우리나라 BALB/c 마우스에서 분리한 Cryptosporidium parvum에 관한 연구

위성환 全南大學校 1993 국내박사

사람을 포함하여 많은 포유동물과 조류, 파충류 그리고 어류에도 감염이 이루어지는 Cryptosporidium은 사람과 사람 또는 동물에서 사람으로 전파되고 있다. 설치류중에 마우스는 가축으로 질병을 전파하는 전염원으로 작용할 수 있으며, 이 원충은 동물이나 사람, 특히 신생 송아지의 설사에 중요할 원인체로 알려져 있다. 본 연구에서는 우리 나라에서 사육되는 BALB/c 마우스에서 이 원충의 오오시스트를 분리하여 설험적으로 ICR 마우스와 한우 송아지 및 젖소 송아지에 감염시킨 후 기생충학적 및 병리학적으로 조사하였다. 또한 실험적으로 감염된 송아지와 마우스의 분변으로 배출되는 오오시스트를 순수 분리하였으며, 이 오오시스트에 대한 monoclonal antibody(MoAb)를 생산하고 생산된 항체의 특성을 조사하였던 바 다음과 같은 결과를 얻었다. 우리 나라에서 사육하는 마우스(BALB/c)에 dexamethasone을 피하접종하여 Cryptosporidium을 분리하였다. 분리된 원충을 SPF(ICR계)마우스에 1.2×10^5개 경구 감염시킨 결과 감염 후 4일째 부터 분변에서 오오시스트를 확인할 수 있었으며, 감염후 40일 까지 오오시스트가 배출되었다. 감염된 마우스의 空腸下部에서 가장 많은 원충이 관찰되었는데, 원충의 기생 부위나 오오시스트의 형태학적 특징으로 보아 C. parvum(VRI-CN91주)으로 동정하였다. 25일령 한우 송아지에 마우스에서 분리한 VRI-CN91주의 오오시스트를 1×10^6개 경구 감염시킨 결과 감염 후 4일째부터 분변으로 오오시스트를 배출하여 6일째에 가장 많은 원충을 배출하였고 (분변 gram당 오오시스트의 수 : OPG : 4.9×10^5개), 오오시스트 배출은 8일간 지속되었다. 따라서 국내 마우스에서 분리된 C. parvum은 송아지에도 감염이 이루어져 숙주 특이성이 없음을 알 수 있었다. 마우스에서 분리한 VRI-CN91주와 워싱턴 주립대학교에서 분양받은 C. parvum (WSU주)을 7일령의 젖소 송아지에 7×10^6개씩 경구 감염시킨 후 기생충학적 및 병리학적 조사를 실시하였다. VRI-CN91주 국내 분리주를 감염시킨 송아지에서는 감염 후 5일째부터 6일간 수양성 설사를 나타냈으며, 감염 후 6일째에 분변으로 오오시스트가 배출되어 감염 후 8일째에 가장 많은 오오시스트를 배출하였다(OPG ; 3.75×10^6개). WSU주를 감염시킨 송아지에서는 감염 후 4일째부터 5일간 수양성 설사를 나타내었고, 감염 후 4일째에 분변에서 오오시스트가 처음 확인되었다. 감염 후 7일째에 분변으로 가장 많은 오오시스트를 배출하였으나 (OPG ; 1.4×10^7개) 감염 후 9일째에 탈수증상을 보이며 폐사되었다. 폐사된 송아지의 장은 전반적으로 충·출혈 소견을 나타냈으며, 특히 回腸部位가 심하였고 장융모의 위축과 부분적인 장세포의 탈락도 관찰되었다. 감염된 송아지의 胃와 腸을 병리조직학적으로 관찰한 결과 回腸部位에서 가장 많은 원충이 관찰되었으며 空腸에서도 드물게 관찰되었다. 실험적으로 C. parvum에 감염된 송아지와 마우스의 분변에서 배출되는 오오시스트를 ether extraction법 (EE법)과 discontinuous sucrose gradients법 (DSG법)을 병용하여 순수 분리하였다. 이 방법은 송아지 설사 분변뿐 아니라 정상적인 송아지 분변이나 마우스 분변에 함유된 오오시스트를 순수 분리하는데 효과적이었다. 순수 분리된 오오시스트를 50% 이상 얻기 위해서는 EE법으로 처리된 부유액에 단위용적당 (ml) 2×10^6개 이상의 오오시스트가 함유되어야 함을 알 수 있었다. 우리 나라 마우스에서 분리한 C. parvum 오오시스트에 대한 MoAb를 생산하였다. 생산된 2주의 MoAb는 IgG_(2b) class (1E7.2)과 IgM class(C6)에 속했으며, SDS-PAGE와 Enzyme immuno-transfer blotting한 결과 1E7.2는 원충의 단백 항원중 36KDa과 반응하였고, C6는 67KDa 및 70KDa과 반응하였다. 생산된 MoAbs를 간접 형광항체법으로 C. parvum원충과 반응시킨 결과 오오시스트 외막에 특이적으로 반응하였으며, Toxoplasma gondii의 tachyzoite, Eimeria zuernii, E. bovis, E. canadensis의 오오시스트와는 반응을 나타내지 않았다. Cryptosporidium species have a wide range of hosts including man and many other mammalian species, birds, reptiles and fish. Infections may be transmitted directly from man-to-man or from animal-to-man. Wild rodent, particularly mice, can act as a reservoir of infection for domestic animals. Since parasites inhibit the microvillous region of epithelial cells of intestine, the parasites mainly cause diarrhea in several mammalian species especially in neonates. The purposes of the present study were to observe the morphological characteristics of Cryptosporidium oocysts isolated from a BALB/c mouse and to characterize the oocysts parasitologically and pathologically isolated from experimentally infected mice and calves. This study was also performed to produce and to characterize the monoclonal antibody (MoAb) which can specifically reactive with this protozoa. To fulfil the purpose of the study Cryptosporidium oocysts were isolated from a BALB/c mouse rearing in Korea. In order to enhance the infectivity, the BALB/c mouse was treated with dexamethasone. Specific pathogen free ICR mice were administered orally with 1.2×10^5 oocysts isolated from the BALB/c mouse. The mice started to discharge oocysts on 4 day post-inoculation (PI) and continued to 40 day PI. The oocysts were most frequently observed at the lower parts of jejunum of the infected mice. The species was identified as C. parvum based on the morphological characteristics and their resident area in the intestine. A 25-day-old Korean native calf was orally inoculated with 1×10^6 C. parvum oocysts isolated from a BALB/c mouse. The calf commenced to discharge oocyst in feces on 4 day PI, and continued until the day 11. This result suggests that C. parvum is cross-transmissible between calf and mouse. For parasitological and pathological investigations of oocysts and to characterize the oocysts morphologically, two 7-day-old Holstein calves were orally administered with 7×10^6 C. parvum oocysts of a Korean strain and a Washington strain, respectively. The calf infected with Korean strain commenced to discharge oocyst in feces 6 days Pl, and reached a peak on the day 8 after inoculation (1.4×10^7 oocysts per gram of feces ; OPG). Clinically, the calf started to show the mucoid-watery diarrhea at 4 days after inoculation and lasted 5 days. Otherwise, the calf infected with Washington strain commenced to discharge oocyst in feces 4 days PI, and reached a peak on the day 7 after inoculation (OPG ; 3.75×10^6). This calf also showed the mucoid-watery diarrhea at 5 days after inoculation and lasted 6 days. The calf infected with Washington strain died of severe dehydration at 9 days after inoculation. Protozoan oocysts were observed in ileum with high amounts and low in jejunum. The combination of ether extraction and discontinuous sucrose gradients is applied to purify oocysts from both feces of the calf and the mouse. This developed purification method enable to isolate oocysts from both normal feces and diarrheic feces from the infected calf and mouse. Recovery rate was dependent on the number of oocysts in each suspension treated with ether extraction. It is suggested that there should be more than 2×10^6 oocysts/ml needed to get more than 50% recovery rate. Two MoAbs against the surface antigens of C. parvum oocysts were produced. The isotype of these 2 MoAbs was IgG2b (1E7.2 MoAb) and IgM (C6 MoAb), respectively. Enzyme immuno-transfer blotting analysis have shown that 1E7.2 MoAb reacted specifically to 36 KDa protein and C6 MoAb reacted to 67 and 70 KDa protein, respectively. These MoAbs were applied to indirect immunofluorescence antibody test. C. parvum were bound specifically to the surface region of oocysts by these MoAbs. No cross-reactivity was observed with tachyzoites of Toxoplasma gondii and oocysts of Eimeria zuernii, E. bovis, E, canadensis of bovine origin, respectively.

Mechanisms underlying Ig isotype switching induced by retinoic acid and iNOS

Lee, Mi-Ra 강원대학교 2011 국내석사

IgA is the most important antibody which protects mucosal surface against pathogens. Retinoic acid (RA) is known to have several activities which lead to potent mucosal IgA response. The present study provides several evidences that RA can act as a specific IgA isotype switching factor. RA, though less effective than TGF-β1, markedly increased the expression of Ig germ-line α (GLα) transcripts and IgA secretion by LPS-activated mouse spleen B cells but not other GL transcripts and Ig secretion. IgA enhancing activity of RA may, in part, be related to its ability to inhibit cell proliferation. RA-induced GLα transcription and IgA secretion were virtually disappeared by LE540, an antagonist of RA receptor (RAR). In addition, p38 inhibitor (SB203580) and ERK inhibitor (PD98059) diminished RA-induced GLα transcription and IgA secretion. Herein, it was found that RA can induce p38MAPK/ERK phosphorylation. Taken together, these results suggest that RA induces GLα transcription through diverse pathways including RAR and p38MAPK/ERK, leading to IgA isotype switching. It has been recently shown that nitric oxide (NO) plays a critical role in mouse IgA synthesis. The present study further characterized inducible-nitric-oxide-synthase-deficient (iNOS-/-) mice in the context of Ig expression. The amount of IgA in fecal pellets substantially diminished in iNOS-/- mice. This was paralleled by a decrease in the IgA production by peyer’s patch cells. Interestingly, the amounts of all IgG subisotypes and IgA substantially diminished in the sera. The same was true for the culture of spleen B cells from iNOS-/- mice. Moreover, TGFβ1-inducible IgA and IgG2b syntheses in iNOS-/- mice were also less than those in WT mice. Nevertheless, in iNOS-/-mice, levels of Ig germ-line transcripts, TGF-β receptor type II (TβRII), and BAFF/APRIL expression was comparable to those of control mice. However, activation-induced cytidine deaminase (AID) expression was diminished in iNOS-/- B cells and this was restored by a NO donor, SNAP. These results indicate that iNOS generally regulates Ig isotype switching event at the level of AID gene expression. IgA는 항원으로부터 점막을 보호하는 가장 중요한 항체이다. 최근 nitric oxide (NO)가 마우스에서 IgA 합성에 중요한 역할을 수행한다고 보고한 바 있다. 본 연구에서는 iNOS^(-/-) 마우스에서의 항체 발현에 대해 연구하였다. 분변에 존재하는 IgA 항체는 WT mice에 비해 iNOS^(-/-) 마우스에서 상당히 감소하였다. 이 결과는 Peyer’s patch cell에서의 IgA 항체 합성이 감소한 것과 일치한다. 흥미롭게도 iNOS^(-/-) 마우스의 혈청에서 모든 IgG와 IgA 항체 합성이 감소한 결과는 iNOS^(-/-) 마우스 비장 B 세포의 항체 합성 양상과 매우 유사하였다. 더군다나 TGFb1-유도성 IgA와 IgG2b 항체 합성은 마찬가지로 WT 마우스에 비해 iNOS^(-/-) 마우스에서 감소되었다. 그럼에도 불구하고 iNOS^(-/-) 마우스에서 germ-line 전사체, TbRII, BAFF와 APRIL 발현은 변화가 없었다. 그러나 activation-induced cytidine deaminse (AID)의 발현은 iNOS^(-/-) 마우스 비장 B 세포에서 감소하였고, 이 감소는 NO donor인 SNAP에 의해 회복되었다. 이상의 결과들은 iNOS가 AID 유전자 발현 수준에서 CSR을 조절할 수 있음을 보여준다. Retinoic acid (RA)는 강력하게 점막 IgA 항체 반응을 유도한다고 알려져 있다. 본 연구에서는 RA가 IgA 선택적인 CSR 인자로 작용하는 몇가지 증거를 확인하였다. 선행 연구결과에서 RA는 TGF-b1보다는 약하지만 마우스 비장 B 세포에서 IgA 항체 합성을 증가시킨 반면 IgM, IgG1과 IgG2b 항체 합성은 감소시켰다. RA는 LPS로 활성화된 마우스 비장 B 세포에서 GLa 전사체 발현과 IgA 항체 합성은 현저하게 증가시킨 반면 다른 GL 전사체와 항체 합성은 감소시켰다. RA의 IgA 증진 효과는 부분적으로 세포 증식을 억제하는 능력과 관련이 있는 것으로 보인다. RA에 의해 증가된 GLa 발현과 IgA 항체 합성은 RAR 억제물질인 LE540에 의해 사라졌다. 더군다나 p38MAPK 억제제 (SB203580)와 ERK 억제제 (PD98059)는 RA에 의해 증가된 GLa 발현과 IgA 항체 합성을 감소시켰다. 이상의 결과들은 RA가 RAR과 p38MAPK/ERK 기작을 통해 GLa transcription을 유도하여 IgA로의 CSR을 증가시킬 수 있음을 시사한다.

Mouse와 hamster의 妊娠期間에 따른 血液像 및 性호르몬 水準의 變化에 관한 硏究

이명헌 忠南大學校 1989 국내석사

These studies were carried out to investigate the changes of blood pictures and sex hormone concentrations during the gestation period in mouse and hamster. Number of erythrocytes, total leukocytes count, value of hemoglobin and hematocrit and erythrocytes index of blood in mouse and hamster were measured at 6, 14, 20 days and 5, 10, 15 days of gestation, respectively. Progesterone, estradiol-17 β, prolactin and LH in serum were assayed by radioimmunoassay method. The results obtained were summarized as follows: 1. Number of erythrocytes, value of hemoglobin and hematocrit during the gestation period in mouse significantly(P<0.05) decreased. The total leukocytes count during the gestation period were decreased from the days of mating to 14 days after gestation, and thereafter increased at 20 days after gestation. 2. Number of erythrocytes, value of hemoglobin and hematocrit during the gestation period in hamster significantly(P<0.05) decreased. The total leukocytes count during the gestation period were not shawing significant changes. 3. The mean of corpuscular hemoglobin content and corpuscular hemoglobin concentration during the gestatian period in mouse were decreased, and the corpuscular volume was increased from the days of mating to 14 days, and thereafter slightly decreased at 20 days after gestation. 4. The mean of corpuscular hemoglobin content, corpuscular hemoglobin concentration and corpuscular volume during the gestation period in hamster were not showing significant changes. 5. The concentration of serum progesterone during the gestation period in mouse were increased the highest level 14.94 ng/ml at 14 days after gestation, and thereafter decreased 8.9 ng/ml at 20 days after gestation. 6. The concentration of serum progesterane during the gestation period in hamster gradually increased from the days of mating, and reached 9.27ng/ml at 10 days after gestation, thereafter decreased at 15 days after gestation, The estradiol-17β concentration showed significantly increasing pattern, and reached a peak level 9.1 pg/ml at 15 days after gestation. 7. The prolactin concentration during the gestation period in mouse gradually increased after the days of mating, and reached a peak level of 7.6ng/ml at 20 days after gestation The LH concentration were below 1.0 mIU/ml during the gestation period. 8. The prolactin cancentration during the gestation period in hamster were s lightly increased, and thereafter reached 9.0ng/ml at 15 day after gestation. The LH concentration were below 1.0mIU/ml during the gestation period.

The effect of Jazf1 overexpression in mouse cardiac development : Jazf1 유전자의 과발현이 마우스 심장 발달에 미치는 영향

배 기범 경북대학교 대학원 2009 국내석사

심장의 형성은 매우 복잡하고 정확한 일련의 분자적인 과정을 통해 일어난다. 심장 형성 과정에 관여하는 유전자 발현의 작은 변화는 선천성 심장질환을 일으키는 원인이 된다. 하지만 선천성 심장질환을 일으키는 정확한 분자적인 매커니즘은 알려져 있지 않다. Juxtaposed with Another Zinc Finger gene 1 (JAZF1) 유전자는 그 기능이 알려지지 않은 zinc finger protein 이다. 현재까지의 연구에 의하면, NF1 syndrome 을 가진 환자들에게서 선천성 심장질환의 비율이 높게 나타났으며, 환자들의 유전자 분석을 통해 JAZF1의 발현이 높게 나타난다는 사실을 확인하였다. 이러한 연구결과를 토대로, Jazf1 유전자가 심장형성 과정에 관여할 것이라는 가정을 하였다. 형질전환 마우스를 확립하기 전, Jazf1 유전자를 과발현 하는 벡터를 제작하여 zebrafish embryo에 미세주입을 통해 심장의 모습을 확인 하였다. 그 결과 정상 zebrafish와는 달리 심장의 looping이 반대로 일어나거나, looping이 전혀 일어나지 않는 형태의 심장 모습을 확인 할 수 있었다. 이 결과를 바탕으로 Jazf1 유전자를 과발현 하는 형질전환 마우스 모델을 확립하여 마우스 심장발달에 어떠한 영향을 미치는지를 확인하였다. 정상 마우스와 형질전환 마우스의 운동성의 차이를 확인하기 위하여 트레드밀 테스트를 수행하였다. 정상 마우스에 비해 형질전환 마우스들은 지구력이 약했으며, 현저하게 운동성이 떨어짐을 확인하였다. 마우스를 마취시킨 후 심전도를 측정 해 본 결과, 형질전환 마우스의 심장박동이 빨랐으나 한번의 박동으로 인한 R peak의 높이는 낮음을 확인하였다. 정상 마우스의 심전도와 비교해 보았을 때 형질전환 마우스의 심장은 약하지만 빠른 속도로 뛰고 있음을 예상할 수 있었다. 13일째의 embryo를 whole embryo section 한 뒤 Hematoxyln & Eosin 염색을 통해 심장의 모습을 확인해 보았을 때, 형질전환 마우스의 심장발달 속도가 정상 마우스에 비해 느림을 확인하였다. 심장의 크기도 작았으며, 심장의 분화 속도도 느렸다. 성체 마우스의 심장 조직을 H&E 염색을 통해 보았을 때, 형질 전환 마우스의 심장 외벽 두께가 얇았으며 그 세포 조직의 괴사가 일어남을 확인 할 수 있었다. 본 연구를 통해 아직까지 정확한 기능이 밝혀지지 않은 Jazf1 유전자가 마우스 심장 형성에 중요한 역할을 한다는 사실을 확인 하였다. JAZF1 (Juxtaposed with Another Zinc Finger gene 1) transcription factors are Zn-finger proteins that bind to the nuclear orphan receptor TAK1/TR4 (Nakajima et al., 2004). The nuclear orphan receptor TAK1/TR4 functions as a positive as well as a negative regulator of transcription. It was recently reported that congenital cardiovascular malformations are significantly more frequent in Neurofibromatosis 1 (NF1) patients with microdeletion syndrome than in those with classical NF1. JAZF1 was expressed in adult heart of patients with NF1 microdeletion syndrome. JAZF1 is highly conserved among various species include mouse. We hypothesized that the expression of mouse Jazf1 may lead to severe forms of congenital heart disease that allow the survival of newborns and adults. In this study, we created Jazf1 transgenic mice which over-express mouse Jazf1 cDNA under control of the CMV promoter. In the Jazf1-Tg mice, Jazf1 mRNA expression was significantly increased in almost all tissues. The Jazf1-Tg mice showed necrosis of heart tissue and ECG (electrocardiogram) abnormality. Surface ECG recordings revealed multiple abnormalities of cardiac rhythm, including heart rate and RR interval. Importantly RR interval was significantly attenuated in Jazf1-Tg mice, which may contribute to the fasted heart rate. Our results suggested that Jazf1 expression may play an important role in mouse cardiac development.

Metabolomics study on growth and aging in mini-pigs and mice

김홍윤 단국대학교 2022 국내석사

노화는 환경적 요인, 유전적 요인, 생활습관 등 다양한 요인에 의해 유발되며, 각 요인의 구체적인 영향을 결정하기는 어렵다. 노화에 따른 내인성 대사산물의 변화를 분석하고 이해하면 노화 관련 질병의 조기 진단과 치료에 도움이 될 수 있다. 본 연구는 미니피그와 마우스를 이용하여 성장 및 노화에 대한 대사체학 바이오마커를 제안하는 것을 목적으로 하였다. 1년령부터 10년령(Y)까지 매년 수컷과 암컷 미니피그 혈청 시료를 채취하였다. 마우스는 DBA/2 수컷(male DBA)과 암컷(female DBA), C57BL/6N 수컷(male C57) 및 암컷(female C57) 마우스에서 6, 26, 52 및 104주령(W)에 혈청 샘플이 연구에 사용되었다. 미니피그(MICROPIG®)와 마우스 혈청 샘플은 1H-NMR을 이용하여 내인성 대사산물의 변화를 분석하였다. 미니피그에서 global profiling과 target profiling trajectory analysis 결과, 1Y에서 시작하는 궤적선이 5Y에서 연령이 증가함에 따라 다시 1Y쪽으로 이동하는 경향성을 확인하였다. 이러한 결과를 바탕으로 1Y와 5Y, 10Y 그룹을 대표로 선정하여 PCA 및 PLS-DA 분석을 수행하였다. Target profiling의 PLS-DA 결과를 이용해 각 그룹의 clustering에 영향을 준 VIP value가 0.7 이상인 대사산물을 확인하였다. 21개의 대사산물이 확인되었으며, 이를 이용하여 노화 관련 대사경로를 확인하였다. 미니피그 혈청에서 예측된 대사경로 중 발린-류신-이소류신 분해, 글리신-세린-트레오닌 대사, 피루브산 대사 및 알라닌-아스파르테이트-글루타메이트 대사가 성장 및 노화와 연관되었고, 11개의 대사산물이 이에 관여하였다 (glycine, alanine, valine, glutamate, glutamine, creatine, threonine, leucine, serine, isoleucine 및 betaine). 모든 대사산물은 5Y까지 증가하였고, 이후 감소하였다. 이러한 결과는 미니피그는 5년까지 성장 및 성년기이며, 이후에는 노화가 발생한다는 사실을 보여준다. 마우스에서 마찬가지로 global 및 target profiling trajectory analysis를 수행하였다. 모든 그룹은 global profiling 분석에서 6, 26 및 52W는 principal component (PC) 1에 따라 104W와 분리되었다. Target profiling trajectory analysis에서 female DBA를 제외한 모든 그룹에서 6, 26W가 PC1에 의해 52, 104W와 분리되었다. 각 그룹의 PCA 및 PLS-DA 분석을 수행한 결과, Global profiling PCA 및 PLS-DA에서는 모든 그룹에서 clustering이 확인되었고, target profiling PCA에서는 PCA male DBA 52W와 male C57 26W를 제외한 모든 그룹에서 clustering이 확인되었다. Target PLS-DA에서는 모든 그룹에서 clustering이 확인되었다. Target profiling의 PLS-DA 결과를 이용해 각 그룹의 clustering에 영향을 준 VIP value가 0.7 이상인 대사산물을 확인하였고, 이를 이용하여 노화 관련 대사경로를 확인하였다. 모든 마우스 그룹에서 예측된 대사 경로는 미니피그와 동일하였고, VIP value와 관계없이 대사경로 내의 모든 대사산물을 확인하였다. 19개의 대사산물이 확인되었으며, 이러한 결과를 바탕으로 미니피그에서 acetate, alanine, creatine, glutamate, glutamine, isoleucine, leucine, threonine 및 valine, female DBA 및 C57 마우스에서 citrate, lactate, sarcosine 및 pyruvate, male DBA 및 C57 마우스에서 asparagine, glutamine, isoleucine, sarcosine, serine, threonine 및 valine을 성장 및 노화에 대한 바이오마커로 선택하였다. 이러한 성장 및 노화에 대한 대사체학 바이오마커는 동물 성장 또는 노화 관련 질병을 예측하는데 유용할 수 있다. Aging is induced by various factors such as environmental and genetic factors, and lifestyle, the specific effects of which are difficult to define. Understanding the changes in endogenous metabolites with age can help in the early diagnosis and treatment of age-related diseases. In this study, metabolomic biomarkers for growth and aging were identified in mini-pigs and mice. Male and female mini-pig serum samples were collected yearly, for 1–10 years (Y). Serum samples from mice (DBA/2 and C57BL/6N) at 6, 26, 52, and 104 weeks (W) were used. The mini-pig and mouse serum samples were analyzed for changes in endogenous metabolites using 1H-NMR. Global and target profiling trajectory analysis revealed that the trajectory line started at 1Y, turned at 5Y, and moved back to 1Y with increasing age in mini-pigs. Based on these results, the 1Y, 5Y, and 10Y groups were selected as representatives, and multivariate analyses of principal component analysis (PCA) and partial least-squares discriminant analysis (PLS-DA) were performed. Using the PLS-DA results of target profiling, 21 metabolites with variable importance plots (VIP) scores of >0.7 were selected for meaningful metabolites influencing separated clustering. Aging-related metabolic pathways were identified using the 21 metabolites. Among the metabolic pathways predicted in mini-pig serum, valine-leucine-isoleucine degradation, glycine-serine-threonine metabolism, pyruvate metabolism, and alanine-aspartate-glutamate metabolism have been suggested to be associated with growth and aging, and 11 metabolites contribute to growth- and aging-related metabolism (glycine, alanine, valine, glutamate, glutamine, creatine, threonine, leucine, serine, isoleucine, and betaine). All metabolites increased up to 5Y and then decreased. These results indicated that mini-pigs grow and reach adulthood for up to five years, after which aging occurs. Similarly, global and target-profiling trajectory analyses were performed on the mice. In the global profiling trajectory analysis, 104W were classified by principal component (PC) 1. In the target trajectory analysis excluding the female DBA, 52W and 104W were classified by PC1. Global PCA and PLS-DA clearly clustered all age groups. The target PLS-DA exhibited separate clustering according to age. Using the PLS-DA results of target profiling, metabolites with a VIP score over 0.7 were selected, and aging-related metabolic pathways were suggested. Metabolites showed a tendency to almost increase up to adulthood of 52W except for male C57. The predicted aging-related metabolic pathway in the mouse serum was the same as that in the mini-pig serum. All metabolites in the metabolic pathway were identified regardless of the VIP value. Nineteen metabolites in the pathway were selected, and aging-related metabolic pathways were identified. Based on these results, acetate, alanine, creatine, glutamate, glutamine, isoleucine, leucine, threonine, and valine were selected as biomarkers of aging in mini-pigs. These endogenous metabolites could be also suggested as biomarkers of growth. Citrate, lactate, sarcosine, and pyruvate in female DBA and C57 mice and asparagine, glutamine, isoleucine, sarcosine, serine, threonine, and valine in male DBA and C57 mice were selected as biomarkers for growth and aging. These suggested metabolomics biomarkers for growth and aging could be useful for prediction of animal growth or age-related diseases in animal.

MOUSE모형의 국내적용성에 관한 연구 : 최적화 및 민감도 분석

김태민 경기대학교 대학원 2005 국내석사

강우에 의한 도시지역의 유출 매개변수를 정확히 산정할 수 있다면 홍수로부터의 피해를 최소화하는데 큰 도움을 줄 수 있다. 이에 본 논문에서는 현재 유럽에서 도시유출모형으로 사용되고 있는 MOUSE 모형을 이용하여 국내 도시유역을 모델링 함으로써 MOUSE의 적용성을 판단하고자 한다. 이에 대해 3가지의 강우사상과 실측유량을 바탕으로 군자배수구역의 적정 소유역분할에 따른 유출량 해석과 유출매개변수의 최적화와 민감도 분석을 연구하였고, 관거 구성시 MOUSE 모형에 입력되는 자료의 구성에 대한 민감도를 분석하기 위해 관거의 크기, 관거의 경사등에 따른 분석도 실시하였다. 그 결과 적정 소유역 분할은 소유역의 분할이 많아질수록 실측유량에 근접하게 모의됨을 알수 있었으며, 유출 매개변수의 최적화 결과 유출매개변수의 최적화는 유출매개변수를 일정한 값으로 변화시킴으로 인하여 소유역마다의 유출매개변수를 각각 변화시키기에는 무리가 있는 것으로 판단되나 비교적 근사한 최적 매개변수를 산정할 수 있었다. 유출매개변수 민감도 분석을 실시한 결과 시간-면적곡선법의 경우에는 손실계수, 비선형 저류방정식에서는 매닝계수(불투수)에 의한 민감도가 가장 크게 나타났다. 관로 매개변수에 따른 유출량 분석결과 관경보다는 관로의 경사에 관한 매개변수들이 유출량에 미치는 영향이 크게 나타났다. This study used the MOUSE model which is used in EURO for Runoff Analysis and Optimization, try to applicate in Korea urban area. First, this study did How many divides sub-basins in Gunja area for exact modeling in 3 rainfall events. Then, I did auto-calibration and sensibility analysis. And I also performed sensibility analysis about the pipe size and slope in MOUSE INPUT Data. As a result, I found that the more sub-basin is the better. also auto-calibration is nearly about the observed discharges. runoff parameter analysis result in Time-Area method case, reduction factor is very sense, and In kinematic wave case, Manning Parameter in previous is ver sense. Pipe Parameter Analysis result is that Pipe Slop influence is better than Pipe size influence.

MOUSE 프로그램을 이용한 하수관망 해석 연구

이상일 충남대학교 대학원 2007 국내석사

Enormous Budget is committed into sewer rehabilitation projects which aimed to not only quantitative expansion but also upgrade qualitatively upgrade since 'the first year of sewer rehabilitation' is started. Therefore, this research compares and evaluates results between currently operated rational equation method and MOUSE program of DHI corporation which is possible to simulate the real time sewerage outflow and if results is not corresponding, the reason and optimal sewer analysis method is grouped. Sewer network analysis is proceeded with both methods in real small drainage area, Jinan-Eup, Jinan-Gun, Jeonbuk. The result shows rational equation method induce more rehabilitation scope sewer length than MOUSE program, which the length in rational equation is 3,918m and the length in MOUSE is 3,195m. The rational equation method doesn't consider delaying condition and calculate peak flow in outlets simultaneously. However, peak flow is lowered in MOUSE because rainfall is distributed hourly and outflow is delayed by hourly distributed rainfall. In medium or large size drainage area, the difference is more increased and MOUSE program method would be economically advantageous rather than rational equation method in selection of rehabilitation scope sewer length. Especially, through the additional function in MOUSE, such as graphic support, GIS linkage, and water quality simulation, rational and easy sewer maintenance would be possible. However, MOUSE has limitation in natural disaster such as natural calamity because samll drainage area has short inflow time followed by the recent rainfall history which has intensive heavy rainfall in local area. Therefore, the conclusion in this research propose that rational equation method would be applied in small drainage area and MOUSE which apply outflow model such as Synthetic Unit Hydrographs could be applied in medium and large size drainage area.

A study on the potential role of necrop-tosis effectors in mouse oocytes during oocyte maturation

안정민 건국대학교 대학원 2022 국내석사

Necroptosis는 programmed cell death의 한 유형으로 세포사멸과 괴사의 특성을 지니고 있다. 종양 괴사 인자 α(TNFα) 및 기타 사멸 리간드에 의해 유발된다. necroptosis의 세포질 이펙터, 수용체-상호작용 세린/트레오닌-단백질 키나제 1(RIPK1), RIPK3 및 혼합 계통 키나제 도메인 유사(MLKL)의 순차적인 작용에 의해 활성화 된다. Necroptosis는 원형질막 파열과 다양한 염증성 케모카인을 포함하는 DAMPs(손상연관분자유형)의 방출로 이어진다. 본 연구에서는 생쥐의 난자에서 주요 괴사 효과인자가 발현되는지와 난자가 necroptosis 신호에 반응하는지를 조사하였다. RT-PCR과 면역형광염색을 통해 생쥐 난자에서 RIPK1, RIPK3, MLKL의 발현을 조사하였다. 세 가지 요인 모두는 생식소포(GV) 및 중기(MII) 단계 난자에서 발되었다. RIPK3 및 MLKL은 핵막이 풀어지지 않은 경우 GV 난자의 핵 내에 국한되지만 GV 분해 후에는 뚜렷한 패턴을 나타내지 않았다. 그런 다음 RIPK1의 inhibitor인 Nec-1s를 처리하여 생쥐 난자의 성숙에 영향을 미치는지를 조사하였다. Nec-1를 처리한 군에서 necroptosis의 최종 단게의 발현 인자인 pMLKL의 발현이 줄어들었음을 IF 사진으로 관찰하였다. 또한 RIPK3 억제제인 GSK'872와 dabrafenib의 처리가 난자의 성숙에 영향을 미칠 수 있는지 조사했다. Dabrafenib 처리된 난자는 성숙이 지연됨(MI 단계에서 54.7% 정지)을 보인 반면 GSK'872는 그러한 효과를 나타내지 않았다. 이는 생쥐의 난자에서 dabrafenib과 GSK’872의 기전이 다름을 암시한다. 후에 면역형광염색법을 통해 IF데이터에서도 보았는데 pMLKL의 발현이 줄어듬을 보이진 않았다. 이러한 결과는 mouse의 난자에서 necroptosis를 유발하는 프로세스에 RIPK1과 RIPK3의 두가지 pathway로 진행 될수 있다는 것을 암시한다. 다음으로 TSZ(TNFα, Smac 및 zVAD-FMK를 포함하는 괴사 유도) 처리가 난자에서 괴사 necroptosis를 일으키는지 조사했다. 2개의 대표적인 DAMP 유전자인 C-X-C Motif Chemokine Ligand 1(Cxcl1) 및 C-X-C Motif Chemokine Ligand 10(Cxcl10)의 발현은 RT-PCR를 통해 TSZ 처리된 난자에서 관찰을하였다. TSZ 처리 시 두 유전자를 모두 발현하는 L929 세포와 달리, 난자는 이 두 DAMPs 유전자의 유도를 나타내지 않았으며, 이는 난자가 외인성 괴사 유도 신호에 다르게 반응할 수 있음을 시사한다. 종합적으로, 결과는 생쥐의 난자 성숙 및 발달에 영향을 미칠 수 있는 necroptosis 기전을 보유하고 있음을 보여준다. Necroptosis is one of the regulated cell death pathways, which shares several upstream signaling elements with apoptosis. It can be triggered by tumor necrosis factor α (TNFα) and other death ligands. Activation of necroptosis involves sequential actions of cytoplasmic effectors, receptor-interacting serine/threonine-protein kinase 1 (RIPK1), receptor-interacting serine/threonine-protein kinase 3 (RIPK3), and mixed lineage kinase domain-like (MLKL). Necroptosis leads to the rupture of plasma membrane and release of molecules termed danger associated molecular patterns (DAMPs), which include various inflammatory chemokines. In this study, I examined whether major necroptosis effectors are expressed in mouse oocytes and whether oocytes respond to necroptosis-inducing signal. I examined expression of RIPK1, RIPK3, and MLKL in mouse oocytes by Reverse Transcrip-tion Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) and immunofluorescence staining. All three factors were expressed in germinal vesicle (GV) and Metaphase II (MII) stage oocytes. RIPK3 and MLKL were localized within the nucleus of GV oocytes when the nuclear membrane was intact, but did not show distinct patterns after GV breakdown. pRIPK1 and pMLKL were both localized in structures associated with microtubule organizing center (MTOCs) in germinal vesicle break down (GVBD)- and MII-stage oocytes. Then, the effect of Nec-1s, an inhibitor of RIPK1, on oocyte maturation was investigated to determine whether it affects the maturation process of mouse oocytes. Nec-1s treatment did not influence oocyte maturation process. In Nec-1s-treated oocytes, pMLKL signal was somewhat reduced in spindle poles of MII oocytes. Next, I investigated whether the treatment of GSK'872 and dabrafenib, both of which are RIPK3 inhibitors, could affect oocyte maturation in vitro. Dabrafenib-treated oocytes showed maturation arrest (54.7% arrested at GVBD stage) while GSK’872 did not show such effect. This suggests that the mechanisms of dabrafenib and GSK'872 in mouse oocytes are different. Although dabrafenib treatment delayed maturation process in oocytes, this treatment did not cause a decrease in the expression of pMLKL. These results suggest that dabrafenib may have distinct targets which were not associated with necroptosis pathway in mouse oocytes. I next examined if treatment of TSZ (necroptosis-inducing cocktail containing TNFα, Smac mimetics, and zVAD-FMK) causes necroptotic activation in oocytes. Expression of two representative DAMP genes, C-X-C Motif Chemokine Ligand 1 (Cxcl1) and C-X-C Motif Chemokine Ligand 10 (Cxcl10), were examined in TSZ-treated oocytes by RT-PCR. Unlike L929 cells, Mouse fibroblast cell line, which expressed both genes upon TSZ treatment, oocytes did not show induction of these two DAMPs genes, suggesting that oocytes may respond differently to exogenous necroptosis-inducing signals. Collectively, the results show that mouse oocytes harbor necroptosis machinery which may influence maturation and development.

Pathogenesis of Mouse Hepatitis Virus A59 Infection in C1qa Knockout Mice

김한웅 건국대학교 대학원 2020 국내석사

Mouse hepatitis virus (MHV) is one of the most contagious pathogens threatening laboratory mice. MHV A59 is a highly infectious and polytropic strain. In general, the infection of MHV A59 starts at respiratory tract and progresses to systemic infection. C1q forms C1 complex and initiates the classical complement pathway of the complement system. In this study, MHV A59 was infected in C57BL/6J-C1qa knockout (C1qa KO) mice to compare the pathogenesis of MHV systemic infection. C1qa KO and C57BL/6J (wild type) mice were inoculated with MHV A59 by intranasal route. Mice were sacrificed 3 and 6 days of post infection. In necropsy, brain, liver, lung, spleen and intestine were sampled for molecular and histopathological analysis. Brain was separated into olfactory bulb, cerebrum, cerebellum, hypophysis and spinal cord. Viral RNA in each organ was measured by a real-time PCR method. MHV A59 infection in C1qa KO showed similar grade of histopathologic changes with those of wild type mice 3 dpi, but more severe lesions were observed 6 dpi compared to wild type mice; interstitial pneumonia, multifocal hepatitis. In contrast, the lesions of wild type mice were mild 3 and 6 dpi. IL-10, TNF-α, IFN-γ, MIP-1α and MCP-1 expression levels in spleen showed upregulation in C1qa KO mice than wild type mice. Chemokine upregulation was consistent with viral loads and histopathologic changes. Virus copy number in olfactory bulb, liver, lung and large intestine of C1qa KO mice was significantly higher than that of wild type mice. Viral copy number of C1qa KO mice was related to histopathologic changes of organs. These results suggest that C1qa deficiency enhances susceptibility to MHV A59 systemic infection and activation of classical complement pathway might be important in protecting host against MHV A59 infection. Mouse hepatitis virus (MHV)는 실험동물에 있어서 전염성이 강한 병원체이다. 그 중에서 MHV A59는 전염성이 매우 높고 전신 장기에 감염이 가능한 바이러스이다. 성체 마우스에서는 심각한 임상증상을 나타내지 않지만, 어린 마우스나 면역이 저하된 마우스에서는 탈수초성 뇌염, 다발성 경화증, 간염 등의 증상을 일으킨다. C1q는 C1r, C1s와 함께 C1 복합체를 형성하여 보체 경로를 개시하는 보체계의 단백질 복합체로, 고전 보체 경로를 개시하는 역할을 한다. 본 연구에서는 정상 마우스와, C1qa를 발현하는 유전자 결핍으로 면역이 저하된 마우스에게 mouse hepatitis virus를 감염시켜 바이러스 감염에 있어서 고전 보체 경로의 역할을 알아보고자 하였다. C1qa 결핍 마우스와 C57BL/6J (wild type) 마우스에 MHV A59를 비강 내 주입 방법으로 감염시켰다. 마우스의 체중은 매일 측정하였고, 실험 마우스는 감염 후 3일 차, 6일에 각각 안락사시켰다. 부검 시에는 분자 생물학적 분석과 조직병리학적인 검정을 위해 뇌, 간, 폐, 비장, 공장, 결장을 분리하였다. 뇌는 각각 후각 망울, 대뇌 피질, 소뇌, 뇌하수체, 척수로 분리하였다. 감염 장기 내에 바이러스의 RNA양을 측정하기 위해 real-time PCR 방법을 이용하였다. C1qa 결핍 마우스와 C57BL/6J 마우스 모두 MHV A59 감염 3일에는 비슷한 정도의 병변을 보였으나, 감염 6일에서 C1qa 결핍 마우스가 정상 마우스인 C57BL/6J 마우스에 비해 심한 간질성 폐렴, 다발성 간염 등의 병변을 보였다. 비장 내 사이토카인의 발현량을 측정하기 위해 마찬가지로 real-time PCR 법을 이용했다. C1qa 결핍 마우스에서 각각 사이토카인의 발현량이 더 높은 것으로 확인했다. 면역이 저하된 C1qa 결핍 마우스는 감염 장기에서의 바이러스 RNA 발현량과 비장의 사이토카인 발현량이 모두 높은 것으로 나타났다. 이는 조직병리학적 평가에서도 염증세포 침윤과 염증의 정도를 보았을 때 일치하는 결과이다. 이러한 결과에서 C1qa의 결핍은 MHV A59의 전신 감염력을 증폭시키며, 고전 보체 경로가 MHV A59의 감염으로부터 숙주를 지키는데, 중요하다는 것을 알 수 있다.

Transplantation of porcine germ cells into mouse testis

이미숙 경상대학교 2004 국내박사

남성생식에 있어서 화학적 요법이나 방사능 치료에 의한 불임으로부터 남성 암환자를 보호하기 위한 기초 연구를 수행할 목적으로 본 연구를 수행하였다. 항암제는 체내에서 빠르게 분화, 증식하는 세포를 죽이는데, 항암제의 일종인 busulfan 은 male germ cell 중 특히 meiosis 와 haploid germ cell 을 비롯하여 분화중인 모든 세포를 죽임으로써 외부에서 들어온 세포가 정착할수 있는 공간과 기회를 제공하게 된다. 이것으로 busulfan 을 투여한 mouse 을 이종간의 이식시 recipient 로 이용 가능하였고, donor 는 생후 7-15 일된 돼지의 정소를 거세하여 세포를 분리한후 germ Cetl 을 mouse 의 정소수출관을 통하여 이식하였다. 이때 돼지의 germ Cell 과 mouse의 세포를 구분하기 위하여 in vivo 에서 100일간 유지되고 red fluorescent 을 발하는 PKH 에 염색하여 돼지 germ cell을 넣어 준후, 일정시간이 지난후 그 발달을 관찰하였다. 시간을 이식후 1일, 10일, 1달로 나누어 frozen section, slide PCR, RT-PCR 로 확인해 본 결과 이종간의 이식인 돼지 germ cell 의 mouse 정소내 이식은 이식후 1 일은 mouse seminiferous tubules 의 lumen 에 이식해준 돼지의 germ cell 이 모여있고, 시간이 지나면서 mouse seminiferous tubules 의 basement membrane 에 localization 하는것을 확인하였다. 그러나 돼지의 germ Cell 은 이식후 1 달까지는 mouse 정소내에서 확인할수 있었지만, 이식후 2 달이 지난후에는 확인할수 없었다. 세포사를 확인하는 방법인 TUNEL 염색으로 확인해 본 결과 이식후 2 달이 되면 돼지의 germ cell 은 mouse 정소내에서 apoptosis로 간다는 것을 알수있었다. 결과적으로 돼지의 germ cell은 mouse 정소내에 이식하였을때, busulfan을 투여한 mouse를 recipient로 이용가능 하였지만 이식해준 돼지의 germ Cell은 더 이상 분화하지 않는 것을 확인하였다.