면양을 이용한 돼지 지방제포 원형질막 단백질 특이 항체의 생산

최창본(Chang-Bon Choi),이명진(Myoung-Jin Lee),권은진(Eun-Jin Kwon) 대한의생명과학회 1998 Biomedical Science Letters Vol.4 No.1

본 연구는 돼지 지방세포 원형질막 단백질에 대한 항체를 면양에서 생산하고 생산된 항체의 역가 및 조직특이성을 조사하기 위하여 실시되었다. 지방세포, 뇌, 심장, 신장, 간장 및 비장으로부터 원형질막 단백질을 추출하였으며, 그중 지방세포로부터 분리한 원형질막 단백질을 면양 (체중 40㎏)에 3주 간격으로 3회 면역접종시켰다. 면역접종 전,3차 면역접종 후 10일 (AS-1), 12일 (AS-2) 및 14일 (AS-3)째에 각각 면양의 경정맥으로부터 혈액을 채취하여 혈청을 분리하였다. 항체의 역가 및 기타 조직과의 교차반응성은 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)로 측정하였다. 면양에서 생산된 돼지 지방세포 원형질막 단백질에 대한 항혈청은 지방세포 원형질막 단백질과 강한 항원-항체 반응을 나타내었다. 항혈청의 교차반응성을 조사한 결과, 기타 조직의 원형질막 단백질과는 매우 미약한 반응을 나타낸 반면 지방세포 원형질막 단백질과는 강한 반응을 나타내었다. 이러한 항혈청의 지방세포 원형질막 단백질과의 조직특이적인 반응은 anti-sheep immunoglobulin G-horseradish peroxidase conjugate를 2차 항체로 이용한 immunoblot에 의해서도 재확인 되었다. 이상의 결과, 면양으로부터 생산된 돼지 지방세포 원형질막 단백질에 대한 항체는 높은 역가를 지니고 있었으며, 지방세포 원형질막 단백질에 특이적으로 작용함을 알 수 있었다. The objectives of this study were to produce polyclonal antibody to adipocyte plasma membrane (APM) proteins isolated from pig, and to investigate its tissue specificity. Plasma membrane proteins from adipocyte, brain, heart, kidney, liver and spleen were isolated using a self-forming Percoll gradient. Sheep (40㎏) was immunized three times at three week interval with the purified APM proteins. Blood was taken from non-immunized sheep (NS) and from immunized sheep at 10 (AS-1), 12 (AS-2), and 14 (AS-3) days after the third immunization. Antisera titers and cross-reactivity against other tissues were determined by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Antisera reacted strongly to APM proteins showing detectable amounts of antibody at 1:81,000 dilution. And antisera showed much stronger reactivity to APM proteins than any other tissue plasma membrane proteins. Furthermore, tissue specificity of antisera against APM was reconfirmed by immunoblotting using anti-sheep immunoglobulin G-horseradish peroxidase conjugate as a secondary antibody. Antisera to APM proteins showed adipocyte specificity compared with other tissues. In conclusion, polyclonal antibody against APM proteins isolated from pig was developed successfully in our laboratory, and these antisera showed tissue specificity with APM.

Evidences that Suggest the Spread of Multiple-Antibiotic-Resistance (mar) Operon of Escherichia coli Mutants among Gram-Negative Bacilli

Byung-Tae Park(박병태) 대한의생명과학회 1999 Biomedical Science Letters Vol.5 No.1

Mar (multiple-antibiotic-resistance) 대장균의 marRAB 돌연변이가 그람음성 세균들 사이로 전파될 수 있는지를 알아보기 위해서, 염색체 위의 marRAB 돌연변이를 λplacMu9 (Km<SUP>r</SUP>)를 이용하여 대장균의 다른 균주내의 pUC19 (Lac?, Ap<SUP>r</SUP>)의 클로닝 사이트, S. typhimurium 및 P. aeruginosa의 염색체 위로 각각 전달시킨 후, Mar phenotype, Km<SUP>r</SUP>, Lac?, 혹은 Ap<SUP>r</SUP> 균주를 선택한 다음, salicylate (SAL)의 유도 (induction) 유무에 따른 항생제 내성검사를 실시하였다. pUC19의 보유 유무에 관계없이 대조군인 야생형 대장균 JM109, NM522에 비해서, pUC19::marRAB 돌연변이를 가진 JM109 혹은 NM522의 대부분 균주들은 항생제 내성 수준들이 훨씬 더 높았으며, Mar 표현형의 유도도 SAL에 의해서 훨씬 더 높게 나타났다. 하지만 일부 소수의 항생제에 대해서는 예외적으로 내성 수준이 더 낮게 나타났는데, 야생형 JM109 균주에서는 chloramphenicol (Cm)과 tetracycline (Tc)이, pUC19::marRAB 돌연변이를 가진 NM522 균주에서는 Tc와 ciprofloxacin (Cp)에 대한 내성 수준이 각각 더 낮게 나타났다. S. typhimurium 및 P. aeruginosa에 대한 같은 실험의 결과도 야생형 대장균의 경우와 거의 대부분 일치하였다. 형질전환 (transformation)과 형질도입 (transduction)의 방법을 주로 사용한 이 실험의 결과는, marRAB 돌연변이가 그람음성 세균들 사이로 전파될 수 있음을 간접적으로 암시한다. To evaluate the spreading possibilities of the marRAB mutation of E. coli Mar mutant among gram-negative bacilli, chromosomal marRAB mutations of Mar mutants were transduced by λplacMu9 into pUC19 (Lac?, Ap<SUP>r</SUP>) cloning site in another strains of E. coli or onto the chrmosome of S. typhimurium and P. aeruginosa, selected for transduction by Mar phenotype, Lac?, or Ap<SUP>r</SUP>, and tested for their antimicrobial resistance with or without addition of salicylate (SAL). Compared with wild type strains of JM109, NM522, harboring pUC19 or not, respectively, all strains of JM109 or NM522 carrying pUC19::marRAB mutation showed higher levels of antimicrobial resistance and SAL induction of Mar phenotype than those of wild type. However, in contrast to the original Mar mutants, there were some tendencies of decreased antimicrobial resistance of JM109 or NM522 harboring pUC19::marRAB mutation with SAL induction against chloramphenicol (Cm) and tetracycline (Tc), or Tc and ciprofloxacin (Cp), respectively. Almost the same results, as shown as the cases of E. coli JM109 or NM522, were obtained from all transductants of S. typhimurium and P. aeruginosa, except Cp, against which increased antimicrobial resistance with SAL induction was shown. This study, employed the methods of transformation or transduction among intercellular gene transfer methods between gram-negative bacteria, shows the evidences that suggest indirectly the spreading possibilities of marRAB mutation among gram-negative bacilli.

간흡충: 충체 및 대사성 항원의 특성분석

양용석(Yong-Suk Ryang),류장근(Jang-Keun Ryu),주난영(Nan-Young Ju),송강원(Kang-Won Song) 대한의생명과학회 1996 Biomedical Science Letters Vol.2 No.2

저자들은 마우스를 실험모델로 하여 간흡충의 항원을 투여 했을 때 비장조직에 대한 CD3, CD4 및 CD8 모노클로날 항체의 반응 여부를 알아보고자 하였다. 즉, 간흡충에 대한 세포면역학적인 특성을 규명고자 하였으며 특히 비장 조직에 대한 phenotype을 관찰한 결과 다음과 같은 결과를 얻었다. 간흡충의 조항원을 면역증강제와 함께 복강 투여한 다음 일정 기간 후에 비장조직을 Avidin-biotin complex 면역조직염색을 실시한 결과 CD3에서 강한 양성 반응을 나타냈고 CD4와 CD8에서는 약한 반응을 나타냈다. 조직부위를 보면 피막, 혈관, 임파관, 백수부위와 림프구 및 대식세포의 세포막에서 양성반응을 보였다. The authors inquired into what reactions comprise the response of mice(as a model) CD3, CD4 and CD8 monoclonal antibodies in spleen tissue when injected intraperitoneally by antigens of Clonorchis sinensis. The author is objective was focused on investigating the property of cellular immunity for liver fluke. In particular, the results of having examined the phenotype of the tissue of spleen were revealed as follows: a certain length of time after having been intraperitoneally injected with antigens of Clonorchis sinensis and Freund's adjuvant, the tissue of spleen was embedded and immunohistochemically stained by the avidin-biotin complex method. A strong reaction in response to CD3, while a feeble reaction resulted from CD4 and CD8. The tissue region showed a positive reaction to all antibodies, especially from capsules, vascular areas, white pulps and membrane of blood cells.

대한의생명과학회 투고논문에 대한 점검사항 외

편집부(편집자) 대한의생명과학회 2000 Biomedical Science Letters Vol.6 No.1

신증후출혈열 환자의 혈청학적 및 분자생물학적 진단 검사법 비교

우영대(Young-Dae Woo),문희주(Hi-Joo Moon),배형준(Hyung-Joon Bae) 대한의생명과학회 2000 Biomedical Science Letters Vol.6 No.2

우리 나라에서 발생하고 있는 급성 출혈성 질환인 신증후출혈열의 원인 바이러스는 Family Bunyaviridae의 Genus Hantavirus에 속하는 한탄과 서울바이러스에 의하여 발생되고 있다. 본 연구에서는 신증후출혈열로 의뢰된 환자에서 한탄바이러스에 대한 항체가를 간접면역형광항체법 (indirect immunofluorescent antibody technique, IFAT), 면 역효소측정법 (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) (IgG, IgM), 고비중입자응집반응 (high density composite particle agglutination, HDPA) 및 플라크감소중화시험 (plaque reduction neutralization test, PRNT) 등으로 비교 측정하였고, 신증후출혈열 환자로 확진된 15명의 한타바이러스 혈청형을 PRNT와 혈청형 특이 역전사 효소 중합효소연쇄반응 (nested reverse transcriptase polymerase chain reaction, nested RT-PCR)으로 확인하였다. 신증후출혈열로 의뢰된 환자에서의 한탄바이러스에 대한 IFAT, ELISA (IgG, IgM), HDPA 그리 고 PRNT 비교에서 형광항체, ELISA IgG, 응집항체 및 중화항체는 8명 모두 높게 나타났으며, ELISA IgM은 5명에서는 현저히 높은 항체를 보유하고 있었다. 신증후출혈열 환자 15명에서는 높은 형광항체와 중화항체 역가를 나타내었고, 15명 중 12명은 한탄바이러스, 2명은 서울바이러스에 대한 높은 중화항체를 갖고 있었으며, 1명은 두 바이러스에 대하여 통일한 항체 역가를 나타내었으며, 혈청형 특이 primer를 사용한 nested RT-PCR에서는 15명 중 3명과 1명만이 한탄바이러스와 서울바이러스 primer에 대해 RNA가 검출되었다. The etiologic agents of haemorrhagic fever with renal syndrome (HFRS) in Korea are Hantaan and Seoul virus in the genus Hantavirus, family Bunyaviridae. Antibody titers of sera from HFRS patients against Hantaan virus were measured by immunofluorescent antibody technique (IFAT), enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), high density composite particle agglutination (HDPA) and plaque reduction neutralization test (PRNT). PRNT and nested reverse transcriptase polymerase chain reaction (nested RT-PCR) was used for serotypic differentiation of Hantaviruses against Hantaan and Seoul virus. Eight doubtful HFRS patients showed higher fluorescent, IgG ELISA, agglutination and neutralizing antibody titer by IFAT, ELISA IgG, HDPA and PRNT, respectively. Five out of them showed high IgM antibody titer by IgM capture ELISA against Hantaan virus, remarkably. Fifteen HFRS patients showed higher fluorescent antibody titer by IFAT. In PRNT, 12 out of them showed high neutralizing antibody titer aginst HTNV, 2 against SEOV and 1 against both viruses. In nested RT-PCR using serotype specific-primer, 3 out of them showed positive against HTNV and 1 against SEOV.

신증후출혈열 환자의 혈청학적 및 분자생물학적 진단 검사법 비교

우영대,문희주,배형준 대한의생명과학회 2000 Journal of biomedical laboratory sciences Vol.6 No.2

우리나라에서 발생하고 있는 급성 출혈성 질환인 신증후출혈열의 원인 바이러스는 Family Bunyaviridae의 Genus Hantavirus에 속하는 한탄과 서울바이러스에 의하여 발생되고 있다. 본연구에서는 신증후출혈열로 의뢰된 환자에서 한탄바이러스에 대한 항체가를 간접면역형광항체법(indirect immunofluorescent antibody technique, IFAT), 면역효소측정법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) (IgG, IgM), 고비중입자응집반응(high density composite particle agglutination, HDPA) 및 플라크감소중화시험(plaque reduction neutrafization test, PRNT)등으로 비교 측정하였고, 신증후출혈열환자로 확진된 15명의 한타바이러스 혈청형을 PRNT와 혈청형 특이 역전사 효소 중합효소연쇄반응(nested reverse transcriptase polymerase chain reaction, nested RT-PCR)으로 확인하였다. 신증후출혈열로 의뢰된 환자에서의 한탄바이러스에 대한 IFAT, ELISA(IgG,IgM),HDPA 그리고 PRNT 비교에서 형광항체, ELISA IgG, 응집항체 및 중화항체는 8명 모두 높게 나타났으며, ELISA IgM은 5명에서는 현저히 높은 항체를 보유하고 있었다. 신증후출혈열 환자 15명에서는 높은 형광항체와 중화항체 역가를 나타내었고, 15명 중 12명은 한탄바이러스, 2명은 서울바이러스에 대한 높은 중화항체를 갖고 있었으며, 1명은 두 바이러스에 대하여 동일한 항체 역가를 나타내었으며, 혈청형 특이 primer를 사용한 nested RT-PCR에서는 15명 중 3명과 1명만이 한탄바이러스와 서울바이러스 primer에 대해 RNA가 검출되었다. The etiologic agents of haemorrhagic fever with renal syndrome(HFRS) in Korea are Hantaan and Seoul virus in the genus Hantavirus, family Bunyaviridae. Antibody titers of sera from HFRS patients against Hantaan virus were measured by immunofluorescent antibody technique(IFAT), enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), high density composite particle agglutination (HDPA) and plaque reduction neutralization test (PRNT). PRNT and nested reverse transcriptase polymerase chain reaction (nested RT-PCR) was used for serotypic differentiation of Hantaviruses against Hantaan and Seoul virus. Eight doubtful HFRS patients showed higher fluorescent, IgG ELISA, agglutination and neutralizing antibody titer by IFAT, ELISA IgG, HDPA and PRNT, respectively. Five out of them showed high IgM antibody titer by IgM capture ELISA against Hantaan virus, remarkably. Fifteen HFRS patients showed higher fluorescent antibody titer by IFAT. In PRNT, 12 out of them showed high neutralizing antibody titer aginst HTNV, 2 against SEOV and 1 against both viruses. In nested RT-PCR using serotype specific-primer, 3 out of them showed positive against HTNV and 1 against SEOV.

열성질환 환자에서 라임병균 Borrelia burhdorferi 감염증 진단을 위한 혈청학적인 분석

김영미(Young-Mi Kim),김종배(Jong-Bae Kim) 대한의생명과학회 1997 Biomedical Science Letters Vol.3 No.2

현재 라임병을 진단을 위해 국내에서 이루어지고 있는 연구 방법은 원인균인 B. burgdorferi 항원에 대한 항체를 검출하는 혈청학적인 방법이다. 하지만 대부분의 경우 항원으로 사용되는 균주가 다른 나라에서 분양받은 균주이므로 이때 얻어진 결과를 유추해석하는데 어려움이 수반되고 있다. 본 실험에서는 국내 분리균주에 대한 항체를 검출하는 조건을 확립하고, 이를 토대로 하여 불명열 환자의 항체가 항원에 반응하는 양상을 파악함으로써 국내 분리균주를 이용한 혈청 학적인 분석방법으로 국내 라임병 진단에 보다 적합한 조건을 제시하고자 하였다. 본 실험 결과 병원에 의뢰된 불명열 환자의 혈청이 B. burgdorferi sensu lato 중 3가지 균종의 항원에 대해 평균 약 8% 정도의 양성반응을 보이는 것으로 미루어볼 때 이들 중 B. burgdorferi에 의한 열성질환 감염증이 존재할 것으로 사료된다. 특히 국내 분리균주 중 가장 많이 분리된 바 있는 B. afzelii에 대한 양성 반응이 14.3%나 나타난 것으로 미루어 아직 밝혀지지 않은 국내 발생 라임병의 원인균은 주로 B. afzelii일 가능성이 가장 크다고 할 수 있을 것이다. 또한 효소결합면역 측정법 (ELISA)을 이용하여 양성으로 판별된 혈청에 대해 immunoblotting법을 실시한 결과 주로 41kDa (flagellin), 27kDa, 31kDa (OspA), 34kDa (OspB)에서 band가 나타났다. 본 실험의 결과 국내 열성질환 환자들 중 라임병균에 의한 감염증이 있을 것으로 사료되므로 국내 분리균주를 항원으로 사용한 효소결합면역 측정법 (ELISA), immunoblotting법과 같은 혈청학적진단이 이루어져야 한다고 사료된다. Currently, the laboratory diagnosis for lyme disease have been performed with the detection of antibodies against Borrelia burgdorferi. However there might be some difficulties in the interpretation of obtained results due to the usage of foreign isolates as an antigen in the test. Therefore the optimization of serological tests with Korean isolates of B. burgdorferi as an antigen would be needed to establish the standardized diagnostic method for the detection of antibodies against B. burgdorferi infection. In this study, the optimization of ELISA was investigated with experimentally challenged rabbit sera and sonicated B. burgdorferi antigens of Korean isolates. Of 217 human patient's sera with unknown fever, the mean seropositivities in ELISA, done under the optimized conditions obtained in this study, were found to be about 8% against B. burgdorferi sensu lato, showing the highest seropositivity of 14.3% against B. afzelii. In immunoblotting assay with ELISA-positive human sera, the major reactive bands were 41kDa (flagellin) which might be the indication of early infection, and 27kDa, 31kDa (OspA), 34kDa (OspB) which are the characteristics of late infection. Obtained results in this study might strongly indicate the possibility of B. burgdorferi infections in Korea.

대한생명과학회 투고논문에 대한 점검사항 외

편집부(편집자) 대한의생명과학회 2000 Biomedical Science Letters Vol.6 No.2

대한의생명과학회 투고논문에 대한 점검사항 외

편집부(편집자) 대한의생명과학회 2000 Biomedical Science Letters Vol.6 No.4

핵 내에서 분리한 Mitogen-Activated Protein (MAP) Kinase의 Transcription Factor에 대한 인산화

김윤석(Yoon-Suk Kim),김소영(So-Young Kim),김태우(Tae-Ue Kim) 대한의생명과학회 1996 Biomedical Science Letters Vol.2 No.2

모든 진핵세포에 존재하며 세포의 성장 및 분화에 주로 관계되는 신호전달물질의 하나인 Mitogen-activated protein(MAP) kinase의 mitogen에 의한 핵내 활성화와 기질 인산화에 대해 알아보기 위해 본 실험을 수행하였다. P388 세포를 10% fetal bovine serum이 첨가된 DMEM 배지에 배양한 후, 혈청이 들어있지 않은 배지에서 24시간 더 배양하고 serum 및 PMA를 농도별로 처리하여 세포성장을 위한 최적농도를 확인한 결과 serum은 5-20% 농도에서 세포성장을 촉진시켰고 PMA는 실험한 모든 농도에서 세포성장을 거의 촉진시키지 못하는 경향을 확인하였다. 이어 P388 세포를 serum 및 PMA로 10 분간 활성화하여 파쇄한 후 세포질분획과 핵분획으로 분리하여 각 분획을 10% gel상에서 전기영동 하여 nitrocellulose paper에 옮긴 후 anti-ERK1 antibody를 이용해 확인해본 결과 serum, PMA로 처리된 세포 모두에서 MAP kinase의 핵내 이동이 관찰되었으며 특히 세포질 내에 주로 존재하는 42, 44 Kd의 MAP kinase isoform중 42 Kd의 isoform이 주로 핵내로 이동되는 것이 관찰 되었다. MAP kinase의 기질인산화실험을 위해 serum으로 활성화시킨 세포를 파쇄하여 SP-sephadex C-50, Phenyl superose, Mono Q column의 순서로 chromatography를 시행하여 MAP kinase를 부분분리 하였다. 이와 같이 얻은 MAP kinase를 가지고 면역 T 세포에 존재하는 tyrosine kinase인 p56<SUP>lck</SUP>대의 N-terminal peptide로 구성된 GST-fusion protein에 대한 인산화를 확인하였다. 또한 세포에서 분리한 MAP kinase를 가지고 transcription factor의 하나인 c-Jun protein에 대한 인산화실험을 실시한 결과 MAP kinase에 의해 인산화 됨이 확인되었다. 이상의 결과를 통해 P388 세포는 (1)세포 성장시 외부 신호를 G-protein-coupled receptor/protein kinase C/MAP kinase의 경로보다는 주로 tyrosine kinase receptor protein/Ras/MAP kinase의 경로를 이용하여 핵으로 전달하는 것으로 추측되며 (2) mitogen의 처리로 활성화된 MAP kinase중 주로 42 Kd isoform 핵내로 이동하고, 분리한 MAP kinase가 GST-fusion protein과 transcription factor인 c-Jun을 모두 인산화 시키는 결과로 보아 MAP kinase의 isoform에 따라 표적 compartment가 다르고 결과적으로 표적 기질에 차이가 있을지 모른다고 간접적으로 추론 할 수 있다. The mitogen-activated protein(MAP) kinase signal transduction pathway represents an important mechanism by which mitogen, such as serum and PMA, regulate cell proliferation and differentiation. Target substrates of the MAP kinase are located within several compartments containing plasma membranes and nucleus. We now report that serum addition induces proliferation of the P388 murine leukemia cell, but PMA does not, while both serum and PMA treatment cause translocation of the MAP kinase, mainly p42<SUP>mapk</SUP> isoform, from cytosol into the nucleus, which was monitored by immunoblot analysis using polyclonal anti-ERK1 antibodies. We investigated whether the MAP kinase was capable of phosphorylating c-Jun protein and GST-fusion proteins, the P56<SUP>lck</SUP>N-terminal peptides (1-77 or 1-123 domain) of the T cell tyrosine kinase, using the partially purified MAP kinase by SP-sephadex C-50, phenyl superose and Mono Q column chromatography. We found that the partially purified MAP kinase was able to phosphorylate c-Jun protein and the GST-fusion protein expressed using E.coli DH5α which is transformed with pGEX-3Xb plasmid vector carrying of p56<SUP>lck</SUP> N-terminal peptide-encoding DNA. These results imply that tyrosine kinase receptor/Ras/Raf/MAP kinase pathway is a major mechanism for mitogen-induced cell proliferation in P388 murine leukemia cell and that the various MAP kinase isoforms may have their own target substrates located in distinct subcellular compartments.