모세관 전기영동법에 의한 식품중에 존재하는 플라보노이드와 페놀산의 동시 프로파일 분석에 관한 연구

류상림 연세대학교 대학원 2000 국내석사

플라보노이드와 페놀산은 식물체내에서 생화학, 생리학적으로 항산화제나 효소 저해제, 독성물질의 전구체, 호르몬 조절제, 색소 등의 역할을 한다. 이러한 성분의 분석과 특정 성분의 양의 변화는 식품의 품질 평가지표가 될 수 있다. 지금까지 플라보노이드나 페놀산 같은 페놀화합물을 분석하는데는 thin-layer chromatography (TLC)나 high-performance liquid chromatography (HPLC)가 많이 사용되어왔다. 본 실험에서는 최근에 빠른 분석 시간과 높은 분리능, 시료절약 등의 여러 장점으로 주목되고 있는 모세관 전기영동 (capillary electrophoresis ; CE)을 이용하여 자연계에 보편적으로 존재하는 15종의 플라보노이드와 9종의 페놀산의 동시분석을 시도하였다. CE 분석법 중 micellar electrokinetic capillary electrophoresis (MEKC) 모드에서 완충액의 이온농도와 pH를 최적화하여 pH 8.0의 50 mM SDS가 첨가된 70 mM boric acid buffer을 사용하여 24종의 화합물을 15분내에 동시분석하였다. 본 분석법을 이용하여 녹차에 적용하였을때 catechin, epicatechin, quercetin, kaemperol 4종의 플라보노이드와 gallic acid을 탐색하였으며 포도주에서 syringic acid 등의 6종 페놀산과 epicatechin, catechin을 신속하게 스크리닝 할 수 있었다. 또한 모세관 전기영동-질량분석기 (CE-MS)를 이용하여 capillary zone electrophoresis (CZE) 모드에서 8종의 플라보노이드와 8종의 페놀산 검출 조건을 최적화 하였으며 이를 포도주에 적용해 본 결과 포도주에 존재하는 6종의 페놀산를 재확인할 수 있었다. 따라서 CE와 CE-MS의 상호 보안적 분석방법은 식품이나 여러 식물체에서의 플라보노이드와 페놀산을 신속하게 탐색하는데 매우 유용하게 응용될 수 있을 것이다. Flavonoids and phenolic acids belong to the group of plant secondary metabolites with important physicochemical, pharmacological, physiological and taxonomic applications. Phenolic acids also inhibit the oxidative degradation of food products and are used for this purpose by the food industry. Change in these compounds during processing and storage is also important to the quality and safety of commercial food products. The most widely used methods for the separation of flavonoid and phenolis compounds are thin-layer chromatograpy (TLC) and high-performance liquid chromatography (HPLC). However, none of these methods is entirely adequate because of the long time required for analysis, the limited resolution, and low sensitivity. As a modern separation method, capillary electrophoresis (CE) has won increasing acclaim for its extremely high efficiency, small sample volume, high speed, and good resolution. An efficient capillary electrophoretic method is described for the simultaneous determination of 15 common flavonoids and 9 phenolic acids in food. The separation of samples injected in pressure injection mode was carried out using fused silica capillrary in boric acid buffer (8.0 pH) containing SDS as pseudostationary phase with direct UV detection at 220nm. Under the opimized conditions of miceller electrokinetic capillary chromatography (MEKC), structurally diverse flavonoids and phenolic acids were well resolved with good precision in migration time and peak area. When applied to food sample such as tea extract and wine, various flavonoids e.g. catechin, epicatechin, quercetin, and phenolic acids e.g. caffeic acid, gallic acid were positively identified. And phenolic acids in wine is identified by capillary electrophoresis-mass spectrometry (CE-MS). The present MEKC method appear to be useful for the rapid profiling and screening of natural products and food for biologically active flavonoids and phenolic acids.

플라보노이드 비배당체의 합성과 티로시나아제 억제효과

황운상 강원대학교 일반대학원 2018 국내석사

본 연구에서는 컴퓨터 분자 모델링을 이용하여 티로시나아제와 그 리간드로 사용 할 천연물 유래 플라보노이드-배당체 그리고 가상의 플라보노이드(비배당체)를 다양한 화학적, 생물학적 계산을 이용해 생체 내에서 가장 안정한 3차원 형태로 재구성하였다. 재구성한 3차원 구조를 이용해 문헌으로 보고 된 플라보노이드-배당체와 티로시나아제의 분자 간 결합을 설명하고, 그 구조와 활성의 상관관계를 확인하였다. 이러한 결과를 바탕으로 플라보노이드(비배당체)를 이용한 가상 활성 검색 결과 비배당체의 플라보노이드가 더욱 안정하게 티로시나아제와 결합하는 것이 예측되었다. 이러한 플라보노이드는 다양한 천연물에 존재하며 항암, 항염, 항바이러스, 항균 등 다양한 생리활성을 지닌 중요한 헤테로고리화합물이다. 천연물 유래의 플라보노이드는 다양한 구조와 오랜 임상경험으로 높은 안정성을 지녀, 다양한 의약품의 주요 골격으로 사용되고 있다. 특히 플라보노이드를 이용한 티로시나아제 저해효과와 이를 활용한 기미, 주근깨와 같은 색소침착 저해를 통한 미백용 화장료 조성물에서부터 악성 흑색종 치료제와 같은 약물로써의 사용이 활발히 연구되고 있다. 이렇게 약물 연구에 계산 화학의 한 분야인 컴퓨터 분자 모델링이 도입되면 더욱 효율적이고 빠른 경로로 새로운 화합물을 설계할 수 있으며, 합성의 단계를 줄여 그 효율을 높일 수 있다. 본 연구에서는 컴퓨터 분자 모델링 결과를 직접 확인하고자 MOM으로 수산기가 보호 된 Acetophenone과 benzaldehyde를 축합 반응하여 찰콘 유도체를 합성하고, 찰콘 유도체의 분자 내 고리화 반응과 탈 보호기 과정을 이용해 플라보노이드를 합성하였으며 플라보노이드-배당체와 합성 된 플라보노이드의 활성비교를 진행하였다. 활성비교 결과, 플라보노이드-배당체에 비하여 플라보노이드 비배당체가 IC50 값이 30% 감소하여 티로시나아제 저해 효과가 변화함을 확인하였다. 이러한 결과는 컴퓨터 분자 모델링의 예측 결과와 일치하는 것으로써, 컴퓨터 분자 모델링이 목표 단백질에 대한 새로운 리간드 탐색에 적절한 도구임을 확인하였다. 더 나아가, 플라보노이드-배당체나 비배당체 또는 새로운 화합물의 다양한 생리 활성을 평가하고 활성의 증가를 위해 골격 및 작용기를 설계하는데 컴퓨터 분자 모델링이 매우 강력하고 효율적인 수단임을 확인하였다.

포유류 플라보노이드 수송체를 통한 세포 내 플라보노이드 흡수

김여진 고려대학교 대학원 2013 국내석사

본 연구의 목적은 플라보노이드 수송 메커니즘에 관여하는 Mammalian Flavonoid Transporter (MFT) 수송체를 통한 동물 세포 내 플라보노이드 흡수에 대하여 알아보고, MFT 수송체를 통하여 어떠한 형태의 플라보노이드가 더 잘 흡수되는지 알아보는 데 있다. 비만과 고지혈증은 각종 성인병과 만성 질환을 일으키는 주요 위험요소로써 초기에 예방하고 치료하는 것이 중요하다. 우리나라 성인의 30%가 비만인 것으로 나타나고, 이러한 현상은 사회적 문제로 대두되고 있다. 이러한 시점에서 독성이 거의 없고, 여러 가지 건강 기능성으로 각광받고 있는 플라보노이드에 관한 연구가 늘어나고 있다. 플라보노이드는 페놀류 파이토케이컬로, 체내 지질을 낮추는 기능을 가지고 있다. 식물체 내에서 플라보노이드 생합성 과정에 관한 연구는 많이 진행되어 왔지만, 인간이나 동물이 식물을 섭취한 후 체내 플라보노이드 수송 메커니즘은 아직 많이 알려지지 않은 상태이다. 인체에서 플라보노이드를 흡수하는데 관여하는 수송체로는 ABC transpoter, Bilitranslocase, MATE(Multidrug And Toxic Compound Extrusion) 등이 있다. 본 논문에서는 세포 내로 흡수된 플라보노이드의 양을 측정하는 새로운 방법으로 DPBA(diphenylboric acid 2-aminoethyl ester)라는 형광물질과 형광스펙트럼분석법을 이용하였다. 형광스펙트럼분석법은 기존에 플라보노이드 분석에 주로 사용되었던 분광스펙트럼분석법에 비하여 시간이 적게 들고, 낮은 농도에서도 더 민감하고 정확하다는 장점이 있다. MFT 단백질이 플라보노이드 흡수에 밀접하게 관여하는 수송체임을 확인하기 위하여 인간신장세포인 HEK293과 인간 간암세포주인 HepG2 세포를 이용하였으며, MFT 수송체를 과발현 시키거나 저해제를 처리하여 대조군과 비교하는 실험을 수행하였다. 또한, 다섯 가지의 플라보노이드 아글리콘과 글리코사이드의 흡수를 비교하여 어떠한 형태의 플라보노이드가 MFT 수송체를 통하여 더 잘 흡수되는지 확인하였다.

대구·경북 성인 여성의 플라보노이드 섭취량과 심혈관질환 위험요인과의 관련성 분석 : 2011년 국민건강영양조사를 이용하여

정지선 계명대학교 대학원 2014 국내석사

본 연구는 대구․경북지역 성인 여성의 플라보노이드 섭취량을 측정하고 심혈관질환 위험요인들과의 관련성을 분석하고자 하였다. 2011년 국민건강영양조사를 이용하여 대구·경북지역 성인 여성 391명 중 24시간회상법을 기록한 364명의 플라보노이드 섭취량을 2011년 선행연구 된 플라보노이드 함량 데이터를 이용하여 계산하였다. 심혈관질환 위험인자를 BMI, 혈중 총 콜레스테롤 농도, 혈중 중성지방 농도, 혈중 LDL-콜레스테롤 농도, 혈중 HDL-콜레스테롤 농도, 공복혈당 농도, 당화혈색소, 혈압으로 설정 한 후, 플라보노이드 섭취량과 연령, 지역, 소득별로 비교하고 심혈관질환 위험요인과의 관련성을 분석하였다. 대구․경북지역 성인 여성의 하루 평균 총 플라보노이드 섭취량은 84.08 mg이었다. 플라보노이드의 섭취량은 70대에서 isoflavones을, 60대에서는 anthocyanidns을 유의적으로 높게 섭취하였다. 가구소득 중상군에서 flavonols을 유의적으로 높게 섭취하였다. 생화학적 지표와의 비교에서는, 혈중 총 콜레스테롤 농도 경계수준에서 isoflavones의 섭취량이 유의적으로 높았다. 상관관계 분석에서는 isoflavones이 나이와 양의 상관관계를 나타내었고, 총 플라보노이드 섭취량이 LDL-콜레스테롤과 음의 상관관계를 나타내었다. Anthocyanidin은 폐경 여성에서 공복혈당 농도와 음의 상관관계를 나타내었다. 다른 생화학적 지표와 플라보노이드 섭취량과는 유의적인 상관관계가 나타나지 않았다. 이상의 조사 결과에 따르면, 나이가 증가할수록 isoflavones 섭취량이 증가 하였고, 총 플라보노이드 섭취량이 높을수록 혈중LDL-콜레스테롤 농도가 낮았고, 폐경 여성에서 anthocyanidin 섭취가 높을수록 공복혈당 농도가 낮은 것으로 조사되었다. The purpose of this study was to calculate the flavonoids intake and analyze the association between flavonoids intake and cardiovascular risk factors for women over the age of 19 in Daegu and Gyeongbuk. Using a previous study on flavonoids contents database from 2011, individual flavonoids intakes were calculated for 364 people, who participated in a 24 hour recall of food intake, from the 2011 Korean National Health and Nutrition Examination Survey. Risk factors for cardiovascular disease, include BMI, plasma total cholesterol concentration, plasma triglyceride concentration, plasma LDL-cholesterol concentration, plasma HDL-cholesterol concentration, fasting plasma glucose concentration, glycosylated hemoglobin, and blood pressure. Flavonoids intakes were analyzed by comparing age, region, income and the relevance of cardiovascular risk factors. For Daegu and Gyeongbuk women, the average daily intake of total flavonoids was 84.08 mg. Participants in their 70's had a significantly higher intake of isoflavones, while Participants in their 60's age group had a significantly higher intake of anthocyanidin. By household income, Participants in the slightly above average income group had a significantly higher intake of flavonols. In comparison with biochemical markers, participants at the alert level group of plasma total cholesterol concentration had a significantly higher intake of isoflavones. A positive correlation was observed between isoflavones intake and age. A negative correlation was observed between total flavonoids intake and plasma LDL-cholesterol concentration. Anthocyanidin intake and fasting plasma glucose concentration level in postmenopausal women exhibited a negative correlation. Flavonoids intake and other biochemical markers did not exhibit a significant correlation.

메밀 새싹 생육 시 LED 광원에 따른 플라보노이드 함량의 변화

이선미 경희대학교 2013 국내석사

본 연구는 메밀 새싹에 특정 파장을 조사하여 플라보노이드 함량의 변화를 알아보고 메밀 새싹 부위에 따른 플라보노이드의 분포를 알아보았다. 그리고 메밀 새싹 재배 기간 동안 플라보노이드 함량의 최대치가 어느 시점인지 알아보기 위해 실시하였다. 주결과는 다음과 같다. 1. 메밀 새싹의 배축의 길이는 암조건에서 가장 길고(10.4cm) 청색광에서 가장 짧다(7.28cm). 뿌리의 길이는 적색광에서 가장 길고(5.96cm) 청색광에서 가장 짧았다(4.78cm). 건물중은 모든 광원에서 유의차가 없는 수준으로 측정되었다. 2. 메밀 새싹의 총 페놀함량은 청색광에서 가장 높은 함량을 보였다(105.7mg GAE/g D.W.). 그 외에 암조건, 형광등, 적색광에서는 각 광질간의 유의차가 없다. 3. 메밀 새싹의 총 플라보노이드함량은 청색광에서 가장 높은 함량을 보였고(18.1mg QE/g D.W.), 암조건에서 가장 낮은 함량을 보였다(8.7mg QE/g D.W.). 4. 메밀 새싹의 항산화활성은 대조구인 암조건(21.5mg VCE/g D.W.)에 비해 형광등(34.5mg VCE/g D.W.), 적색광(34.3mg VCE/g D.W.), 청색광(35.2mg VCE/g D.W.)에서 항산화 활성이 높게 나타났다. 5. 메밀 새싹의 기존에 밝혀진 chlorogenic acid, orientin isoorientin, vitexin, isovitexin, rutin외에 한 가지 물질을 더 분리하였다. 6. 새롭게 분리된 화합물은 HPLC-DAD-ESI/Q-TOF MS를 통해 분석한 결과 질량과 그 fragment들이 같은 isomer 타입의 rutin으로 판단되나, NMR 분석을 통한 구조 동정이 요구된다. 7. 메밀 새싹의 자엽 부위에서 chlorogenic acid를 제외한 다른 6가지 플라보노이드 는 모든 처리구에서 측정되었고, 암조건에 비해 형광등, 적색광, 청색광 모두 플라보노이드 함량이 높은 것을 확인하였다. 8. 메밀 새싹의 줄기 부위에서는 chlorogenic acid, 새로이 분리된 화합물, rutin만이 측정되었다. chlorogenic acid는 자엽 부위와 다르게 모든 광질에서 측정되었다. 9. 메밀 새싹의 뿌리에서 chlorogenic acid는 모든 광질에서 측정되었으나 orientin, isoorientin, vitexin, isovitexin은 모든 광질에서 측정되지 않았다. 새로이 분리된 화합물, rutin은 청색광에서만 측정되었다. 10. 대조구인 암조건에 비해 플라보노이드 함량은 모든 광원에서 높게 나타났고, 청색광에서 가장 높은 함량을 나타낸다. 메밀의 대표적인 phenol 물질은 rutin 뿐만이 아니라 isoorientin, isovitexin도 큰 비율을 차지한다. 11. 생육에 따라 항산화활성은 모든 광원에서 발아 일수가 경과함에 따라 항산화활성이 증가하였다. 대조구인 암조건에 비해 모든 광원에서 높은 항산화활성을 나타낸다. 12. 생육에 따른 chlorogenic acid와 플라보노이드의 일종인 orientin, isoorientin, vitexin, isovitexin, rutin isomer 추정 화합물, rutin은 광원에 관계없이 모두 증가하였으며 암조건에 비해 큰 폭으로 증가하였다. 13. 메밀 새싹 재배 시 암조건보다 광조건에서 플라보노이드의 함량이 증가하는 경향을 나타내어 건강기능성 물질이 증가된 재배 조건은 광처리가 효율적인 것으로 판단된다. 새싹채소로의 이용 시 기호도는 향후 선호도 조사나 맛에 영향을 미치는 물질의 변화를 알아보는 것이 필요하리라 판단된다. This experiment was conducted to evaluate light effect whether different light resources may affect to the growth of buckwheat sprouts and the content of phytochemical components. Light resources were individually treated to pre-germinated seedlings, which were consisted of dark condition, fluorescent light, red, and blue LEDs, irradiating 30 μmol·m-2·s1 intensity except for dark condition. Experimental data were biomass, length, total phenolics, total flavonoids, antioxidant activity, and individual flavonoid content in the sprouts. The data include each part of sprouts and each growth stage. Major results were described in the following categories. 1. The shoot length of common buckwheat sprout was the longest value (10.4cm) in dark condition and shortest value (7.28cm) in blue light. The length of root was the longest value (5.96cm) in red light, and shortest value (4.78cm) in blue light. 2. The total phenolic content of common buckwheat sprout was the highest in blue light, exhibiting 105.7mg GAE/g D.W. among light treatments. There were no significant difference between fluorescent light and red LED treatments. The content in dark condition was the lowest value. 3. The total flavonoid content of common buckwheat sprout was not significantly differed among fluorescent light, red, and blue LEDs, exhibiting about 17 to 18mg QE/g D.W. Otherwise, the content of total flavonoids was significantly low, presenting 8.7mg QE/g D.W. 4. The antioxidant activity of common buckwheat sprouts was shown to similar value among light treatments, exhibiting 34.5mg VCE/g D.W. in fluorescent light, 34.3mg VCE/g D.W. red LED, 35.2mg VCE/g D.W. in blue LED. The activity of sprouts grown under dark condition was shown significantly low value, presenting 21.5mg VCE/g D.W. 5. Phenolic compounds in buckwheat sprouts had known 6 major components, including chlorogenic acid, orientin, isoorientin, vitexin, isovitexin, and rutin. In this study, we found additional one compound that may be an isomer form of rutin. 6. The newly separated compound was analyzed by LC-MS/MS, which had [M+H]+ = 611.17 and fragmented [M+H]+ = 465.10 and [M+H]+ = 303.05. The MS values was same with this mass of rutin. Thus, it should be interpreted as isomer of rutin although further NMR analysis will be accomplished. 7. Among the sprout part analysis, leaf contained orientin, isoorientin, vitexin, isovitexin, a rutin isomer and rutin. Their content in dark condition was shown the lowest value. 8. The shoot contained only chlorogenic acid, a rutin isomer and rutin. Other flavonoids were not detected. The content of detected compounds were higher in blue light resources, including blue LED and fluorescent light. 9. The root grown under each of dark, fluorescent, and red light contained only chlorogenic acid. In blue light treatment, root contained chlorogenic acid, a rutin isomer, and rutin. However, the detected compounds in shoot and root were contained relatively small amount as compared with the content in leaf. 10. In the sprout growing stage, individual flavonoid content and antioxidant activity were gradually increased when period of sprout growth was longer. The tendency were similarly shown all of light treatments. Dark condition induced the lowest value of flavonoid content.

한국 성인의 사회경제적 수준에 따른 플라보노이드 섭취현황 : 2007~2012년 국민건강영양조사 자료를 이용하여

흑양 서울대학교 대학원 2017 국내석사

본 연구에서는 한국 19세 이상 성인의 사회경제적 수준에 따른 플라보노이드 섭취행태와 그에 따른 식생활 특성을 파악하기 위해 제 4․5기 국민건강영양조사 (2007-2012) 자료의 24시간 회상법 자료와 상용식품 중 플라보노이드 함량 데이터베이스를 연계하여, 1일 총 플라보노이드 및 개별 플라보노이드(플라보놀, 플라본, 플라바논, 플라반-3-올, 안토시아닌, 프로안토시아닌, 이소플라본)의 섭취량을 추정하였다. 그 결과, 한국 19세 이상 성인의 1일 평균 총 플라보노이드 섭취량은 남자가 321.8 mg/d, 여자가 308.3 mg/d였으며, 남녀 모두에서 가구소득수준이 높을수록 플라보노이드 및 개별 플라보노이드 섭취량이 증가하였고, 교육수준이 높을수록 플라보놀, 안토시아닌 등의 개별 플라보노이드와 총 플라보노이드의 섭취량이 유의하게 증가하였다. 소득수준과 교육수준에 따라 플라보노이드 섭취량에 가장 큰 차이가 있었던 식품군은 음료 및 주류로, 가구소득수준과 교육수준이 가장 높은 군은 가장 낮은 군에 비해 음료 및 주류로부터 섭취하는 총 플라보노이드가 각각 2.7-2.9배, 8.2-8.8배 가량 더 많았다. 가구소득수준과 교육수준이 복합적으로 플라보노이드 섭취에 미치는 영향을 분석한 결과, 교육수준이 ‘대졸 이상’이면서, 가구소득수준이 상, 중상인 군은 교육수준이 ‘중졸 이하’이면서 가구소득수준이 하, 중하인 군에 비해 플라보노이드 섭취량이 낮을 위험이 남자에서 63%, 여자에서 50.% 더 적은 것으로 나타났다. 추후 사회경제적 수준에 따른 플라보노이드 섭취량과 임상적 지표 혹은 질병의 유병률 등과의 연관성에 대한 후속 연구가 필요할 것으로 사료된다.

Gas chromatography를 이용한 프로폴리스 추출물의 플라보노이드 성분 분석

남경완 고려대학교 생명환경과학대학원 2024 국내석사

본 연구에서는 가스크로마토그래피를 이용하여 프로폴리스의 주요 기능성 성분인 플라보노이드를 국가별로 비교 분석하고 분석된 각 플라보노이드 성분들이 인체에 미치는 영향을 조사하여 프로폴리스가 가질 수 있는 생리활성 효과와의 연관성을 찾고자 하였다. 그 결과 갈색의 프로폴리스에서 공통적으로 4가지 플라보노이드 성분 (Pinostrobin chalcone, Pinocembrin, 5-Hydroxy-7-methoxyflavone (tectochrysin), Chrysin)을 정성하였다. 이후 분석된 4가지 플라보노이드 성분들의 약리효과를 여러 문헌을 통하여 조사하였고 항산화 작용, 항균 작용, 항암 효과, 항염 효과, 항비만 효과, 항당뇨 효과, 신경보호 작용, 간 손상 방지 등 여러 가지 효과가 있음을 확인 하였다. 또한 이 4가지 플라보노이드 성분들은 한국, 캐나다, 호주, 뉴질랜드가 원산지인 갈색의 프로폴리스에서만 공통적으로 검출 되었고 브라질이 원산지인 녹색의 프로폴리스에서는 검출 되지 않는다는 사실을 확인하였다. 이는 프로폴리스가 생산되는 지역의 식물의 종류, 벌의 종류, 기후 등 환경적인 요인이 프로폴리스의 성분 차이에 영향을 주는 것으로 보인다. 이와 같이 갈색과 녹색의 프로폴리스의 플라보노이드 조성의 차이는 이 두 가지의 프로폴리스가 서로 다른 약리 효과를 보일 것임을 예상할 수 있게 하였고 향후 녹색 프로폴리스의 추가적인 연구를 통하여 주요 성분을 밝혀내면 갈색 프로폴리스와의 생리활성효과 차이를 명확히 규명할 수 있을 것이다.

분자모사 기반의 환형올리고당 및 당질배합체의 구조모사 및 생물공학적 응용에 관한 연구 : Biotechnological Application of Cyclic Oligosaccharides and Glycoconjugates Based on the Computer-Aided Molecular Design

김현명 건국대학교 대학원 2009 국내박사

환형올리고당과 당질 배합체의 생물공학적 응용을 위하여 분자모사 및 실험적인 접근방법을 수행하였다. 분자모사기법은 구조적 유동성으로 인해 NMR 및 결정학적 접근의 구조연구에 한계를 보이는 탄수화물 구조의 예측에 중요한 방법으로 이용된다. 분자동력학 및 simulated annealing 모사를 이용하여 미생물이 생산하는 환형올리고당과 플라보노이드 배당체의 구조분석을 수행하였다. 당결합이 전체 환형올리고당의 구조에 미치는 영향과 플라보노이드 배당체의 구조와 이의 산화방지효과 사이의 상관관계를 분자동력학모사를 통하여 살펴보았다. 또한 Monte Carlo 도킹 모사를 통하여 환형올리고당인 사이클로덱스트린과 monocyclic 분자간의 포집복합체의 결합모드에 대한 연구를 수행하였다. 사이클로덱스트린은 환형올리고당의 일종으로서 포집복합체 형성능을 가지며, 이를 이용하여 다양한 생물공학적인 응용이 되고 있다. 주체 (host)와 대상체 (guest)간의 포집복합체는 대상체의 성질을 변화시키는 중요한 기작으로, monocyic 대상체에 대한 효과적인 사이클로덱스트린의 포집복합체를 분자모사를 통하여 예측하였다. 환형올리고당인 사이클로덱스트린과 플라보노이드 대상체간의 포집복합체에 대한 연구를 UV-vis, NMR 분광기 및 모세관 전기영동 (capillary electrophoresis)를 이용하여 수행하였다. 플라보노이드의 이용성을 높이기 위하여 사이클로덱스트린의 플라보노이드에 대한 용해도 증가능 및 광학이성질 플라보노이드의 분리능에 대하여 실험적인 접근방법을 통하여 연구를 수행하였다. 또한 플라보노이드와 사이클로덱스트린간의 포집복합체의 결합모델을 실험결과와 Monte Carlo 도킹모사를 통하여 제안하였다. Ralstonia solanacearum 균주가 생산하는 삼투압 조절에 관련되었다고 보고된 환형올리고당(OPGR)의 구조분석을 분자동력학 모사를 이용하여 수행하였다. 이를 위하여 당결합의 분포 및 유동성과 유래된 구조의 에너지를 조사하였으며, 이론적인 환형(CYS13) 및 선형올리고당 (LINEAR)을 구축하였다. 환형올리고당은 환형구조에 의한 불안정성이 존재하고 있다. 그러나OPGR의 각 당결합은 에너지가 안정한 구조를 이루고 있으며, 전체 환형구조의 안정화를 위하여 α-(1→6) 결합의 구조적 유동성의 감소가 특징적으로 나타남을 알 수 있다. Quercetin과 quercetin의 3번 위치의 수산기에 탄수화물이 결합된 당질배합체의 수용액상 구조를 분자동력학 모사를 통하여 조사하였다. Quercetin은 공액결합(conjugated bond)를 가짐으로써 평면의 구조를 보인다. 그러나 결합된 당의 종류에 따라 quercetin의 구조적 비틀림이 유도되었으며, 이들 물질의 항산화능은 구조의 비틀림의 정도와 밀접한 연관이 있음을 알 수 있었다. 당분자는 이러한 구조적 비틀림을 유발함과 동시에 B ring과의 상호작용으로 quercetin의 자유로운 비틀림을 감소시켰다. 이러한 평면구조의 벗어남의 정도는 플라보노이드의 활성을 예측하는 중요한 요소로 작용될 수 있다. 사이클로덱스트린 (CD)은 포집복합체를 통하여 낮은 용해도 및 약학적 성질을 보이는 물질을 개선하는데 이용된다. 따라서 더욱 효과적인 CD의 선택은 약제의 응용성을 높이는데 중요한 요소이다. 난용성 물질에 대한 용해도 증가에 더욱 효과적인 CD를 선택하기 위하여 Monte Carlo 도킹모사를 수행하였다. 21개 난용성 물질과CD 복합체의 효과적인 선택에 결합에너지를 변수로 이용한 결과, 100%의 정확도를 나타내었다. 플라보노이드는 식물의 이차산물로서 강한 항산화 활성뿐만 아니라 항염증, 항암, 항바이러스 활성을 나타낸다. Flavone과 flavonol은 대표적인 플라보노이드이다. 그러나 그 자체의 phenol 구조의 특징으로 인해 수용액상의 용해도가 매우 낮아 활용성이 떨어진다. 따라서 3가지의 flavone및 4가지의 flavonol의 용해도 증가를 위하여 사이클로덱스트린 및 그 유도체를 이용한 복합체 연구를 수행하였다. 또한 결합구조의 예측을 위하여 phase solubility, NMR 및 분자모델링 방법을 이용하였다. 플라보노이드의 용해도 증가능 및 복합체의 결합구조는 시클로덱스트린과 유도체의 종류에 따라 다른 양상을 나타내었다. Catechin은 광학이성질 플라보노이드로서, 각각의 (+)-catechin 과 (-)-catechin이 서로 다른 생물학적 효과를 보인다. 이러한 광학이성질 catechin을 숙실산으로 수식된 사이클로덱스트린 (Suc-β-CD)를 분리체로 이용하여 모세관 전기영동 방법을 통하여 분리하였다. 숙실산이 한 개 수식된 CD의 경우에 (±)-catechin을 가장 효과적으로 분리하였으며, 숙실산이 2개 및 3개 수식된 CD의 경우 더 넓은 pH 범위에서 분리능을 나타내었다. Molecular simulations and analytical methods were used for the biotechnological application of cyclic oligosaccharides and glycoconjugate. Molecular simulations is a powerful tool to predict the conformation of carbohydrate because its inherent flexibility makes hard to investigate the conformation by either NMR or crystallization method. Molecular dynamics and simulated annealing simulations are used to investigate the conformational characteristics of cyclic oligosaccharide from microorganism and flavonoid glycoside. The effect of glycosidic linkage to the whole conformation of cyclic oligosaccharide and the relationship between structure and antioxidant activity of flavonoid glycoside were investigated by molecular simulations. Monte Carlo docking simulation was used to exploit the binding mode of inclusion complexes between monocyclic compound and cyclodextrin hosts. Cyclodextrins, kinds of cyclic oligosacchrides, have been used in various field of biotechnology through their inclusion complex forming ability. Inclusion complex between host and guest molecules is an important process for modifying the characteristics of guest molecules. Monocyclic compounds used as model guest molecules of cyclodextrins to predict the preferred inclusion complex. Analytical methods such as UV-vis, NMR spectroscopy and capillary electrophoresis were useful approaches to investigate the inclusion complex between cyclodextrin and flavonoid guest molecules. The activity of cyclodextrins as solubility enhancers and chiral selectors for flavonoids to increase their bioavailability was investigated by analytical approach. Furthermore, binding models of flavonoid-cyclodextrin complexes were proposed based on Monte Carlo docking simulations and their experimental results. The conformational preferences of cyclic osmoregulated periplasmic glucan of Ralstonia solanacearum (OPGR) were characterized by molecular dynamics simulations. To determine the conformational characteristics of OPGR, we investigated the glycosidic dihedral angle distribution, fluctuation, and the potential energy of the glucan and constructed hypothetical cyclic (CYS13) and linear (LINEAR) glucans. There are conformational constraints in cyclic glucan. The conformation of OPGR can reconcile the tendency for individual glycosidic bonds to adopt energetically favorable conformation with the requirement for closure of the macrocyclic ring by loosing the inherent flexibility of the α-(1→6)-glycosidic linkage. The conformations of quercetin and quercetin substituents were also investigated by molecular dynamic simulations in aqueous environment. Quercetin's planar structure results from the increased conjugation. However, the glycosylations of quercetin aglycone at 3-hydroxyl position cause the distorted conformation of flavonol backbone and their antioxidant activity is decreased as a function of the degree of distortion. Although the glycosyl moieties cause the distorted conformation, these bulky groups hold B ring and prevent further free rotation. The coplanarity of flavonol backbone can be an important factor to access the conformation-activity relationship. Cyclodextrins (CDs) are useful functional excipients, which are being used to camouflage undesirable pharmaceutical characteristics, especially poor aqueous solubility, through the inclusion complexation process with insoluble drugs. The selection of more efficient cyclodextrin is important to improve the bioavailability of drugs. The complexing and solubilizing abilities toward poorly water-soluble monocyclic molecules of CDs were investigated using Monte Carlo (MC) docking simulations studies. The prediction accuracy of the preferred complex for 21 host-guest pairs is 100% using interaction energy. Flavonoids are polyphenolic compounds that usually exist in plants as secondary metabolites. Flavones and Flavonols constitute a major group within the flavonoids and they possess strong antioxidative activity as well as other potential effects including anti-inflammatory, anti-cancer, and anti-viral. Owing to their phenolic nature, flavonoids are poorly water soluble, which reduces their bioavailability. The aqueous solubility of three flavones and four flavonols was enhanced by β-CD, heptakis (2,6-di-O-methyl) β-cyclodextrin (DM-β-CD), and 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin (HP-β-CD). The phase solubility and ¹H-NMR chemical shift change were used for predicting the binding modes of complex. Depending on the nature of cyclodextrins, flavonoids showed different degree of solubilisation and the binding mode of complexes. Catechin is a kind of flavonoid and is chiral molecules. (+)- and (-)-catechin show opposite and different biological effects. We used the characterized succinyl-β-cyclodextrins (Suc-β-CDs) Suc-β-CDs as chiral selectors for separating (±)-catechin in capillary electrophoresis. Mono-Suc-β-CD is sufficient and effective to separate (±)-catechin. Di- and tri-Suc-β-CD show the ability of chiral separation at broad pH range.

Inhibitory Effects of Flavonoid Antioxidants with Structure-Activity Relationship on Angiogenesis : 항산화 플라보노이드류의 구조적 특징에 따른 혈관 신생 억제 효과의 규명

김은옥 Graduate School of Yosu National University 2005 국내박사

새로운 혈관 형성 과정의 하나인 혈관신생은 종양의 성장과 전이에서 염증에 이르기까지 다양한 형태의 질병 치료과정에서 중요한 역할을 한다. 따라서 혈관신생 기전 억제를 통하여 암의 제어 및 예방에 기여할 수 있을 것으로 사료되었다. 본 연구의 목적은 종양 성장 과정에서 발생하는 혈관 신생 과정에 대한 항산화제로서의 플라보노이드 구조에 따른 억제효과를 규명하는데 있다. 최근 많은 연구에서 플라보노이드는 야채나 과일 등의 천연에 널리 존재하는 polyphenol 분자로서 프리라디칼이 매개하는 각종 질병에 대하여 예방과 치료효과가 있음이 알려져 있다. 플라보노이드가 항산화효과를 나타내기 위해서는 B-ring에 ortho-dihydroxyl 라디칼이 있어야 하며 2, 3 위치에 이중결합과 4위치의 keton기, 그리고 3, 5 위치에 hydroxyl기를 가지는 구조적 특징이 필요하다. 이러한 필수적 구조상의 특징을 모두 갖춘 플라보노이드의 형태가 플라보놀 계열이며 이를 기준으로 B-ring에 존재하는 hydroxyl기의 수가 다른 myricetin, quercetin, kaempferol 및 galagin의 네 종류 플라보놀을 선택하여 항산화능, 세포에 미치는 독성과 신생혈관 형성, 세포 증식, 세포 부착 기전에 대한 저해능을 통하여 혈관신생 억제효과에 미치는 B-ring의 hydroxyl기 수의 영향을 분석하였다. 네 종류의 플라보놀에 대한 항산화능은 FRAP 방법에 의해 측정하였고 실험 결과 myricetin> quercetin> kaempferol> galangin의 순서로 항산화능이 높았다. 이는 프리라디칼에 전자를 제공하여 이들의 연쇄반응을 중단시키고 전자의 편재화를 가능하게 하는 B-ring의 hydroxyl기의 수가 많을수록 높은 항산화력을 갖는다고 볼 수 있다. 세포의 독성에 관하여 trypan-blue 염색 배제법을 이용하여 측정한 결과도 마찬가지로 B-ring의 hydroxyl기 수가 많은 플라보놀의 경우일수록 내피 세포에 대하여 미치는 독성이 낮은 것으로 나타났다. 세포 생존율이 50%가 되는 각각 플라보놀의 농도는 myricetin이 100μM, quercetin이 50μM, kaempferol이 20μM, 그리고 galangin이 10μM이었으며 이 결과를 토대로 내피세포 성장 촉진 인자(VEGF)에 의해 활성화된 사람의 태반세포(HUVEC)를 무독성 농도의 최대값인 50μM의 myricetin, 25μM의 quercetin, 10μM의 kaempferol, 그리고 5μM의 galangin까지 여러 농도의 플라보놀을 각각 처리하여 matrigel 상에서 맥관 구조 형성 저해능을 분석하였다. 그 결과로서 네가지의 플라보놀에 대하여 47.3%(myricetin), 36.9% (quercetin), 15%(kaempferol), 14.2%(galangin)의 저해효과를 보였으며 이 또한 B-ring에 hydroxyl기를 가지지 않는 galangin에서 3개를 갖는 myricetin에 이르기까지 점차 증가하였다. 또한, U937 단구성 세포계(U937 monocytic cell line) 와 HUEC을 이용한 세포 부착에 관하여 네 가지의 플라보놀을 각각 무독성 최고 농도까지 다양한 농도로 처리하여 필요에 따라 PMA와 IL-1β로 U937 세포와 HUVEC을 활성화시키는 세 가지 방법으로 실험하였다. 세포 부착에 대하여 플라보놀의 저해능 역시 B-ring의 hydroxyl기 수가 많아지는 galangin 에서부터 myricetin까지 증가하였다. HUVEC을 네 가지의 플라보놀을 이용하여 무독성 최고 농도까지 처리하여 이들의 세포 증식 저해능을 실험한 결과도 다른 실험결과와 일치하였다. HUVEC의 세포 표면에 존재하는 세포 부착에 관여하는 분자인 VCAM-1, ICAM-1, E-selectin의 발현 정도를 분석한 실험결과 hydroxyl기 수에 따라 저해정도가 증가하였다. 따라서 여러 가지 혈관신생 기전에 대한 항산화 플라보노이드의 억제 효과가 구조상의 B-ring에 존재하는 hydroxyl기 수가 증가할수록 높은 것으로 나타났다. 이는 분자내에 hydroxyl기가 많을수록 극성이 증가하여 세포 표면의 세포 부착 관여 분자와 더 쉽게 반응할 수 있으며 전자 공여능 또한 증가하여 프리라디칼의 환원에 대해서도 쉽게 전자를 공여할 수 있음에 기인되는 것이며, 또한 혈관신생 기전에 관여하는 PI3K, IKK, NFkB의 활성화 경로를 플라보노이드의 구조 활성 상관관계를 바탕으로하여 hydroxyl기를 많이 가지는 플라보노이드가 강하게 저해하는 것으로 사료된다. 본 연구 결과를 토대로 항산화 플라보노이드는 그 구조상 특징인 B-ring의 hydroxyl기 수의 증가에 따라 신생혈관 기전에 대한 억제 효과가 높다고 판단된다. Angiogenesis, the formation of new blood vessels, plays an important role in a variety of pathologies, ranging from tumor growth and metastasis to inflammation and occur diseases. The aim of this research was to investigate whether flavonoid antioxidants could inhibit process of tumor angiogenesis. Flavonoids are a group of naturally occuring polyphenolic compounds found in wide fruits and vegetables. They exhibit diverse protective effects on many diseases mediated by free radical. Key structural elements for the antioxidant activity of flavonoids are the phenolic OH groups in B-ring, 3-OH moiety of the C-ring and C2-C3 double bond conjugated with a 4-keto group. So this study was examined four Flavonols -Myricetin(M), Quercetin(Q), Kaempferol(K), Galangin(G)- with different numbers of -OH groups in Bring about relation to their antioxidant capacity, cytotoxicity for their potential antiangiogenic effects as inhibitor of cell adhesion, proliferation and tube formation. The antioxidant capacity for these four flavonoids in cell culture media measured FRAP method was: M> Q> K> G, which correlated respectively with the presence of 3, 2, 1, and 0 -OH groups on their B-ring where formation and decay of flavonoid aroxyl radicals occurs. Trypan-blue exclusion test also showed that the higher the numbers of -OH groups in B-ring, the less toxic the flavonoids was to endothelial cells(EC). The order of LD50 was: M(100uM)> Q(50uM)> K(20uM)> G(lOuM). 1/2LD50 of flavonoids for their antiangiogenic effects was tested via measuring inhibition level on tubular structure formation in vascular endothelial growth factor-stimulated HUVECs on Matrigel. The order was: M(47.3%)> Q(36.9%)> K(15%)> G(14.2%). Adhesion U937 cells to HUVECs was conducted with 3 ways, U937 cells and HUVECs were treated each or both with 4 flavonoids. Cell adhesion was inhibited significantly with order from myricetin bearing 3 -OH groups to galangin having 0 -OH group in B-ring at their safe doses. HUVECs proliferation was inhibited by flavonoids at maximum safe doses. The inhibition effect of flavonoids was stronger, the more have -OH groups in their B-ring. Expression of cell adhesion molecules VCAM-1, ICAM-1, and E-selectin by HUVECs was inhibited with safe doses by same way of these four flavonoids with structural-activity relationship. Antiangiogenic effects of flavonoid antioxidants are highly dependent on the numbers -OH groups in B-ring. It appears that the presence larger -OH groups in B-ring of the flavonoids makes them more polar. Polarized flavonoids tend to be outside of cell membrane that is hydrophilic part. This fact suggest that flavonoids with more -OH groups in B-ring interact easily with cell adhesion molecules on cell surface and donate electron to scavenge free radicals. Also these four flavonoids may downregulate the activity of the PI3K, IKK, and NFKB in pathways of angiogenesis. Thus flavonoid antioxidants exhibit high antiangiogenic effects in relation to the number of -OH groups in their B-ring.

HPLC-이중질량분석법을 이용한 9 품종의 감귤 플라보노이드 성분과 생물학적 활성 분석

김해경 경상대학교 대학원 2011 국내석사

Fruit peels of Citrus unshiu Marc., Citrus erythrosa Hort, Citrus sunki Hort, Citrus benlkoji Hort, Citrus avrantium L., Citrus leiocarpa Hort. et Tanaka, Citrus playmamma Hort, Citrus nippokoreana and Citrus natsudaidai Hayata were analyzed for flavonoids via high performance liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) in the positive mode with selected ion monitoring (SIM). Among fortynine flavonoid components labeled, five flavanones, twenty tow flavones and tow coumarins were identified for the first time; naringin (3), poncirin (9), trihydroxytetramethoxyflavone-glucoside (11), meranzin (15), hexamethoxyflavone isomers (12, 25, 28 and 45), hydroxypentamethoxyflavone (16, 22), pentahydroxymethoxyflavone (17), isomeranzin (18), isosinensetin (19), hydroxytetramethoxyflavone (20, 41), hydroxyhexametoxyflavone ( 21, 24, 39 and 45), dihydroxytetramethoxyflavone (23, 34), sinensetin (26), dihymethoxyflavone (27), tetramethyl-O-isoscutellarein (29), pentamethoxyflavone (30), dihydroxytrimethoxyflavone (31), tryhydroxytetramethoxyflavone (32), tetramethoxyflavone (33), 3,3’,4’,5,6,7,8-heptamethoxyflavone (37), hydroxypentamethoxyflavone (38, 45), 3-hydroxy-hexamethoxyflavone (39), trimethoxyflavone (40), and 3-hydroxy-pentamethoxyflavone (44), hesperetin 7-O-glucoside (48) and hesperetin (49). Total phenol contents of the nine citrus varieties were measured by Folin-Denis method. The mean content was 2.90mg/g. The content was lowest for Citrus leiocarpa Hort. et Tanaka (1.98±0.13mg/g), and highest for Citrus nippokoreana (4.62±0.13mg/g). The antioxidant effect was evaluated for the flavonoids of the nine citrus varieties; DPPH, ABTS, NO, FRAP. The effect showed dose-dependant trend for the all tests. The identified compounds from fruit peel of C. unshiu Marc. Citrus erythrosa Hort, Citrus sunki Hort, Citrus benlkoji Hort, Citrus avrantium L., Citrus leiocarpa Hort. et Tanaka, Citrus playmamma Hort, Citrus nippokoreana and Citrus natsudaidai Hayata were quantified by HPLC. To investigate the function of the flavonoids as defense materials, the flavonoid content change of the fruit peel of inoculated with P. digitatum was monitored by HPLC. The flavonoid concentration in the infected fruit peel decreased initially after the infection, but then gradually increased before finally progressively decreasing.