발표요지 : 벼의 5- Methyltryptophan 저항성주의 선발과 세포융합

이효연,김진호,김학진,귀곡수소 (龜谷壽昭) 한국식물생명공학회 ( 구 한국식물조직배양학회 ) 1993 한국식물생명공학회 춘계학술연구발표회 Vol.1993 No.-

Agrobacterium tumefaciens를 이용한 bialaphos 저항성 형질전환 벼의 개발

이효연,이춘환,김호일,한원동,최지은,김진호,임용표 한국식물생명공학회 1998 식물생명공학회지 Vol.25 No.4

비선택성 제초제인 bialaphos는 고등식물에 있어서 glutamine 합성을 억제 하여 식물체를 고사시킨다. Acetyltransferase에 의해 encoding된 bialaphos저항성 유전자는 세균 Streptomyces hygroscopicus SF1239로부터 cloning된것을 사용하였다. Bialaphose 저항성 유전자를 Agrobacterium 감염법을 이용하여 국내에서 재배되는 벼(동진)에 도입한 결과 약30%정도의 형질전환 식물체를 얻을 수 있었다. $\textrm{T}_{1}$ 세대의 17개체는 hygromycin과 bialaphos에 대한 저항성 유전형질이 3:1로 분리되었다. 또한 Southern 분석을 실시한 결과 wild type의 식물체에서는 Bar 유전자의 검출을 볼 수 없었으나 형질전환 식물체의 경우 Bar 유전자의 검출이 가능하였다. $\textrm{T}_{3}$세대의 형질전찬 식물체와 wild type의 식물체를 포장상태에서 비선택성 제초제인 바스타를 살포하고 3주 후에 관찰한 결과 형질전환 식물체는 외형적으로 아무런 피해를 받지 않고 정상적으로 생장하였으나, wild type의 식물체와 잡초는 모두 고사하였다. 이상의 결과를 종합해보면 hygromycin과 bialaphos 저항성 유전자는 Agrobacterium감염법을 이용하여 단자엽 식물인 벼에 도입할 수 있다는 것을 보여준 것이며, 또한 bialaphos 저항성 유전자가 식물에 도입됨으로써 비선택성 제초제에 대한 저항성 식물을 개발 할 수 있다는 것을 보여 주었다. The bialaphos is a potent inhibitor of glutamine synthease in higher plants and is used as a non-selective herbicide. We have used the bialaphos resistant gene(Bar) encoding for an acetyltransferase isolated from Streptomyces hygroscopicus SF1293. Callus derived from mature seeds of rice(Oryza sativa L. cv. Dong Jin) were co-cultivated with Agrobacterium tumefaciens EHA101 carring a plasmid pGPTV-HB containing genes for hygromycin resistance (HygR) and Bar. Transgenic plants showing in vitro resistance to 50 mg/L hygromycin and 10 mg/L bialaphos were obtained by using a two-step selection/regeneration procedure. Transformation efficiency of rice was about 30% which was as high as reported in other dicotyledons. Progenies ($\textrm{T}_{1}$ generation) derived from primary transformant of 17 lines were segregated with a 3 resistant : 1 sensitive ratio in medium containing hygromycin and bialaphos. Stable integration of Bar gene into chromosomal DNA was proven by Southern blot analysis of genomic DNA isolated from $\textrm{T}_{2}$ progenies. Transgenic plants ($\textrm{T}_{3}$) grown in the field were resistant to bialaphos (Basta) at a dosage lethal to wild type plants.

길위에 선 사람들

이효연 열린전북 2002 열린전북 Vol.38 No.-

Expression of Human Lactoferrin Gene in Transgenic Rice(Oryza sativa L.)

이효연,Yong-Eok Lee,Seong-Eun Oh,Satoshi Nishiguchi,Key-Zung Riu,송인자,박신영,Jin-Hyoung Lee,Il-Gi Kim,서석철,Seong-Lyul Rhim,임평옥 한국식물생명공학회 2007 JOURNAL OF PLANT BIOTECHNOLOGY Vol.34 No.2

Lactoferrin is an 80-kDa iron-binding glycoprotein known to exert many biological activities, such as facilitating iron absorption and having antimicrobial and anti-inflammatory effects. Rice can be a useful target for edible food plants to introduce human lactoferrin, because it has lower allergenicity and is likely to be safer than microorganisms or transgenic animals. A cDNA fragment encoding human lactoferrin (HLF) driven by the maize polyubiquitin promoter, along with herbicide resistance gene (bar) driven by CaMV 35S promoter, was introduced into rice (Oryza sativa L. cv. Dong Jin) using the Agrobacterium -mediated transformation system. Putative transformants were initially selected on the medium containing bialaphos. The stable integration of the bar and HLF genes into transgenic rice plants was further confirmed through polymerase chain reaction (PCR) and Southern blot analyses. The expression of the full length HLF protein from various tissues such as grains and young leaves of transgenic rice was verified by Western blot analysis. Analysis of progeny also demonstrated that introduced genes were stably inherited to the next generation at the Mendelian fashion.

돌연변이 벼 종자로부터 선발된 5-methyltryptophan 저항성 계통의 특성

이효연,배창휴,임용표,박노동,조백호,이수인,최해춘,김호일 한국식물생명공학회 2000 식물생명공학회지 Vol.27 No.6

Three rice (Oryza sativa L. var Dong-Jin) mutants (DTR1, DTR2, DTR3) resistant to S-methyltryptophan (5MT) were selected by mutagenized M3 seeds. The frequency of chlorophyll mutations induced by the EMS (0.2%) treatment performed 2 hours after flowering is clearly higher than that induced by other treatments in M1 generation. Progeny obtained from the self-pollinating of 5MT-resistant lines segregated with 3 : 1 of resistant to sensitive ratio. Furthermore, the ratio of homozygote to heterozygote in 5MT-resistant plants of the M4 generation was 1:2. These results show that 5MT resistance was inherited as a single dominant nuclear gene. The resistance was also expressed in callus derived from seeds. Total free amino acid content in homozygous seeds of DTR1 and DTR2 showed about 1.7 fold-increased compared to the wild-type seeds. In particular, the levels of phenylalanine and Iysine were, respectively, 6.2 and 3.2 times higher than those in the wild-type seeds. However, seeds of DTR3 had lower levels of free amino acid than the wild-type seeds. This result indicate that these mutants as a significant step towards the production of new rice with balanced amino acid content. 5-methyltryptophan (5MT) 저항성 벼의 3계통 (DTR1, DTR2, DTR3)을 돌연변이 처리된 M3세대의 종자로부터 선발하였다. Ml세대에서 엽록소 돌연변이의 빈도는 개화 2시간 후의 벼이삭에 EMS (0.2%) 처리된 실험구로부터 가장 많이 관찰되었다. 5MT저항성으로 선발된 3계통은 자식후대에 있어서도 저항성과 감수성의 비율이 3:1을 보여주었다. 또한 M4세대의 저항성 식물 중에서 자식후대의 5MT에 대한 저항성은 homozygote와 heterozygote 형태로 분리된것이 1 : 2의 비율로 관찰되었다. 이러한 저항성 돌연변이 식물은 5MT저항성 형질이 단일 우성 핵 유전자에 의해 지배된다는 것을 보여준 것이다. 또한 5MT저항성 형질은 세포수준에서도 관찰되었다. DTR1, DTR2의 homozygous 종자로부터 추출된 전 유리아미노산 함량은 야생형 식물에 비해 약 1.7배정도 높았으며, 특히 phenylalanine, Lysine의 함량이 각각 6.2, 3.2배로 증가하였다. 그러나 DTR3의 경우 야생형과 비교하여 유리 아미노산 함량의 증가는 보이지 않고 약간 감소하였다. 이러한 결과는 곡류작물의 아미노산 함량을 변화시키는 데 있어서 5MT저항성 식물체의 선발이 매우 효과적인 방법이라는 것을 보여주었다.

Agrobacterium tumefaciens를 이용한 bialaphos 저항성 형질전환 벼의 개발

이효연,이춘환,김호일,한원동,최지은,김진호,임용표 충남대학교 생물공학연구소 1999 생물공학연구지 Vol.7 No.-

비선택성 제초제인 bialaphos는 고등식물에 있어서 glutamine 합성을 억제하여 식물체를 고사시킨다. Acetyltransferase에 의해 encoding된 bialaphos 저항성 유전자는 세균 Streptomyces hygroscopicus SF1239로부터 cloning된 것을 사용하였다. Bialaphose 저항성 유전자를 Agrobacterium 감염법을 이용하여 국내에서 재배되는 벼(동진)에 도입한 결과 약 30%정도의 형질전환 식물체를 얻을 수 있었다. T_1세대의 17개체는 hygromycin과 bialaphos에 대한 저항성 유전형질이 3 : 1로 분리되었다. 또한 Southern 분석을 실시한 결과 wild type의 식물체에서는 Bar 유전자의 검출을 볼 수 없었으나 형질전환 식물체의 경우 Bar 유전자의 검출이 가능하였다. T_3 세대의 형질전환 식물체와 wild type의 식물체를 포장상태에서 비선택성 제초제인 바스타를 살포하고 3주 후에 관찰한 결과 형질전환 식물체는 외형적으로 아무런 피해를 받지 않고 정상적으로 생장하였으나, wild type의 식물체와 잡초는 모두 고사하였다. 이상의 결과를 종합해보면 hygromycin과 bialaphos 저항성 유전자는 Agrobacterium 감염법을 이용하여 단자엽 식물인 벼에 도입할 수 있다는 것을 보여준 것이며, 또한 bialaphos 저항성 유전자가 식물에 도입됨으로써 비선택성 제초제에 대한 저항성 식물을 개발 할 수 있다는 것을 보여 주었다. The bialaphos is a potent inhibitor of glutamine synthease in higher plants and is used as a non-selective herbicide. We have used the bialaphos resistant gene (Bar) encoding for an acetyltransferase isloated from Streptomyces hygroscopicus SF1293. Callus derived from mature seeds of rice (Oryza sativa L. cv. Dong Jin) were co-cultivated with Agrobacterium tumefacieus EHA101 carring a plasmid pGPTV-HB containing genes for hygromycin resistance (HygR) and Bar. Transgenic plants showing in vitro resistance to 50 mg/L hygromycin and 10 mg/L bialaphos were obtained by using a two-step selection/regeneration procedure. Transformation efficiency of rice was about 30% which was as high as reported in other dicotyledons. Progenies (T_1 generation) derived from primary transformant of 17 lines were segreagated with a 3 resistant:1 sensitive ratio in medium containing hygromycin and bialaphos. Stable integration of Bar gene into chromosomal DNA was proven by Southern blot analysis of genomic DNA isolated from T_2 progenies. Transgenic plants (T_3) grown in the field were resistant to bialaphos (Basta) at a dosage lethal to wild type plants.

Ethylene Imine 처리에 의해서 얻어진 벼의 5-methyltryptophan 저항성주의 특성

이효연,김진호,김학진,권병선,구곡수소 한국작물학회 1992 한국작물학회 학술발표대회 논문집 Vol.1992 No.-

수분ㆍ수정 시기를 이용한 Bialaphos 저항성 형질전환 담배의 개발

이효연,노일섭,김진호,유장렬,이종석,김학진,Toshiaki KAMEYA 한국식물생명공학회 1994 식물생명공학회지 Vol.21 No.2

비선택성 제초제인 bialaphos는 고등식물에 있어서 glutamine 합성을 억제하여 식물체를 고사 시키는 능력을 갖고 있다. 본 연구에서 acetylteansferase에 의해 encoding된 bialaphos 저항성 유전자(bar gene)는 세균(Pseudomonas sryngae pv tabaci)의 genomic DNA로부터 cloning된 것을 사용하였다. 수분시킨 담배의 화계에 일정한 시간별로 bar 유전자를 처리한 결과 수분 후 30-40시간 사이의 처리구 에서 형질전환 식물체가 가장 많이 얻어 졌다. 그러한 형질전환 식물체의 kanamycin과 bialaphos 저항성 형질은 자식후대(T$_1$, T$_2$)에 있어서도 우성형질로 유전되었으나 wild type의 담배는 상기의 약제를 처리 하였을때 전부 고사하였다. 그리고, T$_1$세대의 형질전환 식물체로부터 전 염색체 DNA를 추출하여 Southern 분석한 결과 bar 유전자가 식물의 염색체상에 안정하게 존재하는 것을 확인하였다. 이상의 결과로부터 담배의 수분, 수정 시기에 외부유전자인 bar를 화주에 처리함으로써 bialaphos 저항성 식물을 만들어낼 수 있었다. The herbicide bialaphos is a potent inhibitor of glutamine synthetase in higher plants. A bialaphos resistance (bar) gene encoding for an acetyltransferase was isolated from genomic DNA of Pseudomonas syringae pv tabaci. The bar gene was ligated to the binary vector pBI121. Pistils of tobacco plane were heated with the bar gene containing plasmid DNA at various times after pollination. When the treatment was applied at 30 and 40 h after pollination, a number of transgenic plants were obtained. Premary transformation (T$_{0}$ generation) and their progenies (T$_1$T$_2$) were resistant to both bialaphos and kanamycin at a dosage lathal to untransformed control plants. Stable integration of bar gene into chromosomal DNA was proven by Southern blot analysis of genomic DNA isolated from T$_1$progenies. These results show that the bialaphos resistant plane could be obtained by treatment to pistils with the exgenous bar gene through the fertilization cycle of tobacco.o.

EMS처리에 의한 한란의 엽록소 결핍 돌연변이 식물체의 유도

이효연,정재성,이종석 한국식물생명공학회 1998 식물생명공학회지 Vol.25 No.3

Chlorophyll mutants were produced by treating the rhizome of Cymbidium kanran with mutagen, EMS(ethyl methan sulfonate). The germination ratio of Cymbidium kanran seeds was 5.5 times higher when the seeds were treated with ultrasonic treatment for 20 minutes than untreated control. Fifty to sixty percent of the rhizomes became dark brown when they were cultured in a liquid growth medium containing 0.2% EMS for three weeks. When the dark-brown rhizomes were cultured in a solified MS medium, new rhizomes were developed from a part of the old ones. Chlorophyll mutant rhizomes were obtained from a meristem tissue by a subculturing the cuts of these new rhizomes for a year. Of the chlorophyll mutants, a zigzag-striped type of rhizome was dominant and light-yellow and albino ones were also produced. While the zigzag-striped type rhizomes were differentiated into green and striped plant, the light yellow and the white rhizomes produced yellow-striped and albino plants repectively.These results indicate that the EMS treatment on the rhizome is an effective means to induce a chlorophyll mutant. We believe that this method may be useful to produce variegated plants chlorophyll mutants from other orchids. 한란(Cymbidium kanran)의 근경에 돌연변이 물질인 EMS를 처리하여 엽록소변이 식물체를 유도하였다. 한란종자를 발아시켜서 근경을 유도할 때 종자에 40분간 초음파 처리한 것이 무처리구에 비하여 발아율이 5.5배 정도 높았다. EMS 0.2%를 포함한 근경증식용 액체배지에서 3주간 배양하였을 경우에 50-60%정도의 근경이 갈변되었다. 갈변된 근경을 근경증식용 고체배지에서 배양하였을 경우에 근경조직의 일부분으로부터 새로운 근경의 증식의 관찰되었고, 이러한 근경조직을 절단하여 1년간 계단배양하던중에 분열조직의 일부분에서 색소변이 근경이 관찰되었다. 색소변이 근경은 나선형의 줄무늬가 가장 많았고, 그 외 엷은 노란색과 흰색의 근경이 분리되었다. 나선형의 근경에서 유도된 식물체는 잎에 무늬가 전혀 없는 녹색의 식물체 또는 줄무늬가 들어 있는 식물체가 유도되었다. 그러나 엷은 노란색 근경에서 유도된 식물체는 노란색 줄무늬가 있는 식물체로, 흰색 근경으로부터 유도된 식물체는 백화된 식물체로만 분화하였다. 이상의 결과 한란근경을 이용한 색소변이식물체의 유도에 있어서 배양중인 근경에 EMS처리가 효과적인 것을 보여주었다. 이러한 방법을 다른 식물에 적용하면 색소변이 식물체를 개발할 수 있으리라 생각된다.

[행복 일기] 요리로 지지고 볶는 수학공부

이효연 샘터사 2009 월간 샘터 Vol.473 No.-