Effect of lidocaine on mammalian cells stably expressing human cardiac sodium channel, hNav1.5, using automated patch-clamp system : 사람의 심장 나트륨 통로인 hNav1.5를 안정적으로 발현시킨 포유세포에서 자동화 패치클램프 기기를 사용한 lidocaine의 약리적

최정희 가톨릭대학교 대학원 2016 국내석사

(The)effects of fluid flow on the voltage-dependent calcium channels in rat vascular smooth muscle cells: fluid flow as a shear stress and a potential source of artifacts during the patch-clamp studies

박상웅 건국대학교 대학원 2008 국내석사

이 연구에서 본 연구자는 분리된 rat 혈관 평활근 세포에서 nystatin perforated patch-clamp 방법을 이용하여 용액의 흐름에 의한 L-type voltage-dependent C^(a2)+ channel (VDCC_(L))의 변화에 대하여 실험하였다. 또한 용액의 흐름에 따른 liquid (bathing solution)-metal (Ag/AgCl ground electrode) junction potential의 영향에 대해 관찰하였다. I-clamp mode에서 Junction potential을 측정하였고, 다양한 flow 속도가 Junction potential에 미치는 효과를 관찰하였다. Pipette solution과 bath solution 사이의 Junction potential 변화를 막기 위해 3M-KCl을 pipette solution으로 사용하였다. Flow의 속도를 0-10ml/min로 실험한 결과 junction potential이 약 5 mV까지 증가하는 것을 관찰하였다. 이러한 변화는 Ground electrode와 bathing solution 사이에 3M-KCl agar bridge를 사용하면 차단되는 것으로 보아 bathing solution 과 ground electrode 사이의 liquid-metal junction potential 변화에 의한 것임을 알 수 있었다. 위에서 관찰한 변화와 함께 fluid flow는 junction potential의 VDCC_(L) current의 증가를 초래하였는데, 3M-KCl agar bridge를 사용하면 전류-전압 관계의 right-shift 변화없이 VDCC_(L) current의 증가만 관찰되었다. 이러한 결과는 patch-clamp실험에서 bath에 fluid flow가 liquid와 metal junction 사이의 잘못된 voltage shift를 가져올 수 있으며, 이것을 방지하기 위해 ground electrode로 3M-KCl Agar bridge를 사용해야 함을 시사한다. 또한, Fluid flow에 의한 shear stress는 혈관 평활근에 가해지는 중요한 기계적 자극이며, 또한 전압 의존성 칼슘의 채널 활성을 조절함으로써 myogenic tone등에 영향을 미침을 제안한다. I examined the effects of fluid flow on L-type voltage-dependent Ca^(2+) channel (VDCC_(L)) currents in rat vascular myocytes using the nystatin perforated patch-clamp technique. The effect of fluid flow on the liquid (bathing solution)–metal (Ag/AgCl ground electrode) junction potential was also studied. With a fluid flow of 0–10 ml/min, changes in the junction potential of up to 5 mV were observed in proportion to the flow rate. Accordingly, fluid flow shifted the current-voltage (I–V) relationship of the recorded VDCC_(L) currents in a positive direction. In addition to these shifts, fluid flow also increased the peak VDCC_(L) current, suggesting some modulatory role for fluid flow in VDCC_(L) currents. The use of a 3 M KCl agar-bridge between the ground electrode and bathing solution abnegated the potential shifts, and fluid flow increased the VDCC_(L) currents in a voltage-independent manner. These results suggest that the bathing fluid flow can be both a source of erroneous voltage shift between liquid and metal junctions in the patch-clamp configuration and an important shear stress for the cells. The facilitation of VDCC_(L) currents by fluid flow in vascular myocytes may contribute to the myogenic contraction of blood vessels. The mechanism by which fluid flow causes the voltage shift is vigorously discussed.

Studies on the mechanism of oxidative and mechanical stress-induced regulations of ion channels in rat mesentery arterial smooth muscle cells

박상웅 건국대학교 대학원 2011 국내박사

Hydrogen peroxide (H2O2) is reportedly an endothelium-derived hyperpolarizing factor in mammalian arteries. However, the effect of H2O2 on the KV currents, which play an important role in regulating membrane potential of many arterial smooth muscles including rat mesenteric artery, is still unclear. Using whole-cell patch-clamp technique, we examined the effect of H2O2 on the Kv currents of rat mesenteric arterial smooth muscle cells (MASMCs). H2O2 increased the Kv currents in major population of MASMCs, whereas relatively little or slightly decreasing effect of H2O2 on the Kv currents was evident in minor populations of MASMCs. We hypothesized that heterogeneity exists in the basal intracellular redox status of MASMCs and that the effects of H2O2 on the Kv currents are intracellular redox-dependent. Accordingly, pipette application of either H2O2 or oxidized glutathione (GSSG) increased the Kv currents by itself. Under this condition, subsequent bath application of H2O2 failed to increase Kv currents Moreover, adding glutathione reductase and NADPH to the pipette for blocking conversion of GSH to GSSG prevented the H2O2–activation of Kv currents. In organ chamber mechanics experiment, bath application of H2O2 relaxed the precontracted arterial rings. Pretreatment of dithiothreitol (DTT) inhibited the relaxation by H2O2. Pull-down assays with biotinylated glutathione ethyl ester (BioGEE) showed incorporation of GSH only to Kv 2.1 subunit in the presence of H2O2, among Kv1.2, Kv1.5, and Kv2.1 subunits. Present results indicate that H2O2 relaxes rat mesenteric arteries by S-glutathionylation-dependent activation of KV currents under physiologic conditions. We suggest that S-glutathionylation of Kv2.1 subunit is an important mechanism of Kv current activation by H2O2 in rat artery. The Kv2.1 channels may serve as a potential therapeutic target for oxidative-stress related cardiovascular diseases such as hypertension and diabetes mellitus. 1. 과산화수소(H2O2)는 포유류 혈관에서 내피 의존적 과분극 요소(EDHF) 라 알려져 있으며, EDHF가 중요한 이유는 여러 혈관 질환(동맥경화, 고혈압, 뇌졸증 등)에 직접 또는 간접적으로 영향을 미치기 때문이다. 하지만 아직 H2O2가 어떠한 신호 전달을 통하여 K 전류를 증가시키는지 아직 불 분명하다. 선행 연구에서 H2O2는 KATP channel, TASK channel, ca –activated K channel, 전압-의존성 K channel(Kv)등 K 전류를 증가시킨다고 보고되었다. 백서의 장간막 동맥(MASMCs)에서 여러가지 K 통로 중 Kv의 증가가 혈관 이완에 중요하다고 보고하였다. 따라서, 우리는 MASMCs에서 H2O2가 Kv 전류를 키우는데 어떠한 신호를 통하는지 알아 보고자 실험하였다. 이 연구에서는 whole-cell patch 방법, 수축실험, 그리고 western blotting 실험을 통하여 H2O2에 의한 Kv 증가 원인을 알아보았다. 우리는 먼저 MASMC에 H2O2 처리했을 경우 Kv의 변화를 관찰하였다. H2O2에 의해 주로 Kv 전류를 증가시키지만 조금은 감소 시키는 두 가지 반응이 나타났다. 이러한 두 가지 반응이 나타나는 이유를 밝히기 위해 pipette에 H2O2를 넣고 실험을 진행 하였다. pipette에 H2O2를 넣은 K 전류는 H2O2를 넣지 않은 K 전류보다 커져 있는 것을 확인할 수 있었다. 우리는 세포에 따라 redox 환경이 다르며, H2O2에 의해 세포내의 redox 환경이 변화여 생겼다고 가정하였다. 이러한 가설을 확인하기 위해 pipette에 글루타치온 환원형인 GSH 10mM과 산화형인 GSSG 10mM를 넣고 실험을 하였다. H2O2와 마찬가지로 GSSG만으로도 K 전류의 증가를 확인할 수 있었고, GSH가 들어있을 경우 H2O2에 의한 Kv 전류 증가되고, H2O2에 의해 더 민감하게 K 전류를 증가시키는 것을 확인할 수 있었다. 우리는 H2O2에 의한 글루타치온의 산화를 막기 위해 glutathione reductase를 사용하여 실험하였다. 파이펫에 NADPH 1mM만 넣어주고 H2O2 처치 후 Kv 전류가 증가하였고, NADPH와 glutathione reductase 0.5unit/ml 을 넣었을 경우 H2O2에 의한 전류 증가가 억제되었다. 수축실험에서, 혈관을 NE로 수축시킨 후 H2O2 10(-4,-3,-2)M에 의해 혈관이 이완하는 것을 관찰 할 수 있었고, DTT 전처리 후 DTT에 의해 NE 수축도 감소하였고 H2O2에 의한 이완도 억제 되는 것을 관찰 할 수 있었다. 다음으로, BIOGEE(250uM)를 이용하여 Kv의 S-glutathionylation을 확인해보았다. 그 결과 Kv 1.2, 1,5에서 보이지 않고 Kv 2.1만 S-glutathionylation 되었다. 또한 H2O2농도에 의해 Kv1.2, 1.5, 2.1 channel 모두 단백질 발현 변화가 없었다. 앞선 결과를 통해 생리적 조건에서 H2O2는 Kv 전류의 S-glutathionylation 을 통해 백서의 장간막 동맥을 이완시키며, Kv의 많은 subtype중 Kv 2.1의 S-glutathionylation이 H2O2에 의한 혈관 이완에 중요한 요소임을 알 수 있다. 2. Caveolae에는 많은 종류의 ion channels, receptors, signal proteins이 존재한다. 특징적으로, caveolin-1 protein이 풍부하게 존재하는데 그 기능에 대해 최근 활발히 연구되고 있지만 아직 불분명하다. 특히, stretch(신전)과 같은 기계적 자극에 의해 caveolae 구조가 없어진다고 보고되었다. 쥐의 장간막 동맥은 myogenic tone(근원성 수축; Bayliss effect)이 존재하는 조직으로 이는 평활근 세포(RMASMC)에서 stretch에 의한 L-type voltage-dependent Ca2+ channel(VDCCL)의 활성화와 밀접한 관련이 있는 것으로 생각된다. 이에, 본 연구는 stretch에 의한 VDCCL의 활성화의 신호전달 기전을 밝히고자 하였다. 우리는, VDCCL 전류를 기록하기 위해, nystatin-perforated patch technique과 whole-cell patch technique을 사용하였다. Nystatin-perforated patch-clamp 기법에서는 Na+ 과 Ca++을 VDCCL을 통한 전하 전달자로 이용하였고, 전통적인 whole-cell patch-clamp 기법에서는 Ba++을 전하 전달자로 실험하였다. 기록 방법에 관계없이 hypotonic solution(230mosm)은 RMASMCs swelling과 VDCCL 전류 증가를 일으켰다. 선행 연구와 마찬가지로 우리의 실험에서도 stretch에 의해 caveolae가 사라졌고, MBCD도 같은 효과가 있는 것이 관찰되었다. 더욱이, MBCD 처치만으로 VDCCL 전류가 증가하였다. 또한 Confocal microscopy를 통한 caveolin-1의 위치변화에서 stretch/MCD모두 caveolin-1의 세포 내로의 이동을 일으키는 것을 확인하였다. Stretch에 의한 VDCCL 조절에서 tyrosine kinase, PKC, MAP kinase 그리고 PLC 등 다양한 signal protein들의 역할에 대해 연구하였다. 여러 종류의 tyrosine kinase 차단제들(genistein, AG1478, PP2)과 PLC 차단제들(U73122, neomycin) 및 JNK 차단제(SP600125) 모두 stretch에 의한 VDCCL의 증가를 억제하였다. 하지만, ERK 차단제, p38 MAPK 차단제 및 강력한 PKC 차단제인 GF100923X는 stretch에 의한 VDCCL의 증가를 억제하지 못했다. PKC 활성제인 PMA는 약간의 VDCCL 증가 효과를 보였지만 PMA 존재 하에서도 stretch는 VDCCL 전류를 여전히 잘 증가시켰다. Western 실험 결과, stretch에 의해 Cav-1, PLCr-1, JNK 모두 phosphorylarion이 증가되었다. U73122처리 후 stretch를 가했을 때, Cav-1 phosphorylation은 증가 하였지만 JNK의 phosphorylation 증가는 사라지는 것을 확인하였다. Cell fraction을 통한 Cav-1과 PLCr-1 의 위치적 변화 관찰에서 Cav-1이 cell membrane과 cytosol에 존재하고, Cav-1과 PLCr-1의 phospho type은 cytosol 부분에만 존재하는 것으로 확인되었다. Immunopricipitation(IP)-Western blotting 실험 결과, Cav-1과 PLCr-1 phosphorylation의 결합이 stretch후 더 증가하는 것으로 관찰되었다. 위 결과들은 stretch에 의한 VDCCL 증가에서 caveolae 구조 및 Cav-1, PLCr-1, JNK 신호전달의 역할을 밝히고 있다. 우리가 아는 한, 제안된 기전은 기계적 자극에 의한 VDCCL 증가의 새로운 기전으로서, 기계적 자극에 대한 생체 감지 기전의 새로운 방향을 제시한다. 심혈관계에서 기계적 자극에 의한 VDCCL의 증가는 고혈압, 부정맥 등과도 관련이 깊은 것으로 알려져 있어 이들 질환에서도 caveolae 및 Cav-1-PLCr-1-JNK 기전에 대한 면밀한 검토가 필요하다고 사료된다.

사춘기전 마우스 미측소핵의 아교질 신경세포에서 시트랄의 억제성 신경전달 조절에 대한 연구

Thao, Nguyen Thi Phuong 전북대학교 일반대학원 2020 국내석사

Citral (3,7-dimethyl-2,6-octadienal) is a monoterpene aldehyde consisting of isomers geranial and neral chemically. The substantia gelatinosa (SG) of the trigeminal subnucleus caudalis (Vc) is admitted as a key site of receiving and regulating orofacial nociceptive inputs. Although citral is known to be involved in antinociception, the action mechanism of citral on the SG neurons of the Vc has not been fully understood yet. In this study, I examined the direct membrane effects of citral and how citral mediates responses on the SG neurons of the Vc in juvenile mice using a whole-cell patch-clamp technique. Under high chloride pipette solution, citral showed repeatable inward currents that persisted in the presence of tetrodotoxin, a voltage-gated Na+ channel blocker, and 6-cyano-7-nitro-quinoxaline-2,3-dione, a non-N-methyl D-aspartate (NMDA) glutamate receptor antagonist, 2-amino-5-phosphonopentanoic acid, an NMDA receptor antagonist. However, the citral-induced inward currents were partially blocked by picrotoxin, a gamma-aminobutyric acid (GABA) type A receptor antagonist, or by strychnine, a glycine receptor antagonist. Further, the citral-induced responses were almost blocked by picrotoxin with strychnine. I also found that citral exhibited additive effect with GABA-induced inward currents and glycine-induced inward currents were potentiated by citral. In addition, citral suppressed the firing activities by positive current injection on the SG neurons of the Vc. Taken together, these results indicate that citral has glycine- and/or GABA-mimetic actions and suggest that citral might be a potential target for orofacial pain modulation by the activation of inhibitory neurotransmission in the SG area of the Vc. keywords : Citral, GABAA receptor, Glycine receptor, Patch-clamp, Substantia gelatinosa neuron

마우스 미측소핵의 아교질 신경세포에서 세로토닌, 아연, 비스페놀 A에 의한 글리신 반응 조절에 대한 연구

Hoang, Nguyen Thi Thanh 전북대학교 일반대학원 2020 국내박사

The lamina II, also called the substantia gelatinosa (SG), of the medullary dorsal horn (the trigeminal subnucleus caudalis, Vc), is thought to play an essential role in the control of orofacial nociceptive. Glycine, the main inhibitory neurotransmitter in the central nervous system (CNS), has been shown to contribute an essential role in the transference of nociceptive messages from the periphery to the higher brain regions. For this reason, if any compound alters the functional properties of this neurotransmitter in the SG neurons, it may modify significantly the pain-signaling messages proceeding from the orofacial region to the brain. This thesis consists of three parts which correspond with the study about the effect of serotonin, Zn2+, and bisphenol A to the glycine receptors on SG neurons of the Vc. Serotonin (also known as 5-hydroxytryptamine, 5-HT) is an important neurotransmitter in the CNS. 5-HT is concerned in nociceptive transmission through regulation of the descending pathways in the spinal level initiating in the rostral ventromedial medulla. In this study, the whole-cell patch-clamp technique was used to investigate the interaction of intracellular signal transduction between 5-HT and the glycine receptors on SG neurons of the Vc. In nine of 13 neurons tested (69.2%), pretreatment with 5-HT potentiated glycine-induced current (IGly). Among the classes of 5-HT receptor subtypes, my study demonstrated that the 5-HT2 receptor is responsible for the potentiation of 5-HT to the glycine responses. The next compound is Zn2+. Zn2+ is particularly abundant in the mammalian CNS. There are proofs demonstrated the role of Zn2+ in the modulation of voltage- and ligand-gated ion channels. However, little is known about the roles of Zn2+ in the modulation of the glycine responses in the SG neurons of the Vc. Also with the whole-cell patch-clamp technique, Zn2+ was proved to induce a potentiation of glycine receptor-mediated responses. This effect was concentration dependent, the mean inward currents induced by glycine increased correspond with the rise of Zn2+concentration. The last compound of my thesis is bisphenol A (BPA), one of the endocrine disrupter. BPA is reported to alter the morphological and functional characteristics of neuronal cells and to be an effector of a great number of ion channels in the CNS. However, the electrophysiological effects of BPA on the glycine receptors on SG neurons of the Vc have not been well studied yet. By the whole-cell patch-clamp technique, BPA was demonstrated to not show any effect on the glycine-induced inward current in the early neonatal mice (0-3 postnatal day mice). However, at the juvenile and adult groups, BPA enhanced the glycine–mediated responses. This modulation by BPA was proved to be involved in the heteromeric glycine receptors. In summary, the results have demonstrated that both 5-HT, Zn2+, and BPA can potentiate the glycine-induced responses in the SG neurons in mice. The interaction between these above compounds on the glycine receptor in the SG neurons provides additional knowledge about their role in the transmission of orofacial nociceptive information. 연수후각 아교질은 악안면 통증정보 전달 및 조절의 핵심 중추로 간주된다. 중추신경계에서 대표적인 억제성 신경전달물질로 알려진 glycine은 악안면 영역으로부터 상위 중추로 통증정보를 전달하는데 있어 중요한 신경전달물질로 작용한다. 따라서 연수후각 아교질 내에 존재하는 신경세포에서 glycine 반응성을 조절하는 물질은 악안면 통증정보의 전달 및 조절에 영향을 미칠 수 있다. 따라서 본 연구에서는 마우스 미측소핵 아교질 신경세포에서 세로토닌, Zn2+ 및 bispenol A가 glycine의 반응성에 미치는 영향 및 작용 기전을 뇌절편을 이용한 패치클램프 기법을 통해서 규명하고자 하였다. 세로토닌(5-hydroxytryptamine, 5-HT)은 중추신경계에서 중요한 신경전달물질중의 하나로서 rostral ventromedial medulla (RVM)에서 기시하여 척수 수준으로 하행성 회로를 통해서 통증정보를 조절한다고 알려져 있다. 기록된 대다수의 세포에서, 세로토닌 전처리 시 glycine 반응성이 증가되었으며, 이러한 세로토닌에 의한 glycine 반응성의 증가는 세로토닌 수용체 아형 중 5-HT2 수용체가 관여됨을 확인하였다. Zn2+는 특히 포유류 중추신경계에서 막전압 의존성 및 리간드 의존성 이온통로의 활성 조절에 관여한다는 다수의 보고가 있으나 연수후각 아교질 신경세포에서의 작용 양상은 잘 알려져 있지 않다. 본 연구를 통해서 Zn2+가 마우스 연수후각 아교질 신경세포에서 glycine 반응성을 증가시킨다는 사실을 패치클램프 기법을 통해서 확인하였다. Bisphenol A는 내분비 교란물질로 잘 알려진 물질로 신경세포의 형태학 및 기능적 특성을 변화시키고 중추신경계 내 다수 이온통로의 활성에 영향을 미친다고 보고되고 있으나 미측소핵 아교질 신경세포에서의 영향은 보고된 바가 거의 없다. 신생아 마우스(생후 0-3일) 미측소핵 아교질 신경세포에서 bisphenol A는 glycine 매개로 유발된 전류에 영향을 미치지 않았으나 사춘기 및 성체에서는 glycine 매개 반응성 증가를 유발함을 확인하였다. 본 연구를 통해서 얻은 결과로서 세로토닌, Zn2+ 및 bisphenol A가 중추신경계 내 대표적인 억제성 신경전달물질인 glycine의 반응성을 조절함으로서 악안면 통증조절의 잠재적인 표적물질이 될 수 있음을 시사해 주고 있다.

Effects of stress hormones and drugs on electrophysiological functions of cardiomyocytes and vascular smooth muscle cell

박미형 강원대학교 일반대학원 2016 국내박사

Hydrocortisone ((11β)-11, 17, 21-trihydroxypregn-4-ene-3,20-dione) and cortisone (17-hydroxy-11-dehydrocorticosterone) are steroid hormones having lots of adverse effect on various organs. Human may be exposed to stressful conditions with harmful influences on their physiological and psychological health. To date, the adverse effect of hydrocortisone and cortisone on cardiac functions has not been revealed. Therefore, the effect of stress hormones on heart function was studied by examining the relation of two glucocorticoids (hydrocortisone and cortisone) and Q-T interval of electrocardiogram (ECG), action potential duration, intracellular Ca2+ transient, contractile force, and PKC phosphorylation status in guinea pigs' hearts. Administration of hydrocortisone and cortisone reduced the Q-T interval of ECG. Also, hydrocortisone and cortisone decreased the action potential duration at 90% of repolarization (APD90), APD50, and APD20 in a concentration- and time-dependent manner. Hydrocortisone and cortisone decreased the contraction and Ca2+ transient amplitude in ventricular myocytes. The hydrocortisone-induced decreases in contraction and Ca2+ transient amplitude were prevented by PKC inhibitor. Western blot analysis demonstrated concentration- and time-dependent changes in the phosphorylation status of PKC alpa/betaII, PKC epsilon. These results suggested that the stress hormones, hydrocortisone and cortisone, can affect the cardiac electrophysiology possibly either by direct action on ion transport mechanism or via biochemical change of intracellular signaling molecules. Azelastine is a second generation histamine H1-receptor antagonist used as an anti-asthmatic and anti-allergic drug that can induce QT prolongation and torsades de pointes. We investigated the acute effects of azelastine on human ether-a-go-go-related gene (hERG) channels, action potential duration (APD), and L-type (ICa,L) and T-type Ca2+ current (ICa,T) to determine the electrophysiological basis for its proarrhythmic potential. Azelastine increased the APD at 90% of repolarization concentration dependently, with an IC50 of 1.08 nM in guinea-pig ventricular myocytes. We examined the effects of azelastine on the hERG channels expressed in Xenopus oocytes and HEK293 cells using two-microelectrode voltage-clamp and patch-clamp techniques. Azelastine induced a concentration-dependent decrease of the hERG current amplitude at the end of the voltage steps and tail currents. The IC50 for the azelastine-induced block of the hERG currents expressed in HEK293 cells was 11.43 nM, while the drug inhibited ICa,L and ICa,T with IC50 values of 7.60 and 26.21 μM, respectively. The S6 domain mutations, Y652A partially attenuated and F656A abolished hERG current block. These results suggest that azelastine is a potent blocker of hERG channels rather than ICa,L or ICa,T, providing molecular mechanisms for the arrhythmogenic side effects during the clinical administration of azelastine. The effect of efonidipine, a commercially available antihypertensive drug and Ca2+ channel inhibitor, on voltage-dependent K+ (Kv) channels was studied in freshly isolated rabbit coronary arterial smooth muscle cells using the whole-cell patch clamp technique. The amplitude of Kv current was decreased by application of efonidipine in a dose-dependent manner, with IC50 of 0.26 M and a Hill coefficient of 0.91, which suggests 1:1 binding stoichiometry. Efonidipine did not affect voltage-dependent activation of the Kv channel, but shifted the inactivation curve by - 8.87 mV. The inhibitory effect of efonidipine was not significantly changed by depletion of extracellular Ca2+ or intracellular ATP, which indicated no involvement of the Ca2+ channel or intracellular protein kinase-dependent cascades. We conclude that efonidipine dose-dependently inhibits Kv current in a phosphorylation- and Ca2+ channel-independent manner.

Characterization of potassium ion channels of G292 cell line

전성진 Kyung Hee Univ. 2002 국내박사

칼륨이온통로는 생체 내에 널리 분포되어 있으며 다양한 기능을 수행한다. 6개의 막 관통 단백질로 구성된 전압의존성 칼륨이온통로는 신경세포에서 자극 활성을 조절하며 이들 단백질은 4개가 모여 하나의 전압의존성 칼륨 이온통로를 구성한다. Ca2+-activated 칼륨이온통로는 전도도에 따라 BK (big-conductance), IK (intermediate-conductance), SK (small-conductance)로 나뉘어 지며 안정막 전압 유지에 중요한 역할을 수행한다. Inwardly rectifying 칼륨이온통로는 세포 활성, 심장 박동률 조절, 인슐린 분비 등의 다양한 기능을 수행하며 이들은 두개의 막 관통 단백질 4개가 모여 하나의 이온통로를 구성한다. 이와 같이 칼륨이온통로는 세포마다 각기 다른 기능을 수행하며, 그 분포도에도 차이를 나타낸다. 또한 4개의 소 단위체가 모여 하나의 이온 통로를 구성하는 경우, 동일한 소 단위체가 결합하는지, 다른 소 단위체가 결합하는지에 따라 다른 양상의 칼륨 전류가 측정된다. 이러한 칼륨이온통로에 대한 연구는 지금까지는 주로 신경세포나 심장, 근세포 등에서 이루어 졌다. 줄기세포에서 형성된 골아세포는 뼈 형성에 중요한 역할을 수행한다. 그러므로 이 세포에 대한 연구가 구강영역에서 중요할 것으로 생각된다. 본 연구에서는 골아세포인 G292 세포 내에 존재하는 칼륨 이온 통로의 종류를 확인하고 칼륨이온전류를 측정하였고 그 결과는 다음과 같다. 1. G292 세포의 전기생리학적 특성 G292 세포의 전기생리학적 특성을 연구하기 위하여 whole-cell patch clamp방법을 사용하였다. -80 mV의 유지전압에서 70 mV부터 80 mV까지 10 mV 간격으로 자극하여 전류를 기록하였고 그 결과는 다음과 같다. 1)IK가 빠르게 최대치에 도달한 후 비활성이 신속하게 일어나는 전류들이 기록되었다. 2)역시 빠르게 최대치에 도달되고 oscillation이 심하며 자극기간 동안 거의 비활성이 일어나지 않는 전류들이 기록되었다. 3)최대치에 도달하는 속도가 비교적 느리며 후에 비교적 완만하게 비활성이 일어나며 자극의 크기 증가에 따라 전류의 크기 증가가 비교적 균일한 전류들이 기록되었다. 4)3)과 비슷한 양상으로 기록되나 비교적 비활성이 일어나지 않는 전류들이 기록되었다. 5) 3), 4)와 비슷한 양상이나 높은 전압에 의한 자극에 의해서도 비활성이 일어나지 않는 전류들이 기록되었다. 2. G292 세포 내에 존재하는 칼륨이온통로의 종류 본 연구에서 western blotting 방법을 이용하여 전압 의존성 칼륨 이온통로인 Kv1.3은 80 kDa, 칼슘에 의해 활성화되는 칼륨이온통로인 SK3는 40 kDa, inwardly rectifying 칼륨이온통로인 Kir2.1은 38 kDa의 크기로 G292 세포 내에 존재 함을 확인하였다. 이상의 연구결과를 통해서 골아세포인 G292 세포 내에 다양한 칼륨 통로가 존재함을 알 수 있었다. 또한 기록된 전류 양상으로 보아 이들 통로를 구성하는 소 단위체는 서로 다른 소 단위체가 하나의 통로를 이루어 각기 그 역할을 수행하리라고 사료된다.

신경말단부의 탈분극에 의한 신경전달물질 방출

이근희 경북대학교 일반대학원 2007 국내석사

The effect of potassium-induced presynaptic depolarization on spontaneous GABAergic inhibitory postsynaptic currents (mIPSCs) under extracellular Ca^(2+)-free conditions was investigated in mechanically dissociated rat CA3 pyramidal neurons using whole-cell patch-clamp technique. Elevating extracellular K+ concentration (15 mM) reversibly increased the frequency of mIPSCs even in the absence of extracellular Ca^(2+). Tetrodotoxin, organic calcium antagonists, such as nifedipine and ??-grammotoxin, had no effect on the potassium-induced synaptic potentiation. The potassium-induced increase in IPSC frequency was also observed in the presence of extracellular Cd2+. The potassium-induced facilitation of mIPSCs was not affected by blocking Ca^(2+) efflux through ryanodine receptors, but prevented by depletion of intracellular Ca^(2+) store with cyclopiazonic acid, suggesting the contribution of Ca^(2+)-release from intracellular Ca^(2+) stores. These results reveal a novel mechanism by which potassium-induced depolarization regulates the intracellular Ca^(2+) concentration and exocytosis in presynaptic nerve terminals.

Identification of compound 48/80-activated chloride channel in RBL-2H3

김현석 서울대학교 대학원 2015 국내석사

Mast cells are present in tissues in the body and participate in many physiological processes including allergy, tissue remodeling, fibrosis, angiogenesis, and autoimmunity. They can be activated by many stimuli, including calcium (Ca2+) ionophores, Compound 48/80, neuropeptides and immune stimulation. When activated, mast cells release several mediators, such as histamine, cytokines and bradykinin. According to many reports, increment of intracellular Ca2+ is the key factor for mast cell degranulation. Compound 48/80 mediated Ca2+ mobilization was regulated by 4,4’-diisothiocyanato-stilbene-2,2’-disulfonic acid (DIDS), general chloride (Cl-) channel blocker. In this thesis, we identify the Compound 48/80 induced Cl- channel which is involved in increase of intracellular Ca2+ and histamine degranulation in Rat Basophilic Leukemia cell (RBL-2H3) cell. Ion channel activated by Compound 48/80 was examined in RBL-2H3 cells using whole-cell patch clamp. Compound 48/80 evoked robust Cl- current in RBL cells and these currents were inhibited by Cl- channel blockers, including DIDS and 5-nitro-2-(3-phenylpropyl-amino)benzoic acid (NPPB). Next, we found that Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) protein is expressed in RBL cells by using RT-PCR. Our data showed that Cyclic AMP, known as CFTR agonist, mediated Cl- current was abolished by DIDS and CFTR-(inh)-172. When CFTR is expressed in HEK293T cells, Compound 48/80 induced CFTR dependent current which was inhibited by ADP substitution and activated by Forskolin and IBMX mixture. These findings suggest that Compound 48/80 mediated Cl- channel is CFTR.

신경 시냅스 조절인자 cAMP/cGMP ratio에 따른 시냅스 가소성 기전 규명

최원영 강원대학교 대학원 2008 국내석사

척수 아교질세포는 Aδ와 C-통각섬유와 시냅스를 이루며 통각정보가 통합되고 조절되는 중추신경계의 일차관문으로 많은 종류의 신경전달물질 혹은 조절물질에 의하여 흥분성 및 시냅스 가소성이 조절된다. 이와 관련된 시냅스 가소성의 기전에 대한 연구는 다양하게 이뤄졌으며cAMP와 cGMP와 같은 2차 전령계도 시냅스 가소성의 방향을 결정하는데 중요한 역할을 하나, 그들 간의 crosstalk에 대한 연구는 거의 없는 실정이다. 따라서 이번 연구에서는 척수 시냅스 수준에서 2차 전령계로서 cAMP와 cGMP간의 신호전달계 crosstalk과 시냅스 가소성의 관련성을 척수절편을 이용한 전기 생리학적 방법을 동원하여 규명하였다. 척수 아교질 신경세포의 시냅스 변화를 알아보기 위하여 척수 절편의 dorsal root entry를 전기자극하여 발생하는 시냅스 전류를 기록 (excitatory postsynaptic current; EPSC)를 기록하였다. 1 mM Br-cAMP 또는 Br-cGMP 15분간 처치는 washout이후에도 EPSC의 크기가 증가되었으며 그 반응은 30분 이상 지속되는 변화를 보였다. 그러나 1 mM cAMP와 cGMP를 동시 처치한 경우 EPSC의 증가가 관찰되지 않았으며, 이러한 결과는 각 약물이 서로의 작용을 억제하는 작용기전을 가지고 있음을 시사한다. cAMP와 cGMP 분해효소인 phosphodiesterase의 차단제 IBMX 전처치는 EPSC의 일시적 증가를 보이며, 이 조건에서 cGMP/cAMP의 처치는 EPSC의 반응성을 더욱 증가시켰다. 이러한 결과를 종합해 보면 각각의 2차 전령계는 통증을 유발하며 또한 두 2차 전령계가 활성화 되는 상황에서는 서로의 신호전달경로를 조절함으로써 통증조절을 하고 있음을 의미한다. Many neurotransmitters and modulators are associated with excitability or synaptic plasticity in substantia gelatinosa neuron (SGN), which integrated the nociceptive information from Aδ- and C-primary afferent. Previous studies reported that secondary messengers, such as cAMP or cGMP, play an important role in synaptic plasticity. However, their crosstalk mechanism is not explored. Thus, this study investigated that crosstlak between cAMP and cGMP is involved in spinal synaptic plasticity, using spinal slice patch clamp technique. In order to analyze spinal synaptic changes, dorsal root entry stimulation-induced excitatory postsynaptic current (EPSC) was recorded. Fifth min application of Br-cAMP (! mM) or Br-cGMP increased EPSC, which maintained for 30 min. However, co-application of cAMP and cGMP did not alter EPSC, which suggested that each has an antagonistic effect. Block of phosphodiesterase (PDE), which breakdowns cAMP and cGMP, by IBMX increased EPSC, and co-application cGMP/cAMP in this condition induced additional increase of EPSC. Taken together, each secondary messengers (cAMP and cGMP) induced hyperalgesia through the regulation of the mutual signal transduction and this process was understood as a pathophysiology of chronic pain.