제대혈 분리방법의 차이에 따른 단핵구 및 조혈모세포의 수득 효과에 관한 비교연구

박정숙,이영호,최안홍,노신애,김태겸,한진영 대한조혈모세포이식학회 1998 대한조혈모세포이식학회지 Vol.3 No.1

연구배경 : 최근에 보고된 변형적 Ficoll-Hypaque 방법을 이용한 제대혈 분리방법이 지금까지의 고식적 Ficoll-Hypaque 분리방법에 비하여 조혈모세포의 수득효과면에서 얼마나 차이가 있는지 또한 비교적 수득효과가 크다고 알려져 있는 3% gelatin을 이용한 분리방법에 비하여 얼마나 효과적인지를 알아보고, 제대혈 분리방법의 차이에 따라 단핵구와 조혈모세포 사이에 어떤 상관관계가 있는지 알아보기 위하여 본 연구를 시행하였다. 방법: 21명의 건강한 산모로부터 정상 질식 및 제왕절개 분만 후 제대정맥에서 해파린 처리한 주사기를 사용하여 제대혈을 채취하였다 채취한 제대혈은 동일하게 3개월 시험관에 나누어 실온에서 24시간 이내에 고식적 Ficoll-Hypaque분리법, modified Ficoll-Hypaque 분리법, 3% gelatin 분리법을 이용하여 각각 단핵구 분리를 시도하였으며 이들의 단핵구수 및 생존률, CD34 양성세포수, 집락수를 측정 비교 하였다. 또 상관분석을 이용하여 단핵구수, CD34양성세포수와 CFU-GM집락수 사이의 상관관계를 알아보았다. 결과: 1) 세포 생존률은 고식적 Ficoll-Hypaque 분리법, 변형적 Ficoll-Hypaque 분리법, 3% gelatin 분리법 사이레 통계적 차이가 없었다. 2) 단핵구수는 3% gelatin으로 분리했을 때가 4.56±1.86 (×10^(6)/mL)로 수득효과가 가장 높았으며 (P=0.0001), Ficoll-Hypaque으로 분리했을때는 각각 1.54±0.06(×10^(6)/mL), 1.36±0.67(×10^(6)/mL)로서 고식적 방법과 변형적 방법 차이에 통계적 차이가 없었다. 3) CD34 양성세포수는 3%gelatin으로 분리했을 때가 6.08±3.99(×10⁴/mL)로 수득효과가 가장 높았으며 (P=0.0001), Ficoll-Hypaque으로 분리했을 때는 각각 2.18±2.17(×10⁴/mL), 2.24±1.63(×10⁴mL)로서 고식적 방법과 변형적 방법사이에 통계적 차이가 없었다. 4) CFU-GM 집락수는 3% gelatin으로 분리했을 때가 15.72±8.93(×10³/mL)로 수득효과가 가장 높았으며 (P=0.0002), Ficoll-Hypaque으로 분리했을 때는 각각 3.12±1.45(×10³mL), 2.35±0.82(×10³/mL)로서 고식적 방법과 변형적 방법 사이에 통계적 차이가 없었다, 5) 제대혈 고식적 Ficoll-Hypaque 방법으로 분리하였던 경우는 단핵구수와 CFU-GM집락수 사이에 상관관계가 없었으며CD34 양성세포수만 CFU-GM집락수와 상관관계가 있었다. (r=0.57). 또 변형적 Ficoll-Hypaque 방법에 의하여 분리하였던 경우는 단핵구수나 CD34 양성세포수 모두가 CFU-GM 집락수와 상관관계가 없었다. 그러나 제대혈을 3% gelatin법으로 분리하였던 경우는 CFU-GM집락수 가 단핵구수 (r=0.88) 및 CD34양성세포수(r=0.86)양자 모두와 상관관계가 있었다. 결론 : 3%gelatin을 이용하여 제대혈을 분리하는 것이 단핵구 및 조세모세포의 수득효과면에서 가장 효과적이었다. 한편 변형적 Ficoll-Hypaque 분리법이 고식적 Ficoll-Hypaque 분리법보다 시간과 경비면에서 비효율적이면서 수득효과도 높지 못하였다. 또 제대혈 분리법의 차이에 따라 단핵구나 CD34 양성세포와 VFU-GM사이에 상관관계에 차이가 있었으며, 실제로 제대혈이식 후에 생착 여부를 예측할 수 있는 인자가 제대혈 분리법의 차이에 따라 달라지는지에 관해서 보다 많은 임상적 연구가 필요할 것으로 사료된다. Background : Cord blood banking for stem cell transplantation requires volume reduction and red cell depletion for cost effective storage. To determine which technique could minimize the loss of progenitor cells during cord blood processing, we compared the efficacy of cord blood separating methods which were conventional Ficoll-Hypaque method, modified Ficoll-Hypaque method, and 3% gelatin method. Methods : Twenty-one cord blood samples were obtained with heparinized syringes from the umbilical vein following delivery. Three aliquots of each 20mL cord blood were stored at room temperature and processed by 3 different techniques within 24 hours after collection. We compared mononuclear cells(MNCs) counts and their viability, CD34+ cells counts, and CFU-GMs counts and also observed their correlations among three techniques. Results : 1) The yield of MNCs or CD34+ cells was highest in the cord blood processed with 3% gelatin method than conventional or modified Ficoll-Hypaque method(P=0.0001). 2) There were no significant difference in the yield of MNCs and CD34+ cells between conventional and modified Ficoll-Hypaque method. 3) Both MNCs counts (r=0.800) and CD34+ cells counts (r=0.86) were significantly correlated with CFU-GM counts in the cord blood processed with 3% gelatin method. 4) CD34+ cells counts were significantly correlated with CFU-GM counts in the cord blood processed with conventional Ficoll-Hypaque method (r=0.57), but MNC counts were not. 5) Both MNC counts and CD34+ cell counts were not correlated with CFU-GM counts in the cord blood processed with modified Ficoll-Hypaque method. Conclusion : Cord blood separation with 3% gelatin method could provide better yield of progenitor cells than with FICOLL_Hypaque methods. And between two Ficoll-Hypaque methods, modified method is more laborsome but not better in terms of clonogenic potential than conventional method.

제대혈에서 유핵세포 분리방법에 따른 회복률

이건수,김미정,최은진,최성민 대한조혈모세포이식학회 1998 대한조혈모세포이식학회지 Vol.3 No.2

연구배경 : 제대혈 조혈모세포 이식은 혈액 및 종양질환의 치료로 여러 가지의 이점으로 인해 많은 연구와 더불어 은행화에 대한 노력이 활발히 진행되고 있다. 그러나 이식의 성공률을 향상시키기 위한 제대혈 조혈모세포의 채집 방법과 획득, 장기간 냉동보존에 대해 표준화된 방법이 아직 제시되고 있지 못한 실정이다. 이 연구는 이러한 제대혈 조혈모세포의 획득률의 향상을 위해 시도되었다. 방법 : 건강한 산모로부터 제대혈 54례를 무균적, 노출(open) 방법으로 채혈하였다. F-H법, Gelatin법, HES법으로 적혈구 제거 또는 유핵세포를 분리하여 자동세포분석기를 이용하여 획득률을 구하였다. 세 가지 방법으로 분리된 유핵세포를 각각 2%, 10% 그리고 17% FBS 농도의 배지에서 실온에서 1시간, 2시간, 3시간, 20시간 그리고 24 시간 보관 후 회복률과 비교하였다. Gelatin법과 HES법으로 적혈구를 제거한 검체들은 세포수를 L-15배지로 2배 희석하여 각각 2%, 10% 그리고 17% FBS 농도의 배지에서 실온에서 1시간, 2시간, 3시간, 20시간 그리고 24 시간 보관 후 회복률을 확인하여 세포수를 2배 희석하기 전에 회복률과 비교하였다. 세 가지 세포분리법에 의해 얻어진 유핵세포를 프로그램냉동법을 이용하여 냉동한 후 37℃ 보육기에서 해동 후 회복률을 비교하였다. 결과 : 유핵세포분리에서 F-H법으로 분리한 총 백혈구의 획득률은 27.2%, Gelatin법 71.5%, HES법 73.7%로 Gelatin법이나 HES법이 F-H법에 비해 많았으나 다핵세포 제거율은 F-H법 92.9%, Gelatin법 38.2%, HES법 32.1%로 F-H법이 Gelatin법이나 HES법에 비해 통계적으로 유의하게 높았다.(P<0.05). 16례에서 실시된 3가지 방법에 의해 분리된 단핵세포 또는 유핵세포를 2% FBS가 섞인 L-15 배지에 희석한 후 보관시간에 따른 회복률의 비교에서 F-H법과 Gelatin법에 비해 HES법에 의한 세포분리방법에 의할 때 회복률은 시간경과에 따라 더 급격히 감소하였고, 10% FBS가 섞인 L-15 배지에 희석한 후 보관시간에 따른 회복률의 비교에서는 F-H법은 회복률이 유지되는데 비해 Gelatin법과 HES법에서는 회복률의 감소를 보이고 있으나 통계적인 유의성은 없었다. 17% FBS가 섞인 L-15 배지에 희석한 후 보관시간에 따른 회복률의 비교에서는 F-H법, Gelatin법 그리고 HES법에서 모두 회복률의 감소를 보였다. Gelatin법과 HES법에서 세포 수를 2배 희석하여 각각 2%, 10% 그리고 17%농도의 FBS가 섞인 L-15배지에 희석한 후 보관시간에 따른 회복률은 세포 수를 희석하기 전과 비교하여 통계적으로 유의한 차이를 보이지는 않았다. F-H법, Gelatin법, HES법으로 분리한 유핵세포를 프로그램냉동법으로 냉동하고 37℃에서 해동하였을 때 회복률은 각각 85.8%, 65.3%, 72.7%로 통계적으로 유의하기는 않았다. 결론 : 유핵세포분리는 Gelatin법이나 HES법이 F-H법에 비해 많았으나, 조혈모세포 이식에 불필요한 적혈구와 다핵세포의 제거율이 낮았고, 보관시간이 길수록 회복률의 감소가 현저했으며, F-H법에 의해 단핵세포를 분리한 검체를 10% FBS 농도의 배지에 보관했을 때 비교적 회복률이 유지되었다. 그러므로 세포분리 방법에 상관없이 냉동보존 전의 보관시간이 짧을수록 더 높은 회복률을 얻을 수 있었다. 프로그램냉동법을 이용하고 급속 해동을 실시할 경우 단핵세포 또는 유핵세포 분리방법에 따른 회복률의 차이는 없었다. Background: Human umbilical cord blood contains sufficient numbers of hematopoietic stem cells to provide long-term engraftment in the unrelated recipient with several advantages. The number of hematopoietic stem cells is an important factor for better results in transplantation. The purpose of this study is the development of a technique for the collection, separation and cryopreservation of the cord blood mononuclear cells for transplantation. Methods: Fifty four cord bloods were collected during deliveries at Kyungpook National University Hospital and Hana Hospital, Taegu, Korea from May, 1997 to May, 1998. The mononuclear cell separation by Ficoll-Hypaque (F-H) or red cell sedimentation by 3% Gelatin or 6% Hydroxyethyl Starch (HES) was done and the number and recovery rates were compared with hemocytometry. The recovery rates of separated cells by different cell separation methods in the L-15 medium containing 2%, 10% or 17% FBS before cryopreservation according to the suspension time were compared. The recovery rates of separated cells by Gelatin or HES which were diluted two times in the L-15 medium containing 2%, 10% or 17% FBS were compared as the same way. The recovery rates according to different cell separation methods after a programmed freezing method and thawing in the incubator were compared. Results: The mean volume of collected cord blood was 121 mL (80-155 mL). The removal of red blood cell was 99.4% by F-H, 79.6% by Gelatin and 70.3% by HES. The mononuclear cell separation was 52.6±27.2% by F-H, 91.1±28.9% by Gelatin and 89.4±27.8% by HES. The removal of polymorphonuclear cell was 92.9% by F-H, 38.2% by Gelatin and 32.1% by HES. The recovery rates of separated cells by Gelatin or HES in the L-15 medium containing 2%, 10% or 17% FBS before cryopreservation were gradually decreased according to the longer suspension time, and those by F-H in the L-15 medium containing 2% or 17% FBS before cryopreservation were also gradually decreased, but those by F-H in the L-15 medium containing 10% were relatively maintained up to 24 hours (P<0.01). The recovery rates of two times diluted separated cell concentration by Gelatin or HES in the L-15 medium containing 2%, 10% or 17% FBS were also decreased according to the longer suspension time as those of the initially separated cell concentration were done. The recovery rate after programmed freezing and thawing was 85.8% by F-H, 65.3% by Gelatin and 72.7% by HES. Conclusion: The nucleated cell separation by 3% Gelatin or 6% HES showed better yield than F-H. The red cell and polynuclear cell contaminations were higher in the former two methods. The recovery rates of separated cells were not significantly decreased in the 10% FBS by F-H method. The shorter the suspension time before cryopreservation, the better the recovery rate of separated cells regardless of cell separation methods. The programmed freezing showed good recovery rates of cells after thawing. These will be important factors in raising the success rate in hematopoietic stem cell transplantation.