Generation and preservation of genome edited rats by delivery of CRISPR /Cas9 protein

진윤경 서울대학교 대학원 2020 국내석사

Rats are major laboratory animals for biomedical research. They are easy to handle and have similar physiological characteristics like humans. However, mouse was preferred animal for the studies of gene function and the development of genetically modified animals for a long time. Currently, the importance of developing genome engineered rat has been increased because of their physiological advantages. In this study, to efficiently produce and preserve genome engineered rats, three parts of producing genome edited rats (superovulation, gene editing, and embryo freezing) were investigated. Firstly, superovulation is an essential technique to increase the possibility to produce genome engineered embryos. Commonly, a combination of equine chorionic gonadotropin and human chorionic gonadotropin has been used for a conventional method to induce superovulation. However, for increasing the ovulated oocytes, inhibin anti-serum was used to regulate the secretion of follicle stimulating hormone at pituitary gland. Immature Sprague Dawley rats were injected inhibin anti-serum (200 ul vs 500 ul) by two administration ways (Intravenous; IV vs intraperitoneal; IP). As a result, the highest number of collected zygotes was obtained at 500 ul IP group aged at 3-week-old. Secondly, PRNP gene encoding prion protein was targeted to produce PRNP knock out rats mediated by CRISPR/Cas9. To increase the efficiency of genome engineering, Cas9 protein and guide RNA were introduced into zygotes by electroporation. After electroporation, 2-cell stage embryos were transferred to recipient females and some pups were produced. Genomic DNA of produced pups was isolated, and genotyping analysis was performed. As a result, insertions and deletions were observed at targeted loci. Further, different embryo freezing methods (slow freezing and vitrification) were applied to preserve the generated genome engineered rats. To compare the efficiency of freezing methods, 2-cell stage embryos were cryopreserved by both methods. Additionally, after freezing-and-thawing, thawed embryos were cultured in vitro for development to blastocyst stage and, both the development rate and the number of nucleus at blastocyst stage were observed. As a result, thawed embryo recovery rate was higher at slow freezing group. Also, 2-cell stage embryos of PRNP knock out rats were cryopreserved by slow freezing method. After thawing, embryos were transferred to recipient females and two pups were successfully generated. Produced pups showed normal heath condition and had the same genetic sequences as donor. In conclusion, three technical parts were improved to produce and maintain PRNP KO rats. In the future, generated genome engineered rats could be utilized to investigate the function of PRNP gene and mechanism of prion disease. Also, these results could be helpful to development of genome engineering techniques and production of genetically modified animals. 유전자 교정 동물은 유전 질환 연구와 치료제 개발을 위해서 중요한 자원으로 활용된다. 랫드는 사육이 용이하고, 짧은 번식 주기를 가지며, 많은 수의 산자를 생산하고, 마우스와 비교하여 사람과 생리학적 유전학적으로 유사하다는 장점이 있다. 본 연구에서는 보다 효율적으로 유전자 교정 랫드를 생산하기 위하여, 과배란, 유전자 교정, 및 수정란 동결 단계로 나누어서 실험을 수행하였다. 유전자 교정 랫드를 만들기 위해 첫번째로 마우스의 과배란에 사용되는 인히빈 항 혈청 주사제를 용량 (200 μl 또는 500 μl)과 주사 방법 (복강내 주사 또는 미정맥 주사)을 다르게 설정하여 미성숙 랫드 (21일 - 27일령 또는 28일 - 32일령)에 주사하여 배란된 수정란의 개수를 확인하였다. 그 결과, 21일 - 27일령 군에서 500 μl 복강내 주사 군에서 유의미한 정도의 수정란 수의 증가가 관찰되었다. 랫드의 프리온 질환 모델 생산을 위하여 PRNP 유전자를 목표로 설정하였다. 표적 위치를 선별하고 그 위치에 특이적으로 교정하기 위해 CRISPR/Cas9 유전자 가위를 수정란 내에 Electroporation 방법으로 주입하였다. 그 결과, 대리모에 2세포기 수정란을 이식하여 3마리의 산자들을 얻을 수 있었다. 태어난 산자들의 꼬리에서 추출된 DNA를 이용하여 유전자형을 분석하여, 표적 위치의 염기 서열 변화가 관찰되었다. 또한, 정상적인 생식 능력을 보유하여서 다음 세대로의 유전자형 전달이 가능하였다. 생산된 동물을 효율적으로 보존하기 위하여 수정란 동결 기술을 적용하여 보았다. 완만 동결 방법을 사용하여 적절한 수정란 동결이 가능한지 확인하기 위하여, 야생형 랫드를 과배란 후 2 세포기 상태의 수정란을 기존에 사용하였던 제작된 배지를 사용하여 동결하였다. 또한, 시판되는 배지를 사용하여 급속 동결 또한 진행하였다. 동결란은 해동 후 실험실 내에서 배양하여 배반포 단계까지 배양 후 그 발달 비율과 핵 수를 확인하였다. 그 결과 완만 동결을 사용한 군에서 보다 높은 배반포의 핵 수가 확인되었다. 또한, PRNP 유전자 위치 교정 랫드의 2 세포기 단계의 수정란을 완만 동결하여 동결란을 해동 후 대리모에 이식하여 산자를 생산할 수 있었다. 태어난 산자는 정상적인 신체 발달을 보였으며, 공여 개체와 동일한 유전자형이 확인되었다. 결론적으로, 본 연구에서는 PRNP 유전자 위치 교정 랫드를 생산하고 보존하기 위하여 필요한 기술을 세가지 부분으로 나누어서 실험을 진행하였으며, 그 결과 효율적으로 목표 동물을 생산할 수 있었다. 앞으로, 생산된 동물을 활용하여 프리온 신경 질환과 관련된 연구를 진행할 수 있을 것이다. 또한, 이 기술은 다양한 형태의 유전자 조작과 유전자 교정 동물을 생산하는데 응용될 수 있을 것이라 기대한다.

Rat에서의 Ranitidine제제의 생체내이용율

이미숙 梨化女子大學校 大學院 1994 국내석사

Rat NDP kinase와 truncated NDP kinase (Nm23)/GST fusion protein의 효소 활성 및 생화학적 특성에 관관한 연구

장근혜 梨花女子大學校 大學院 1998 국내석사

Effects of water deprivation for 48 hours on the behavioral changes, and stereoselective absorption and disposition of Ofloxacin after intravenous and oral administration of (±)-Ofloxacin or (S)-(-)-Ofloxacin to rats

한순영 Graduate School of Sookmyung Women's University 1994 국내박사

수분제한이 랫드의 혈액, 혈청 및 요생화학과 행동에 미치는 영향을 알아보기 위하여 48시간 수분을 제한시킨 랫드와 대조랫드에 대하여 혈액학적, 혈청생화학적 분석 및 요분석을 실시하였고, 자발운동량 (activity monitor) 시험, hot plate 시험, 수동회피 (passive avoidance) 시험 및 rotarod 시험등 행동시험을 실시하였다. 수분제한으로 인하여 적혈구수, 헤모글로빈의 농도, 적혈구 침층용적%, 총단백 및 알부민농도가 증가하였으며, glucose, 총 bilirubin, creatinine, 혈중요소질소 및 Cl^-의 농도가 증가하였다. 수분제한랫드에서 자발운동량이 감소하였고 hot plate에 대한 반응이 지연되었으며, 수동회피시험에서 소리에 대한 반응이 지연되었다. Rotarod 시험에서도 운동조합능력이 감소하는 경향을 보였다. 한편, 대조랫드와 수분제한랫드에 20mg/kg의 (±)-ofloxacin을 정맥 및 경구투여하여 입체이성체의 체내동태를 알아보고, 입체이성체중 주활성형인 (S)-(-)-ofloxacin도 10mg/kg의 용량으로 정맥 및 경구투여하여 그 체내동태를 비교 관찰하였다. (土)-Ofloxacin을 정맥주사하였을때 (S)-(-)-ofloxacin은 수분제한에 의하여 AUMC, MRT 및 반감기가 증가하였고, X_u, CL_R 및 위장관 잔존량은 감소하였으나 CL_NR은 증가하였다. (R)-(+)-Ofloxacin의 경우도 V_ss의 증가와 함께 (S)-(-)-ofloxacin과 같은 경향을 보였다. (±)-Ofloxacin을 경구투여하였을 때에는 (S)-(-)-ofloxacin은 X_u 및 CL_R의 감소만을 (R)-(+)-ofloxacin은 X_u및 CL_R의 감소와 함께 AUC의 증가를 보였다. (S)-(-)-Ofloxacin을 10mg/kg의 용량으로 정맥주사했을때 수분제한에 의해 AUMC, MRT 및 반감기가 증가하였으나 경구투여했을 때에는 유의성있는 변화가 없었다. 대조랫드에 (±)-ofloxacin을 정맥주사했을때 (R)-(+)-ofloxacin은 (S)-(-)- 이성체보다 높은 혈중농도를 보이며 AUC, AUMC, MRT, X_u 및 반감기가 컸고 CL_NR 및 위장관 잔존량은 적었다. 수분제한에 의해서도 반감기 및 X_u에는 차이가 없었으나 그 외에는 대조랫드와 유사한 경향을 보였다. 수분제한된 랫드에 (±)-ofloxacin을 경구투여하였을 때에도 (R)-(+)-ofloxacin이 AUC 및 X_u가 크며 CL_NR 및 위장관 잔존량은 (S)-(-)- 이성체보다 적었다. 대조랫드에 경구투여할 경우에도 위장관 잔존량은 (R)-(+)- 이성체가 (S)-(-)- 이성체보다 적었다. Ofloxacin과 랫드 혈장단백과의 결합율은 (s)-(-)- 및 (R)-(+)- 이성체가 각각 52.4% 및 54.2%로서 (R)-(+)- 이성체가 (S)-(-)- 이성체보다 유의성 있게 컸다. 수분제한에 의해서는 (s)-(-)- 이성체의 단백결합만이 유의성있게 증가하였으나 그 증가율은 3.4%에 불과하였다. 수분제한 상태에서의 pharmacokinetic parameter들의 변화는 수분 제한에 의해 신기능이 저하되므로써 신장배설량이 감소하여 CL_R이 감소하는 반면 CL_NR은 증가함으로써 CL에는 차이가 없는 것으로 추정되며, 대사과정중에서는 glucuronidation의 증가가 주원인일 것으로 추측된다. 따라서 앞으로 이에 대한 규명이 필요하리라 생각된다. Effects of water deprivation for 48 h on the pharmacokinetics of (S)-(-)-ofloxacin and (R)-(+)-ofloxacin were investigated after intravenous (i.v.) and oral administration of (±)-ofloxacin, 20 mg/kg, and (S)-(-)-ofloxacin, the mainly active enantiomer, 10 mg/kg to the control and water deprived rats. Effects of water deprivation for 48 h on behavioral changes were also investigated in rats. The 24 h urinary excretion of (S)-(-)-ofloxacin decreased significantly (1720 vs 927 μg) in the water deprived rats (n=12) when compared with that of the control rats (n=9) after i.v. administration of (±)-ofloxacin, and it could be due to the significantly reduced kidney function in the dehydrated rats. This resulted in significant decrease in CL_R (10.8 vs 5.76 ml/min/kg) in the water deprived rats. However, CL was not different between the control and water deprived rats due to the significantly increased CL_NR (7.29 vs 12.8 ml/min/kg). Similar results were also obtained from (R)-(+)-ofloxacin after i.v. administration of (±)-ofloxacin. Similar trends for both (S)-(-)-ofloxacin and (R)-(+)-ofloxacin were also obtained after oral administration of (±)-ofloxacin. After i.v. administration of (±)-ofloxacin to the control rats, AUC (537 vs 625 ㎍·min/ml), MRT (31.0 vs 42.2 min), t_½ (57.2 vs 62.8 min), X_u,0-24h (1720 vs 2490 ㎍) and CL_NR (7.29 vs 1.57 ml/min/kg) of (R)-(+)-ofloxacin were significantly different form those of (S)-(-)-ofloxacin. Similar tendencies were observed in the water deprived rats. After i.v. administration of (S)-(-)-ofloxacin to the water deprived rats (n=9), t_½ (55.5 vs 85.6 min) and MRT (21.7 vs 30.5 min) increased significantly when compared with those of control rats (n=8). In water deprived rats, the plasma protein binding of only (S)-(-)-ofloxacin increased by 3.4%. Water deprivation for 48 h also caused lower locomotor activity, and lower sensitivity to hot stimulation than those of the control rats. In water deprived rats, a significantly increased latency from sound in the passive avoidance test was observed. There was a decreasing tendency in motor-coordination of water deprived rats.

저혈압 rat 모델에서의 활동혈압 변동성의 증가와 안관류압의 저하가 망막과 시신경에 미치는 영향 : Effects of Increased Variability of Ambulatory Blood Pressure and Decreased Ocular Perfusion Pressure on Retina and Optic Nerve in the Hypotensive Rat Model : 서홍

서홍융 동아대학교 일반대학원 2014 국내박사

Purpose: This study was designed to know the effect of increased variability of the blood pressure (BP) and excessive reduction of the ocular perfusion pressure (OPP) which were induced artificially by interrupting the autoregulation by oral administration of over-dose of antihypertensive drug to the rat model on tissue responses in retina and optic nerve. Materials and Methods: Male Wistar rats (3-4 weeks old, 50–70 g) were used in this study. Over-dose of an antihypertensive drug (calcium channel blocker, amlodipine besylate, 0.4 mg/kg) was administered for achieving increased BP variability and excessive reduction of OPP. Group A, B, C and D were treated by oral administration of the antihypertensive drug for 3, 6, 9 and 12 weeks, respectively (n=6 at each group). All experimental groups were sacrificed for tissue preparation at 15-16 weeks old (400-450 g), and age-matched vehicle treated rats (n = 6) were also included for the control group. Intraocular pressure (IOP) was checked at every week with a tonometer (Tono-Pen; Mentor O&O Inc., USA). Systolic and diastolic BPs were measured at every hour by the tail-cuff method (BP recorder 58500; Ugo Basile, Italy) for 24 hours at every week without anaesthetization. A fall of BP during the daytime (FD), weighted standard deviation (WSD), mean arterial pressure (MAP), OPP were calculated with these values. This study was examined Annexin V-positive retinal ganglion cells (RGCs) after intravitreal Annexin V injection and morphology and axonopathy of TUJ1–positive RGCs and anti-neufofilament-positive retinal nerve fibers in the hypotensive rat model. Axonopathy of optic nerve was examined with transmission electron microscope. The expression of glial fibrillary acidic proteins (GFAPs) and caspase-3 proteins was examined with western blot analysis. When comparisons were made between experimental groups and the controls, ANOVA test was used. The level of significance was set at P < 0.05. Results: The IOPs of all experimental groups slightly decreased, but the relation was not statistically significant. After oral administration of antihypertensive drug, SBP and DBP decreased, the FD of SBP and DBP increased, and the increase of WSD in SBP and DBP was shown in all experimental groups significantly. MAP and OPP reduced by approximately 20% in group C and D and all groups showed a statistically significant reduction. In group C and D, the number of Annexin V-positive apoptotic RGCs is approximately 300% increase compared to the number of apoptotic cells in normal control eyes. By elongating the period of antihypertensive application per oral administration, mean density of retinal nerve fiber bundles was decreased gradually, and significantly in group C and D. Segmentation of retinal nerve fibers was found in group D, and the finding was similar to “Wallerian-like degeneration”. In retinas of group C and D, RGC density was reduced by about 20-40% compared with the controls. According to increase of the period of oral antihypertensive drug, the total number of axons and local axon density in cross sections of optic nerves was decreased gradually, especially optic nerves of group C and D reduced by about 30-50% compared with the controls. The number of degenerating axon profiles in optic nerves of group B, C and D was increased 202%, 248% and 287% compared with the controls. Excessive reduction of OPP and increase of BP variability didn’t cause overexpression of GFAP, however Caspase-3 was found to be increased in group C and D. Conclusions: This study was designed our study to demonstrate how distal stressors such as deterioration of ambulatory BP and OPP could affect retinas and optic nerves in rats, and concluded that deterioration of BP variability and OPP induced degeneration of RGC axons and somas in retinas and axonopathy in optic nerves. Thus, alteration in the hemodynamic factors might be essential for the development of glaucoma. 목적: 정상 rat에게 인위적으로 경구 혈압강하제를 과다 투여하여 자가조절을 방해하도록 하는 저혈압 rat 모델에서 활동혈압 변동성의 증가와 안관류압의 과도한 저하가 망막과 시신경의 조직 변화에 미치는 영향에 대해 알아보고자 하였다. 대상 및 방법: Male Wistar rat (3-4주령, 50–70 g)를 대상으로, 활동혈압의 변동성을 증가시키고 안관류압을 과도하게 낮추기 위하여 경구 혈압강하제(calcium channel blocker, amlodipine besylate)를 0.4 mg/kg로 과다 투여하였다. 그룹 A, B, C, D의 각각의 실험군은 마지막 3주, 6주, 9주, 12주 동안 경구 혈압강하제를 투여하였고, 각 실험군은 6마리의 rat이 포함되었다. 모든 실험군은 실험 조직을 만들기 위해 15-16주령 (400-450 g)에 희생되었고, 그 주수에 맞는 대조군으로 6마리의 rat을 사용하였다. 안압은 Tono-pen (Mentor O&O Inc., USA)을 이용하여 매주 24시간 동안 측정하였다. 수축기와 이완기혈압은 the tail-cuff method (BP recorder 58500; Ugo Basile, Italy)를 이용하여 rat을 마취하지 않은 상태에서 매주 24시간 동안 측정하였다. 주간혈압하강, 활동혈압의 가중표준편차, 평균동맥압, 안관류압을 앞서 측정한 데이터를 이용하여 계산하였다. Annexin V를 유리체내로 주입 후 24시간이 지나 Annexin V에 염색된 retinal ganglion cell (RGC)를 살펴보고, TUJ1에 염색된 RGC와 항-neurofilament에 염색된 망막신경섬유의 형태와 axonopathy를 관찰하였다. 시신경의 조직학적 변화는 transmission electron microscope을 이용하여 알아보았고, western blot 분석을 이용하여 glial fibrillary acidic proteins (GFAPs)과 Caspase-3 단백질의 양을 측정하였다. 정상 대조군과 실험군의 비교를 위해 ANOVA test를 이용하였고, 통계학적으로 의미 있는 P value는 0.05 미만으로 정하였다. 결과: 안압은 약간 감소하는 경향을 보였으나, 통계학적으로 유의하지는 않았다. 모든 실험군의 혈압, 평균동맥압, 안관류압은 유의하게 감소하였고, 활동혈압의 변동성을 나타내는 지표인 주간혈압하강과 가중표준편차는 모든 군에서 통계학적으로 유의한 증가를 보였다. 그룹 C와 D에서 Annexin V에 염색된 apoptotic RGC는 약 300% 증가하였다. 과도한 경구 혈압강하제의 사용기간이 늘어날수록 망막신경섬유다발의 밀도는 점점 감소하였고, 그룹 C와 D에서는 통계학적인 의미가 있었다. 특히 그룹 D에서는 망막시신경섬유의 분절화가 나타나, “Wallerian-like degeneration”을 보였다. 시신경의 axon의 수와 밀도도 그룹 C와 D에서 약 30-50%의 감소를 보였고, degenerating axon profile의 수 또한 그룹 B, C, D에서 200% 이상의 의미 있는 증가가 나타났다. 과도한 안관류압의 감소와 활동혈압의 변동성 증가는 GFAP의 발현을 유도하지는 않았으나, Caspase-3 단백질이 그룹 C와 D에서 유의하게 증가되었다. 결론: 이 연구는 활동혈압 변동성의 증가와 과도한 안관류압의 저하가 정상 rat의 망막과 시신경에 미치는 영향을 알아보고자 하였는데, 이러한 혈역학적 변화로서 RGC의 axon과 soma의 변성이 초래되고 시신경의 axonopathy를 유발됨을 확인하였다. 이런 결과는 혈역학적 요인들이 녹내장에 미치는 영향을 연구하는데 도움이 될 것으로 생각된다.

嗅球除去 Rat의 行動學的 및 藥物學的 特性에 關한 硏究

김선장 忠南大學校 1987 국내석사

Olfactory bulbectomized rat(O.B.rat) showed a characteristic behavior, which were changed by various drugs. The present investigation was undertaken to observe the changes in the effects of psychotropic drugs and total ginseng saponin on the behavior of O.B.rats. As a results, 1. Emotional behaviors were markedly increased by olfactory bulb lestions in the rats. 2. CPZ, HPD, DZP, and total saponin produced the inhibition of statie but morphine appeared not to inhibit startle in the O.B.rats. CPZ, HPD, DZP and morphine produced a dose-dependedent inhibition of attack and total saponin appeared to inhibit attack in the O.B. rats. COZ and DZP produced a dose-dependent inhibition of struggle but HPD, morphine and total saponin appeared not to inhibit struggle in the O.B.rats. 3. Total saponin appeared to decrease the effect on startle and to increase the effect on attack vut not to effect on struggle in the O.B.rats pretreated with HPD. Total saponin appeared to increase the effect on startle and attack but not to effect on struggle in the O.B.rats pretreated with morphine. 4. HPD-induced catalepsy was markedly increased by O.B.rats but morphine-induced catalepsy wasn't. Total saponin appeared to decrease the effect of morphine and HPD on catalepsy in the O.B.rats. 5. Locomotor activity and rearing were increased by O.B.rats. Total saponin appeared not to effect on locomotor activity and rearing in the O.B.rats and intact rats.

Development of gene transfer by injection of round spermatid into oocytes in rat : 흰쥐의 원형정자세포 직접주입에 의한 유전자 전이

이상민 [Graduate School of] Konkuk University 1998 국내박사

본 연구는 정자 형성 과정중의 세포인 원형정자세포내로 외래 유전자를 도입한 후, 미수정란에 미세 직접주입을 실시하여 수정 및 산자 생산을 유도함으로써 새로운 형질전환 동물생산 방법을 개발하고, 체외에서 정자형성과정 연구를 위한 기초 배양조건을 확립하고자 실시하였다. 따라서 본 연구에서는 4 가지의 실험을 계획하였다. (1) 정확한 원형정자세포를 선별하고, (2) 이들 정소세포로의 유전자를 도입하기 위한 최적조건을 확립하고, (3) 원형정자세포를 이용한 정상적인 수정과 배발달 및 산자의 생산을 유도하고, (4)체외에서 정소세포의 배양체계를 확립하고자 기초연구로 배양액에 첨가되는 여러 가지 물질들의 영향을 조사하였다. 본 연구에서 얻은 결과를 요약하면 다음과 같다. 1. 정소세포를 분리하는데 사용된 방법중 trypsin과 collagenase를 이용하여 그 부유액을 준비하는 것이 단순한 물리적인 방법보다 양호하였으며, 밀도 구배를 달리 했을 때, BSA의 경우가 세포의 순수분리 정도면에서 약 90% 정도로 percoll의 약 80% 보다는 다소 양호한 성적을 얻을 수 있었다. 또한 분리 직후의 생존성과 분리속도, 순수정도 및 농도를 조사해 본 결과, 약 97% 이상이 생존하였으며, 원형정자세포와 pachytene spermatocyte의 경우 분획이 각각 26~32, 2~6번으로 순수정도는 89.8과 87.2%였고, 분획 38-48에서는 81.1%의 분화중인 원형정자 세포를 얻을수 있었으며, 분획 50~55에서 74.3%의 원형정자 세포로부터 박리된 잔여체를 얻을 수 있었다. 또한 분리과정중 과격한 조작은 세포들의 융합에 의한 다핵세포들이 형성되어진다. 각각 분리된 세포들의 농도는 각각 2×1과 4×10^(5) cells로 비교적 양호한 분리 정도를 나타내었다. 2. 전기아공 용액에 따른 외래 유전자의 발현율에는 PBS보다 HeBS에서 외래 유전자의 발현이 다소 높게 나타났으나, 1×10^(6)~2×10^(7)까지의 세포 농도에 따른 유의차는 없었다. 정소세포로의 유전자 도입에 최적 조건은 100 V, 200 μsec, 1 pulse의 전기자극에서 가장 양호한 발현율을 나타내었으며, 전기자극 후 약 60~70%의 정소세포가 생존하였다. 원형정자세포의 경우 DNA농도에 따른 발현율을 보면 0 ㎍, 10 ㎍ 경우는 각각 0 과 4.3%로서 20 ㎍과 30 ㎍의 22.1과 13.8%보다 상당히 저조한 발현 양상을 보였다. 전기자극 전 neuraminidase의 처리는 도입후 유전자의 발현양상이 증가하였으나, 세포끼리의 융합을 또한 증가되었다. 이것은 세포막단백질의 극성을 변화시켜 DNA도입이 용이한것으로사료된다. 따라서 이러한 결과는 외래 유전자가 전기아공법에 의해 원형정자세포로 도입이 가능하며, 또한 이들 세포에 의한 수정으로 횐쥐의 난자내로 유전자 도입을 용이하게 하는 효율적인 방법이라 할 수 있다. 3. 원형정자세포를 난자내로 주입하였을 때 수정과 배 발달율을 조사하였다. 원형정자세포 주입시 62%가 생존하였고, 정상적인 수정 (2전핵 + 2극체)인 경우는 77.8%로서 대조구에 비해 유의하게 높은 성적을 얻었다. 또한 이들 수정란을 체외에서 배양한 결과 86%가 분할하였고, 이중 오직 4%만이 배반포 단계까지 발달하였다. 전기자극으로 먼저 미수정란의 활성화를 유도한 경우가 그렇지 않은 경우보다 배 발달율에서 양호한 성적을 나타내었다. 체외배양동안 발생이 정지한 수정란에서 외래 유전자의 발현 유무를 조사한 결과, 1세포기 단계에서부터 상실배기까지 발현을 확인할수 있었으나, 배반포 단계에서는 발현이 되지 않았다. 상설배기에서 22.2%의 발현율을 나타내었으며, 발현된 난자모두에서 모자이크현상이 없이 할구 전체가 염색되었다. 미세주입이 완료된 난자를 체외 배양할 때 기본 배양액에 비타민이 첨가되었을 때 부화율이 증가하였고 수정란의 발달속도도 빨라짐을 확인하였다. 514개의 난자를 28마리의 가친에 이식하여 5마리의 산자를 생산하였다. 따라서 횐쥐에서는 정자세포 완성단계가 시작 되기전에 이미 배우자로써의 유전적 요인이 완성되어질 것으로 생각된다. 4. 21일령 흰쥐의 정소로부터 분리된 세포들을 Matrigel이 피복된 곳에서 배양할 경우 세포의 부착성을 도와 생존율과 증식에서 양호한 성적을 얻을 수 있었다. 특히, 0.1 ml의 norepinephrine (1 mg/ml)의 첨가로 정자 형성세포의 생존율 및 세포수의 증가를 보였다. 또한, insulin, transfer-rin, selenium (ITS premix) 의 첨가는 정소세포의 배양에서 증식과 생존성에서 다소 양호한 성적을 얻었다. 정소세포 체외 배양시 배양액에 FSH, testosterone, β-mercaptoethanol, norepinephrine 등을 첨가 하였을 때 무첨가군에 비해 세포의 생존성 및 증식에 양호한 성적을 얻었다. 특히 testosterone과 norepinephrine 첨가군에서 가장 양호한 세포증식을 보였다. 이와 같은 배양체계는 정자형성 과정 연구를 위한 유용한 도구로 이용될 수 있을 것으로 사료된다. 결론적으로, 흰쥐의 여러 단계의 정소세포들이 정확하게 분리되고 이들 세포로 외래 유전자가 도입될 수 있으며, 난자내로 미세주입하여 정상적인 수정과 산자를 생산할 수 있을 것으로 생각된다. 그리고 이들 수정란에서도 역시 외래유전자가 발현되어진다. 따라서 이들 원형정자세포를 이용하여 새로운 방법의 형질전환 횐쥐를 생산하는 vector개발이 가능하리라 생각된다. 또한, 체외에서 정소세포의 배양이 가능하면 정자형성과정의 기전 뿐만 아니라 정자발생과정중의 결손으로 인한 웅성요인의 불임을 극복할 수 있는 치료 수단으로도 이용 가능 할 것으로 사료된다. These studies were performed to investigate the possibility of transgenic rat production by microinjection of round spermatid electro-porated with foreign DNA and the culture condition for in vitro spermatogenesis. For this purpose, four experiments were designed; 1) to select the precise round spermatid, 2) to identify the optimal condition for gene transfer into spermatogenic cells, 3) to induce the complete fertilization with round spermatid and subsequent embryonic and fetal development, 4) to examine in vitro proliferation and viability of spermatogenic cells. The results obtained in these studies were summarized as follows. 1. In the experiment to compare various methods of producing suspensions, the best cell separation was achieved by using suspensions prepared with collagenase and trypsin. Identification of cell types was made in stained smears of cell suspensions prepared from rat testes and separated by velocity sedimentation at unit gravity. Following separation, various fractions obtained 87.2% pachytene spermatocytes sedimenting at fraction 2~6, 76.1% multinucleate spermatids and 14% secondary spermatocytes at fraction 7~11, 89.8% round spermatids at fraction 26~32, 81.1% elongated spermatids at fraction 38~48 and 74.3% cytoplasmic fragments at fraction 50~55 detached from these spermatids. The resolution of different size classes of cells was essentially complete but separation of different cell types was limited by the occurrence of multinucleate forms of the cells and by fragments of damaged elongated spermatids. Most cells, however, appeared to be intact on light microscopical examination. 2. To develope simple and reproducible procedure for the introduction of DNA into round spermatid cells by electroporation, the parameters involving the cells, the DNA conditions, and the electric stimulation and supplements were investigated. About 60 to 70% of the cells were confirmed to be alive after electroporation with LacZ gene. Expression rates of LacZ gene in spermatogenic cells were significantly higher than those of control cells. More than 35% of the viable cells were in the stable expression of a report gene and neuraminidase (0.5 unit /ml) enhanced the gene expression rate in the round spermatids. Therefore, electroporation may be a simple, highly effective means of introducing foreign genes into spermatogenic cells, In addition, this result suggest that foreign DNA can be introduced into rat oocyte through electroporated spermatid. 3. After microinjection of round spermatids into mature rat oocytes, it investigated whether these nuclei are able to participate in syngamy and normal embryonic development. Sixty-two percent of rat oocytes injected with round spermatid survived and 78% of them were normally fertilized. Unlike testicular spermatozoa, round spermatids could not activate the oocytes, and therefore the oocyte had to be activated artificially either before or after spermatid injection. The highest rate of normal fertilization was obtained in the oocytes which were activated by electric cur rent and then injected individually with a single spermatid. Expression of LacZ gene was detected by staining embryos with X-gal as a substrate at pH 7.2. Among 144 fertilized eggs which were injected with electroporated round spermatid, 87 (60.4%) had developed to the 2-cell stage by the day following injection. The maximum staining (22.2%) was attained at the morula stage and homogenous staining in whole embryos. When 514 two-cell embryos developed from round spermatid injected oocytes were transferred to 28 foster mothers, 5 offsprings were produred and grew into healthy adults. Thus, it seems that gametic imprinting in rat spermatogenic cells may be completed before spermiogenesis begins. Under the experimental conditions employed, spermatid nuclei were less efficient than sperm nuclei in producing normal offspring. 4. The testes of 21 day male rats were decapsulated and isolated spermatogenic cells were cultured at 32.5℃ with 5% CO_(2) for 2 weeks at DMEM containing ITS (Insulin, Transferrin, Sele-nium) premix. Optimal concentration of cells for the culture was 1×10^(5)/well. The viability and about 40% of cultured cells in the presence of β-morcaptoethanol and norepinephrine was higher than that about 10% of culture cells without supplements. The proliferation of cultured cells was found the same pattern compared to viability. Specially, the highest proliferation was found that when testosterone and norepinephrine was supplemented. The viability and proliferation of the cultured cells by co-culture or basement membrane coating of plate were higher than those of basic culture medium only. Therefore, this in vitro culture system may offer a useful tool for the possible study that initiate meiosis. In conclusion, the spermatogenic cells are presumably separated by sedimentation velocity and transfected with foreign DNA by electro-poration procedure. Rat oocytes can be fertilized normally by microin jection of round spermatid and expressed foreign DNA. Futhermore, these embryos are able to develop into normal offsprings. Therefore, the use of spermatids as vectors for introducing foreign DNA into the oocyte at fertilization may be an efficient tool to produce a transgenic rat.

Carcinogenicity study of Indian madder color by 104-week gavage exposure in F344 rats

강민수 서울대학교 대학원 2013 국내박사

Indian madder color (IMC), one of Radix Rubiae in herbal medicine, has been used for food coloring, and dye of textiles. However, madder color, another kind of Radix Rubiae, has been reported to have carcinogenicity in the liver and kidney of laboratory animals. So a carcinogenicity evaluation of IMC was needed because they are close-related species. For the risk assessment of IMC, 104-week carcinogenicity study was carried out. F344 rats were treated with hydrothermal extract of IMC for five times per week during 104 weeks by oral gavage at dose levels of 40, 200 and 1,000 mg/kg. In survival analysis, the number of overall unscheduled dead rats was not significantly changed, though the number of moribund rats in male 1,000 mg/kg dose group was significantly increased (P<0.05). The body weight and food consumption were changed significantly until 77 weeks (P<0.05), but the changes did not show dose-dependency. Macroscopically, cases with pink discoloration of bone, mainly in femur and skull was significantly increased in male and female 1,000 mg/kg dose groups (P<0.01). Microscopically, hepatic oval cell hyperplasia was significantly increased in male 40, 200 and 1,000 mg/kg dose groups. And renal papillary mineralization and pigmentation was significantly increased in male 1,000 mg/kg dose group (P<0.01). And no significant difference in neoplastic lesions was in male and female 1,000 mg/kg dose groups compared to control. These results do not show that IMC had a toxic effect at 1,000 mg/kg dose. From these results, oral treatment of IMC for 104 weeks in F344 rats had no carcinogenicity and the no-observed-adverse-effect level of IMC was 1,000 mg/kg dose. 천초근(Indian madder color, IMC), 즉 Rubia cordifolia Linne의 뿌리는 식용 색소와 섬유의 염색, 그리고 전통약재로 사용되었다. 그러나, 다른 천초근(Madder color, MC)의 추출물의 연구에서 랫드 간세포와 신장 세뇨관 상피세포에 대한 발암성이 보고되었다. IMC와 MC, 두 종은 유사하므로 IMC 발암성의 가능성이 제기되었으므로 이에 대한 평가가 필요하게 되었다. 그러므로 IMC의 발암성평가를 위해서, F344 rat를 이용한 104 주 발암성 연구를 수행하였다. 40, 200 및 1,000 mg/kg의 투여용량으로 104주 동안 일주일에 다섯 번씩 IMC추출물을 경구 투여하였다. 생존 분석에서 수컷 1,000 mg/kg 투여 그룹에서 비록 빈사동물의 수는 유의성있게 증가되었으나(P<0.05), 폐사와 빈사를 합친 개체 수의 변화는 유의성이 없었다. 투여 77 주 이전에 체중과 사료섭취량은 일부 변화가 관찰되었으나(P<0.05) 용량상관성을 보이지는 않았다. 부검 시 관찰된 대퇴골, 두개골의 뼈에서 주로 관찰된 분홍색으로의 변색은 암수1,000 mg/kg 투여 그룹에서 유의성(P<0.01)있게 증가되었다. 간세포의 난원세포증식은 수컷 40, 200, 그리고 1,000 mg/kg 투여 그룹에서 증가하였다. 그리고 신장 유두부위 광물화(mineralization)는 수컷 1,000 mg/ kg 투여 그룹에서 증가하였으나 수질부의 광물질화(mineralization)는 암컷 1,000 mg/kg 투여 그룹 (P<0.01)에서 감소하였다. 대조군에 비해 암수의 1,000 mg/kg 투여 그룹에서 종양성(neoplastic) 병변은 큰 차이를 보여주지 않았다. 그러므로 본 연구은 104 주 동안 IMC의 투여에 의한 발암성이 없는 것으로 나타났다. 이러한 결과에서 IMC의 NOAEL은 1,000 mg/kg 이었다.

Automated rat biosensor system for odor monitoring

오윤광 Graduate School, Korea University 2021 국내박사

동물 바이오센서는 후각 능력이 뛰어난 살아있는 동물을 사용하여 표적 냄새에 반응하고 측정 가능한 행동 반응을 생성하며, 저비용, 신속한 감지, 비침습적 진단과 조기 진단 등의 장점이 있다. 대표적인 동물로는 개, 설치류, 벌 등이 있으며, 동물들은 연상학습이론 기반의 훈련을 통해 조건화 되었다. 본 논문에서는 매우 저렴하고 후각 능력이 뛰어난 설치류를 훈련시켜 질병 진단, 폭발물 검출, 약물 검출 등 다양한 분야에서 사용할 수 있는 표준화된 래트 바이오센서에 대해서 연구하였다. 첫째, 폐암의 잠재적 1차 선별검사를 위해서 래트 바이오센서 시스템을 연구하였다. 이를 확립하기 위해서 폐암의 악취 지표 성분인 톨루엔을 검출하기 위하여 조작적 조건화 패러다임을 기반으로 악취 판별 훈련 장치를 개발했다. 훈련된 래트 중에서 탐지 성능이 우수한 래트 (N = 3)는 총 1934 건의 테스트를 통해 82% 정확도, 83% 민감도, 81% 특이도, 80% 양성예측도, 83% 음성예측도를 보였다. 주어진 온도 (20, 25, 30°C) 및 습도 (30, 45, 60% RH) 조건에서 래트 바이오센서는 ± 10%의 편차 범위 내에서 평균 정확도를 보여 우수한 환경 안정성을 나타낸다. 또한, 훈련된 래트들은 훈련 45일 후에 시험했을 때 마지막 냄새 구별 유지에 차이가 없었으며, 이는 훈련된 냄새에 대한 래트의 기억이 오랜 기간 동안 여전히 사용 가능함을 나타낸다. 둘째, 동물이 냄새를 감지 할 때 외부 환경의 변화에 ​​신속하고 정확하게 대응하기 위해서는 서로 다른 반응과 연관 될 수 있는 여러 가지 냄새를 구별하는 방법을 배우는 것이 중요하다. 그러나 동물의 냄새를 맡는 것에 인한 다중 냄새 구별에 대한 연구는 거의 없습니다. 폐암과 당뇨병의 악취 지표인 톨루엔과 아세톤 검출을 위한 2-Choice/No-Go 결합 패러다임을 기반으로 검출래트에 의한 새로운 다중 냄새 판별 시스템을 연구하였다. 훈련된 동물(N = 3)은 총 1300 건의 테스트를 통해 정확도 88%, 민감도 87% 및 특이도 90% 로 다중냄새 감지성능을 입증하였다. 또한, 주어진 농도 조건에서 냄새 농도에 대한 행동 반응 시간의 의존성이 관찰되어 시스템이 정량적 측정에 사용될 수 있음을 시사한다. 또한 래트의 다중 냄새 감지 성능은 45일 동안 지속되어 학습된 다중 냄새 구별의 장기적인 안정성을 나타낸다. 셋째, 자동 훈련된 래트를 기반으로 하는 냄새 감지 시스템을 연구하였다. 이를 위해 우리는 아두이노 마이크로 컨트롤러를 장착하고 특정 냄새를 감지하도록 설계된 새로운 자동화된 살아있는 래트 바이오센서 시스템을 개발하였다. 훈련 프로그램은 훈련의 효율성을 극대화하기 위하여 긍정적/부정적 강화, 긍정적/부정적 처벌과 같은 조작적 조건화의 네 가지 주요 학습 패러다임으로 구성된다. 래트 (N = 12)는 자동화 장치에서 2,4-Dinitrotoluene (DNT) 및 γ-Butyrolactone (GBL) 으로 자동으로 훈련되었다. DNT 래트 (N = 4)는 총 380건의 테스트를 통해 95% 정확도, 99% 민감도 및 91% 특이성을 보였으며, GBL 래트 (N = 4)는 320건의 테스트를 통해 90% 정확도, 97% 민감도 및 82% 특이성을 나타냈다. DNT 검출래트는 질산 암모늄과 니트로구아니딘에 노출되었을 때 레버 누르는 동작을 생성하지 않았으며, 이는 센서가 선택성을 유지했음을 시사한다. 방해 물질이 함유된 알코올 음료의 실제 샘플에서 GBL이 검출되는지 여부를 테스트 한 결과, GBL 검출래트는 위스키에서 GBL을 90%의 정확도로 인식하여 우수한 성능을 보여주었습니다. 또한, 자동 훈련된 래트는 마지막 훈련 4개월 후 시험한 결과에서 학습된 냄새 구별 유지에 큰 차이를 보이지 않았으며, 이는 학습된 냄새에 대한 래트의 기억이 오랫동안 유지되었음을 나타낸다. 종합해보면, 우리의 자동화된 래트 바이오센서 시스템이 특정 냄새 성분을 감지하고 인식하는 데 유용 할 수 있으며 다른 냄새를 보다 빠르고 안정적이며 정확하게 구별 할 수 있음을 보여준다. The animal biosensor uses a live animal with excellent olfactory ability to respond to a target odor and generates a measurable behavioral response, and has advantages such as low cost, rapid detection, non-invasive diagnosis and early diagnosis. Representative animals include dogs, rodents, and bees etc. and animals are conditioned by training based on the theory of associative learning. In this thesis, a standardized rat biosensor that can be used in various fields such as disease diagnosis, explosives detection, and drug detection by training rodents with very low cost and excellent olfactory ability was studied. First, the rat biosensor system for a potential primary screening of lung cancer was studied. To establish this, an odor discrimination training device based on operant conditioning paradigms for detection of toluene was developed. Toluene is a potential odor indicator component for lung cancer. Among the trained rats, the rats (N = 3) with excellent detection performance showed excellent performance for toluene detection with 82% accuracy, 83% sensitivity, 81% specificity, 80% positive predictive value (PPV) and 83% negative predictive value (NPV) through a total of 1934 tests. At given conditions of temperature(20, 25, and 30°C) and humidity (30, 45, and 60% RH), the animal biosensors showed an average accuracy within a deviation range of ±10%, indicating the excellent environmental stability of the detection rats. Also, the trained rats did not differ in retention of last odor discrimination when tested 45 days after training, denoting that the rats’ memory for trained odor is still available over a long period of time. Second, when animals detect odors, it is important to learn to discriminate between multiple odors that can be associated with different response in order to respond quickly and accurately to changes in the external environment. However, very few studies have been done on multi-odor discrimination by animal sniffing. The novel multi-odor discrimination system by detection rats based on combined 2-Choice/No-Go paradigm for detection of toluene and acetone was studied. Toluene and acetone are odor indicators of lung cancer and diabetes, respectively. Trained rats (N = 3) demonstrated multi-odor detection performance with 88% accuracy, 87% sensitivity, and 90% specificity through a total of 1300 tests. In addition, a dependence of behavioral response time on odor concentrations under given concentration conditions was observed, suggesting that the system could be used for quantitative measurements. Furthermore, the rats’ multi-odor sensing performance has lasted for 45 days, indicating long-term stability of the learned multi-odor discrimination. Third, an odor detection system based on automatically trained rats was studied. For this, it was developed that the novel automated rat biosensor system equipped with arduino microcontroller and designed to detect specific odors. The training program consists of four major learning paradigms of operant conditioning such as positive/negative reinforcements, positive/negative punishments to maximize training efficiency. The rats (N = 12) were automatically trained with 2,4-Dinitrotoluene (DNT) and γ-Butyrolactone (GBL) in the automated apparatus. The DNT rats (N = 4) showed 95% accuracy, 99% sensitivity and 91% specificity through a total of 380 tests, and the GBL rats (N = 4) displayed 90% accuracy, 97% sensitivity and 82% specificity through a total of 320 tests. The DNT detection rats did not generate lever-pressing behavior, when exposed to ammonium nitrate and nitroguanidine, suggesting that the sensor retained selectivity. When testing whether GBL is detected in a real sample of alcohol drink containing interfering substances, the GBL detection rats showed excellent performance by recognizing GBL in whiskey with an accuracy of 90%. In addition, the automatically trained rats displayed no significant difference in retention of the learned odor discrimination when tested 4 months after the last training, indicating that the rats’ memories on the learned odors have been maintained over a long period of time. Taken together, the results demonstrate that our automated rat biosensor system can be useful for detection and recognition of specific odorant components, providing more rapid, reliable and accurate discrimination between different odors.

마늘즙 投與가 Rat의 鉛毒性에 미치는 營響

정두례 朝鮮大學校 大學院 1991 국내박사

In this study 'Garlic juice was administered to the intoxicated rats induced by Lead to reveal any detoxication effect of liver. Even the 8.59 of Garlic juice/kg mouse (IP) had not any acute toxicity so the median lethal dose (LD_(50)) is likely to be much greater. In comparison of average weight gain rate for 4 weeks control and test groups of GML(l% Garlic juice /daily diet plus Pb 100mg/kg rat), GHL(5% Garlic juice plus Pb 100mg), GMLO(l% Garlic juice), and GHLO(5% Garlic juice) were the much the same as about 11.36-1274 but GLL(O.5% Garlic juice plus Pb 100mg) and GOL(Pb 100mg), having 9.5% and 8.45% of weight gain rate respectively, were lower than control. Especially the GOLE(Pb 1,000mg), the heavily Pb loaded group, was lowest as 4.5%. In the biochemical studies of blood there were siginficantly increases in the serum GPT of GOL, and GOLE group, having 113.5~131.2 unit which were higher than control. But GLL, GML, and GHL group were lowered as about 100.4-137 unit compared to GOL and GOLE. GOT values were same feature as GPT. There were significantly difference between GHL and GOL group which indicate the probable detoxication effect of Garlic juice. Cholesterol and s-Triglyceride in the test groups, having 166-192.9 mg/㎗ and 94.3~129.8md/㎗ respectively, were higher than their controls which have 161mg/㎗ and 89.7mg/㎗. Alkaline Phosphatase and Blood Urea Nitrogen did not show any difference between control and test groups. In the Hemoglobin and Hematocrit value, the GOLE was significantly decreased compared to control. But in the combination of Garlic juice and Lead the increase of Hemoglobin and Hematocrit was interpreted into the improvement of hypochromic anemia. In the PbB (blood pb concentration) control, GMLO, and GHLO showed nearly normal level with 0.2-0.3mg/kg, and GOL and GOLE were 1.42 and 4.54 mg/kg which were 3.5-15 times as control. But PbB of GLL, GML, and GHL, having 1.12, 0.93, and 0.82 mg/kg respectively, were reduced by increasing of Garlic juice content. In the balance test of Lead GLL, GML, GHL, GOL, and GOLE group of 1st week showed the absorption ratios of Lead as 102, 8.4, 5.9, 11.2 and 13.8% of total intake, having 10.68, 8.71, 6.11, 11.49, and 146.05mg of absorbed Lead respectively, and 66.75-77% of absorbed Lead were excreted by urine. In the 2nd, 3rd, 4th week all test groups showed absorption ratios of 5.7~12.9, 5.5~12%, and 5.6-11.2% of intake lead and the urine excretion ratio was similar to 1st week and the absorption ratio was reduced by increasing of Garlic content. In the pathological findings of liver for 28 days experiment GMLO like control showed nearly healthful1 liver but a rat liver of GHLO group had slightly fatty metamorphosis and bile pifmentation in hepatic parenehyma. 4 rats in the GOL showed chronic: inflammatory cell infiltration and plasma cell in Portal tract. 5 rats of GOLE had slightly degenerative change of hepatocytes and chronic inflammatory cell in Portal tract. All rats of GHL and GML were nearly normal state but GLL showed bile pigmentation in cytoplasm of hepatocytes and small perivascular hemorrhage. So it is supposed that 1-5% content of Garlic has somewhat detoxication effect against Lead poisoning.