Sodium salicylate activates p38MAPK through a specific-sensing mechanism, distinct from pathways used by oxidative stress, heat shock, and hyperosmotic stress : 활성산소, 열충격, 고삼투압 스트레스와는 다른 sodium salicylate 특이적 신호전달계에 의한 p38MAPK 활성화

김정모 부산대학교 대학원 2003 국내석사

병원성 미생물과 초식동물의 공격에 대한 식물체 방어기작에서 중요한 조절인자로 작용하는 식물 스트레스 호르몬인 sodium salicylate는 동물세포에서 항염증작용 및 세포주기 억제, 세포사멸 유도와 같은 다양한 작용을 나타내며 이를 위하여 여러 종류의 신호 전달계를 경유한다는고 보고되어 있다. 또한 sodium salicylate의 효과와 신호전달계 경로는 세포마다 차이가 크다. 최근 이러한 sodium salicylate에 의한 p38MAPK활성화가 대부분의 세포에서 관찰되며 이는 세포기능 조절 과정에서 중요한 역할을 담당하는 것으로 밝혀지고 있다. p38MAPK는 다양한 환경 스트레스에 의해 활성화되므로 다양한 신호전달계를 거쳐 활성화되는 것으로 생각된다. 본 연구에서는 아직까지 sodium salicylate 자극이 어떤 기작을 통하여 p38MAPK을 활성화시키는지 정확히 밝혀져 있지 않으므로, 이에 대한 연구를 진행하고자 하였다. 먼저 본 연구에서는 sodium salicylate가 활성산소를 증가시키는지 그리고 활성산소 증가에 의해 p38MAPK가 활성화되는지를 조사하였다. 그 결과, 비록 sodium salicylate는 활성산소를 증가시키지만, p38MAPK는 활성산소 증가와 무관하게 활성화되는 것으로 나타났다 반면에, 또 다른 식물 스트레스 호르몬인 methyl jasmonate (MeJA) 는 세포 내 활성산소 증가를 통하여 p38MAPK 활성을 조절하는 것으로 밝혀졌다. 그리고 sodium salicylate에 의해 활성화된 p38MAPK는 salicylate 제거 후 2분만에 다시 불활성화되는 특징을 보였다. 이러한 결과를 바탕으로 본 연구에서는 연속된 동일한 자극에 대해 해당 신호전달계가 과활성되지 않게 둔감화되는 현상인 desensitization 기작을 이용하여, sodium salicylate에 의한 p38MAPK 활성화 신호전달계를 규명하고자 하였다. 그 결과 sodium salicylate 처리에 이은 연속된 동일한 sodium salicylate 자극에 의해서도 p38MAPK의 활성화가 나타나는 것으로 관찰되었다. 뿐만 아니라, sodium salicylate가 전처리 된 세포는 H2O2와 methyl jasmonate 등과 같은 다른 종류의 스트레스 자극에 의해서도 p38MAPK 활성화를 나타내었다. 이러한 결과는 sodium salicylate에 의한 p38MAPK 활성화 신호전달계는 연속된 동일자극과 이질(異質)자극에 대해 desensitization을 보이지 않는다는 것을 보여준다. 즉, sodium salicylate는 sodium salicylate를 전처리한 세포는 물론, MeJA, H2O2, 열충격 혹은 고삼투압 스트레스 등에 의해 둔감화 (desensitization)된 세포에서도 p38MAPK을 활성화시키는 것으로 나타났다. 반면, MeJA, H2O2, 열충격 그리고 고삼투압 스트레스에 의한 p38MAPK 활성화는 연이은 동일한 자극 처리에 대해 p38MAPK 활성화 반응을 둔감화시키는 homologous desensitization을 나타냈다. 이러한 결과는 sodium salicylate에 의해 p38MAPK가 활성화되는 동안 매우 특이적인 감지 장치가 작용하고, sodium salicylate에 의한 p38MAPK 활성화는 MeJA나 H2O2와 같은 다른 스트레스들에 의한 p38MAPK 활성조절인자를 이용하지 않는다는 것을 시사한다. 그리고 sodium salicylate는 p38MAPK 아주 가까이 있는 상위 요소를 활성화시키거나, sodium salicylate 부착 단백질과의 상호작용을 통하여 p38MAPK 활성을 조절하거나, 혹은 자가인산화를 통하여 p38MAPK를 활성화시킬 가능성이 있음을 시사한다.

Expression and relationship of p38MAPK, p16INK4a, Bmi-1 in human lung adenocarcinoma tissue

김미애 차의과학대학교 대학원 2010 국내석사

배경 : p38MAPK는 MAPKs(mitogen-activated protein kinases)중의 하나로, 자외선(UV)이나 산화 스트레스, 종양발생 스트레스 등의 세포 스트레스가 발생한 경우 활성화되는 신호변환경로의 세포질 내 매개체이다. p16INK4a은 p38MAPK 신호전달체계의 일부이며 p38MAPK로부터 신호를 전달받는다. p16INK4a은 세포주기를 조절하는 Cdk(cyclin dependent kinase) 길항단백으로 INK4 family에 속하며 Cdk4와 Cdk6를 억제하여 세포주기 중 G1 phase를 arrest시킨다. 세포 스트레스가 발생하면 p38MAPK가 활성화되어 여러 하위단계 중 하나인 p16INK4a도 증가되어 G1 phase가 억제되어 cellular senescence가 일어나게 되는데, 이를 종양유전자유도-노화(oncogene-induced senescence)라고 한다. 하지만 여러 보고에 의하면, 실제 폐암조직에서 p38MAPK는 활성화되어 있었다. 즉 종양유전자유도-노화신호의 매개체가 활성화되었음에도 불구하고 폐암이 발생한 것이다. 본 연구의 목적은 절제된 폐암조직에서 p38MAPK가 실제로 활성화되었는지 확인하고, p38MAPK가 활성화되어 종양유전자유도-노화가 시작되었음에도 불구하고 종양형성이 일어난 이유에 대해 알아보고자 하였다. 그래서 p38MAPK가 신호를 전달하는 p16INK4a유전자 전사개시영역의 과메틸화 여부 및 Bmi-1(B cell specific Molony murine leukemia virus insertion site 1)전사의 변화를 확인하여 이들 간의 상관관계에 대해 알아보고자 하였다. 방법 및 결과 : 2002년 1월부터 2008년 12월까지 분당 차병원에서 병리학적으로 비소세포폐암, 특히 선암을 진단받고 수술적 절제를 시행받은 환자 중 조직 보관 상태가 양호한 10명을 선정하여 그들의 절제되어 냉동 보관된 폐암조직 및 정상폐조직을 대상으로 연구를 시행하였다. 절제된 폐암조직 및 정상폐조직에서 추출된 단백질을 이용하여 phosphorylated p38(pp38)MAPK에 대한 western blot을 시행한 결과, 6개의 폐암조직에서 정상폐조직보다 pp38이 증가되어 있었다. 또한 이들 조직에서 추출된 mRNA를 이용하여 p16INK4a에 대한 qRT-PCR을 시행한 결과 10개 중 6개의 폐암조직에서 정상 조직에 비해 감소된 p16INK4amRNA수치를 보였다. 두 결과를 비교해보면 pp38이 증가되어 있는 폐암조직 6개 중 5개에서 p16INK4amRNA수치가 감소한 것을 확인할 수 있었다. 또한 이 5개의 폐암조직중 4개에서 Bmi-1 mRNA수치가 증가하였고 나머지 1개의 폐암조직에서는 p16유전자의 과메틸화가 존재하였다. p16유전자의 과메틸화는 주로 진행된 폐암에서 발견되므로, 수술로 절제된 조기폐암조직을 이용한 이 실험에서는 p16유전자의 과메틸화가 적게 관찰된 것으로 생각된다. pp38 및 Bmi-1의 발현은 면역조직화학염색을 통해 다시 확인되었다. 이들 결과를 해석해보면 종양발생 스트레스를 받은 상황에서 p38MAPK가 활성화됨으로써 종양유전자유도-노화신호가 시작되었지만 하위신호전달체계에 문제가 생겨 p16유전자의 발현이 증가되지 않아 노화신호를 전달할 수 없었기 때문에 폐암이 발생한 것으로 생각할 수 있다. 그리고 p16유전자의 발현이 증가되지 않은 것은 후생유전적 변별화(epigenetic modification)인 전사개시영역의 과메틸화와 p16유전자를 억제하는 Bmi-1의 전사(transcription) 증가로 설명할 수 있었다. 결론 : 조기폐암에서는 p38MAPK가 활성화되어 종양유전자유도-노화가 시작되었음에도 불구하고, 주로 Bmi-1의 과발현으로 인한 p16INK4a로의 신호전달 장해가 발생하여 폐선암이 생긴 것으로 생각된다. 따라서 Bmi-1을 조절하는 분자생물학적 기전은 앞으로 새로운 폐선암의 보조화학요법의 표적인자를 도출하는데 응용될 수 있을 것으로 기대된다. 향후 Bmi-1의 조절기전 및 Bmi-1이 폐선암에 미치는 영향에 대한 추가적인 연구가 필요하리라 생각된다. Background p38MAPK is one of the mitogen activated protein kinases(MAPKs), which is a part of cytoplasmic signal transduction pathway. p38AMPK is activated when cellular stress such as UV(ultraviolet) or oxidative stress was initiated. This signal is transducted to p16INK4agene and senescence was induced with decreased proliferation or increased apoptosis. Then tumorigenesis is suppresed. This is called oncogene-induced senescence. Recently there are contrary reports that expression of p38MAPK was rather increased in lung cancers. So, we checked the expression of p38MAPK at lung cancer tissue and closely related factor, p16Ink4a. Also we studied about aberrant methylation of p16Ink4a promoter region and expression of Bmi-1, a polycomb protein inhibiting p16Ink4a, to find out the mechanism of suppressed p16Ink4a in lung cancer. Methods Lung adenocarcinoma tissues and paired normal lung tissues were obtained from 10 surgically resected lung adenocarcinoma patients. Level of phosphorylated p38 MAPK(pp38), p16Ink4a, and Bmi-1 were examined using western blot and qRT-PCR in 10 subjects. And we investigated the methylation status of p16Ink4a promotor region with nested methylation specific PCR method in 10 subjects. Also we conducted immunohistochemistry of pp38, Bmi-1 to confirm the results. Results 6 out of 10 lung adenocarcinoma tissues revealed more increased expression of pp38 compared with normal lung tissue. And 6 out of 10 tumors revealed decreased p16Ink4amRNA level compared with normal lung tissues. Putting this results together, there were 5 lung adenocarcinoma tissues which showed decreased p16Ink4a transcription under increased pp38 expression. Among these 5 lung adenocarcinoma tissues, 4 tissues showed overexpression of Bmi-1 and 1 tissue showed hypermethylation of p16Ink4a. Conclusion Suppression of p16Ink4a under activation of p38MAPK is the key factor which contributed to the tumorigenesis of lung adenocarcinoma. And suppression of p16Ink4a is mainly due to Bmi-1 overexpression, especially in early lung adenocarcinomas. So Bmi-1 might conduct a key role in tumorigenesis of early lung adenocarcinomas and this would be a new target for treating lung adenocarcinoma. Keywords : lung adenocarcinoma, p38MAPK, p16INK4a, Bmi-1, oncogene-induced senescence(OIS)

대장직장 점막의 전암성병변과 암종에서 Nuclear Factor-κB p65 (RelA)와 Nuclear Factor-κB1 p50, p38 Mitogen-Activated Protein Kinase 및 cyclin D1 단백 발현에 관한 면역조직화학적 분석

이상대 중앙대학교 대학원 2008 국내박사

배경 : Nuclear Factor-κB p65 (NF-κB p65)와 Nuclear Factor-κB1 p50 (NF-κB p50)은 세포증식과 세포자멸사, 시토카인 생성 및 종양화에 역할을 하는 것으로 알려져 있고, 최근 p38 Mitogen-Activated Protein Kinase (MAPK)/ NF-κB/ cyclin D1 신호전달 경로가 인간 종양의 발생에 중요한 부분을 담당한다는 연구 결과가 있다. 본 연구에서는 대장직장의 전암성 병변과 선안종에서 NF-κB p65, NF-κB p50, p38MAPKα, cyclin D1의 단백 발현을 알아보고자 한다, 방법 : 정상 점막 20예, 저등급의 선종 20예, 고증급의 선종 20예, 선암종 64예의 파라핀 포매 조직을 이용하여 NF-κB p65, NF-κB p50, p38MAPKα, cyclin D1 단백에 대한 면역조직화학 염색을 실시하였다. 결과 : NF-κB p65과 NF-κB p50 및 p38MAPKα 단백의 발현은 정상 점막에서 선암종으로 진행하면서 통계학적으로 유의하게 증가하였다. 선암종에서 NF-κB p65 단백은 저등급의 분화도, 림프절 전이가 있는 경우, 병기가 높은 경우에 발현 빈도가 높았으며, NF-κB p50 단백은 종양 병기가 높은 경우, 림프절 전이가 있는 경우, 병기가 높은 경우에 발현 빈도가 높았고, p38MAPKα 단백은 종양 병기가 높은 경우, 림프절 전이가 있는 경우, 병기가 높은 경우에 발현 빈도가 높았다. NF-κB p65, NF-κB p50, p38MAPKα, cyclin D1 단백은 서로 연관성 있게 발현을 하였고, 선암종에서 NF-κB p65, NF-κB p50, p38MAPKα, cyclin D1 단백이 모두 발현되는 예가 많았다. 결론 : NF-κB p65, NF-κB p50, p38MAPKα, cyclin D1 단백은 서로 연관성있게 발현을 하며 NF-κB/ p38MAPKα/ cyclin D1 신호전달 경로가 대장직장암의 발생과 진행에 역할을 하는 것으로 생각된다. Background : Nuclear Factor-κB p65 (NF-κB p65), Nuclear Factor-κB1 p50 (NF-κB p65) have been shown to play a role in cell proliferation, apoptosis, cytokine production, and oncogenesis. Recently, p38 Mitogen-Activated Protein Kinase (MAPK)/ NF-κB/ cyclin D1 signaling pathway has been shown to play an important part in the pathogenesis of human cancers. This study was designed to investigate the expression of NF-κB p65, NF-κB p65, p38MAPKα, and cyclin D1 proteins in premalignant lesions and colorectal adenocarcinoma. Methods: Paraffin sections of 20 normal mucosa, 20 low grade tubular adenoma, 20 high grade tubular adenoma and 64 adenocarcinoma tissues were analysed immunohistochemically for expression of NF-κB p65, NF-κB p65, p38MAPKα, and cyclin D1 proteins. Results: The expression of NF-κB p65, NF-κB p65, and p38MAPKα proteins were significantly higher in adenocarcinoma tissue in comparison with that in normal mucosa, low grade tubular adenoma, and high grade tubular adenoma tissues. Expression frequency of NF-κB p65 was higher in poorly differentiated histologic grade, presence of nodal metastasis and high stage. Expression frequency of p38MAPKα was higher in high tumor stage, presence of nodal metastasis and high stage. There were significant correlations between NF-κB p65, NF-κB p50, p38MAPKα, and cyclin D1 proteins. Moreover, synchronous expression of NF-κB p65, NF-κB p65, p38MAPKα, and cyclin D1 proteins were significantly higher in adenocarcinoma. Conclusion: The expression of NF-κB p65, NF-κB p50, and p38MAPKα proteins and the p38MAPK/ NF-κB/ cyclin D1 signaling pathway may be to play role in the pathogenesis of colorectal carcinoma.

p38 MAPK 활성화와 p53 하향 조절을 통한 Ebp1의 발암 역할 : 간암세포암에서 Ebp1의 생물학적 역할과 그 의의

무나커르미 수베스 전북대학교 일반대학원 2014 국내석사

Functional analysis of Protein arginine methyltransferase 7 in skeletal muscle maintenance

정현주 성균관대학교 일반대학원 2017 국내박사

Skeletal muscle comprises up to 45% of total body mass in normal mammals and is one of major energy consuming organ. The maintenance of muscle mass and functionality is critical for whole body metabolic health and a reduction in oxidative muscle metabolism and muscle functionality is implicated in a variety of metabolic conditions, including insulin resistance and obesity. Thus, elucidation of the regulatory pathways that control the oxidative muscle metabolism and muscle mass/function triggered by stimuli like physical exercise is critical to develop therapeutic tools to intervene the muscle weakness and atrophy involved in normal aging or pathological conditions. Prmt7 catalizes symmetric demethylation of arginine residues in histone or nonhistone substrates. This study is divided into two parts: (I) to characterize the role of Prmt7 in control of oxidative muscle metabolism and muscle mass maintenance and (II) to characterize the role of Prmt7 in control of stem cell function during muscle regeneration. In the first part, Prmt7 is decreased in muscles from aging or muscle disuse model mice. In young animals, Prmt7-/- muscles show a shift toward glycolytic fibers, correlating with decreased mitochondrial contents and endurance exercise capacities. Prmt7 appears to be critical for induction of PGC-1α, a key regulator for mitochondrial biogenesis and function through regulation of p38MAPK/ATF2 activities. Taken together, Prmt7 is a novel regulator for maintenance of muscle mass and function via activation of p38MAPK/ATF2/PGC-1α. In the second part, to investigate the role of Prmt7 in control of muscle stem cell function during muscle regeneration, I have utilized the primary myoblasts, C2C12 myoblasts and the cardiotoxin (CTX)-induced injury mouse models. Prmt7 is expressed in muscle stem cells and Prmt7 deficient myoblasts exhibit decreased differentiation, while they proliferate faster than the control cells. Consistently, Prmt7 deficient-mice exhibit enhanced cell proliferation and delayed the expression of embryonic myosin heavy chain after injury, leading to regeneration defects. Prmt7 seems to regulate the MyoD-mediated gene expression through enhancing the recruitment of MyoD, BAF60c, Prmt5 and Brg1 to the E-box elements in the myogenin promoter. Furthermore, Prmt7 forms a complex with p38MAPK and regulates activation of p38MAPK through methylation of arginine 70 in p38MAPK. Taken together, Prmt7 is critical for activation of p38MAPK and MyoD-mediated myogenin expression upon differentiation. Thus, Prmt7 plays an essential role for the maintenance of muscle mass and function through control of muscle oxidative metabolism and muscle stem cell function during muscle repair.

Tyrosinase 분해 촉진을 통한 벌사상자 추출물의 멜라닌 생성 억제

이환진 성균관대학교 일반대학원 2020 국내석사

Cnidium monnieri (L.)의 과일은 생식기, 강직, 피부 관련 질병의 치료를 위해 동아시아 지역에서 소양증 치료, 항-알레르기, 향균 등의 활성을 갖는 전통 한방 원료로써 사용되어 왔다. 본 연구에서는 피부병에 효능을 나타내는 Cnidium monnieri fruit extract의 멜라닌 생성 억제 효능과 그 작용기전에 대해 밝히고자 연구를 진행하였다. Mouse melanoma 세포주인 B16F10 세포를 통해 Cnidium monnieri fruit extract 세포 독성을 확인하였고, 독성을 보이지 않은 농도 범위 내에서 멜라닌 함량 변화 실험을 수행한 결과 멜라닌 생성 억제 효능을 나타냄을 확인하였다. 이러한 현상이 세포 내 tyrosinase 활성의 직접적인 조절에 의한 것인지 아니면 세포 내 신호전달조절을 매개로 나타나는 것인지 알아보기 위하여 L-DOPA을 기질로 tyrosinase 활성 측정 실험을 진행하였다. 실험결과 tyrosinase 활성에는 전혀 영향을 주지 않는 것으로 확인되어 멜라닌 형성 신호 전달에 주요 조절 유전자인 MITF와 tyrosinase의 mRNA 및 단백질 발현을 확인하였다. Cnidium monnieri fruit extract 처리 시 MITF 및 tyrosinase의 mRNA 발현이 증가하였으며 동일한 양상으로 MITF 단백질 발현이 증가하였다. 하지만 tyrosinase의 경우 mRNA 발현 양상과 상이하게 Cnidium monnieri fruit extract 처리 시 단백질 발현이 감소하는 현상을 보였다. 이와 같은 결과를 토대로 tyrosinase의 post-translational regulation을 통해 멜라닌 생성 저해 효능을 나타내는 것이라는 가설을 세웠고, p38 MAPK에 의한 ubiquitin-proteasome pathway의 활성은 tyrosinase degradation을 촉진시킨다는 선행 연구에 기반하여 Cnidium monnieri fruit extract에 의한 p38 MAPK 활성 변화 여부를 확인하였다. Cnidium monnieri fruit extract 처리 시 p38 MAPK 단백질이 phosphorylation 되는 것을 확인하였다. 또한 Cnidium monnieri fruit extract에 의해 tyrosinase degradation이 유도되는지 확인을 위해 proteasome inhibitor인 MG132를 처리하여 tyrosinase 단백질 발현 변화를 확인하였다. 그 결과 MG132가 처리되지 않은 조건에서 α-MSH에 의해 증가한 tyrosinase 단백질 발현이 Cnidium monnieri fruit extract 처리 시 감소하는 반면에 MG132 처리된 조건에서는 α-MSH에 의해 증가한 tyrosinase 단백질 발현이 Cnidium monnieri fruit extract 처리 시 tyrosinase 단백질 발현 감소 양상이 억제되는 것을 확인하였다. 또한, Cnidium monnieri fruit extract를 분석하였을 때 osthol이라는 주 유효 성분을 찾아내었다. 본 연구를 종합하였을 때, Cnidium monnieri fruit extract에 대한 멜라닌 생성 억제 효능을 확인하였으며 이러한 효능은 p38 MAPK 활성화를 통한 tyrosinase 분해를 촉진함에 의한 것임을 규명하였다. 이를 통해 Cnidium monnieri fruit extract가 향후 피부 미백 개선 물질로써 발전할 수 있는 가능성을 시사한다. In this study, we investigated the anti-melanogenesis effect of Cnidium monnieri fruit extract and its underlying mechanism involved in suppression of melanin production in B16F10, a mouse melanoma cell lines stimulated with α-MSH. Cnidium monnieri fruit extract did not show a cytotoxicity up to 5 μg/ml, thus most of the experiments were conducted under 5 μg/ml. The α-MSH-stimulated melanin production was suppresed in the presence of 5 μg/ml Cnidium monnieri fruit extract. Moreover, cellular tyrosinase activities was inhibited in cells treated with Cnidium monnieri fruit extract. The mRNA expression of MITF and tyrosinase was increased after treatment with Cnidium monnieri fruit extract. However, tyrosinase showed a decrease in protein expression when Cnidium monnieri fruit extract was treated differently from mRNA expression. Based on these results, we hypothesized that the melanogenesis was inhibited by post-translational regulation of tyrosinase and it was confirmed though the change in p38 MAPK activity. The p38 MAPK protein was phosphorylated when Cnidium monnieri fruit extract was treated. Furthermore, proteasome inhibitor MG132 was treated to confirm the change of tyrosinase protein expression. As a result, the expression of tyrosinase protein increased by α-MSH was decreased in Cnidium monnieri fruit extract under MG132 treatment. Moreover, analysis of Cnidium monnieri fruit extract shows that the main active ingredient is osthol. Overall, we confirmed that anti-melanogenesis effect on Cnidium monnieri fruit extract due to promoting the degradation of tyrosinase through p38 MAPK activation. Cnidium monnieri fruit extract hope to be a valuable candidate for skin-whitening materials.

Negative regulation of the TGF-β1-mediated noncanonical TRAF6-TAK1-p38 MAPK/JNK pathway by Inhibitory Smad, Smad6

정수명 Sungkyunkwan University 2014 국내박사

Transforming growth factor (TGF)-β, a pivotal cytokine involved in a variety of cellular functions, transmits signals through Smad-dependent canonical and Smad-independent noncanonical pathways. In contrast to the canonical TGF-β pathway, it is unknown how noncanonical Transforming growth factor-beta (TGF-β) pathways are negatively regulated. Here we demonstrate that the inhibitory Smad Smad6, but not Smad7, negatively regulates TGF-β1-induced activation of the TRAF6-TAK1-p38 MAPK/JNK pathway, a noncanonical TGF-β pathway. TGF-β1-induced Smad6 abolished K63-linked polyubiquitination of TRAF6 through recruiting the A20 deubiquitinating enzyme in AML-12 mouse liver cells and primary hepatocytes. In addition, the knockdown of Smad6 or A20 in an animal model or cell culture system maintained TAK1 and p38 MAPK/JNK phosphorylation and increased apoptosis, emphasizing the crucial role of the Smad6-A20 axis in negative regulation of the TGF-β1-TRAF6-TAK1-p38 MAPK/JNK pathway. Therefore, our findings provide insight into molecular mechanisms underlying negative regulation of noncanonical TGF-β pathways.

STUDY ON THE NEUROPROTECTIVE EFFECT OF GHELIN AFTER SPINAL CORD INJURY

이지윤 연세대학교 대학원 2010 국내박사

Spinal cord injury (SCI) induces massive cell death leading to permanent neurological disability; no satisfactory treatment is currently available. Ghrelin, a gastric hormone, is known to stimulate growth hormone release from the hypothalamus and pituitary gland. Here, we examined that ghrelin administration improves functional recovery after SCI in part by inhibiting apoptosis of neurons and oligodendrocytes. Ghrelin was not detected in normal, uninjured spinal cord, but spinal cord neurons and oligodendrocytes expressed the ghrelin receptor. Ghrelin significantly inhibited apoptotic cell death of neurons and oligodendrocytes, release of mitochondrial cytochrome c and activation of caspase-3 after moderate contusion SCI. Ghrelin also significantly increased the level of phosphorylated extracellular signal-regulated kinase (p-ERK), but decreased the level of phosphorylated p38 mitogen-activated protein kinase (p-p38MAPK). In addition, ghrelin increased the level of ERK-dependent brain-derived neurotrophic factor expression and decreased the level of pro-nerve growth factor expression. Furthermore, the neuroprotective effects of ghrelin were mediated through the ghrelin receptor. Finally, ghrelin significantly improved functional recovery, and reduced the size of the lesion volume and the loss of axons and myelin after injury. These results suggest that ghrelin may represent a potential therapeutic agent following acute SCI in humans. Based on our recent evidences showing that ghrelin also inhibited oligodendrocyte cell death after SCI, we further examined the protective effect of ghrelin on apoptotic cell death of oligodendrocyte induced by hydrogen peroxide (H2O2) in primary oligodendrocyte culture. Primary oligodendrocyte expressed ghrelin receptor, GHS-R1a, after maturation. Treatment of H2O2 (1 mM) to mature oligodendrocyte induced apoptotic cell death and ghrelin treatment significantly inhibited the apoptotic cell death induced by H2O2. In addition, ghrelin treatment inhibited cytochrome c release followed caspase-3 activation after H2O2 treatment, which was mediated by ghrelin receptor, GHS-R1a. Treatment of H2O2 induced ERK activation (peaked at 8 h) and p38MAPK activation (peaked at 1 h), whereas JNK and Akt were not activated by H2O2 treatment. Furthermore, ERK activation was significantly increased whereas p38MAPK activation was decreased by ghrelin treatment as compared to control group, which were also dependent on GHS-R1a. When oligodendrocyte was treated with ERK inhibitor, PD98059 (20 μM) or p38MAPK inhibitor, SB203580 (10 μM), protective effect of ghrelin against H2O2-induced apoptotic cell death was abolished by PD98059, while oligodendrocyte cell survival was increased by SB203580. These results indicated that the ERK activation may be involved in the survival response, whereas p38MAPK activation may mediate death signaling pathway in oligodendrocytes cell death by H2O2 treatment. Conclusively, our data show that ghrelin protects H2O2-induced oligodendrocyte cell death via up-regulation of ERK activation and down-regulation of p38MAPK activation and ghrelin may represent a potential therapeutic agent for CNS injury by protection of oligodenrocytes.

일과성 국소허혈이 유도된 흰쥐의 뇌신경계에서 p38 MAPKs의 선별적인 발현 및 활성화에 대한 연구

박춘주 인하대학교 대학원 2001 국내석사

p38 mitogen activated protein kinases (MAPKs)는 MAPK 패밀리의 일종으로 다양한 조직 및 세포에서 염증과 세포사멸과정에 관여한다고 알려져 있다. 허혈 스트레스에 의한 신경세포 사멸과정에서 p38 MAPKs의 역할을 알아보기 위하여 Longa 방법을 변형하여 일과적 국소 뇌허혈 (transient focal cerebral ischemia) 동물모델을 만들고, 허혈-재관류 (ischemia-reperfusion) 과정에서 p38 MAPKs의 활성화양상과 단백질수준에서의 발현 및 조직에서의 세포와 세포 내 분포를 생화학적 및 면역조직화학적 염색법을 통하여 조사해 보았다. 일과적 국소 뇌허혈 및 재관류에 의한 p38 MAPKs의 아형 (isoform)인 p38α와 p38β의 단백질의 양적 변화는 없었지만 활성화양상은 허혈반구 (ipsilateral hemisphere)와 비허혈대조반구 (contralateral hemisphere)에서 각기 다르게 나타났다. 허혈반구에서의 두 아형의 활성화양상의 특징을 보면 공통적으로 두 차례에 걸쳐서 증가하는 양상을 보이는데 p38α는 재관류 10분과 1일에 피크를 이루고 p38β는 재관류 30분과 4일에 피크를 이룬다. 비허혈대조반구에서는 모두 재관류 진행시간에 따라 약간 증가하는 양상을 보인다. 면역조직 화학적 소견에서 p38α는 중추신경계 면역세포인 소교세포 (microglia)에서 발현되며 1일 경과하면 주로 허혈 중심부의 활성화된 소교세포에서 관찰되었고 4일이 되면 큰함식세포에서 관찰되었다 p38α가 발현되는 세포가 소교세포임을 GSA I-B4를 사용한 이중형광면역조직화학염색을 시행하여 검증하였다. p38β는 이른 시기에는 신경세포에서 발현되며 주로 핵과 수상돌기에 분포하였고 허혈-재관류 후 4일을 경과하면 허혈 경계부위 (penumbra/peri-infarct)의 활성화된 별아교세포 (astrocyte)에서 발현되었다. 이와 같이 p38 MAPKs가 허혈후 뇌신경계의 신경세포와 아교세포 (glial cell)에서 발현되는 것은 p38 MAPKs 신호전달계가 일과적 국소 뇌허혈 시 염증과정이나 신경세포사멸과정에 관여하는 것을 시사하며 p38α와 p38β는 각기 다른 시기와 부위 및 다른 세포에서 발현되는 것으로 보아 허혈손상과 회복과정에서 각기 선별적으로 작용할 것으로 생각된다. p38 mitogen-activated protein kinases (MAPK), also known as one of the stress activated protein kinases (SAPK), are induced by various cellular stresses both in vitro and in vivo. To understand the role of p38 MAPKs in brain enduring stroke. present study was designed to investigate the expression and activation of p38 MAPKs by using biochemical and histological approaches after middle cerebral artery occlusion (MCAO) in rat brain. The activation profiles of p38α and p38β in post-ischemic brain were biphasic. Increase of p38 MAPKs activity was observed within several minutes and also around a few days after ischemia in the ipsilateral hemisphere. However, there was no significant changes in the amounts of p38 proteins. Immunohistochemical studies indicated both p38α and p38β were induced in neurons as well as in glial cells after ischemia-reperfusion injury. p38α immunoreactivity was observed in resting/ramified microglia and neurons in sham-operated control. At the following day of reperfusion, a fully activated 038α-positive microglia infiltration was observed in the ischemic core. Over 4 days of reperfusion, the ischemic core was completely replaced by ameboid phagocytic p38α -positive microglia. On the contrary, there was an early (30 min) induction of p38 β immunoreactivity in neurons in MCA territory, in which p38β was preferentially expressed in nucleus. At 4 days after ischemia-reperfusion injury, p38β immunoreactivity was mainly observed in reactive astrocytes at the peri-infarct regions. In conclusion, enhanced expression and activation of p38α and p38β were observed in neurons and glial cells, localized in the Infarction core and penumbra, respectively. We, hence, speculate that p38 MAPKs participate in ischemia-associated neuronal death or in concomitant inflammation and gliosis in post-ischemic brain, in which the isoforms of p38 MAPKs may play differential roles.

Blockade of spinal p38 MAPK and NF-kB attenuates trigeminal neuropathic pain produced by mal-positioned dental implants in rats : 중추성 p38 MAPK와 NF-kB 차단에 의한 비정상적인 위치에 식립된 임플란트에 의한 발생하는 신경병증성통증 억제 효과

이민경 경북대학교 대학원 2011 국내박사

본 연구에서 치과 임프란트 시술 시 야기되는 신경병증 통증을 실험할 수 있는 동물 모델을 사용하여 두개안면영역의 신경병증 기전을 연구하였다. 실험 동물은 수컷 Spargue Dawley 흰 쥐 (몸무게 220~240g)를 사용하였다. 실험 동물을 마취한 다음, 아래턱 좌측 제 2대구치를 발거하고, 하치조관 손상을 위해 작게 만든 임프란트를 식립하였다. 실험 동물 모델을 이용하여 비정상적인 위치에 식립된 임프란트가 p38 MAPK와 NF-kB의 활성화를 통하여 신경병증성 이질 통증을 유발하는지를 확인하였다. 비정상적인 위치에 식립된 임프란트는 연수후각에서 신경손상 초기에 p-p38 MAPK를 증가시키고 후기에 p-NF-kB 발현을 증가시켰다. p38 MAPK 억제제인 SB203580과 NF-kB 억제제인 SN50를 처치한 다음 신경병증 통증 발생에 미치는 영향을 확인하였다. SB203580 혹은 SN50을 소뇌연수조로 각각 3일과 21일째에 주입하면 신경손상으로 유발되는 기계적 이질통증을 효과적으로 경감시키는 것을 관찰할 수 있었다. 또한 연수후각에서 p-p38 MAPK 와 p-NF-kB 발현을 유의하게 감소시켰다. Dexamethasone의 진통작용과 p38 MAPK 와 NF-kB 활성의 연관성을 확인하였다. 비정상적인 위치에 임프란트를 식립하고 통증이 발생하기 시작하는 1일째부터 3일간 dexamethasone을 처치한 동물에서 p-p38 MAPK 와 p-NF-kB 발현의 유의한 경감을 확인할 수 있었다. 이러한 실험결과는 비정상적인 위치에 식립한 임플란트가 p-p38 MAPK 와 p-NF-kB 증가시킴으로써 신경병증 통증 조절에 관여함을 보여주었고, SB203580와 SN50 및 dexamethasone 처치는 p38 MAPK 와 NF-kB의 발현을 억제시켜 신경병증 통증을 유의하게 억제할 수 있다는 것을 말해 준다. 따라서 두개안면영역에서 발생되는 신경병증성 통증 조절에 p38 MAPK 와 NF-kB 의 차단은 새로운 치료전략으로 제시될 수 있다. The present study investigated that nerve injury by mal-position dental implants induce the activation of p38 MAPK or NF-kB and their activation is involved in development and maintenance of neuropathic pain in rats. The present study has characterized the spatial and temporal expression of p38 MAPK or NF-kB in the MDH of rats with trigeminal neuropathic pain caused by inferior alveolar nerve injury. Double immunofluorescence revealed that p38 MAPK phosphorylation following mal-positioned dental implants was increased in microglia following nerve injury and peaked on POD 3 and then, gradually decreased thereafter. However, activation of NF-kB in astrocytes was peaked on POD 7 and sustained POD 21. Western blotting was also showed increase of p38 MAPK and NF-kB phospholylation after nerve injury at same time point. SB203580 (1 or 10 ug), when intracisternally administered on POD 3, markedly inhibited mechanical allodynia and the p-p38 MAPK expression induced by nerve injury. However, intracisternal administration of SN50 (0.2 or 2 ng) on POD 21 attenuated mechanical allodynia and the p-NF-kB expression. Dexamethasone (25 mg/kg) decreased not only the increased p-p38 MAPK on POD 3 but also p-NF-kB on POD 7, when it was administered intraperitoneally once daily for 3 consecutive days, beginning 1 day after surgery. Taken together, these findings indicate that the spatial and temporal blockade of p38 MAPK or NF-kB might be a potential therapy for trigeminal neuropathic pain.