Computational modeling of molecular interactions for biomarker discovery using single/multi-omics data

정다빈 서울대학교 대학원 2024 국내박사

Biomarkers are indicators of biological processes and disease status, guiding treatment decisions and assessing responses to therapies. They encompass various measurable entities such as gene transcripts and proteins, reflecting physiological or pathological conditions within complex biological systems which is a collection of complex interactions between biomolecules. With the advent of high-throughput omics technologies, biomarker discovery has shifted towards data-driven approaches that allow complete profiling of biomolecules at different biological levels. That is, high-throughput technologies can profile complete set of biomolecules in each omics at individual molecular level. This poses challenges in modeling complex biological systems for biomarker discovery because inference of molecular interactions from individual molecular measurements is needed. To address these challenges, computational methodologies that integrate inductive biases should be developed to model the complex interplay of biomolecules. Inductive bias, a method to guide learning with prior knowledge, helps narrow down the search space for potential molecular interactions. By incorporating biological network structures, regulatory motifs and functional annotations, these approaches aim to enhance the predictability and interpretability of biomarkers. This integration of inductive biases improves the reconstruction of biomolecular interactions, facilitating the discovery of accurate and meaningful biomarkers among complex biological systems. My thesis consists of three studies that incorporate the biological network as an inductive bias to model interactions between biomolecules to aid biomarker discovery. In the first study, our objective was to address the challenge of reconstructing the rewired gene regulatory network (GRN) in response to external stimuli using transcriptome data. We hypothesized that the expression of RNA molecules, typically assessed at the individual gene level, is correlated between the interacting genes in GRN. The challenge in GRN reconstruction is large search space of transcription factor (TF) and the target gene (TG) pairs and cooperative nature of TFs in regulating TGs. Thus, we proposed a computational method for reconstructing GRNs from transcriptome data that reduces search space of TF-TG pairs by graph filtering of knowledge graph on gene interactions. To capture cooperative regulatory modules in GRN, kernel canonical correlation analysis (CCA) is used to project profiles of TFs and TGs in the same embedding space to generate overlapped representations of TFs and TGs. We demonstrated valid dynamics of GRN in human blood transcriptome after high-fat meal and Arabidopsis thaliana transcriptome after heat/cold stress. The second question focuses on the reliability of biomarkers identified by machine learning methods in predicting the metastasis status of breast cancer for clinical application. Identification of novel and robust prognostic biomarkers is needed to predict early and late breast cancer metastases, and the proteome assay can be easily translated into clinical practice. We hypothesized that proper modeling of gene interactions can better distinguish biomarkers with enhanced predictability and interpretability. Thus, a machine learning-driven method that incorporates a network analysis technique to model gene interactions is proposed to identify biomarkers using proteome data. This approach involves prioritizing biomarker candidates using mutual information score and network propagation score, followed by Support Vector Machine (SVM) classifier that evaluates the biomarker candidates’s ability to distinguish between metastasis status of breast cancer. We further experimentally demonstrated the efficacy of the identified biomarker with the knockdown assay and the prognosis analysis in an external dataset. The third question explores the possibility of discovering regulatory biomarkers for asthma subtypes within a multi-omics context. Although various asthma subtypes are established to resolve the heterogeneity of asthma patients, molecular biomarkers to explain the pathophysiology of the asthma subtypes are yet to be discovered. We hypothesized that phenotype is conceptualized as a result of an information process among genes. This motivates the computational modeling of multi-omics interactions as gene interactions. Thus, a patient can be represented as a graph of genes, and the biomarker discovery problem is formulated as a graph classification of the feature selection task. Graph neural networks (GNNs) enable the modeling of intricate gene interactions, identifying biomarkers that influence other biomolecules and may serve as therapeutic targets. We developed a deep graph neural network modeling of gene interaction networks within a multi-omics context, leveraging a knowledge graph over gene interactions to identify hidden biomarkers. We discovered genes that encode transcription factors as biomarkers, which can hardly discovered by other biomarker discovery methods, and demonstrated the biological impact of the biomarkers in silico. It is also demonstrated that the proposed biomarker discovery method showed significantly high performance compared to the other multi-omics data-driven biomarker discovery methods in predicting asthma subtypes of unseen patients. Taken together, my doctoral study presented computational methodologies for modeling molecular interactions to advance biomarker discovery. Since reflecting biological traits in computational modeling is challenging, we have explored graph-based methods to handle the complex interactions of biomolecules —CCA-based graph filtering, network propagation, and GNN. Given a graph of GRN, CCA projects profiles of TFs and TGs into a shared embedding space. Network propagation simulates the impact of anchor genes through a random walk on a gene-gene interaction graph. GNNs learn latent representations of genes in a multi-omics context from a gene-gene interaction network. Having explored these different approaches, my thesis provides new insights to understand gene interactions that is crucial for modeling biological system for biomarker discovery. 바이오마커(biomarker)는 생물학적 과정과 질병 상태를 나타내는 지표로, 치료전략 결정 및 치료 반응 평가에 필요한 요소이다. 유전자 전사체, 단백질 등 생체내의 다양한 분자가 바이오마커로 사용될 수 있다. 다양한 생체 분자(biomolecule)의 상호작용의 결과로 생리적 또는 병리적 상태가 결정되므로, 바이오마커 발굴은 복잡한 생물학적 시스템을 구성하는 생체 분자 중 생리적 또는 병리적 상태를 대표하는 특징(feature)을 찾는 과정이라고 볼 수 있다. 대용량 오믹스 처리 기술(high-throughput omics technology)의 발전으로, 바이오마커 발굴은 데이터 기반 접근법으로 전환되었다. 대용량 오믹스 처리 기술의 발달 덕분에 다양한 생물학적 수준에서 개별 생체 분자의 포괄적인 프로파일링이 가능하다. 그러나 오믹스 데이터는 개별 분자를 독립적으로 측정한 데이터이므로, 복잡한 생물학적 시스템을 모델링하기 위해서는 개별 분자의 측정값으로부터 분자간의 상호작용을 추론해야한다는 어려움이 있다. 본 학위 논문 에서는 생물 분자의 복잡한 상호작용을 모델링하기 위해 귀납적 편향(inductive bias)을 통합하는 계산 방법론을 제안한다. 귀납적 편향은 사전 지식을 통해 학습을 지도하는 방법으로, 잠재적인 생물 분자 상호작용의 탐색 공간을 좁힐 수 있다. 이러한 접근법은 생물학적 네트워크 구조, 조절 모티프 및 유전자의 기능 정보 등을 통합함으로써 복잡한 생물학적 시스템에서 생체 분자 상호작용의 재구성을 개선하고, 바이오마커의 예측 가능성과 해석 가능성을 향상시키는 데 도움을 준다. 본 박사학위 논문은 바이오마커 발굴 생물학적 네트워크를 귀납적 편향으로 통합하여 생물 분자 간의 상호작용을 모델링하는 세 가지 연구로 구성된다. 첫 번째 연구에서는 전사체 데이터에 기반해 외부 자극에 반응하는 유전자 조절 상호작용을 재구성하는 문제를 다룬다. 유전자 조절 상호작용 중 전사인자에 의한 유전자 조절은 세포가 자극에 반응해 생체 반응을 조절하는 대표적인 기작이다. 본 연구에서는 유전자 조절 네트워크에서 상호작용하는 유전자들은 전사체 발현량의 상관관계가 있다는 가설에 기반해 전사체 데이터로부터 유전자간 조절 관계를 유추하고자 한다. 유전자의 전사체 발현량 상관관계를 고려한 그래프 필터링(graph filtering) 방법을 기반으로 유전자 상호작용에 대한 지식 그래프 주형(template)으로부터 유의미한 조절 관계가 있는 유전자쌍들을 선별한다. 또한 커널 정준 상관 분석(kernel canonical correlation analysis)을 사용하여 전사 인자(transcription factor)의 협력적 조절 모듈을 반영하는 유전자 조절 네트워크를 재구성할 수 있는 계산 방법을 제안했다. 두 번째 연구는 머신러닝 방법을 사용하여 질병 상태를 예측할 수 있는 바이오마커를 식별하는 데 중점을 두며, 이러한 바이오마커가 실제 임상 응용에서 신뢰성 있는 예측을 제공할 수 있는지를 평가한다. 단백체 검사는 임상에서 접근성이 높은 기술이므로 단백체에 기반한 유방암의 초기 및 후기 전이 바이오마커를 발굴하는 것이 유방암 치료에 중요하다. 바이오마커는 표현형을 대표하는 특징들의 하위 집합으로서, 다양한 생체 분자 중에서 유효한 바이오마커를 우선순위화하고 선택하는 것이 중요하다. 따라서 머신 러닝에서 바이오마커 발굴 문제는 특징 선택 문제(feature selection task)로 접근할 수 있다. 본 연구에서는 유전자 상호작용을 적절히 모델링하면 예측 가능성과 해석 가능성이 향상된 바이오마커를 더 잘 구별할 수 있다는 가설에 기반해 네트워크 분석 기술을 통합한 머신 러닝 기반 바이오마커 발굴 방법을 제시한다. 예측 가능성과 해석 가능성을 보장하기 위해, 후보 바이오마커는 그들의 변별력과 생물 분자 네트워크에 미치는 영향을 기반으로 우선순위를 정해야 한다. 따라서 상호 정보(mutual information) 점수와 네트워크 전파(network propagation) 점수를 사용하여 바이오마커 후보를 우선순위화한 다음, 서로 다른 표현형을 구별할 수 있는 능력을 평가해 바이오마커를 선정한다. 우리는 추가적으로 유전자 발현 억제 (knockdown) 실험과 외부 데이터셋에서의 예후 분석을 통해 식별된 바이오마커의 효능을 실험적으로 입증했다. 세 번째 연구는 다중 오믹스 컨텍스트에서 천식 아형(subtype)의 조절(regulatory)바이오마커를 발굴하는데 중점을 둔다. 천식 병태생리는 환경, 유전 등 다양한 요인이 관여하기 때문에 천식 환자의 표현형은 이질적이며, 이러한 이질성을 해결하기 위해 다양한 천식 아형이 확립되었다. 그러나 천식 아형의 병태생리를 설명할 바이오마커는 아직 확립되지 않았다. 본 연구에서는 표현형이 유전자를 매개로 한 정보 처리 과정(information process)의 결과로 표현 가능하다는 가설을 세우고,다중 오믹스 상호작용을 유전자 상호작용으로 모델링하는 방법론을 제시하고자 한다. 즉, 환자를 유전자 그래프로 표현할 수 있으며, 바이오마커 발굴 문제는 그래프 분류 및 특징 선택 문제로 접근해 부분 그래프(subgraph)를 추출하는 문제로 치환된다. 딥러닝 모델의 일종인 그래프 신경망(graph neural network)은 복잡한 유전자 상호작용을 모델링하여 다른 생체 분자에 영향을 미치는 바이오마커를 발견할 수 있는 가능성을 제시한다. 우리는 유전자 상호작용에 대한 지식 그래프를 활용하여 다중 오믹스 컨텍스트(context)에서 유전자 상호작용 네트워크의 딥러닝기반 바이오마커를 발굴할 수 있는 방법론을 제안했다. 우리는 다른 바이오마커 발견 방법으로는 발견되기 어려운 전사인자 유전자들을 바이오마커로 발견했으며, 제안된 바이오마커 발견 방법이 다른 다중 오믹스 데이터 기반 바이오마커 발견 방법보다 높은 천식 아형 구분 성능을 보이는 것을 확인했다. 종합적으로, 본 박사학위 논문은 생물 분자 상호작용을 모델링해 바이오마커 발견을 돕기 위한 계산 방법론들을 제시한다. 구체적으로는 외부 자극에 대한 세포 반응 이해, 단백체 데이터에 기반한 유방암의 전이 상태 상태 예측 및 천식 환자의 다중 오믹스 데이터 내의 조절 메커니즘 발견에 대한 함의를 제공한다.

Development and usability evaluation of a digital biomarker platform

문수현 Graduate School, Yonsei University 2024 국내석사

Digital biomarkers are an emerging topic of interest within the digital health domain, incorporating HCI research. However, as this field is in its early stages, researchers face challenges in the holistic use of digital biomarkers in their studies due to time and cost constraints. To overcome these barriers, we introduce biomarker.it, a user-friendly web-based platform facilitating digital biomarker development, from task design to data collection, integration, and visualization. Based on a Design Science Research (DSR) approach, we conducted two iterative phases. The first phase involved testing an initial web prototype to establish the problem motivation and objectives for the platform, followed by the development and real-world evaluation of the webpage. This phase included heuristic evaluations and in-depth interviews with five double experts who possess significant expertise in both HCI and digital biomarker research. The interview process comprised three sessions: briefing, evaluation, and debriefing, all centered on the web demo of biomarker.it. In the second phase, we applied the insights gained from the first phase to the next version of biomarker.it, enhanced by the refined design guidelines resulting from the heuristic evaluations in the first phase. This phase aimed to capture user needs and expectations, refine the application design, and develop an accurate health referral system. The first iteration highlighted the experts' perspectives on the digital biomarker platform, identifying key usability issues and recurring heuristic themes, leading to a redesign of the web interface. The evaluation phase prioritized crucial usability issues and presented results from the Post-Study System Usability Questionnaire (PSSUQ). In the second iteration, the application of the design principles derived from the first phase informed the redesign of the beta version of biomarker.it, aligning it more closely with user needs and expectations. The study provides valuable insights into the usability of the digital biomarker web platform, underscoring the necessity for digital biomarkers and offering domain-specific use case perspectives. These findings offer critical feedback for future research and platform refinement. Subsequently, a thorough review of existing literature, user studies, and design processes aims to elucidate the importance of digital biomarkers and their integration into digital health and HCI. 디지털 바이오마커는 디지털 헬스 분야에서 HCI 연구를 포함하여 관심을 받고있는 신흥 주제이다. 그러나 이 분야가 초기 단계에 있기 때문에 연구자들은 시간과 비용 제약으로 인해 디지털 바이오마커를 연구에 전체적으로 활용하는 데 어려움을 겪고 있다. 이러한 장벽을 극복하기 위해, 우리는 해당 연구에서 작업 설계에서 데이터 수집, 통합 및 시각화까지 디지털 바이오마커 개발을 용이하게 하는 사용하기 쉬운 웹 기반 플랫폼인 biomarker.it 을 개발했다. 해당 연구에서는 디자인 과학 연구(Design Science Research, DSR) 접근법을 기반으로 두 가지 iteration 을 진행했다. 첫 번째 단계는 플랫폼의 문제 동기 및 목표를 설정하기 위해 초기 웹 프로토타입을 테스트하는 것으로, 이어서 웹 페이지의 개발 및 실제 평가가 이루어졌다. 이 단계에는 HCI 와 디지털 바이오마커 연구에서 상당한 전문 지식을 보유한 다섯 명의 이중 전문가와의 휴리스틱 평가 및 심층 인터뷰가 포함되었다. 인터뷰 과정은 모두 biomarker.it 의 웹 데모를 중심으로 Briefing, Evaluation, Debriefing 으로 구성됐다. 두 번째 단계에서는 첫 번째 단계에서 나온 인사이트를 기반으로 디자인 가이드라인을 도출하여, 이를 기반으로 beta 버전의 biomarker.it 를 기획 및 개발했다. 이 단계의 목표는 사용자 요구를 충족하고, 디자인을 정제하며, 효과적인 디지털 바이오마커 시스템을 개발하는 것이었다. 1st iteration 은 디지털 바이오마커 플랫폼에 대한 전문가들의 관점을 강조하여 주요 사용성 문제와 반복적인 휴리스틱 테마를 식별하고 웹 인터페이스를 재설계하는 결과를 도출했다. 평가 단계에서는 중요한 사용성 문제를 우선시하고 PSSUQ(PostStudy System Usability Questionnaire) 결과를 제시했다. 2nd iteration 에서는 첫번째 단계에서 도출된 디자인 가이드라인을 적용하여 biomarker.it 의 beta 버전을 재설계하여 사용자 요구와 기대에 더 가깝게 조정했다. 이 연구는 디지털 바이오마커 웹 플랫폼의 사용성에 대한 귀중한 통찰력을 제공하며, 디지털 바이오마커의 필요성을 강조하고 도메인별 사용 사례 관점을 제시한다. 여기서 도출된 디자인 가이드라인은 향후 연구 및 플랫폼 개선을 위한 중요한 피드백을 제공합니다. 이후 기존 문헌, 사용자 연구 및 디자인 프로세스에 대한 철저한 검토를 통해 디지털 바이오마커의 중요성과 디지털 헬스 및 HCI 로의 통합에 대한 이해를 돕고자 한다.

Proteomic analysis for biomarker discovery in autism spectrum disorder using mass spectrometry : Mass spectrometry based proteomics

Mohammad Hazara Begum DGIST 2025 국내박사

자폐 스펙트럼 장애(ASD)는 광범위한 행동 및 인지적 증상을 특징으로 하는 복잡한 신경발달 질환으로, 조기 진단에 상당한 어려움을 겪습니다. 따라서 신뢰할 수 있는 바이오마커를 식별하는 것은 조기 발견 및 개입 전략을 개선하는 데 필수적입니다. ASD 연구의 최근 진전에도 불구하고 일관된 생물학적 마커의 부재는 여전히 중요한 한계로 남아 있으며, 강력한 바이오마커 발견의 필요성을 강조합니다. 이 연구는 질량 분석 기반 프로테오믹 분석을 통해 ASD에 대한 잠재적 바이오마커를 식별하고 검증하여 장애와 관련된 분자 패턴을 발견하고 근본적인 생물학적 메커니즘에 대한 통찰력을 제공하는 것을 목표로 합니다. 자폐 스펙트럼 장애에 대한 바이오마커를 식별하는 것은 조기 진단, 개인화된 치료 및 장애의 근본적인 메커니즘을 이해하는 데 매우 중요합니다. 바이오마커는 생물학적 과정에 대한 객관적이고 정량화된 지표로, 자폐 스펙트럼 내에서 다양한 표현을 감안할 때 매우 중요한 다른 신경발달 장애와 ASD를 구별하는 데 도움이 될 수 있습니다. 현재 ASD 진단은 주로 행동 평가에 의존하며, 이로 인해 진단 및 개입이 지연될 수 있습니다. 유전적, 신경 영상 또는 생화학적 마커와 같은 바이오마커는 더 빠르고 정확한 진단과 시간 경과에 따른 ASD 관련 신경 생물학적 변화를 추적할 수 있는 잠재력을 제공합니다. 신뢰할 수 있는 바이오마커를 식별하면 특정 생물학적 경로를 임상 증상과 연결하여 표적 치료 전략의 개발을 용이하게 할 수 있으며, 궁극적으로 ASD가 있는 개인의 결과와 삶의 질을 개선하는 데 기여할 수 있습니다. 혈장에서 고농도 단백질을 고갈시키는 것은 자폐 스펙트럼 장애의 바이오마커를 식별하는 데 중요한 단계입니다. 혈장은 잠재적 바이오마커의 풍부한 공급원이지만 광범위한 단백질 농도를 포함하고 있으며, 소수의 고농도 단백질(예: 알부민, 면역글로불린)이 총 단백질 함량의 90% 이상을 차지합니다. 이러한 우세한 단백질은 ASD 병리 생리학과 관련이 있을 수 있는 단백질을 포함하여 저농도 단백질의 존재를 가릴 수 있어 탐지가 어렵습니다. 고갈 기술을 사용하면 이러한 고농도 단백질을 줄이거나 제거할 수 있으므로 유익한 바이오마커 역할을 할 수 있는 저농도 단백질에 대한 혈장을 풍부하게 할 수 있습니다. 하류 분석 기법(예: 질량 분석법)의 민감도를 향상시킴으로써 고갈은 ASD와 관련된 새롭고 미묘한 분자적 시그니처의 발견을 용이하게 하여 진단 및 치료 전략을 개선할 수 있습니다. 이 논문의 첫 번째 목표는 건강한 개인과 자폐 스펙트럼 장애가 있는 환자의 혈장 프로테옴을 비교하여 질병 특이적 바이오마커의 조기 검출을 위한 잠재적 바이오마커로 사용할 수 있는 차별적으로 발현된 단백질을 식별하여 예후와 치료 결과를 크게 개선하는 것입니다. 잠재적 바이오마커 관련성이 있는 저농도 혈장 단백질을 검출하기 위한 샘플 준비 및 질량 분석 매개변수를 최적화하여 분석 프로세스의 민감도와 처리량을 개선합니다. 혈장에는 광범위한 단백질 농도가 포함되어 있어 저농도 바이오마커를 검출하기 어렵습니다. 최적화된 프로토콜은 임상적으로 관련 있는 바이오마커의 발견을 향상시킬 수 있습니다. 마지막으로, 표적 접근 방식 병렬 반응 모니터링(PRM)을 사용하여 발견 기반 질량 분석 연구에서 확인된 후보 바이오마커를 검증하여 재현성과 임상적 유용성을 보장합니다. 바이오마커의 검증은 발견 연구를 임상 응용 프로그램으로 전환하고 식별된 바이오마커가 진단 또는 치료 모니터링에서 신뢰할 수 있고 적용 가능한지 확인하는 데 중요합니다. 키워드: 바이오마커, 자폐 스펙트럼 장애, 비표적 프로테오믹스, 표적 프로테오믹스, 질량 분석법 Autism spectrum disorder (ASD) is a complex neurodevelopmental condition characterized by a broad range of behavioral and cognitive manifestations, presenting significant challenges for early diagnosis. Consequently, identifying reliable biomarkers is essential to improve early detection and intervention strategies. Despite recent advances in ASD research, the absence of consistent biological markers remains a critical limitation, underscoring the need for robust biomarker discovery. This study seeks to identify and validate potential biomarkers for ASD through mass spectrometry-based proteomic analysis, aiming to uncover molecular patterns associated with the disorder and provide insights into underlying biological mechanisms. The identification of biomarkers for autism spectrum disorder is critically important for advancing early diagnosis, personalized treatment, and understanding the underlying mechanisms of the disorder. Biomarkers objective, quantifiable indicators of biological processes can aid in distinguishing ASD from other neurodevelopmental disorders, which is vital given the diverse presentations within the autism spectrum. Currently, ASD diagnosis relies primarily on behavioral assessments, which may lead to delayed diagnosis and intervention. Biomarkers, such as genetic, neuroimaging, or biochemical markers, offer the potential for earlier, more precise diagnosis and for tracking ASD related neurobiological changes over time. Identifying reliable biomarkers can also facilitate the development of targeted therapeutic strategies by linking specific biological pathways with clinical symptoms, ultimately contributing to improved outcomes and quality of life for individuals with ASD. Depleting high-abundance proteins in plasma is a critical step in identifying biomarkers for autism spectrum disorder. Plasma, while a rich source of potential biomarkers, contains a wide range of protein concentrations, with a small number of high-abundance proteins (e.g., albumin, immunoglobulins) comprising over 90% of its total protein content. These dominant proteins can mask the presence of low- abundance proteins, including those potentially linked to ASD pathophysiology, making their detection challenging. Depletion techniques allow for reducing or removing these high-abundance proteins, thus enriching the plasma for low-abundance proteins that may serve as informative biomarkers. By enhancing the sensitivity of downstream analytical techniques, such as mass spectrometry, depletion facilitates the discovery of novel and subtle molecular signatures associated with ASD, which may lead to improved diagnostic and therapeutic strategies. This thesis first aim is to compare the plasma proteome of healthy individuals and patients with an autism spectrum disorder to identify differentially expressed proteins that could serve as potential biomarkers for early detection of disease-specific biomarkers that can significantly improve prognosis and treatment outcomes. To optimize sample preparation and mass spectrometry parameters for the detection of low-abundance plasma proteins with potential biomarker relevance, improving the sensitivity and throughput of the analytical process. Plasma contains a wide dynamic range of protein concentrations, making it challenging to detect low-abundance biomarkers. Optimized protocols can enhance the discovery of clinically relevant biomarkers. Finally, validation of candidate biomarkers identified in discovery-based mass spectrometry studies using targeted approach parallel reaction monitoring (PRM) to ensure their reproducibility and clinical utility. Validation of biomarkers is critical for translating discovery research into clinical applications, ensuring that the identified biomarkers are reliable and applicable in diagnostics or therapeutic monitoring. Keywords: Biomarker, Autism spectrum disorder, untargeted proteomics, targeted proteomics, Mass spectrometry

Discovery of anthrax biomarker candidates from human aortic endothelial cells : 인간 대동맥 내피세포 모델에서의 탄저 바이오마커 후보 발굴

조혜은 서울대학교 대학원 2014 국내석사

Anthrax, a zoonotic disease caused by Bacillus anthracis, is classified as cutaneous, gastrointestinal, or inhalational anthrax depending on the route of infection. The most threatening and fatal form is inhalational anthrax, which can be used as a biological weapon. B. anthracis releases three types of toxins, protective antigen, lethal factor, and edema factor that cause vascular and organ hemorrhage, and eventually fatal damage to the host. Since the early symptoms of inhalational anthrax are similar to those of the common cold, the status of infection is difficult to recognize. Moreover, any monitoring and prognostic tools have not been developed to predict recovery of anthrax patients. Therefore, infected patients receive late or unsuitable treatments, contributing to their increased mortality rate. Our purpose in this study was to identify the candidates of surrogate biomarker for anthrax that can be used to rapidly diagnose and monitor treatment outcomes. To evaluate the effects of anthrax toxins?lethal toxin (LT) and edema toxin (ET)?, cytotoxicity, cell growth inhibition, and cell morphology were analyzed in primary human aortic endothelial cells (HAECs). ET induced morphological changes in HAECs while maintaining cell viability similar to that of the control group. LT reduced cell viability in a concentration- and time-dependent manner. To discover the candidates of surrogate biomarker, secretome from anthrax toxin-treated HAECs was analyzed by using nano-liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry. Proteins significantly upregulated or downregulated in comparison to the control group were selected, and four proteomic candidates were confirmed using immunoblot analysis. Therefore, lactotransferrin, pregnancy zone protein, and sarcolemmal membrane-associated protein were identified as proteomic candidates of anthrax biomarker. In addition, we analyzed exosomal small RNAs and miRNAs secreted from toxin-treated HAECs by using expression array and microarray to discover transcriptomic candidates. One miRNA and several small RNAs were selected and verified using real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction. As a results, ASPH, CD151, HSP90AA1, ICAM2, LYPD1, MPST, NUAK1 and hsa-miR-1307-3p were found as transcriptomic candidates of anthrax biomarker. We intend to confirm the clinical utility of these proteomic and transcriptomic candidates as anthrax biomarker using sera obtained from rat injected with anthrax toxins. In this study, three proteins, seven small RNAs, and one miRNA were identified and validated in an in vitro anthrax model. These results suggested that secretory proteins and exosomal RNAs could be used as putative anthrax biomarkers for early diagnosis and treatment monitoring. 탄저병(Anthrax)은 탄저균(Bacillus anthracis) 감염에 의해 발생하는 인수공통전염병으로 감염경로에 따라 피부탄저, 장탄저, 폐탄저로 분류된다. 탄저균은 세 가지 독소(Protective antigen, Lethal factor, Edema factor)를 분비하며, 분비된 독소들은 순환계를 통해 전신으로 운반되어 각종 장기 및 혈관에서 출혈을 야기하고 숙주에게 치명적인 손상을 일으킨다. 특히 생물 무기로 악용될 수 있는 폐탄저의 경우 초기 증상이 감기와 유사하기 때문에 치료 시기를 놓칠 경우 치사율이 급격히 증가하게 된다. 따라서, 본 연구에서는 탄저균 감염을 빠르게 진단하고 탄저병 치료의 예후를 모니터링 할 수 있는 생물학적 표지인자(Biomarker)에 대한 연구를 수행하였다. 본 연구의 모델시스템인 인간 대동맥 내피세포(Primary human aortic endothelial cells, HAECs)에서 탄저 독소의 영향을 보기 위하여 cytotoxicity, cell growth inhibition 및 cell morphology를 관찰하였다. 그 결과 치사독소(Lethal toxin, LT)를 처리한 군이 대조군에 비해 농도 의존적으로 cell viability가 감소하는 것을 관찰할 수 있었으며, 이와는 대조적으로 부종독소(Edema toxin, ET)를 처리한 군에서는 세포의 morphology만 변할 뿐 cell viability는 대조군과 유사하게 유지되는 것을 확인할 수 있었다. 본 연구의 목적인 탄저병 biomarker 후보를 탐색하기 위하여 탄저 독소 LT와 ET에 의해 HAECs이 분비하는 단백질(Secretome)을 분리하여 nano-LC-ESI-MS/MS 기법으로 동정하였다. 그리고 후보단백질을 immunoblot 기법으로 verification하였으며, 그 결과 Lactotransferrin (LTF), Pregnancy zone protein (PZP), 그리고 Sarcolemmal membrane-associated protein (SLMAP)이 탄저병 biomarker 후보단백질로의 가능성이 있음을 확인하였다. 또한 탄저 독소 LT와 ET에 의해 HAECs에서 유리된 exosomal small RNA와 miRNA를 추출하여 각각 Expression array와 Microarray 기법을 통해 또 다른 탄저병 biomarker 후보를 동정하였다. 그 결과 exosomal small RNA 후보로는 ASPH, CD151, HSP90AA1, ICAM2, LYPD1, MPST, 그리고 NUAK1를 찾아내었고, exosomal miRNA 후보로는 hsa-miR-1307-3p를 찾아내었다. 그리고 후보 exosomal RNA를 qRT-PCR 기법을 통해 verification하였다. 더 나아가 탄저 독소를 주입한 rat으로부터 얻은 serum에서 본 연구에서 동정한 후보 biomarker에 대한 verification을 수행하여 clinical utility를 확인할 계획이다. 따라서, 본 연구에서는 탄저병의 세포배양 모델에서 탐색한 host-derived biomarker로서 단백질 3 종, mRNA 7 종, 그리고 miRNA 1 종을 동정 및 validation 하였으며, 이러한 11종의 proteomic 및 transcriptomic biomarkers가 탄저병의 진단과 치료 효과 모니터링에 사용될 가능성을 제시하였다.

Association between perceived exposure to secondhand smoke and depression independent of biomarker measured exposure

이동규 Graduate School, Yonsei University 2024 국내석사

서론 선행 연구들에서 간접흡연과 우울증의 상관성은 간접흡연의 정의 방식에 따라 서로 다른 결과들을 보인다. 간접흡연에 노출되었다고 인지한 정도와 우울증의 상관성은 유의한 반면, 바이오마커를 이용한 간접흡연 노출정도와 우울증의 상관성은 이보다 더 약하거나 유의하지 않은 결과들이 있다. 또한, 선행 연구들은 인지된 노출정도와 생물학적 노출정도를 동시에 고려하지 않았다. 이 연구는 성인 비흡연/과거흡연자들에서 인지된 간접흡연이 생물학적 간접흡연을 보정하고도 우울증과의 상관성이 있는지 연구하고자 한다. 연구방법 국민건강영양조사의 2014, 2016, 2018, 2020년 자료로부터 총 16,926명의 참가자들의 자료를 수집하였다. 해당 자료는 복합표본설계를 통해 인구집단 전체를 대표할 수 있도록 대상자를 추출한 자료이다. 독립변수인 인지된 간접흡연은 직장, 가정, 또는 공공장소 실내에서 최근 7일간 간접흡연에 노출된 경험이 있는지에 대한 이분형 변수로 정의되었다. 종속변수인 우울증은 한글판 우울증 선별도구 (Patient Health Questionnaire-9)에서 10점 이상인 경으로 정의되었다. 주요 공변수인 바이오마커 기반 간접흡연 노출정도는 니코틴 대사체인 코티닌을 이용하였다. 해당 연구는 로지스틱 회귀분석을 이용해 인지된 간접흡연과 우울증의 상관성이 바이오마커 기반 간접흡연 노출량을 보정하여도 통계적으로 유의한 양의 상관관계를 갖는지 알아보았다. 또한, 자살 (자살사고, 계획, 행동) 및 의료이용 (우울증 후 의료이용 및 정신과 질환으로 인한 의료이용) 관련된 변수들을 이차 종속변수로서 평가하였다. 추가로, 인지된 간접흡연 노출과 바이오마커 기반 간접흡연 노출의 우울증에 대한 교호작용에 대해 검증하였다. 그리고, 사회경제적 계층, 과거 흡연 여부, 그리고 성별에 따라 인지된 노출과 우울증의 상관성의 크기가 달라지는지에 대해 분석하였다. 그리고, 인지된 간접흡연 노출을 장소에 따라 나누어, 각각의 장소에서의 인지된 노출이 우울증과 상관성 있는지에 대해 연구하였다. 추가로, 여러 민감도 분석들을 실시하였다. 나이와 동거인수를 국민건강영양조사 데이터에서는 80세 이상은 80으로, 6명 이상은 6으로 코딩하기 때문에, 정보의 손실 가능성에 대해 나이와 동거인수를 범주형 변수로 변경해 분석하였다. 그리고, 단면연구로서의 연구설계의 한계점에 의한 역인과성의 가능성을 고려하기 위해 우울증에 대한 의사진단 경험이 없는 대상자들로 분석을 한정하여 시행하였다. 또한, 코티닌의 반감기가 짧아 만성적인 생물학적인 간접흡연 노출을 충분히 반영할 수 없어, 더욱 긴 반감기를 가지는 바이오마커를 이용해 동일한 분석을 수행하였다. 그 후, 현재 흡연자들 중 자가응답에서 비흡연/과거흡연자로 응답한 경우를 제외시키기 위해 바이오마커들을 이용하여 의심 대상자들을 재분류 한 후 분석을 수행하였다. 우울증에 대한 정의 또한 여러가지로 변경하여, 우울증 선별도구의 절단점을 변경하거나, 자기보고된 우울증상으로 종속변수를 변경하여 동일한 분석을 수행하였다. 마지막으로, 다중 대치법을 이용하여 분석을 재시행하였다. 또한, 종속변수를 변경하여 음성대조군 분석을 시행하였다. 인지된 간접흡연 및 바이오마커 기반 간접흡연 모두 통계적으로 유의하지 않은 상관성이 나오도록 백내장 및 B형 간염 병력을 비정신과 비호흡기 음성대조군 질환으로 선정하였다. 또한, 생물학적 간접흡연만 유의한 상관성이 보이도록 천식 병력을 비정신과 호흡기 음성대조군 질환으로 선정하였다. 결과 인지된 간접흡연은 생물학적 노출량을 보정하여도 우울증과 유의한 상관성을 보였다 (오즈비: 1.60, 95% 신뢰구간: 1.31-1.95). 또한, 인지된 노출은 자살사고 (오즈비: 1.34, 95% 신뢰구간: 1.11-1.61) 및 정신과 질환으로 인한 의료이용 (오즈비: 1.62, 95% 신뢰구간: 1.23-2.13)과도 상관성을 보였다. 인지된 노출과 바이오마커 기반 노출의 우울증에 대한 교호작용은 통계적으로 유의하지 않았다. 인지된 노출과 우울증의 상관성은 가장 고소득 집단 (오즈비: 3.31, 95% 신뢰구간: 2.03-5.39)에서 높았으며, 그 외의 소득계층에서는 상관성의 크기가 적었다. 예를 들어, 가장 저소득 집단이면서 인지된 간접흡연이 없을 때의 상관성 (오즈비: 3.86, 95% 신뢰구간: 2.60-5.75)은 가장 저소득 집단이면서 인지된 간접흡연이 있을때의 상관성 (오즈비: 4.99, 95% 신뢰구간: 3.24-7.69)와 차이가 적었다. 인지된 간접흡연 노출은 직장실내 (오즈비: 1.62, 95% 신뢰구간: 1.17-2.25), 가정실내 (오즈비: 1.56, 95% 신뢰구간: 1.14-2.13), 그리고 공공장소 실내 (오즈비: 1.57, 95% 신뢰구간: 1.28-1.93)에서의 노출 모두 우울증과 유의한 상관성을 보였다. 마지막으로, 여러 민감도 분석의 결과들은 기존 분석과 유사한 결과를 보였다 (오즈비 최솟값: 1.38, 최댓값: 1.71). 비정신과 비호흡기 음성대조군 질환은 인지된 간접흡연 (백내장과의 오즈비: 1.07, 95% 신뢰구간: 0.78-1.47, B형 간염과의 오즈비: 1.16, 95% 신뢰구간: 0.91-1.47) 및 바이오마커 기반 간접흡연 (백내장과의 오즈비: 0.95, 95% 신뢰구간: 0.86-1.05, B형 간염과의 오즈비: 1.00, 95% 신뢰구간: 0.94-1.06) 모두와 통계적으로 유의하지 않은 상관성을 보였다. 또한, 비정신과 호흡기 음성대조군 질환은 바이오마커 기반 간접흡연 (천식과의 오즈비: 1.09, 95% 신뢰구간: 1.01-1.18)만이 통계적으로 유의한 상관성을 보였다. 결론 인지된 간접흡연은 우울증에 대해 실제 생물학적인 노출량과 독립적으로 상관성을 보였다. 현재의 국민건강증진법은 생물학적인 간접흡연 노출량을 최소화시키는데 집중하고 있지만, 추가적으로 인지되는 간접흡연을 줄이기 위한 노력이 필요하다. 인구 집단을 간접흡연에 의한 우울증에서 보호하기 위해서는, 흡연 공간을 엄격하게 분리하거나 흡연실에서 불투명한 벽을 사용하는 것처럼 시각적 노출을 줄이거나, 환기를 시키거나 냄새가 덜 나는 형태의 담배를 사용하도록 하여 후각적 노출을 줄이는 등의 방식들이 필요할 수 있을 것이다. Introduction Studies on the association between secondhand smoke and depression show heterogeneous results according to the definition of exposure, whether assessed by perception or biomarkers of tobacco smoke. While associations between secondhand smoke and depression using definitions by perception showed significant results, associations were weaker or nonsignificant when associations between biomarker-based secondhand smoke exposure and depression was evaluated. Furthermore, no prior study evaluated both perceived and biomarker measured exposure to secondhand smoke simultaneously. This study aimed to evaluate whether perceived exposure was associated with depression after adjusting for biomarker measured exposure in an adult, non-/ex-smoker population. Materials and methods A total of 16,926 participants were sampled from the Korea National Health and Nutrition Examination Survey biennially from 2014 to 2020. The dataset followed a complex survey structure enabling representation of the general Korean population. Perceived exposure was defined as a binary variable indicating self-reported indoor secondhand smoke exposure in occupational, household, or public locations in the past 7 days. Log-transformed urine cotinine, a nicotine-specific metabolite, was used as the biomarker. Depression was defined using the Patient Health Questionnaire-9, where a total score of 10 or above indicated depression. Logistic regression accounting for the complex survey structure evaluated the association between perceived exposure and depression while adjusting for cotinine. In addition to the main analysis, variables associated with suicidality and medical use were analyzed as secondary outcomes of the study. Suicidal ideation, planning, and attempts were used as suicidality associated outcomes. Medical use after depression, and medical use due to any mental health problems were used as medical use outcomes. Also, interaction between perceived and biomarker measured exposure was assessed. Furthermore, effect heterogeneity across socioeconomic status, smoking history, and sex was evaluated. Next, associations between perceived secondhand smoke exposure in individual locations (i.e., occupational, household, or public locations) and depression were evaluated. Several sensitivity analyses were conducted to test the robustness of the results. First, age and the number of cohabitants were used as categorical variables instead of continuous variables. This was done in response to the lost information in the dataset, where participants with age over 80 or the number of cohabitants over 6 were coded as 80 and 6 respectively. To account for possible reverse causality due to the cross-sectional study design, the analysis was restricted to participants who were never diagnosed as depressed. Also, to account for the short half-life of cotinine, an alternative biomarker with a longer half-life was used for adjustment. Considering smokers who falsely report themselves as non-smoking, analysis was performed after excluding hidden smokers using urine biomarkers. Furthermore, different definitions of depression were used, such as changing the cut-off score of the questionnaire or using self-reported depressive symptoms. Finally, analysis was done after multiple imputation. Also, negative control analysis was done by changing the outcome variable. History of cataract and hepatitis B were used as non-psychiatric, non-respiratory outcomes, where both perceived and biomarker measured secondhand smoke exposure were expected to show nonsignificant associations with the outcome. Meanwhile, history of asthma was used as a non-psychiatric, respiratory negative control outcome, where only biomarker measured exposure was expected to show significant associations with the outcome. Results Perceived exposure was associated with depression (odds ratio [OR]: 1.60, 95% confidence interval [CI]: 1.31-1.95). Also, perceived exposure was associated with suicidal ideation (OR: 1.34, 95% CI: 1.11-1.61) and medical assistance due to psychiatric problems (OR: 1.62, 95% CI: 1.23-2.13). Interaction between perceived exposure and biomarker measured exposure on depression was insignificant. The perceived exposure-depression association was stronger in highest income groups (OR: 3.31, 95% CI: 2.03-5.39) while lower income groups showed lower increase in odds (e.g., lowest income without perceived exposure [OR: 3.86, 95% CI: 2.60-5.75], lowest income with perceived exposure [OR: 4.99, 95% CI: 3.24-7.69]), indicating negative additive interaction. Perceived exposure in occupational (OR: 1.62, 95% CI: 1.17-2.25), household (OR: 1.56, 95% CI: 1.14-2.13), and public (OR: 1.57, 95% CI: 1.28-1.93) locations were all associated with depression. Multiple sensitivity analyses reported results that were significant and similar to the main analysis, with ORs ranging from 1.38 to 1.71. Non-psychiatric, non-respiratory negative control outcomes showed nonsignificant associations with both perceived (OR:1.07, 95% CI: 0.78-1.47 for cataract, OR: 1.16, 95% CI: 0.91-1.47 for hepatitis B) and biomarker measured (OR: 0.95, 95% CI: 0.86-1.05 for cataract and OR: 1.00, 95% CI: 0.94-1.06 for hepatitis B) secondhand smoke exposure. Also, the non-psychiatric, respiratory negative control outcomes showed only significant associations with biomarker measured exposure (OR: 1.09, 95% CI: 1.01-1.18 for asthma). Discussion Perceived exposure to secondhand smoke was associated with depression independent of actual biological exposure. While the current National Health Promotion Act focuses on reducing biological tobacco smoke exposure, regulations focusing on restricting perceived exposure should be emphasized. Reducing perceivable cues such as visual (e.g., spatial separation, intransparent smoking room walls) and olfactory (e.g., ventilation, use of tobacco with less odor) cues may be further needed to protect the general population from depression.

Study of Lung cancer Biomarkers:Identification and validation of two protein biomarkers from different sources : 혈액유래 단백질 바이오마커의 검증방법의 확립과 폐암조직 유래 단백질 바이오마커의 발굴과 그 기전연구

성혜진 경북대학교 대학원 2014 국내박사

Quantification is an essential step in biomarker development. Multiple reaction monitoring (MRM) is a new modified mass spectrometry-based quantification technology that does not require antibody development. Serum amyloid A (SAA) is a positive acute-phase protein identified as a lung cancer biomarker in our previous study. Acute SAA exists in two isoforms with highly similar (92%) amino acid sequences. Until now, studies of SAA have been unable to distinguish between SAA1 and SAA2. To overcome the unavailability of a SAA2-specific antibody, we developed MRM methodology for the verification of SAA1 and SAA2 in clinical crude serum samples from 99 healthy controls and 100 lung adenocarcinoma patients. Differential measurement of SAA1 and SAA2 was made possible for the first time with the developed isotype-specific MRM method. Most healthy control samples had small or no MS/MS peaks of the targeted peptides otherwise, higher peak areas with 10- to 34-fold increase over controls were detected in lung cancer samples. In addition, our SAA1 MRM data demonstrated good agreement with the SAA1 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) data. Finally, successful quantification of SAA2 in crude serum by MRM, for the first time, shows that SAA2 can be a good biomarker for the detection of lung cancers. As lung cancer is showing the highest mortality in cancer related death, convenient and rapid molecular diagnostic methods might be helpful for the lung cancer diagnosis and its treatment. Protein biomarkers could be lead to the development of molecular diagnostics. Biomarkers from distal fluids generally have high cross reactivity to many similar diseases. To discover lung cancer tissue specific protein biomarkers, secreted proteins from primary cultured lung cancer and adjacent normal tissues from patients were subjected to proteomic analysis. QSOX1 (Quescin sulfhydryl oxidase), one of the proteins in the increased protein list, is selected as a biomarker candidate. Increase of QSOX1 in lung cancer was verified through western blot analysis of about 60 patients’ tissue lysates. Unique higher expression of QSOX1 in lung cancer compared to other solid cancers was confirmed by immunohistochemistry. Lewis lung adenocarcinoma mouse model experiment proved the QSOX1 increase in the induced lung cancer tissues of mice. QSOX1 is known as a secreted protein, therefore, QSOX1 level in the albumin and IgG depleted serum was measured by MRM (multiple reaction monitoring). Significant increase was detected in lung cancer patients compared to healthy control. In conclusion, QSOX1 might be a lung cancer tissue derived specific biomarker and in combination use with other blood biomarkers, it is expected to increase specificity of biomarkers in diagnostics.

Integrated assessment of multi-biomarker responses to hazardous chemicals in fish, Cyprinus carpio and Zacco platypus

Kim, Woo-Keun 고려대학교 대학원 2012 국내박사

Biomarker responses in fish have been widely used to assess toxicological effects of hazardous chemicals. Given that more than one biomarker response is generally observed by exposure to toxic compounds, the use of a battery of biomarkers is likely preferred and integration of the biomarker battery is one of the key challenges. Thus, this study aimed to evaluate biomarker responses in Cyprinus carpio (a common carp) and Zacco platypus (a pale chub) exposed to hazardous chemicals, and to integrate the multi-biomarkers quantitatively to provide a useful tool for ecotoxicological assessments. Firstly, the toxicological effects of perfluorooctanoic acid (PFOA) and perfluorooctanate (PFOS) toward C. carpio were evaluated by assessing the responses of five biomarkers, including DNA single-strand breaks (COMET), vitellogenin (VTG) concentration and the activities of 7-ethoxyresorufin-O-deethylase (EROD), acetylcholinesterase (AChE) and catalase (CAT). Upon PFOA exposure, both the VTG concentration and CAT activity were significantly increased, while there was a negligible change in the responses of other biomarkers when compared to the control. Upon PFOS exposure, a significant increase in the DNA single-strand breaks was observed, while the responses of other biomarkers were not significantly altered when compared to the control. Standardized scores of biomarker responses were computed as the integrated biomarker response (IBR) and visualized using star plots. PFOA and PFOS showed totally different patterns of biomarker responses, the IBR values were strongly correlated with the logarithmic concentrations of PFOA and PFOS (r2 = 0.943 and 0.951, respectively). Secondly, the toxicological effects of copper (Cu) and benzo[a]pyrene (BaP) toward Z. platypus were evaluated by assessing histological/physiological responses as well as the molecular/biochemical biomarkers. No significant differences at the histological or physiological levels were observed among treatment groups, except for kidney tissue exposed to 20 μg Cu L-1. However, various molecular/biochemical responses were observed in Z. platypus, and these primarily depended on exposure time. Upon Cu exposure, both COMET and metallothionein (MT) activity were significantly increased for 4 days, while there was no significant change after 14 days of exposure. BaP exposure significantly induced COMET and EROD activity at 4 and 14 days of exposure, however significant induction of AChE activity was observed only at 14 days of exposure. The IBR values well correlated with the concentrations of Cu and BaP, and the correlations were better at 4 days of exposure (r2 = 0.780 and 0.699, respectively) than 14 days (r2 = 0.692 and 0.548, respectively). Finally, the oxidative stresses of Cu and BaP toward Z. platypus were evaluated by assessing induction of antioxidant enzymes and lipid peroxidation in liver, muscle and gill of the fish. The most significant oxidative stresses were observed in liver among the target tissues. The 4 day-exposure to Cu resulted in increase of superoxide dismutase (SOD) activity in liver. BaP exposure, however, did not induce any antioxidant enzyme activities and lipid peroxidation, implying chemical specific antioxidant responses in Z. platypus. Additionally, the correlation (r2 = 0.780) between IBR value and Cu concentration was much improved by inclusion of the oxidative stress, SOD (r2 = 0.889).

Biomarker를 활용한 식품 중 다환방향족탄화수소류의 인체 위해성평가

윤은경 高麗大學校 2005 국내박사

This study was conducted to estimate excess cancer risk caused by current dietary polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) exposure of the Korean and to identify the relationship between the internal and external doses of dietary intake using analysis of urinary 1-hydroxypyrene as a biomarker of PAHs. Sixty food commodities highly consumed containing high PAHs were selected from 2001 national health and nutrition survey. The foods including rice, bread, kimchi, soybean curd, ramen, chicken, pork etc. were analyzed for 14 PAHs congeners profile using high performance liquid chromatography and fluorescence detector. The range of total PAHs level was 8.31 ppb ~ 218.41 ppb and the highest total PAHs level was found in roasted laver (218.41 ug/kg). The higher levels of naphthalene and fluoranthene were detected in all foods except microwave cooked foods. Heating process of foods may result the rise in PAHs level and total PAH-TEQBaP level. Total PAHs contents detected in edible foods were significantly correlated with fluoranthene, benzo(a)anthracene, pyrene, and chrysene levels, having relative factor greater than 0.5. Considering the toxic equivalent (TEQ) level converted by the toxic equivalent factors (TEFs), the highest total PAH-TEQBaP level was detected from uncooked ramen because of its deep frying process. The highest total PAH-TEQBaP level of cooked foods was found in roasted laver as 1.2 ug-TEQ/kg. For the exposure assessment of PAHs from foods ingestion, the average body weight for each age groups was separated as 1-6yrs, 7-19yrs, 20-64yrs and >64yrs and consumed values from report on national health and nutrition survey were drived. The estimated lifetime average daily intake of PAHs was 3.2210^-3 ug/kg/day for carcinogenic effects and was higher in younger population than elder population. To calculate a realistic PAHs intake level, weekly intake frequency and one serving size were considered to calculate lifetime average daily intake of PAHs, which was 2.7910^-3 ug-TEQ/kg/day. The dietary excess cancer risk estimated using cancer potency of benzo(a)pyrene (7.3(mg/kg/day)^-1) was 2.3x10^-5 and 2.010^-5, for 3.2210^-3 ug-TEQ/kg/day and 2.7910^-3 ug-TEQ/kg/day respectively. This result implies the probability of tumor break-out in upper gastrointestinal tract was two per hundred thousand persons. For the identification of dose-response according pyrene exposure by food ingestion and urinary excretion of 1-hydroxypyrene, human monitoring was executed. Fifty-five non-smoking volunteers had three food items (fried chicken, hamburger, roasted pork) in every other day with three different amounts. In every the first morning, urine samples were collected during 18 consecutive days. Urinary concentration of 1-hydroxypyrene was measured by high performance liquid chromatography and fluorescence detector, and adjusted to urinary creatinine concentration. The results revealed that urinary 1-hydroxypyrene concentration was affected by diet intake in a numeric formula : y= 18.16x+0.102 (R=0.34, p<0.0001) according regression analysis. On the other hands, regression of the total PAHs-TEQ exposure level and pyrene exposure level induced numeric formula y= 1.334x+0.00003 (R=0.86, p<0.0001). It induced relative equation of dietary PAHs-TEQ exposure level and urinary 1-hydroxypyrene level, y(total PAHs-TEQ intake, ug-TEQ/kg/day) = 0.0076x (urinary 1-hydroxypyrene level, umol/ mol cr.) + 0.0068 when mixed the results of above two regression analyses. The calculation of excess cancer risk of the PAHs diatery exposure using biomarkers in human study has lower uncertinty level than the cancer risk calculated from food PAHs contamiantion level and shows more realistic PAHs exposure trends.

Development of isothermal nucleic acid amplification-based all-in-one-pot biomarker analysis system for multi-detection of exosomal biomarker

이명준 서강대학교 일반대학원 2024 국내박사

Exosome biomarker analysis is one of the areas of research that is rapidly attracting attention in the fields of modern medicine and life sciences. However, this field of research is facing some major limitations. First, the complicate isolation and enrichment process of exosome are need, because exosomes exist in very small amounts in biofluids. Second, the complexity of exosomes makes it difficult to identify and interpret biomarkers. Exosomes are produced from various cell origins, and their composition is also diverse. Therefore, in order to analyze exosomes, it is necessary to analyze multiple biomarkers through normalization by the number of exosomes that may affect the number of biomarkers. Third, the exosome biomarker are existed in sample with very low concentration that need high sensitive detection method. To overcome these limitations, here, we suggest easy, fast, high-sensitive, high-specific and multi-detectable one-pot based biosensor to analyzing exosomal biomarker, including protein and miRNA. With only a simple procedure, the developed biosensor can simply separate exosomes, amplify multiple exosome biomarker signals in an isothermal condition, and analyze signals with high sensitivity and high specificity at the same time. It is possible to precisely analyze various biomarkers of various cell-derived exosomes and further obtain normalized signals with a combination of biomarkers. The developed exosome biomarker analysis system can be applied not only to exosome biomarker analysis but also to other protein and nucleic acid analysis tools. This biosensing system is expected to be applied in conjunction with machine learning and artificial intelligence in the future to enable more accurate exosome diagnosis and analysis.

Development of protein arrays for validating serological biomarkers and monitoring enzyme activities : 혈액 biomarker의 검증 및 효소 활성도 분석을 위한 단백질 칩 개발

Deok-Hoon Kong 강원대학교 대학원 2014 국내박사

마이크로 어레이 기술은 고속으로 대량의 시료를 분석할 수 있는 기술로써, 단백질체학과 혈청학적 진단에 필요한 기술 중에 하나이다. 따라서, 본 연구에서는 혈청 biomarker의 검증, 단백질 분해 효소의 활성도 분석 그리고 혈액 내 protein kinase A (PKA)의 활성도 분석을 위한 새로운 마이크로 어레이 기술의 개발에 관한 내용을 시사한다. 첫번째로, 항체 어레이 데이터 분석시 실험적인 오차를 최소화하기 위해 median-centering 방법과 TIS 분석에 의한 혈청 내 IgM 농도를 이용하여 median-centered/IgM-tagged-internal standard (TIS) assay 표준화 방법을 개발하였다. 먼저 정상 (n = 25)과 간경화 (n = 25), 간암 (n = 29) 그룹으로부터 얻은 혈청 샘플에서 6종류의 혈청 단백질을 분석하기 위하여 5종류의 표준화 방법을 평가하였다. 평가방법은 상관계수와 변동계수를 이용하여 평가하였다. 그 결과, IgM을 이용한 표준화 방법은 변동계수의 향상을 가져왔고, median-centered 표준화 방법은 상관계수의 향상에 효과가 있었다. 또한, 혈액 내 IgM을 분석하기 위해 분석법을 비교해본 결과, TIS assay는 ELISA 방법에 비해 효과적이고 경제적이며 재현성이 있다는 결과를 얻었다. 이를 바탕으로 median-centered/IgM-TIS assay 방법을 이용하여 6종류의 혈액 단백질을 분석한 항체 어레이 데이터를 표준화 하였고, 표준화된 fluorescence intensity의 distribution 분석법을 이용하여 혈액 biomarker의 평가와 ROC 분석법을 이용하여 간경화와 간암을 진단하였다. 진단결과, Apolipoprotein A-1은 간경화 biomarker, alpha-fectoprotein과 CRP 복합은 간암의 혈액 biomarker로써 가능성이 있음을 알 수 있었다. 따라서, median-centered/IgM-TIS assay 표준화 방법은 항체 어레이 데이터의 분석과 간질환 및 암 진단 혈액 biomarker의 평가를 위한 유용한 표준방법이다. 두번째로, 단백질 분해효소 활성도의 실시간 정량 분석을 위해 유리기질로부터 액체상으로의 위상전위를 이용한 펩타이드 어레이를 개발하였다. 펩타이드 어레이는 두 기능을 가진 cross-linker인 GMBS와 C-와 N-말단에 각각 cysteine과 TAMRA를 가진 펩타이드 기질을 이용하여 제작하였다. 위상전위를 이용한 펩타이드 어레이는 MMP-3에 의해 유리기질로부터 분해된 펩타이드의 분석을 통해 입증하였다. 본 연구는 성공적으로 MMP-3의 단백질 분해 활성도를 분석하였다. 또한, MMP-3 활성도에 의해 분해된 펩타이드의 농도 분석을 통해 Km, Vmax 그리고 IC50 상수를 도출하였다. 따라서, 본 연구에서 개발된 펩타이드 어레이는 단백질 분해 효소의 kinetics 정량 분석과 약물 개발을 위한 kinetics 정보 제공에 적절하다. 세번째로, PKA 활성도 분석을 위해 형광 인산화 센서를 이용한 펩타이드 어레이를 개발하였다. 본 연구에서는 혈액 내 PKA 활성도와 자가항체 농도를 분석하기 위해 PKA 기질인 kemptide와 cPKA 에레이를 사용하였다. PKA 활성도 분석 칩의 민감도는 Trion X-100에 의해 0.01 U/ml로 증가하였고 PKA 억제제인 PKI에 의해 PKA 활성도가 억제되었으며 0.5 ?M에서 최고의 억제효과를 볼 수 있었다. 또한, 정상 (n = 30)과 간암 (n = 30), 위암 (n = 30), 폐암 (n = 30) 그리고 대장암 (n = 30) 환자 그룹에서 얻은 혈청에서 sPKA 활성도와 자가항체를 분석한 결과, sPKA 활성도 분석에서 암 그룹에 대해 90%의 민감도와 90%의 특이도, 0.966 AUC 그리고 3.5 U/ml의 cutoff value를 얻을 수 있었다. 그러나, PKA 자가항체 농도 분석 결과, 정상과 암 그룹과의 차이를 볼 수 없었고, sPKA 활성도와 자가항체 농도가 상관관계가 없음을 알 수 있었다. 따라서, sPKA 활성도가 자가항체보다 암 진단을 위한 biomarker로써 가능성이 있음을 알 수 있었고, sPKA 활성도 분석 칩이 암 진단과 PKA에 관련된 질환 진단에 효과적인 분석법임을 시사하는 바이다. Microarray technology is a one of the key technology in proteomics and serodiagnosis because this technology is appropriate for the large-scale and high-throughput analysis. In this paper, we developed novel microarrays for validating serological biomarkers, monitoring proteolytic enzyme activity, and analyzing serological protein kinase A activity. First, we developed a novel median-centered/IgM-tagged-internal standard (TIS) assay normalization using median-centering and TIS assay-based determination of serum IgM concentrations for minimizing systemic experimental variation in the analysis of antibody array data. We evaluated five normalization methods by analyzing correlation coefficients and coefficients of variation for six serum proteins using human serum samples from normal controls (n = 25) and patients with liver cirrhosis (n = 25) or hepatocellular carcinoma (HCC; n = 29). Median-centered normalization improved correlation coefficients, while IgM-based normalizations improved coefficients of variation. The TIS assay was more efficient, economical, and reproducible for determining IgM concentrations than enzyme-linked immunosorbent assay. Additionally, we normalized antibody array data for six serum proteins using the median-centered/IgM-TIS assay, and evaluated serum biomarkers through distribution analysis of normalized fluorescence intensities and receiver operating characteristic analyses for the diagnosis of liver cirrhosis and HCC. Apolipoprotein A-1 and a combination of alpha-fetoprotein and C-reactive protein were determined to be potential serological biomarkers for liver cirrhosis and HCC, respectively. Thus, median-centered/IgM-TIS assay normalization is a useful approach for analyzing antibody array data and evaluating serological biomarkers for the diagnosis of liver disease or cancers. Second, we have developed an assay using peptide arrays based on phase transition from the glass substrate to the liquid for monitoring quantitative protease activity in real-time. Peptide arrays were fabricated using a bifunctional cross-linker, N-[γ-maleimidobutyryloxy] sulfosuccinimide ester, and a substrate peptide containing two functional groups, cysteine and tetramethyl-6-carboxyrhodamine (TAMRA) on the C- and N-terminus, respectively. The phase transition-based peptide arrays were characterized by analyzing the substrate peptide cleaved from the solid substrate by matrix metalloproteinase-3 (MMP-3). We successfully used this assay to determine quantitative proteolytic activity of MMP-3 in a dose-dependent manner. In addition, parameters including Michaelis constant (Km), maximum rate of enzymatic reaction (Vmax), and half maximal inhibitory concentration (IC50) were determined by analyzing the concentrations of substrate peptide cleaved by MMP-3. Therefore, this new assay has potential for the quantitative analysis of enzyme kinetics of protease and informs research developments in drug discovery utilizing kinetic studies. Third, we present a novel peptide array based on fluorescence phosphorylation sensor for analysis of c-AMP dependent protein kinase (PKA) activity. In the present study, we used kemptide (the protein kinase A [PKA] substrate peptide) and PKA catalytic subunit C? (cPKA) arrays to evaluate serological PKA (sPKA) activity and autoantibody levels, respectively. The sensitivity of the on-chip sPKA activity assay was enhanced by Triton X-100, with a 0.01 U/mL detection limit. Protein kinase peptide inhibitor (PKI) decreased PKA activity in a dose-dependent manner, with a maximal effect at 0.5 ?M. We analyzed sPKA activities and autoantibody levels in sera from normal individuals (n = 30) and patients with hepatic (n = 30), gastric (n = 30), lung (n = 30), or colorectal (n = 30) cancers. sPKA activities in human sera from cancer patients were much higher than those in controls. The sPKA activity assay for cancer patients (n = 120) showed 90.0% sensitivity and 90.0% specificity at the cutoff value of 3.5 U/mL, with an area under the curve value of 0.966. However, no significant differences in PKA autoantibody levels were found between groups. Additionally, sPKA activities were not correlated with sPKA autoantibody levels. These results suggest that sPKA activity rather than autoantibody level could be used as a biomarker for cancer diagnosis. Furthermore, on-chip sPKA activity assay could be useful for cancer diagnosis and investigating PKA-related human diseases.