Epstein-Barr virus 감염 B 세포에서 miR-22에 의한 p21Waf1/Cip1의 발현 조절

송경주 연세대학교 대학원 2012 국내석사

국소 진행성 유방암 환자에서 p21waf1/cip1과 p27의 발현과 예후와의 관계

이혜란 연세대학교 대학원 2004 국내석사

유방암은 생물학적 특성이 매우 다양하여 예후에 영향을 미치는 인자도 다양하다. p21waf1cip1과 p27은 세포 주기 조절에 관여하는 단백질로서 몇몇 고형암에서 예후와 관련되어 있는 것으로 알려져 있다. p21waf1cip1과 p27은 이들 단백질의 존재 부위, 즉 핵에 존재하는지 세포질에 존재 하는지에 따라 그 예후가 다르게 나타난다. 이들이 핵에 존재하는 경우는 예후가 좋지만 세포질에 존재하는 경우는 예후가 불량한 것으로 알려져 있다. 그 이유는 p21waf1cip1 또는 p27이 핵에 있는 경우는 CDKI (cyclin dependent kinase inhibitor)로 작용하여 세포 성장을 억제하지만 세포질에 존재하는 경우는 항아포토시스 역할을 하여 세포 성장을 증가하게 하기 때문이다. 이에 저자들은 수술 전 항암요법을 시행 받은 50명의 국소 진행성 유방암 환자를 대상으로 하여 면역조직화학염색을 통하여 p21waf1cip1과 p27발현 부위에 따른 항암제에 대한 반응성 및 예후와의 상관성을 조사하였다. 진단 당시의 임상적 병기와 수술 전 항암요법 시행 후 수술 조직에서의 병리학적 병기를 비교한 결과 p21waf1cip1발현이 음성인 환자의 75%, 발현이 핵인 환자의 54%, 발현이 세포질인 환자의 42%에서 항암치료 후 병기가 감소되어 세포질에서의 발현이 항암치료에 대하여 저항성이 있는 경향을 보였다(p=0.20). 2년 무병 생존율과 5년 생존율은 p21waf1cip1이 세포질에서 발현되는 환자에서 증가되는 경향을 보였다 (p=0.39)(p=0.19). p27 발현 부위에 따른 항암치료 후 병기의 감소는 큰 차이가 없었다(p=0.98). 하지만 p27의 발현이 세포질인 경우 발현이 핵과 음성인 경우보다 재발률이 높은 경향을 보였다(p=0.19). p27의 발현이 음성, 핵, 세포질인 환자의 2년 무명 생존율은 각각 65%, 75%, 28%로 p27 발현이 세포질인 환자의 2년 무병 생존율이 가장 나쁜 경향을 보였으며(p=0.13), 5년 생존율도 p27의 발현이 음성, 핵, 세포질인 환자에서 각각 68%, 50%, 24%로 p27 발현이 세포질인 환자에서 5년 생존율이 불량한 경향을 보였다(p=0.83). 위의 결과를 보면 수술 전 항암치료를 시행 받은 국소 진행성 유방암 환자에서 p21waf1cip1 세포질 발현은 항암치료에 대한 저항성을 나타내는 경향이 있어 항암제에 대한 반응성의 예측인자로서의 가능성을 시사하며, p27의 세포질 발현 시 생존율이 감소되는 경향을 보여 p27은 예후인자로서의 가능성을 보여 주었다. Breast cancers have heterogeneous characteristics that affect their prognosis. The presence of the cyclin dependent kinase inhibitors (CDKI) p21waf1cip1 and p27 is related to the prognosis of some solid tumors and hematologic malignancies. Recent studies indicate that there is a strong correlation between the inhibition of cell growth and the presence of p21waf1cip1 and p27 within the nucleus. It has been shown that p21waf1cip1 and p27 can reside in the cytoplasm, where they play a role in protecting cells against apoptosis. Therefore, the cytoplasmic location of p21waf1cip1 and p27 can indicate a poor prognosis. To investigate the value of p21waf1cip1 and p27 as predictive and prognostic markers in breast cancer, we performed immunohistochemical staining with tissues from 50 patients who were diagnosed with locally advanced breast cancer and had undergone preoperative chemotherapy and surgery. We evaluated the correlation between the response to preoperative chemotherapy, the prognosis, and the expression of p21waf1cip1 and p27 in these patients. We observed down-staging in 75% of the p21waf1cip1 negative patients, 54% of the nuclear p21waf1cip1 patients, and 42% of the cytoplasmic p21waf1cip1 patients after neoadjuvant chemotherapy. This study shows that patients with the cytoplasmic p21waf1cip1 may be less responsive to chemotherapy than other groups (p=0.20). 2-year disease free survival (DFS) and 5-year survival rates seemed to be increased in the cytoplasmic p21waf1cip1 group (p=0.39)(p=0.19). Down-staging after neoadjuvant chemotherapy was not significantly different in three groups according to p27 expression (p=0.98). 2-year DFS rates for the negative p27, the nuclear p27, and the cytoplasmic p27 were 65%, 75%, and 28%, respectively (p=0.13). 5-year survival rates for the negative p27, the nuclear p27, and the cytoplasmic p27 were 68%, 50%, and 24%, respectively (p=0.83). In conclusion, though it was not statistically significant, there was an indication that patients with the cytoplasmic p21waf1cip1 are less responsive to chemotherapy than those with the nuclear p21waf1cip1 and the negative p21waf1cip1. Our study also shows that the cytoplasmic p27 patients tend to have the worst prognosis. It may require further study to confirm these findings with a larger number of patients.

국소 진행성 유방암 환자에서 p21^(waf1/cip1)과 p27의 발현과 예후와의 관계

이혜란 연세대학교 대학원 2003 국내석사

유방암은 생물학적 특성이 매우 다양하여 예후에 영향을 미치는 인자도 다양하다. p21^(waf1/cip1)과 p27은 세포 주기 조절에 관여하는 단백질로서 몇몇 고형암에서 예후와 관련되어 있는 것으로 알려져 있다. p21^(waf1/cip1)과 p27은 이들 단백질의 존재 부위, 즉 핵에 존재하는지 세포질에 존재 하는지에 따라 그 예후가 다르게 나타난다. 이들이 핵에 존재하는 경우는 예후가 좋지만 세포질에 존재하는 경우는 예후가 불량한 것으로 알려져 있다. 그 이유는 p21^(waf1/cip1) 또는 p27이 핵에 있는 경우는 CDKI (cyclin dependent kinase inhibitor)로 작용하여 세포 성장을 억제하지만 세포질에 존재하는 경우는 항아포토시스 역할을 하여 세포 성장을 증가하게 하기 때문이다. 이에 저자들은 수술 전 항암요법을 시행 받은 50명의 국소 진행성 유방암 환자를 대상으로 하여 면역조직화학염색을 통하여 p21^(waf1/cip1)과 p27발현 부위에 따른 항암제에 대한 반응성 및 예후와의 상관성을 조사하였다. 진단 당시의 임상적 병기와 수술 전 항암요법 시행 후 수술 조직에서의 병리학적 병기를 비교한 결과 p21^(waf1/cip1)발현이 음성인 환자의 75%, 발현이 핵인 환자의 54%, 발현이 세포질인 환자의 42%에서 항암치료 후 병기가 감소되어 세포질에서의 발현이 항암치료에 대하여 저항성이 있는 경향을 보였다( p=0.20). 2년 무병 생존율과 5년 생존율은 p21^(waf1/cip1)이 세포질에서 발현되는 환자에서 증가되는 경향을 보였다( p=0.39)( p=0.19). p27 발현 부위에 따른 항암치료 후 병기의 감소는 큰 차이가 없었다( p=0.98). 하지만 p27의 발현이 세포질인 경우 발현이 핵과 음성인 경우보다 재발률이 높은 경향을 보였다( p=0.19). p27의 발현이 음성, 핵, 세포질인 환자의 2년 무명 생존율은 각각 65%, 75%, 28%로 p27 발현이 세포질인 환자의 2년 무병 생존율이 가장 나쁜 경향을 보였으며( p=0.13), 5년 생존율도 p27의 발현이 음성, 핵, 세포질인 환자에서 각각 68%, 50%, 24%로 p27 발현이 세포질인 환자에서 5년 생존율이 불량한 경향을 보였다( p=0.83). 위의 결과를 보면 수술 전 항암치료를 시행 받은 국소 진행성 유방암 환자에서 p21^(waf1/cip1) 세포질 발현은 항암치료에 대한 저항성을 나타내는 경향이 있어 항암제에 대한 반응성의 예측인자로서의 가능성을 시사하며, p27의 세포질 발현 시 생존율이 감소되는 경향을 보여 p27은 예후인자로서의 가능성을 보여 주었다. Breast cancers have heterogeneous characteristics that affect their prognosis. The presence of the cyclin dependent kinase inhibitors (CDKI) p21^(waf1/cip1) and p27 is related to the prognosis of some solid tumors and hematologic malignancies. Recent studies indicate that there is a strong correlation between the inhibition of cell growth and the presence of p21^(waf1/cip1) and p27 within the nucleus. It has been shown that p21^(waf1/cip1) and p27 can reside in the cytoplasm, where they play a role in protecting cells against apoptosis. Therefore, the cytoplasmic location of p21^(waf1/cip1) and p27 can indicate a poor prognosis. To investigate the value of p21^(waf1/cip1) and p27 as predictive and prognostic markers in breast cancer, we performed immunohistochemical staining with tissues from 50 patients who were diagnosed with locally advanced breast cancer and had undergone preoperative chemotherapy and surgery. We evaluated the correlation between the response to preoperative chemotherapy, the prognosis, and the expression of p21^(waf1/cip1) and p27 in these patients. We observed down-staging in 75% of the p21^(waf1/cip1) negative patients, 54% of the nuclear p21^(waf1/cip1) patients, and 42% of the cytoplasmic p21^(waf1/cip1) after neoadjuvant chemotherapy. This study shows that patients with the cytoplasmic p21waf1/cip1 may be less responsive to chemotherapy than other groups ( p=0.20). 2-year disease free survival (DFS) and 5-year survival rates seemed to be increased in the cytoplasmic p21^(waf1/cip1) group ( p=0.39)( p=0.19). Down-staging after neoadjuvant chemotherapy was not significantly different in three groups according to p27 expression ( p=0.98). 2-year DFS rates for the negative p27, the nuclear p27, and the cytoplasmic p27 were 65%, 75%, and 28%, respectively ( p=0.13). 5-year survival rates for the negative p27, the nuclear p27, and the cytoplasmic p27 were 68%, 50%, and 24%, respectively ( p=0.83). In conclusion, though it was not statistically significant, there was an indication that patients with the cytoplasmic p21^(waf1/cip1) are less responsive to chemotherapy than those with the nuclear p21^(waf1/cip1) and the negative p21^(waf1/cip1). Our study also shows that the cytoplasmic p27 patients tend to have the worst prognosis. It may require further study to confirm these findings with a larger number of patients.

Expression of viral microRNAs during primary infection of Epstein-Barr virus in B cells

이정화 Graduate School, Yonsei University 2006 국내석사

MicroRNA (miRNA)는 약22뉴클레오타이드로 이루어진 작은 비번역 RNA로 전사후 단계에서 진핵세포의 유전자 발현을 조절한다. MiRNA는 표적 mRNA의3''-UTR에 염기서열 특이적으로 결합하여 표적mRNA의 분해나 번역 억제를 유도하며, 세포의 증식이나 분화, 세포사멸, 발달과정에서 중요한 역할을 하는 유전자의 발현을$$a$$a조절한다고 알려져 있다.$$a$$a최근에 바이러스가 miRNA를 발현하고 있음이 밝혀졌다. MiRNA를 발현하는 바이러스로 최초로 보고된 Epstein-Barr virus (EBV)는 BHRF1 mRNA와 BART 인트론에 존재하는 5 개의 miRNA를 발현하며 세포 증식과 사멸의 조절자, B 세포 특이적인 케모카인과 사이토카인,$$a$$a전사 조절자, 신호 전달 경로에서 역할을 하는 물질이 바이러스$$a$$amiRNA의 표적으로 예측되었다.$$a$$a바이러스 miRNA의 발견은 바이러스가 숙주와 바이러스의 유전자$$a$$a조절과 바이러스에 대한 숙주의 방어 기작 조절에서 RNA 침묵 기작을 이용함을 나타낸다. EBV miRNA는 바이러스 복제, 잠복감염, B 세포 형질전환과 종양 형성에 관여하여 중요한 역할을 할 것으로 예상된다.$$a$$a본 연구에서는 EBV의 B 세포 초기 감염 과정에서 EBV miRNA의 발현을 조사하기 위하여 EBV-negative Burkitt''s lymphoma (BL) 세포주인 Akata 세포주에 EBV를 감염시키고 시간별로 EBV miRNA의 발현을 조사하였다. Microinspector를 통해 mir-BHRF1-3의 표적으로 예측된 p21waf1 의 발현을 mir-BHRF1-3을 발현하는 EBV-positive 세포에서 조사하였고, EBV 감염 세포에서 mir-BHRF1-3가 세포주기 진행과 세포사멸에 미치는 영향을 알아보기 위해 mir-BHRF1-3을 발현을 2''-OMe-mir-BHRF1-3로 저해 후 유도되는 세포사멸의 변화를$$a$$a살펴보았다.$$a$$amir-BHRF1의 발현이 감염 6시간 후부터 관찰되는 것을 Northern blot을 통해 확인하였다. 즉, mir-BHRF1은 EBV의 B 세포 감염 초기 과정에서 발현되어 EBNA2와 EBNA-LP와 같이 초기 감염 단계에서 바이러스와 숙주 세포의 유전자 발현을 조절하는 기능을 할 것으로$$a$$a예측되었다.$$a$$amir-BHRF1-3의 발현 저해 결과 EBV 감염 B 세포에서 세포사멸의 증가가 유도었으며 mir-BHRF1-3을 발현하는 세포에서 DNA 손상 물질인 cisplatin에 의해 유도되는 p21WAF1의 발현을 조사한 결과 높은 수준으로 mir-BHRF1-3을 발현하는 LCL-1 세포에서는 p21WAF1 단백질의 발현이 cisplatin에 의해 유도되지 않았으나, mir-BHRF1-3의 발현량이 낮은 IB4 세포의 경우에는 p21WAF1 단백질의 발현이 증가하는 것이 관찰되었다. 반면, p21WAF1 mRNA의 발현은 LCL-1과 IB4 세포에서 모두 cisplatin에$$a$$a의해 증가된 것으로 나타났다.$$a$$a이상의 결과는 EBV 감염초기에 발현되는 mir-BHRF1-3가 전사후 단계에서 p21WAF1 발현의 조절을 통해 EBV 감염 세포의 세포사멸 유도를 막고 세포주기의 계속적인 진행을 유도함으로써 바이러스가 효과적인$$a$$a감염을 이룩하는데 작용하고 있다는 것을 시사한다.$$a$$aMicroRNAs (miRNAs) are single-stranded RNAs (ssRNAs) of 19?25 nucleotides and regulate gene expression at the posttranscriptional level by base pairing with$$a$$atarget mRNAs, which leads to mRNA cleavage or translational repression.$$a$$aRecently, many virus-encoded miRNAs have been identified, but the functions of most virus-derived miRNAs are unknown. The identification of virus-encoded miRNAs implicates that viruses would employ RNA silencing mechanism in the regulation of host and viral gene expression and host immune defense mechanism. Epstein-Barr virus (EBV) is the first virus demonstrated to encode miRNAs and encodes five miRNAs located in BHRF1 mRNA and intronic regions of the BARTs.$$a$$aNorthern blot analysis of reported five EBV miRNAs in cell lines of different latency types was performed to analyze expression pattern of EBV miRNAs. Mir-BHRF1s were detected in all different latent cell types tested; at significant levels in B95.8 cells but at only low levels in other cells, such as Rael, Mutu III, IM9wt and IM9mt. Mir-BARTs were detected in B95.8 and Rael cells. There was no significant difference between latent infected cells and lytic cycle-induced B95.8 cells.$$a$$aIn this study, to investigate the expression pattern of EBV miRNAs in early infection of B cells, Akata, a EBV-negative Burkitt''s lymphoma (BL) cell line, was infected with EBV and time course expression of EBV miRNAs was analyzed following infection. Mir-BHRF1s were expressed during an initial infection step. Mir-BHRF1s were coordinately expressed with EBNA2 that was also expressed in an early infection step.$$a$$aTo determine the function of mir-BHRF1-3 on predicted target p21WAF1, p21 WAF1 expression was investigated in EBV-positive cells which express mir-BHRF1-3, and the effect of mir-BHRF1-3 on cell cycle progression and apoptosis was analyzed in EBV-infected B cells. 2''-O-methyl oligonucleotides, specifically inhibiting individual miRNAs, were transfected into EBV negative Akata cells and then these transfectants were infected with EBV. 2''-OMe-mir-BHRF1-3 resulted in an increase of apoptosis, implicating that mir-BHRF1-3 functions in cell survival maintenance. A DNA damaging agent, cisplatin, failed to induce p21WAF1? protein expression in LCL-1 cells representing high level of mir-BHRF1-3 expression, whereas induced increased expression of p21WAF1? in IB4 cells with low level of mir-BHRF1-3 expression. However, expression of p21WAF1? mRNA induced by cispatin was shown to be increased in both cells. Thus, these data suggest that mir-BHRF1-3 functions in blocking apoptosis and maintaining cell survival through the regulation of 21WAF1 expression at the posttranscriptional level. Through inhibition of 21WAF1 expression, mir-BHRF1-3 can induce EBV-infected cells to bypass G1/S checkpoint and therefore contribute to maintenance of EBV latent infection and EBV-induced tumorigenesis.$$a$$aMir-BHRF1s were expressed in initial infection phase and coordinately expressed with EBNA2. Mir-BHRF1-3 induced cell survival maintenance, regarded as participating in latent infection maintenance and EBV-associated tumorigenesis by regulating cell cycle checkpoint.$$a$$a

H2O2에 의한 세포조기노화 모델에서 actin의 핵 내 이동과 p21WAF1의 세포질로의 이동

김연주 아주대학교 2006 국내석사

목적 : 세포는 오랫동안 스트레스에 노출될 경우 조기노화가 유도된다. 이를 stress-induced premature senescence라 부른다. 자외선, 약물 또는 cytokine등 세포외의 자극에 의한 스트레스나 DNA 손상에 의한 스트레스에 의해 조기노화가 유도되는데, 이 경우 세포 내 활성 산소의 증가가 동반되는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 human diploid fibroblast (HDF) 1차 배양체에 산화적 스트레스의 매개체의 일종인 H2O2를 한 번 또는 반복적으로 투여하여 유도되는 세포의 조기노화 과정에서 나타나는 세포의 변화를 다음의 세 가지 측면에서 연구하고자 하였다. 첫째, 세포의 형태적 변화와 노화와 관련된 유전자 발현을 조사하였다. 둘째, 노화의 마커로 보고된바 있는 actin의 핵 내 이동현상이 H2O2에 의한 산화적 스트레스에 의해서도 반응하는지를 조사하였다. 마지막으로 세포노화 유도에 관여하는 것으로 알려져 있는 cyclin-dependent kinase inhibitor인 p21WAF1의 발현정도와 세포 내 위치에 대해 젊은 세포와 노화가 진행되는 세포에서 H2O2에 대한 반응성의 차이를 조사하였다. 재료 및 방법 : 어린 남아의 포피로부터 분리한 human diploid fibroblast에 H2O2를 200 µM의 농도로 한 번 또는 반복적으로 처리하였다. 세포주기는 propidium iodide로 DNA를 염색하여 fluorescence activated cell sorting (FACS)을 통해서 측정하였으며, reactive oxygen species 생성은 2',7'- dichlorofluorescin diacetate로 염색하여 FACS를 통해서 측정하였다. 단백질의 발현과 세포 내 위치변화는 immunoblotting과 면역형광염색을 수행하여 측정하였다. 세포노화가 진행된 정도는 senescence associated-β-galactosidase (SA-β-gal)의 활성으로 측정하였다. 결과 : 1. H2O2를 한 번 처리한 경우에는 시간이 경과함에 따라 세포의 크기가 커지면서 평평해지는 노화된 세포의 모양을 관찰하였지만 SA-β-gal의 활성은 H2O2를 처리한 후 3일까지 관찰할 수 없었다. 2. H2O2를 반복적으로 처리한 경우 H2O2 처리 횟수에 따라 세포질이 감소하고 긴 filopodia를 형성하면서 일부 세포가 죽는 것이 관찰되었지만 살아있는 세포의 일부분은 SA-β-gal의 활성을 나타내었다. 3. H2O2를 한 번 처리한 경우에는 일시적인 G2/M 정지를 보이는 반면 반복적인 H2O2의 처리는 지속적인 G2/M 정지현상을 보였다. 4. 노화의 마커로 보고된 actin의 핵 내 이동현상은 산화적 스트레스의 일종인 H2O2를 처리한 경우에도 관찰되었으며, 이때 핵 내 축적된 actin이 단량체 actin임을 알 수 있었다. 6. H2O2에 의해 유도되는 p21WAF1의 발현은 노화가 진행된 세포보다는 젊은 세포에서 H2O2 처리 횟수에 비례하여 발현양이 증가하는 것을 관찰하였다. 7. H2O2 처리 후 p21WAF1의 세포질로의 이동은 젊은 세포와 노화가 진행된 세포에서 공통적으로 관찰되었다. 결론 : HDF 세포에 H2O2를 한 번 또는 반복적으로 처리하였을 경우 정상세포에 비해 세포의 성장은 현저히 감소되었다. 그러나 세포의 형태변화와 SA-β-gal의 활성에는 차이를 보였다. H2O2를 한 번 처리 후 3일에 세포형태는 노화의 표현형을 보였지만 SA-β-gal 활성은 관찰할 수 없었다. H2O2의 반복처리는 세포질의 감소와 긴 filopodia 형성을 유도하면서 세포사멸이 관찰되었고 일부 살아남은 세포는 SA-β-gal 활성을 나타내었다. 노화된 세포에서 관찰되는 actin의 핵 내 이동은 H2O2에 의한 산화적 스트레스에 의해서도 나타났으며, p21WAF1의 발현은 노화된 세포에 비해 젊은 세포에서 H2O2를 처리한 횟수에 의존적으로 발현양이 증가하는 것을 관찰하였다. H2O2에 의한 p21WAF1의 세포질로의 이동은 젊은 세포와 노화세포 모두에서 공통적으로 나타나는 현상임을 알 수 있었다. 이 결과로 H2O2에 의한 산화적 스트레스로 세포의 조기노화를 유도할 때 H2O2의 투여 정도에 따라 조기노화 유도 양상이 달라짐을 알 수 있었고, actin의 핵 내 이동과 p21WAF1의 발현 증가 및 세포질로의 이동은 H2O2에 의한 산화적 스트레스 유도 조건에서 공통적으로 나타나는 현상임을 알 수 있었다.

세포 노화에 관한 새로운 조절자로서 ZNF313 확인

김유리 고려대학교 대학원 2010 국내석사

화학 물질, 독성 혹은 방사선과 같은 피해의 다양한 종류에 대한 반응으로, 세포는 더 이상 유사분열 세포 주기를 유도할 수 없게 되고, 세포성 노화라고 불리는 특정한 단계로 들어가게 된다. 그러므로, 세포성 노화란 암의 성장을 야기할 수 있는 비 정상적인 증식을 막는 세포 고유의 보호 메커니즘 이라고 여겨질 수 있다. 이전에, 우리는 pro-apoptotic 기능을 통해 암의 발달을 막을 수 있는 XAF1을 보고하였으며, 이는 RING과 DNA binding domain을 가진 zinc finger protein 인 ZNF313 (RNF114라고도 알려짐)과 연관되어 있다. 그러나, 이 ZNF313 단백질의 암 발달에서의 정확한 역할은 밝혀지지 않았다. 이번 연구에서, 우리는 ZNF313이 사람의 종양 세포에서 p21waf1의 양성 조절을 통해 복제하는 세포성 노화와 연관되어 있다는 것을 보고하고 있다. HCT116 (결장 종양) 과 PC-3 (전립선 종양) 세포를 사용하여, 우리는 si-RNA에 의해 매개된 분해로 ZNF313의 발현이 막히게 되면 세포의 증식이 농도와 시간에 의존된 방식으로 억제되는 것을 발견하였다. 흥미롭게도, SA-β-gal이 양성 착색되고 납작하게 퍼진 세포의 수는 ZNF313 발현의 저하에 의해 상당하게 증가된다. 또한 유세포 분석기를 통한 연구에서 ZNF313 발현을 막는 것은 세포 주기의 G1 단계의 저해를 일으킨다고 조사되었다. 게다가, 이러한 ZNF313 발현의 저하에 의해 유도된 모든 노화 표현형들은 p21waf1의 증가된 발현이 동반되며, 이는 세포성 노화를 조절하기 위한 ZNF313의 특성은 p21waf1에 대한 영향과 관계될 수 있다는 것을 제시한다. 결과적으로, 우리의 자료들은 ZNF313이 세포성 노화의 조절자로서 중요한 역할을 할 수 있다는 것과 그러므로 새로운 항암 치료제의 계발하기 위한 유용한 표적이 된다는 것을 제시한다. In response to various types of damage, such as chemical, toxin, or radiation, cells are no longer able to drive their mitotic cell cycle and go into the specific stage called cellular senescence. Therefore, the cellular senescence could be regarded as an intrinsic protection mechanism of cells preventing abnormal proliferation which could cause a cancerous growth. Previously, we reported that XAF1 could prevent tumor progression via its pro-apoptotic activity and interacts with ZNF313 (also known as RNF114), a zinc finger protein containing RING and DNA binding domain. However, the precise role of ZNF313 in tumorigenesis has not been elucidated. The present study demonstrates first that ZNF313 involves in cellular senescence of human cancer cells via the negative regulation of p21Waf1. Using HCT116 (colon cancer) and PC-3 (prostate cancer) cells, I found that blockade of ZNF313 expression by siRNA-mediated knockdown suppressed cell proliferation in dose- and time-dependent manner. Interestingly, the number of SA-β-gal staining positive and flatten cells was significantly increased by knockdown of ZNF313 expression. Flow cytometry analysis also revealed that suppression of ZNF313 expression leads to a G1 arrest of the cell cycle. Additionally, all these senescence phenotypes induced by ZNF313 knockdown was accompanied with increased expression of p21Waf1, suggesting that ZNF313’s capability to regulate cellular senescence might be associated with its effect on p21Waf1 expression. Collectively, these data suggest that ZNF313 might play a crucial role as a regulator of cellular senescence, and thus be a valuable target for the development of novel anticancer therapeutics.

Suppressive effect of Morin on human bladder cancer EJ cells

원세연 중앙대학교 대학원 2016 국내석사

Morin은 항균성, 항진균성, 항염증 효과를 포함한 다양한 약리효과가 있는 것으로 알려져 있다. 그러나, 방광암 세포에 대한 Morin의 증식, 침윤, 전이에 대한 억제효과와 작용기전에 대에서는 잘 알려져 있지 않다. 본 연구는 인체 방광암세포 (EJ 세포)에 대한 Morin의 증식, 침윤, 전이에 대한 억제효과와 작용기전을 확인하고, 나아가 암의 발생을 억제할 수 있는 소재 가능성에 대해 탐색하고자 수행하였다. 첫 번째로 방광암 EJ 세포에 대한 Morin의 증식억제 효과를 알아보기 위해 MTT assay를 수행하였다. 그 결과, Morin을 처리하였을 때 농도 의존적으로 EJ 세포의 성장을 억제하는 것을 확인하였다. 이러한 성장 억제 효과에 대한 기전을 알아보기 위해 FACS를 수행한 결과 세포주기의 G0/G1 cell cycle arrest가 유도되는 것을 확인하였고, 이와 같은 결과는 세포주기 조절 단백질인 cyclinD1, cyclinE, CDK2, CDK4의 발현감소와 p21WAF1의 발현 증가에 기인하는 것을 확인하였다. 또한, Morin을 처리하였을 때 세포의 증식과 전이에 관여한다고 알려진ERK1/2의 인산화 증가, AKT의 인산화 감소가 확인되었고, JNK와 p38MAPK의 변화는 없었다. 또한 EJ 세포에 대한 Morin의 전이와 침윤의 억제능을 확인하기 위해 wound healing assay와 invasion assay를 수행하였으며, 그 결과 시간-농도 의존적으로 방광암세포의 전이와 침윤 능력이 억제 되는 것을 확인하였다. 방광암세포의 전이와 침윤 작용기전을 알아보기 위해 zymography를 수행한 결과 Morin을 처리하였을 때, 기질금속단백질분해효소인 MMP-9과 MMP-2의 활성이 억제가 되는 것을 확인하였고, 이는 전사인자인 AP-1, Sp-1and NF-κB의 활성감소로 인한 것임을 확인하였다. 결론적으로, 본 연구를 통해 Morin의 방광암세포에 대한 증식, 침윤, 전이 억제 작용능력을 확인하였으며, 이는 세포주기 조절 단백질인 cyclinD1, cyclinE, CDK2, CDK4의 발현 감소, p21WAF1의 발현 증가와 ERK1/2, AKT signaling과 연관이 있음을 확인하였다. 또한 전사인자 AP-1, Sp-1과 NF-κB의 활성억제로 인한 MMP-9의 발현감소로 인해 세포의 전이가 억제하는 것을 확인하였다. 이와 같은 결과는 방광암의 예방 및 치료에 있어 Morin의 사용 가능성을 나타내는 중요한 기초자료로써 제공 될 수 있을 것으로 생각된다. The morin has showed various pharmacological effects including antibacterial, antifungal, and anti-inflammatory effect. In this study, we investigated the effect of morin on bladder cancer EJ cells. Morin treatment inhibited cell growth in EJ cells using a MTT assay. These inhibitory effects were associated with reduced expression of cyclin D1, cyclin E, CDK2 and CDK4 via increased expression of p21WAF1 in EJ cells. In addition, treatment with morin increased ERK1/2 phosphorylation and decreased JNK and AKT phosphorylation without altering the phosphorylation level of p38MAPK. Moreover, morin treatment suppressed the migration and invasion of EJ cells as demonstrated by wound-healing assay and transwell plate invasion assay. Furthermore, zymography analyses demonstrated that treatment of morin suppressed the expression of matrix metalloproteinase-9 (MMP-9). Collectively, these results demonstrated that morin reduced cyclin D1, cyclin E, CDK2 and CDK4 expression through the induction of p21WAF1 expression, increased ERK1/2 phosphorylation and decreased JNK, and AKT phosphorylation, and prevented MMP-9 expression by the inhibition of transcription factors AP-1, Sp-1, and NF-κB in EJ cells, which led to the inhibition of growth and migration in bladder cancer EJ cells. These results might provide a novel insight in the use of morin for the prevention of bladder cancer.

Development of analytical method for esculetin in medicinal plants using LC-MS/MS and esculetin-induced growth inhibition effect in vascular smooth muscle cells

윤은선 건국대학교 대학원 2012 국내박사

A liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) analysis method was developed to determine the contents of esculetin in medicinal plants. The analysis was performed using multiple reaction monitoring (MRM) in negative mode, and an XBridgeTM C18 column (2.1×100 mm, 3.5 m) was used. Methanol and 0.1% formic acid were used for gradient analysis. The calibration curve showed good linearity (r2>0.9993). The limit of detection (LOD) and limit of quantitation (LOQ) were 0.02 and 0.07 ng/ml respectively. The intra- and inter-day precisions were 1.5-6.8% and 2.0-5.3%, respectively, and the accuracy was 102.0-110.2%. The contents of esculetin in 35 different plants were determined, and Fraxini cortex showed the highest content of esculetin (761.5-5,475.0 mg/kg). In Mori folium and Artemisiae capillaris herba, 5.2-21.5 mg/kg and 7.0-17.6 mg/kg of esculetin were found, respectively. In other medicinal plants, no esculetin was detected, or it was present at a concentration less than 10 mg/kg. The analysis method appears to be simple, sensitive, and reproducible. The pharmacological effects of esculetin isolated from medicinal plants were investigated as part of the new medicines development. Esculetin is known to inhibit the proliferation of vascular smooth muscle cells (VSMC). However, the signaling pathway by which esculetin mediates its molecular effects in VSMC remains to be identified. The present results suggest an unexpected role of the p38 MAPK signaling pathway in esculetin-induced inhibition of VSMC growth. Treatment of VSMC with esculetin resulted in significant growth inhibition and G1-phase cell cycle arrest, which was followed by down-regulation of cyclins and cyclin-dependent kinase (CDK) expression. This G1-phase cell-cycle arrest was due to up-regulation of p21WAF1 expression. In addition, esculetin treatment activated p38 MAPK and ERK1/2. Pretreatment with SB203580, which is a p38 MAPK specific inhibitor, or expression of the dominant negative p38 MAPK (DN p38 MAPK) gene blocked esculetin-induced p38 MAPK activation and p21WAF1 expression. Finally, both the growth inhibition and the down-regulation of CDKs induced by esculetin were suppressed by either SB203580 or the DN p38 MAPK mutant gene. In conclusion, these results demonstrate that activation of p38 MAPK contributes to esculetin-induced p21WAF1 expression in VSMC by decreasing both the cyclin D1/CDK4 and cyclin E/CDK2 complexes.

니코틴아마이드를 처리한 세포에서 Sp1 전사조절인자의 안정성과 당화의 감소기전

조화정 서울시립대학교 2005 국내석사

ABSTRACT Nicotinamide(NAM) is a form of the B-complex vitamin, niacin. Nicotinamide is incorporated into nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) and nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADP). NAD and NADP function as coenzymes in a wide variety of enzymatic oxidation-reduction reactions essential for tissue respiration, lipid metabolism, and glycogenolysis. In yeast, NAM treatment inhibits Sir2, an NAD-dependent HDAC, which is an essential factor for the effect of calorie restriction in proliferative life span. Interestingly, in contrast to the case in yeast, continuous treatment of NAM caused a significant increase in the life span of normal human fibroblsts. In addition, NAM suppresses the p21WAF1 gene induction in human cells. In this study, the underlying mechanism(s) of the nicotinamide-mediated p21 down-regulation was sought. Since p21WAF1 is regulated by Sp1 transcription factor, the status of Sp1 level was examined in the cells treated with NAM. NAM treatment caused a substantial decrease in the Sp1 protein level and O-glycosylation. The decrease of Sp1 was not detected when NAM was treated along with ALLN, a proteasome inhibitor, or 2-deoxyglucose, an inhibitor of protein de-GlcNAcylation. Rapid downregulation of Sp1 is likely due to hypoglycosylation-induced degradation by proteasome. Key words: Nicotinamide, Sp1, O-GlcNAcylation, p21WAF1

인간 세포에서 nocotinamide가 p21WAF1의 발현과 세포의 증식에 미치는 영향

이형일 서울市立大學校 2004 국내석사