정량적 분석

정혜미,김광엽 한국식품위생안전성학회 2014 한국식품위생안전성학회지 Vol.29 No.3

본 연구에서는 FCV 현탁액에 물리, 화학적 위생처리 후 복합효소처리라는 전처리과정을 적용한 뒤 real-time RTPCR법을 이용하여 살균효능을 분석하였다. RT-PCR 이전에 37oC에서 30분 동안 PK와 RNase A를 처리함으로써 UV, 열, 염소, 에탄올, 과초산계열 제품에 의해 불활성화 된 바이러스들은 음성 결과를 나타내었고, real-time RTPCR법을 통해 살균 효능을 정량분석한 결과, 복합효소처리를 했을 경우 무처리구보다 더 높은 살균 효능을 보이는 것을 확인할 수 있었다. 이로써 Nuanualsuwan S. 등11,18,29)의 선행연구에서와 같이 PK와 RNase A로 전처리하는 단계를 통하여 물리, 화학적 위생처리에 의해 손상되지 않은 바이러스가 RT-PCR 법에 의해 증폭되는 것을 방지함으로써 Real-time PCR법 에 대한 검출 감도를 높일 수 있음을 확인하였다. 또한, FCV를 검출하기 위해 사용된 RT-PCR과 real-time RT-PCR 두 방법 중에서도 real-time RT-PCR법이 가장 신속하면서도 민감도 높은 결과로 도출되었다. 따라서, 유전자 분석 이전에 복합효소처리는 물리, 화학적 위생처리에 의해 불활성화 된 바이러스의 RNA가 transcription 또는 증폭되는 것을 방지하기 위한 수단으로 real-time RT-PCR법과 결합 됨으로써 노로바이러스를 비롯한 식중독 바이러스를 검출 하는데 효과적으로 적용될 것으로 판단된다. 또한 식품현 장에서 전기영동 과정없이 신속하게 살아있는 바이러스만을 수치적으로 정량화함으로써 식품안전에도 기여할 것으 로 사료된다. Norovirus causes acute gastroenteritis in all age groups and its food poisoning outbreaks are rapidly increasing in Korea. Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) is most widely used for the rapid detection of foodborne viruses due to high sensitivity. However, the false positive results of RT-PCR obtained against already inactivated viruses could be a serious drawbacks in food safety area. In this study, we investigated a method to yield true positive RT-PCR results only with alive viruses. To decompose the RNA genes from dead viruses, the enzymatic treatments composed of proteinse K and Ribonuclease A were applied to the sanitized and inactivated virus particles. Another aim of this study was to quantify the efficiencies of several major sanitizing treatments using realtime RT-PCR. Feline calicivirus (FCV) that belongs to the same Caliciviridae family with norovirus was used as a surrogate model for norovirus. The initial level of virus in control suspension was approximately 104 PFU/mL. Most of inactivated viruses treated with the enzymatic treatment for 30 min at 37oC were not detected in RT-PCR, Quantification results to verify the inactivation efficiencies of sanitizing treatments using real-time RT-PCR showed no false positive in most cases. We could successfully develope a numerical quantification process for the inactivated viruses after major sanitizing treatments using real-time RT-PCR. The results obtained in this study could provide a novel basis of rapid virus quantification in food safety area.

크립토스포리디움 활성 및 감염성 판정을 위한 direct RT-PCR, cell culture RT-PCR 및 cell culture IFA의 비교

박상정,유재란,김종민,임연택,진익렬,정현미,Park, Sang-Jung,Yu, Jae-Ran,Kim, Jong-Min,Rim, Yeon-Taek,Jin, Ing-Nyol,Chung, Hyen-Mi 한국생명과학회 2006 생명과학회지 Vol.16 No.5

크립토스포리디움의 활성 및 감염성 판정을 위해 Direct RT-PCR, 세포배양 후 RT-PCR 및 면역형광염색법을 비교한 결과는 다음과 같다. 1) 크립토스포리디움의 HSP70 gene에 대해 direct RT-PCR한 결과, 민감도가 매우 높아 저농도로 존재하는 환경시료에서의 크립토스포리디움 활성을 모니터링하는데 장점이 있을 것으로 보이나, 감염성의 판정은 알 수 없으며, 정량화가 안되는 단점이 있었다. 2) ${\beta}-tubulin$ gene에 대해 RT-nested PCR을 한 결과 크립 토스포리디움의 난포낭이 $1{\times}10^4$ 세포수정도 되어야 검출이 되는 것으로 나타나 HSP70 gene에 대한 RT-PCR결과와 비교할 때 10,000배 이상 민감도가 떨어지는 것으로 나타났다. 3) 세포배양 후 RT-PCR 또는 면역형광염색법을 이용할 경우에는 민감도가 direct RT-PCR보다 다소 떨어지는 단점이 있었으나 크립토스포리디움의 오염원이나 오염이 심한 지역의 감염성 조사에 적합할 것으로 나타났으나, 정량화가 필요한 경우에는 세포배양 후 면역형광염색법이 효과적일 것으로 나타났다. Cryptosporidium is a waterborne pathogenic parasite which causes diarrhea. Immunomagnetic separation-immunofluorescent assay (IMS-IFA) has been a widely adopted for Cryptosporidium detection as standard method. However, this method does not provide information about viability or infectivity of Cryptosporidium. Therefore, many researchers have studied viability or infectivity analyses of Cryptosporidium with various methods such as vital staining, in vitro excystation, RT-PCR, cell culture, and mouse infection assay. In this study, two direct RT-PCR methods, cell culture RT-PCR and cell culture IFA were compared for sensitivity and other characteristics. The results showed that direct RT-PCR method with HSP70 genes had the highest sensitivity with detection up to 1 viable cell of Cryptosporidium. The infectious Cryptosporidium were detected up to 10 to 25 cells by cell culture methods in combination with RT-PCR and IFA. The infectious Cryptosporidium were apt to be quantified by cell culture IFA.

역전사중합효소 연쇄반응-효소면역측정법을 활용한 장내바이러스 감염 진단

박귀성,백경아,정은혜,이강범,박성민,조영채,송재형,천두성,안광숙 대한진단검사의학회 2009 Annals of Laboratory Medicine Vol.29 No.6

Background : Enteroviruses are known as major pathogen for aseptic meningitis. Although rapid diagnosis for enteroviruses is very essential to exclude bacterial infections in patients with meningitis, classical diagnostic method based on virus isolation is not practicable for timely treatment of patients due to its laborious and time-consuming procedure. Recently molecular methodologies as alternatives are routinely used for rapid and sensitive diagnosis for enteroviruses infections. Methods : Reverse transcription (RT)-PCR ELISA kit for targeting 5’non-coding region (NCR) with highly conserved genetic identity among all genotypes of enteroviruses was introduced in this investigation. RT-PCR ELISA was evaluated about sensitivity and specificity through virus isolation using clinical specimens from patients suspected of enteroviral infections and enteroviral isolates comparing with conventional RT-PCR identifying them. Results : The detection limit of the RT-PCR ELISA was up to 10-100 folds higher than virus isolation using cell culture and conventional RT-PCR. On comparison between above two methods, the detection rate of RT-PCR ELISA for clinical specimens from patients with aseptic meningitis was 7% higher than that of conventional RT-PCR targeting 5’NCR (P=0.016). Conclusions : Our results suggest that RT-PCR ELISA developed in this study could be an alternative diagnostic method for the detection of enteroviral genome with high sensitivity and specificity. 배경 : 장바이러스(enterovirus)는 무균성 수막염의 주요 병 원체이다. 무균성 수막염이 의심되는 경우, 장바이러스에 대한 정확한 진단이 필수적이지만 기존의 세포배양을 통한 바이러스 의 분리법은 많은 시간과 노력이 필요하다. 그러므로 최근에는 장바이러스 진단을 위하여 신속하고 민감한 분자생물학적 방법 이 사용되고 있다. 방법 : 장바이러스의 유전자 중 잘 보존된 부분인 5’non-coding region에 대한 소식자를 이용하여 reverse transcription (RT)-PCR ELISA 키트를 제작하였다. 제작된 RT-PCR ELISA 키트는 RT-PCR법과 비교되었는데, 바이러스 분리주와 무균성 수막염이 의심되는 환자 검체에 대하여 민감도와 특이도를 측 정하였다. 결과 : RT-PCR ELISA법의 검출한계는 세포배양을 통한 바 이러스 분리법과 RT-PCR법보다 10-100배 높았으며, 또한 무 균성 수막염 환자의 임상 시료를 대상으로 한 RT-PCR ELISA 법의 검출률이 RT-PCR법 보다 7% 높게 나타났다(P=0.016). 결론 : 본 연구에서 활용된 RT-PCR ELISA법은 높은 민감 도와 특이도를 보여 장바이러스 진단법으로 이용할 것을 제안 한다.`

RT-PCR 기법을 이용한 mRNA의 정량

예성수 인제대학교 백병원 2002 仁濟醫學 Vol.23 No.2

Although steady state levels of individual RNA transcripts have traditionally been measured by northern blotting, in situ hybridization and nuclease protection assays, these techniques are limited by their sensitivity. For analysis of mRNA expression, RT-PCR is very sensitive technique. It is capable of detecting moderately expressed transcripts from a single cell. Though mainly used for qualitative studies, several modifications of this method have been developed that allow quantitative analyses to be performed. Quantification of transcription via RT-PCR can be approached using either relative RT-PCR or competitive RT-PCR strategy. Quantification by relative RT-PCR involves normalization to a housekeeping gene that is amplified within the same reaction as the target gene. Competitive RT-PCR, as the name implies, utilizes synthetic competitor RNA within the same reaction as the sample RNA. Recently the introduction of the new procedure based on fluorescence-kinetic RT-PCR enables quantification of the PCR product in real-time. The newest form of quantitative RT-PCR is termed real-time RT-PCR, as measurements are taken throughout the reaction due to oligonucleotide cleavage by DNA polymerase that release a fluorescent dye. The purpose of this review is to summarize the RT-PCR-based quantification methods of mRNA expression for useful clinical applications.

One-step RT-PCR을 이용한 Major bcr-abl mRNA 검출

강창석,이은정,유재빈,김도희,김동언,양일호,오은지,김용구,김원일 대한임상검사정도관리학회 1997 臨床檢査와 精度管理 Vol.19 No.2

정상, 낭종 및 법랑아세포종 세포에서의 유전자 발현 차이 분석

양철희,김재곤,백병주,양연미 大韓小兒齒科學會 2005 大韓小兒齒科學會誌 Vol.32 No.1

법랑아세포종은 1868년에 처음 보고된 이래 명칭, 발생기전, 분류 그리고 치료 방법 등에 관하여 수 많은 논란이 있어 왔는데 이는 법랑아세포종이 양성종양임에도 불구하고 종양자체의 진행이 파괴적이고, 외과적 처치를 한 후에도 재발이 잘되며, 흔하지는 않지만 악성종양과 유사하게 전이를 보이는 등 독특한 특성을 지니고 있기 때문이다. 정상세포와 암 세포 간에 차이를 보이는 유전자 혹은 정상세포에서 변형이 일어날 때 특이적으로 발현하는 유전자의 분리 및 분석하는 것은 암세포의 생성과정을 이해하는데 있어서 중요한 열쇠를 제공할 수 있다. 이에 본연구는 RNA differential display 방법 중 재연성과 반복성이 개선된 Ordered differential display(ODD)RT-PCR과 보다 개선된 GeneFishing™기술을 이용하여 악성과 양성종양 사이의 유전자 발현의 차이를 조사하고, 특이 유전자의 profile을 확보하고자 하였다. GeneFishing™기술과 RT-PCR을 수행한 결과 nasopharyngeal carcinoma gene을 제외한 9개의 유전자는 악성에서 특이적으로 발현되는 것을 확인하였다. 따라서 GeneFishing™을 이용하면 각 시료간의 mRNA 상에서 발현차이를 보이는 DEG를 비교 분석하면 암관련 유전자, 항생제 내성 유전자, 그리고 분화 관련 유전자들에 대한 연구가 용이하게 수행할 수 있을 것으로 생각된다. Ameloblastoma is the most commonly occurring odontogenic tumor in oral cavity. Although most are benign epithelial neoplasm, they are generally considered to be locally aggressive and destructive, exhibiting a high rate of recurrence. The biological behavior of this neoplasm is a slowly growing, locally invasive tumor without metastasis, therefore malignant neoplasm, changed its histological appearance to carcinoma or showed distant metastasis, is only defined clinically. In this study, we identified the differentially expressed genes(DEGs) in stages under benign or malignant ameloblastoma compared with normal patient using ordered differential display(ODD) reverse transcription(RT)-PCR and GeneFishing™ technology. ODD RT-PCR is rather effective when the investigation of samples containing very small amounts of total RNA must be accomplished. ODD RT-PCR used the means of amplification with anchored T-primer and adaptor specific primer, bearing definite two bases at their 3' ends and so this method could display differential 3' -expressed sequence taqs(ESTs) patterns without using full-length cDNAs. Compared with standard differential display, ODD RT-PCR is more simple and have enough sensitivity to search for molecular markers by comparing gene expression profiles. However, this method required much effort and skill to perform. GeneFishing™ modified from DD-PCR is an improved method for detecting differentially expressed genes in two or more related samples. This two step RT-PCR method uses a constant reverse primer(anchor ACP-T) to prime the RT reaction and arbitrary primer pairs(annealing control primers, ACPs) during PCR. Because of high annealing specificity of ACPs than ODD RT-PCR, the application of GeneFishing™ to DEG discovery generates reproducible, authentic, and long(100bp to 2kb) PCR products that are detectable on agarose gels. Consequently, various DEGs observed differential expression levels on agarose gels were isolated from normal, benign, and malignant tissues using these methods. The expression patterns of the some isolated DEGs through ODD RT-PCR and GeneFishing™ were confirmed by Northern blot analysis and RT-PCR. The results showed that these identified DEGs were implicated in ameloblastoma neoplasm processes. Therefore, the identified DEGs will be further studied in order to be applied in candidate selection for marker as an early diagnosis during ameloblastoma neoplasm processes.

RT-PCR을 이용하여 저장된 골수천자도말로부터 Major bcr/abl mRNA의 검출

이은엽,신정환,전은숙 대한임상병리학회 1997 대한임상병리학회지 Vol.17 No.4

RT-PCR을 이용한 수박 Cucumber Green Mottle Mosaic Virus의 효율적인 진단 및 외피단백질 유전자의 클로닝

양덕춘,이진숙,김두욱,임용표,민병훈 한국식물생명공학회 1998 식물생명공학회지 Vol.25 No.6

한국산 수박 녹반 모자이크 바이러스(CGMMV-WK)를 TR-PCR 기술에 의해서 간편하고 확실한 진단방법을 구명하고 아울러 CGMMV의 외피단백질 유전자를 클로닝 하였다. 바이러스의 추출은 Lee등 (1996)의 간이 조즙액추출법을 변형하여 정제된 핵산 추출액을 사용하여도 RT-PCR이 양호하였으며, 20 pmol의 primer, reverse transcriptase (30 unit), Rnasin (5unit)이 첨가된 PCR 반응액에서 one step reaction으로 RT-PCR이 가능하였다. CGMMV의 진단을 위한 RT-PCR 조건으로 42$^{\circ}C$에서 45분간 cDNA를 합성하고 있어서 95$^{\circ}C$ 에서 2분간 per-denaturation하고 96$^{\circ}C$ 에서 30초, 6$0^{\circ}C$ 에서 30초 그리고 72$^{\circ}C$에서 1분간으로 36 cycle을 반응을 수행함으로서 간편하고 확실하게 CGMMV를 진단할 수 있었다. 또한 추출된 CGMMV의 외피단백질의 염기서열분석 한 결과 CGMMV-W와는 98.77%, CGMMV-SH와는 99.38%의 상동성을 가지고 있었으며 아미노산 서열은 모두 100%의 상동성을 가지고 있었다. A simple and reliable method to diagnose cucumber green mottle mosaic virus of watermelon in Korea (CGMMV-WK) was determined by RT-PCR, and coat protein gene for CGMMV-WK was cloned. Comparing to a method reported by Lee et al. (1996), the method developed here showed a better RT-PCR reaction. RT-PCR was possible by one step in the PCR reaction mixture that contains 20 pmol of primer, reverse transcriptase (30 unit), RNasin (5 unit) using the crude RNA solution. RT-PCR condition for specifically diagnosing CGMMV-WK was that cDNA was synthesized at 42$^{\circ}C$ for 45 min followed by pre-denaturation at 95$^{\circ}C$ for 2 min, and then PCR reaction was carried out with a programmed condition that consisted of 36 sequential cycles at 96$^{\circ}C$ for 30 sec, 6$0^{\circ}C$ for 30 sec, and 72$^{\circ}C$ for 1 min. A gene encoding the coat protein of CGMMV-WK was cloned and characterized. Nucleotide sequence of coat protein gene of CGMMV-WK shared 98.77% and 99.38% of sequence identity with those of CGMMV-W and CGMMV-SH, respecitvely, however, all of amino acid sequences were same.

국내의 토마토 주요 바이러스 진단을 위한 역전사중합반응법용 프라이머 세트

신준성,한정헌,신유주,곽해련,최홍수,김정수,Shin, Jun-Sung,Han, Jung-Heon,Shin, Yu-Ju,Kwak, Hae-Ryun,Choi, Hong-Soo,Kim, Jeong-Soo 한국식물병리학회 2017 식물병연구 Vol.23 No.2

국내의 토마토에서 발생하는 주요 바이러스는 Tomato chlorosis virus (ToCV), Tomato spotted wilt virus (TSWV), Cucumber mosaic virus (CMV), Pepper mottle virus (PepMoV), Tomato mosaic virus (ToMV)이다. 이들 바이러스를 진단하기 위해 프라이머 세트와 반응액을 포함하는 역전사중합반응(RT-PCR)법의 조건을 조사하였다. 공시한 바이러스에 특이적인 염기서열로부터 모두 46개 프라이머 세트를 설계하고, 이를 이용해 주형을 넣지 않은 RT-PCR에서 비특이 반응을 조사하였다. 이들 가운데 16개 조합을 건전한 토마토 RNA에 적용한 결과 프라이머 세트와 RT-PCR 반응액 간의 친화성이 비특이 반응 감소에 영향을 주었다. cDNA 합성과 관련된 인자와 RT-PCR 반응액 사이의 조합을 근거로 ToCV 진단을 위한 두 종류의 반응액을 선발하였다. ToCV 진단 시 수립된 조건을 나머지 바이러스 진단에 적용했을 때, 특이성이 높은 프라이머 세트 C029 (ToCV), C072 (TSWV), C070 (CMV), C048 (PepMoV), C065 (ToMV)를 선발할 수 있었다. 이들 프라이머 세트는 공시한 바이러스를 특이적으로 진단하는 데 유용할 것으로 판단된다. Major tomato viruses in Korea are Tomato chlorosis virus (ToCV), Tomato spotted wilt virus (TSWV), Cucumber mosaic virus (CMV), Pepper mottle virus (PepMoV), and Tomato mosaic virus (ToMV). RT-PCR conditions for the viruses were examined, especially in primer set and RT-PCR mixture. Total 46 primer sets from the unique sequence of the viruses were tested for nonspecific background products in a RT-PCR mixture without template. Among them 16 primer sets were applied to healthy tomato RNA, resulting the compatibility between RT-PCR mixture and primer set influenced RT-PCR to reduce nonspecific background products. Based on the combinations among cDNA synthesis parameters and RT-PCR mixtures, two reaction mixtures were finally selected for ToCV detection. The condition allowed to determine more specific primer sets; C029 (ToCV), C072 (TSWV), C070 (CMV), C048 (PepMoV), and C065 (ToMV). These primer sets are expected to be of use to specific detection of the major viruses in tomato plants.