흰쥐 침샘의 Nitric Oxide Synthase에 관한 면역전자현미경적 연구

이영환,고정식,박대균,박경호 韓國電子顯微鏡學會 2008 Applied microscopy Vol.38 No.3

산화질소는 생물체내에서 생리적이나 병리학적으로 중요한 역할을 한다고 알려져 있으며, 특히 침샘조직에서 침분비작용과 샘혈류 조절에 중요한 인자의 하나로 관여함이 알려져 있다. 산화질소합성효소 (nitric oxide synthase, NOS)는 동위효소로서 내피산화질소합성효소 (endothelial NOS, eNOS), 신경산화질소합성 효소 (neuronal NOS, nNOS)와 유도산화질소합성효소 (inducible NOS, iNOS)가 있으며, 세포내에서 내인성산화질소를 합성한다고 알려져 있다. 그러나 산화질소합성효소의 세포내 분포에 관한 전자현미경적 연구는 매우 드물며, 흰쥐 침샘에서의 산화질소생산효소(NOS)에 대한 전자현미경적 연구는 없었다. 흰쥐 침샘에서 NOS의 세포내 분포를 규명하기 위하여 면역전자현미경방법을 이용한 금입자표지법을 시행하여 아래와 같은 결과를 얻었다. eNOS에 양성 면역반응을 보이는 구조는 침샘의 분비세포 중장액세포에 있는 전자밀도가 높은 분비과립이었으며, 점액분비세포의 점액분비과립에서는 비교적 약한 면역반응성이 관찰되었다. 즉 턱밑샘과 혀밑샘을 구성하고 있는 두 종류의 분비세포 중장액세포의 분비과립에 금입자가 비교적 많이 표지되었으며, 점액세포의 분비과립에서는 적은 수의 금입자가 관찰되었고, 침샘의 소엽속관(intralobular duct)의 전자밀도가 높은 분비과립에서도 금입자가 표지된 것이 관찰되었다. 귀밑샘에서도 장액세포의 분비과립과 소엽속관의 분비과립에 금입자가 표지되었다. nNOS의 양성 면역반응은 턱밑샘에서 점액세포의 분비과립에서만 약간의 금입자가 관찰되었으며, 턱밑샘, 혀밑샘 및 귀밑샘의 분비세포와 분비관세포에서는 iNOS에 대한 양성 면역반응이 관찰되지 않았다. 흰쥐 침샘에서 산화질소합성효소 중 eNOS는 침샘분비세포의 분비과립에 존재하며, 특히 전자밀도가 높은 장액성분비과립에 주로 분포하고 있으며, 분비관 중에서 소엽속관에도 분포하고 있는 것이 관찰되었으나, 다른 동위효소인 nNOS와 iNOS는 거의 관찰되지 않았다. 산화질소합성효소가 흰쥐 침샘분비세포의 분비과립과 소엽속관의 분비과립에 분포하고 있는 것으로 보아 침샘에서 산화질소가 침의 생산과 분비에 중요한 역할을 담당하는 것으로 생각된다. Endogenous nitric oxide (NO) has been known to regulate many physiological and pathological processes, especially the glandular secretion and blood flow. However, nitric oxide synthase (NOS) responsible for NO synthesis has not been well studied ultrastructurally in rat salivary gland. The present study was performed to investigate the distribution of nitric oxide synthase isoforms (endothelial, neuronal, and inducible NOS). Immunoelectron microscopic study, using monoclonal mouse anti-endothelial NOS, anti-neuronal NOS, and anti-inducible NOS, was performed in the salivary gland of rat. Endothelial NOS (eNOS)-positive immunoreactivities were most prominent in the secretory granules of serous cells of the salivary gland of the rat. Immunoreactivities were well concentrated on serous secretory granules in the serous cells. However, weak eNOS-positive immunoreactivity was observed in the mucous secretory granules of the mucous cells. Positive endothelial NOS (eNOS) immunoreactivities were most prominent in the secretory granules of intralobular ducts. Ductal secretory granules and acinar serous secretory granules have a similar pattern of labeling as eNOS suggestings. Neural NOS (nNOS)-positive immunoreactivity was not detected in duct systems or in acinar cells. Inducible NOS (iNOS)-positive immunoreactivity was not seen in acinar and ductal cells. These results reveal the presence of eNOS in the salivary gland of the rat, which may be related with regulation of the glandular secretion and blood flow through the gland.

자간전증 산모에서 제대정맥 혈청Nitric oxide 농도와 태아 성장지연과의 관계

차문석(Moon Seok Cha) 대한산부인과학회 1999 Obstetrics & Gynecology Science Vol.42 No.9

목적: 태아 제대정맥혈의 NO(nitric oxide) 농도를 측정하여 태아 체중과의 관계를 알아 봄으로써 NO가 태아성장에 미치는 영향에 대해 알아보고자 하였다. 연구방법: 1997년11월부터 1998년10월까지 동아대학교병원 산부인과에서 분만한 산모 중 임신 31주에서 41주사이의 자간전증 산모 21명과 임신 32주에서 38주의 쌍태 산모 20명 및 임신37주에서 41주사이의 정상 만삭 단태 산모 30명을 대상 분만 직후에 제대정맥혈을 채취하여 혈장 부분을 3000rpm에서 원심 분리하여 상층액을 검사 시기까지 영하 70℃에서 냉동 보관 하였다. 태아 제대정맥의 혈청 내 NO값은 빠르게 대사 되고 반감기가 짧은 NO를 대신하여 그 대사물인 nitrite(NO2-) 농도를 Stuehr의 방법을 사용하여 측정하였다. 결과: 자간전증 산모군에서 제대정맥의 혈청 NO(nitric oxide) 농도는 13.80±2.19 mol/L로 정상 단태 산모군의 5.63±1.21 mol/L에 비해 유의하게 높았으며 (P<0.005), 자간전증 산모군 중에서도 특히 태아발육지연를 보인 군에서 21.65±6.68 mol/L로 정상 태아발육을 보인 군의 7.35±2.04 mol/L에 비해 유의하게 높은 제대정맥 혈청 NO 농도를 보였다(P<0.005). 쌍태 산모군에서 체중이 무거운 태아군은 제대정맥의 혈청 NO 농도가 11.8±1.54 mol/L, 체중이 가벼운 태아군은 7.80±1.32 mol/L로 체중이 무거운 태아군에서 높았으나 통계학적인 유의한 차이는 보이지 않았다 (P>0.005). 쌍태 산모군의 제대정맥의 혈청 NO 농도는 8.50±1.45 mol/L로 정상 단태 산모군의 5.63±1.21 mol/L에 비해 높았으나 유의한 차이는 보이지 않았다(P>0.005). 결론: 자간전증 산모에서 태어난 신생아의 제대정맥 혈청 NO농도는 정상 산모군에 비해 유의하게 높고, 특히 태아발육지연이 있는 경우에 더욱 현저히 높게 나타나 태아성장을 위한 보상적 상승으로 보인다. Objective: To evaluate the role of nitric oxide(NO) in fetal growth. Method: We measured umbilical vein serum NO in preeclampsia by Stuehr method and evaluated the association with the fetal birth weight and compared with normal pregnancy and twin pregnancy. Results: 1. The umbilical vein serum nitrite concentration in preeclampsia was higher than that of the normal pregnancy (p<0.005). 2. Umbilical vein serum nitrite concentration of FGR(fetal growth restriction) baby group was higher than that of the non-FGR group in preeclampsia (p<0.005). 3 Umbilical vein serum nitrite concentration of larger baby group was higher than that of the smaller baby group in twin pregnancy but statistically not significant (p>0.005). 4. There were no significant differences of umbilical vein serum nitrite concentration between twin pregnancy and normal single pregnancy group (p>0.005). Conclusion: These results suggest that the increased nitric oxide production in the umbilical vein may be a compensatory response to improve blood flow and fetal growth in preeclampsia.

Analysis of Blood Flow-dependent Blood Nitric Oxide Level and Half-life of Nitric Oxide in Vivo

Kim Cuk-Seong,Kim Hyo-Shin,Lee Young-Jun,Park Jin Bory,Ryoo Sung-Woo,Chang Seok-Jang,Jeon Byeong-Hwa Biomedical Engineering Society for Circulation 2003 International Journal of Vascular Biomedical Engin Vol.1 No.2

Endothelial release of nitric oxide (NO) contributes to the regulation of vascular tone by inducing vascular relaxation. To estimate the blood flow-dependent nitric oxide level and half-life (T1/2) of nitric oxide in vivo state, we investigated the change of aortic NO currents during the change of aortic blood flow rate using NO-selective electrode system and electromagnetic flowmeter in the aorta of anesthetized rats. Resting mean aortic blood flow rate was $49.6{\pm}5.6ml/min$ in the anesthetized rats. NO currents in the aorta were increased by the elevation of blood pressure and/or blood flow rate. When the aortic blood flow was occluded by the clamping, aortic NO currents were decreased. The difference of NO concentration between resting state and occluded state was $1.34{\pm}0.26{\mu}M$ (n=7). This NO concentration was estimated as blood flow-dependent nitric oxide concentration in the rats. Also, while the aortic blood flow was occluded, NO currents were decreased with exponential pattern with $12.84{\pm}2.15$ seconds of time constant and $7.70{\pm}1.07$ seconds of half-life. To summarize, this study suggested that blood flow-dependent NO concentration and half-life of nitric oxide were about $1.3{\mu}M$ and 7.7 seconds, respectively, in the aorta of anesthetized rats. The nitric oxide-selective electrode system is useful for the direct and continuous measurement of NO in vivo state.

백서의 실험적 치아이동식 Nitric Oxide Synthetase의 발현 양상

박동권,김상철 대한치과교정학회 2001 대한치과교정학회지 Vol.31 No.1

반응 질소 중간 대사를 중의 하나인 nitric oxide(NO)는 작고 불안정하며 전하가 없는 free radical이며 신체의 여러 종류 세포에서 분비되어 대부분의 조직 세포에 영향을 미친다. 또한 NO는 lipopolysaccharide나 cytokines등의 자극으로 골모세포로부터 생산되어 파골세포의 활성을 강력하게 억제한다는 보고도 있다. 이러한 NO는 L-arguinine으로 부터 nitric oxide synthetase(NOS)에 의해 합성된다. 골개조에 의해 이루어지는 생체 내 치아이동 및 그에 따른 치주조직 변화에서 NO및 NOS가 중요한 역할을 할 것으로 생각되나 교정적 치아이동에서 치주인대의 재생 과정과 관련되어 이들의 역할이 밝혀진 것이 드물었다. 본 연구에서는 견인력에 의한 치아이동시 시간 경과에 따른 NOS의 발현 정도 및 분포 변화를 알아보고자, Sprague-Dawley계 백서 27마리를 대조군(3마리)과 실험군(24마리)으로 나누었으며, 실험군은 견인력(75g)을 가한 후 12시간, 1일, 4일, 7일, 14일, 28일이 경과한 후 각각 4마리씩 희생시켜, NOS3와 NOS2의 발현 정도 및 분포를 면역조직화학적으로 관찰한 바 다음과 같은 결과를 얻었다. 1.대조군의 NOS3 발현은 치은과 상아질, 치주인대, 치조골에서 경미하였지만 치수, 악간 봉합에서는 약양성의 발현을 보였으며, NOS2의 경우와 유사하였다. 2.실험군의 상아질, 치은, 백악질, 백악모세포, 상아모세포에서의 NOS2 및 NOS3의 발현은 견인력 적용 기간에 관계없이 대조군과 큰 차이가 없이 경미하거나 약양성이었다. 3.치주인대에서의 NOS3의 발현은 실험 4일째부터 치근단에서 증가되어 7일째에 압박측을 중심으로 증가한 이후 감소되었다. 4.치조골에서의 NOS3는 실험 7일째까지 경미한 발현을 보이다가 14일째부터 28일째까지 약양성으로 발현 증가를 보였으며 압박 및 견인측 간의 차이는 없었다. 5.치주인대에서의 NOS2는 압박측과 견인측 간의 차이 없이 실험 7일째 이후에 대조군보다 증가된 약양성의 발현을 보였으며 NOS3의 발현에 비해 상대적으로 많았다. 6.치조골에서의 NOS2의 발현은 14일째에 가장 크게 증가하여 골모세포, 파골세포, 골세포 모두에서 발현되었으며 압박측보다 견인측 치조골의 골세포에서 약간 많았다. Nitric oxide(NO) has been reported to be one of the mediators relating to bone remodelling. Nitric oxide is synthesized from L-arguinine by nitric oxide synthetase(NOS), which is largely divided into two groups. One group which is composed of NOS1 and NOS3, is dependent of calcium or calmodulin. The other consisted of NOS2, which is independent of calcium or calmodulin. NOS is thought to be a possible intermediate affecting in the course of tooth movement. This study was designed to evaluate the expression of nitrous oxide synthetase(NOS) in periodontal tissue during the experimental movement of rat incisors, by LSAB(labelled streptavidine biotin) immunohistochemical staining for NOS2 and NOS3. Twenty seven Sprague-Dawley rats were divided into a control group(3 rats), and 6 experimental groups(24 rats), to which 75g of force was applied, with helical springs across the maxillary incisors. Rats of experimental groups were sacrificed at 12 hours, 1, 4, 7, 14 and 28 days after force application, respectively. After that, the tissues of the control group and experimental groups were studied immunohistochemically. The results were as follows: 1.In control group, the expression of NOS3 was rare in gingiva, dentin, periodontal ligament and alveolar bone, and was mild in the capillaries of pulp and intermaxillary suture. And the expression of NOS2 showed similar pattern to that of NOS3. 2.There were no differences in the expression of NOS2 or NOS3 in dentin, gingiva, cementum, cementoblast and odontoblast, between control and experimental groups, regardless of the duration of the force application. 3.The expression of NOS3 began to increase at 4 days and showed to the highest degree at 7 days after force application, in the apical region of pressure side of periodontal ligament in experimental groups. 4.The expression of NOS3 in alveolar bone was rare until 7 days, after which it increased to mild degree at 14 days through 28 days in experimental group. But there was no difference between pressure and tension side of periodontal ligament. 5.The expression of NOS2 in periodontal ligament was mild from 7 days after force application, regardless of the side of periodontium, which was generally more evident than that of NOS3. 6.The expression of NOS2 in alveolar bone increased to mild degree at 14 days after force application, and it was evident in osteoblasts, osteoclasts and osteocytes. And the expression of NOS2 was little more stronger in the tension side than that of pressure side of alveolar bone.

흰쥐 눈물샘 및 침샘에서 산화질소합성효소 (Nitric Oxide Synthase)에 대한 면역조직화학적 연구

박경호,표창해,고정식,안의태 대한해부학회 2003 Anatomy & Cell Biology Vol.36 No.6

혈청이 마우스 간 세포주 BNL CL.2의 Nitric Oxide 생성에 미치는 영향

김유현(Yoo-Hyun Kim),김신무(Shin-Moo Kim),배현옥(Hyun-Ok Pae),유지창(Ji-Chang Yoo),정헌택(Hun-Taeg Chung),진효상(Hyo-Sang Jin) 대한의생명과학회 1999 Biomedical Science Letters Vol.5 No.1

마우스 간 세포주인 BNL CL.2의 시험관내 배양에서 혈청과 IFN-γ가 세포주의 nitric oxide (NO) 생성과 세포 손상에 미치는 영향을 알아보기 위한 실험을 하였다. 혈청이 공급된 배양에서 IFN-γ에 의한 세포 생존율은 거의 변동이 없었으나, 혈청을 제거한 배양에서는 약 65%의 생존율이 유지되었으며, NO 생성 억제제인 NG-monomethy-L-arginine (NMA)의 첨가는 농도 의존적으로 세포의 생존율을 감소시켰다. 혈청이 제거된 BNL CL.2 세포주는 IFN-γ 단독 처리에서도 NO를 생성할 수 있었으며, IFN-γ와 lipopolysaccharide (LPS)의 복합 처리는 세포주의 NO 생성을 상승적으로 증가시켰다. 또한 protein tyrosine kinase (PTK) inhibitor인 herbimycin A와 genistein에 의해서 NO 생성이 억제되어 PTK의 활성이 혈청이 고갈된 BNL CL.2 세포에서 NO의 생성에 중요한 역할을 담당하고 있기 때문으로 판단된다. IFN-γ의 독성은 혈청을 제거시킬 때 NO 생성 억제제에 상승적으로 간 세포를 손상시키며, 이때 NO가 IFN-γ에 의해 유도된 손상을 어느 정도 억제시키는 것을 알 수 있었다. Nitric oxide (NO) plays an important role in immunologic defense, and influences upon the functioning of secretory tissues and cells. It also exhibits cytotoxic/cytostatic activity as one of major operating effectors of the cellular immunity system. We investigated the effects of serum on the cell damages and NO production in the mouse liver cell line BNL CL.2 to establish the role of NO. We observed that, when BNL CL.2 cells were cultured in serum-free medium, they were induced to cell damage by the stimulation of IFN-γ alone or IFN-γ plus LPS. Serum-starved cells showed large amount of nitrite accumulation and NO synthase (NOS) expression in response to INF-γ alone in dose- and time- dependent manners, but serum-supplied cells did not. The production of NO was blocked by protein tyrosine kinase (PTK) inhibitors, genistein and herbimycin. These results suggest that the deprivation of serum in the BNL CL.2 cell culture medium might primed with the cells to produce NO when the cells are triggered by IFN-γ and the involvement of PTK signal transduction pathway in the expression of NOS gene in murine hepatocytes.

심장근육모세포에서 Nitric Oxide 세포독성에 관한 Calcium의 역할

이병호,정경민,안병관,문연자,오재민,김정중,최민규,박승택,정연태 대한해부학회 2000 Anatomy & Cell Biology Vol.33 No.5

노화된 흰쥐 대뇌겉질에서 NOS신경세포의 분포에 관한 면역세포화학적 연구

정윤희,신정민,이왕재,황덕호,이병란,조사선,백상호,차중익 대한해부학회 1999 Anatomy & Cell Biology Vol.32 No.4

실험적 각막 상피세포 제거시 발생한 Nitric Oxide

주명진,이도형,조혜진,이광주 인제대학교 1998 仁濟醫學 Vol.19 No.2

Nitric Oxide(NO)는 작고 비교적 불안정하고 독성이 있는 무기 가스로 L-arginine이 NO Synthase(NOS)에 의해 L-citrulline으로 전환될 때 생성되는 자유기이며 저농도에서는 생리적 기능을 하지만 고농도에서는 세포 독성을 일으킨다고 알려져 있다. 저자들은 상피세포에 손상을 주면 전반부 각막 간질세포에 세포사가 일어나는데, 이때 각막 간질세포의 세포사에 NO가 매개할 수 있다는 가정하에 실험적 각막 상피를 제거하였다. 실험결과 각막이 기계적으로 손상된 후 NO가 과다하게 생성되었고, NO 형성의 근원인 NOS 중에서 세포 독성이 강한 iNOS가 발현되는 것을 증명할 수 있었다. 따라서 각막 상피세포가 손상을 받았을 때 일어나는 각막 실질세포의 세포사 발생 기전에, 즉 각막 상피-각막 간질 상호 관계(epithelial-stromal interaction)에 NO가 매개할 수 있음을 시사한다고 할 수 있겠다. Apoptosis of the anterior stromal keratocytes has been demonstrated after corneal epithelial scraping wound. Nitric oxide(NO) is not only known to act as a neurotransmitter, but also act as a cytotoxic mediator when overproduced. Therefore, in this study, in order to detect the production of NO which may mediate the loss of keratocytes following epithelial injury, mechanical epithelial scraping in the rabbit eye was done. According to the time table, tear samples were collected with microcapillary tubes. NO production was assessed by measuring concentration of nitrite and nitrate. Immunohistochemical localization was performed on frozen sections from cryopreserved rat eyeball tissue using a polyclonal antibody against nitric oxide synthase(NOS). NO synthesis was increased after mechanical scraping, and reached a maximum value(0.60±0.09 μM/㎍ protein) at 12 hours after the treatment. There were statistically significant increases until 48hours postoperatively. Immunohistochemical staining of cornea showed that inducible and constitutive NOS were expressed in corneal stromal fibroblasts. These results suggest that mechanical scraping may induce NOS expression in cornea and NO produced by this enzyme may play an important role in mediating the stromal apoptosis after the removal of corneal epithelium.

노화된 흰쥐 대뇌겉질에서 NOS 신경세포의 분포에 관한 면역세포화학적 연구

정윤희(Yoon Hee Chung),신정민(Chung Min Shin),이왕재(Wang Jae Lee),황덕호(Douk Ho Hwang),이병란(Byung Lan Lee),조사선(Sa Sun Cho),백상호(Sang Ho Baik),차중익(Choong Ik Cha) 대한해부학회 1999 Anatomy & Cell Biology Vol.32 No.4

Nitric oxide (NO)는 생체 내에서 수많은 생리과정에 관여하며 특히 중추신경계통에서는 신경전달물질로서 synaptic plasticity와 밀접한 관련이 있다고 알려졌다. 노화 흰쥐에서는 NO의 생성이 감소했음을 시사하는 연구들이 있지만 NO를 생성하는 세포의 노화에 따르는 형태학적 연구는 미흡한 상태이다. 본 연구에서는 노화군 흰쥐와 대조군 흰쥐의 대뇌겉질 및 해마의 각 영역에서 nitric oxide synthase (NOS) 신경세포의 분포와 형태 양상을 면역세포화학 방법과 in situ hybridization 방법을 이용하여 조사하였는데 다음과 같은 결과를 얻었다. 1. 대조군 흰쥐와 노화군 흰쥐에서 NOS 신경세포들은 대뇌겉질 및 해마의 전 영역에 고르게 분포되어 있었다. 2. 노화군 흰쥐에서 NOS 신경세포의 가지돌기는 가지치기 양상이 많이 감소했으며 길이도 짧아졌다. 3. 노화군 흰쥐에서 NOS 신경세포의 수가 유의하게 감소되어 있었는데 부위별로 달랐다. 그 중 50% 이상 감소된 부위는 띠겉질 (cingulate cortex), 마루엽겉질 1영역 (parietal cortex area 1), 관자엽겉질 2, 3영역 (temporal cortex area 2, 3), 뒤통수엽겉질 2영역의 내측 부분 (medial part of occipital cortex area 2), 뒤통수엽겉질 1영역의 monocular와 binocular 부분 (monocular and binocular of occipital cortex area 1), 속후각겉질 (entorhinal cortex), 해마 (hippocampus proper), 치아이랑 (dentate gyrus), subiculum 등이다. 4. 노화군 흰쥐에서 NOS 신경세포는 대조군보다 염색성이 감소되었다. 5. In situ hybridization 방법에 의하면 노화군 흰쥐에서 NOS mRNA 양성세포의 수가 대조군 흰쥐보다 감소하였다. 이상의 소견으로 미루어 볼 때 노화에 따라 NOS 신경세포 수는 감소한다는 형태학적 증거를 파악하였고 이에 따라 NO 의 생성도 감소함으로써 학습과 기억 능력의 감퇴가 수반되는 노화의 한 현상을 설명할 수 있는 일부 원인이 될 수 있으리라고 추정된다. Nitric oxide (NO) involvement has been demonstrated in mechanisms of synaptic plasticity, particularly in hippocampal long-term potentiation, a mechanism that underlies certain forms of learning and memory. Further, NO has been shown to regulate various neurotransmitters which play an important role in learning and memory. Several findings suggest that NO production may be decreased in the aged rat. Changes in the nNOS-containing neurons with aging were demonstrated by immunocytochemistry and in situ hybridization. NOS-immunoreactive cells in aged rats were present in all cortical areas and the hippocampus, and the pattern of distribution was similar to that of the control group. The number of NOS-immunoreactive cells in the cerebral cortex was significantly decreased in the aged rats, but the extent of changes was variable in each area, and ranged from mild decrease (<30%) to severe decrease (>50%). Severely decreased areas were the cingulate cortex, parietal cortex area 1, temporal cortex area 1, 2, 3, medial part of occipital cortex area 2, monocular and binocular part of occipital cortex area 1, entorhinal cortex, hippocampus proper, dentate gyrus and subiculum. Moderately decreased areas (30~50%) were frontal cortex area 1, 2, 3, parietal cortex area 2, forelimb, hindlimb, lateral part of occipital cortex area 2. Slightly decreased area was insular cortex. Morphologically, the number of dendritic branches seemed to be decreased in aged group and the length of dendrites of NOS-IR neurons showed a tendency to shorten. These results indicate the involvement of neuronal system containing NOS in the aging brain, and provide the first morphological evidence for the loss of NOS neurons in the cerebral cortex of the aged rats by immunocytochemistry. Further multidisciplinary investigations involving normal aging and neurodegenerative disease such as Alzheimer’s disease are needed to clarify the importance of nitric oxide changes in the cerebral cortex with aging.