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제대혈액 유래 중간엽 줄기세포의 in vitro 배양에 세포 적응성과 세포손상에 따른 산소농도가 증식에 미치는 영향
남궁원석,문민경,이경아,김세곤(지도교수),김태전(지도교수) 대한임상병리사협회 2010 조직세포검사학회 발표자료집 Vol.2010 No.-
중간엽 줄기세포(Mesenchymal stem cell)는 성체의 골수, 지방조직, 제대혈 등에서 분리 배양되고 있으며 자기복제능력(self renewal)과 분화(differentiation)능력을 특징으로 하는 세포이며, 이러한 특성을 이용하여 손상된 장기의 회복을 위하여 다양한 연구가 진행되고 있다. 특히 제대혈에서 분리된 중간엽 줄기세포는 이용하기 쉽고, 안전성과 효율성 측면에서 세포이식 치료에 훌륭한 세포 공급원이 될 수 있다. 중간엽 줄기세포의 임상활용을 위해서는 in vitro에서 줄기세포를 충분히 증식시키는 것이 중요한 문제이다. 그러나 in vitro에서 치료용 세포확보를 위한 계속적인 세포배양은 세포가 스트레스를 받아 세포손상이나 노화로 진행되어 원하는 양의 세포나 양질의 세포를 얻을 수 있는 결과를 감소시킨다. 이에, 본 연구의 저자들은 제대혈에서 단핵구를 농도구배 (Ficoll, 1.077)로 원심분리 한 후 배양기에 분주하고, 약 14일 후에 확인 된 중간엽 줄기세포를 in vitro상태로 배양 하였다. 원래의 환경에 이탈된 세포는 스트레스를 받게 되는데, 이중 산화적 스트레스(oxidative stress)가 세포증식에 미치는 영향을 확인하고자 하였다. 5% 이산화탄소만이 조절되는 일반조건(20%산소)의 배양기와 최근에 산소농도가 임의로 조절 가능한 배양기(5% 산소)에서 세포의 증식 효과를 automatic cell counter를 이용하여 비교 분석하였다. 또한, 제대혈 세포에서 줄기세포가 출현(CFU, Colony Forming Unit)한 배양환경(세포 적응성)이 세포증식에 우선하는지, 임의적으로 산소 농도 조절이 가능한 배양기가 우선하는지도 비교 분석하였으며, 증식용 배지 내에 포화되어 있는 산소농도가 미치는 영향을 확인하고자 일반적으로 사용하는 배지는 별다른 처치를 하지 않았으나, 또 다른 배지는 산소영향을 없애기 위하여 배지 내에 파스퇴르 파이펫을 삽입하고 1시간 정도 suction out하여 배지 내에 포화된 산소를 제거한 배지로 세포의 증식 정도를 비교 분석하였다. 그 결과, 줄기세포가 원래 있어야할 본연의 환경(niche)조건에 우선함은 세포의 CFU가 out brake한 조건(환경)의 산소농도가 실험 군에 사용한 5%농도의 산소조건에 우선하여 (1 - 2passage, 25% 증식, 3passage 50% 증식) 증식함을 간접적으로 확인하였다. 이는 세포적응성이 임의적 산소농도에 우선함을 확인한 결과이다. 그러나 계속적인 세포배양으로 인해 산화적 스트레스를 받은 세포나, 물리적, 화학적으로 산화적 스트레스를 받은 줄기세포는 앞의 결과와는 달리 5%산소농도(in vivo 산소농도) 배양에서 확연한 증식효과(15% ~ 100% 증식)를 보였다. 또한, 배지에 포화되어 있는 산소를 제거해 준 경우에도 세포증식에 관여함을 확인하였다 (10~20% 이상). 결론적으로, 제대혈유래 줄기세포의 증식은 체내의 원래 환경(niche)이나. 그에 준하는 최적인 조건이 가장 우선하며, 산화적 스트레스가 거의 없거나 적은 환경으로 출현한 줄기세포는 임의적으로 조절한 배양기의 산소농도에 영향을 받지 않는다. 그러나, 산화적 스트레스를 받은 줄기세포의 경우는 적절한 산소 농도 조절이 필요하며, 이는 배양기뿐 만 아니라, 배지에 포화되어 있는 산소도 줄기세포의 증식과 관련됨을 확인하였다.
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박아름,남궁원석,박채원,정연미,이지혜,신재호(지도교수),김태전(지도교수) 대한임상병리사협회 2010 조직세포검사학회 발표자료집 Vol.2010 No.-
고정은 생체조직을 고정액에 넣어 그 구조를 생체와 거의 같도록 만들어 주는 과정으로써 방법은 검사목적에 따라 다양하며 실온에서 대개 12~24시간 고정한다. 고정액 중 중성포르말린이 가장 일반적으로 사용된다. 고정전의 보관에 따른 조직의 변화를 관찰하기 위하여, 부검 후 조직을 각각 냉장, 냉동, 실온 상태에 보관 후 그 변화를 조사하였다. 4마리의 랫드를 부검한 후 모든 장기를 적출하여, 한 마리의 장기는 즉시 중성포르말린에 고정하여 대조군으로 사용하였다. 두 마리의 장기는 생리식염수에 넣어 그 중 한 마리는 실험실(실온)에 보관하였고, 다른 한 마리는 냉장실(4℃)에 넣어서 보관하였다. 나머지 한 마리는 장기를 적출한 후 조직이 겹치지 않도록 부검용 밧드에 펼쳐 냉동실에 넣어서 보관하였다. 그리고 3곳에 보관된 세 마리의 장기는 장기 적출 24시간 후 모두 중성 포르말린으로 고정하였다. 적출된 장기는 모두 일반 조직표본제작 과정을 거친 후, 표본을 제작하고, Hematoxylin & Eosin염색을 하여 조직의 핵과 세포질의 형태를 관찰 하였다. 그 결과 실온에 보관한 간조직의 핵은 소실되었고, Sinusoid 및 간세포에서는 세포질의 변화가 관찰되었다. 그러나 Kuffer``s cell의 변화는 거의 나타나지 않았다. 신장의 경우, 사구체의 변화는 거의 없었으나, 세뇨관의 상피세포는 간조직과 같이 핵 소실과 세포질의 변화가 관찰되었다. 특히 근위곡세뇨관의 변화가 뚜렷하게 관찰되었다. 냉동 보관한 간장에서 핵은 소실되지 않았으나, 세포질과 sinusoid는 대조군과는 다른 양상을 나타내었다. 신장의 경우, 사구체의 변화와 핵소실은 관찰되지 않았으나, 세뇨관의 경우, 대조군과는 다른 소견을 보였다. 그 외의 장기에서도 보관 조건에 따라 유사한 변화가 관찰되었다. 따라서 냉동과 실온에서 보관한 장기의 경우, 대조군과 비교하였을 때 유의한 변화가 있음을 알 수 있었으나 냉장한 상태에 보관한 장기의 경우는 대조군에 비해 유의한 차이를 보이지 않았다. 본 실험의 결과 보관 방법에 따라 조직의 손상 정도를 알 수 있었으며, 부검 후 장기는 가능한 즉시 포르말린 등의 고정액에 고정해야 고정의 목적에 맞는 조직을 관찰할 수 있었으며, 특히 냉장처리한 조직의 경우 조직학적 변화가 크지 않아 조직을 바로 고정할 수 없는 경우, 냉장고에 보관하는 것이 조직의 변화를 줄일 수 있는 하나의 방법임을 알 수 있었다.
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