카드뮴과 납의 다경로 노출량 추정 및 통합 위해평가

유창우 서울대학교 대학원 2020 국내석사

중금속, 그 중에서도 카드뮴과 납은 자연적으로, 혹은 오염에 의해 일사 어디에서나 검출될 수 있는 유해물질이다. 카드뮴과 납과 관련된 연구는 다양하나, 대부분이 단일 경로에 대한 노출 평가만을 실시하였으며, 통합 노출 평가에 대한 연구는 미진하다. 특히 경로 별이나 통합 위해 평가에 대한 연구는 더욱 부족하다. 따라서 본 연구에서는 다경로 노출량 추정 및 통합 위해평가를 실시하여 주요 노출원 파악 및 위해 정도를 분석하고자 하였다. 제7기 국민건강영양조사의 대상자를 바탕으로 개개인이 식품, 물, 호흡, 흡연, 화장품 그리고 여성용 위생용품으로부터 노출 될 수 있는 카드뮴과 납의 중금속 노출량 추정을 실시하였다. 경로 별 카드뮴, 납의 농도는 국내외 발표된 자료를 적용하였다. 식품의 노출량은 24시간 회상 자료를 바탕으로 추정하였다. 물은 먹는 물과 음식 중 포함된 물의 양을 환산하였다. 공기는 개인의 성별, 직업에 따라 활동 시간을 다르게 적용하였으며, 호흡률 또한 보고된 나이 및 활동량을 바탕으로 서로 다른 호흡률을 적용하였다. 물과 공기 중 중금속 농도는 시도에 따라 다르게 적용하였다. 화장품과 여성용 위생용품은 사용 빈도와 사용량을 고려하여 노출 시나리오를 구성하였다. 통합 위해 평가는 국내외 발표된 독성 값을 바탕으로 Aggregate Risk Index, Total Exposure Hazard Index, Excess Cancer Risk를 이용하여 실시하였다. 노출량 추정 결과 카드뮴과 납 모두 경구 노출, 특히 식품이 가장 큰 노출원이었다. 이외에도 흡연을 통한 담배 노출 또한 주요 노출원 중 하나였다. 납은 오히려 피부 노출이 노출의 상당 부분을 차지하였다. 비발암성에 대한 통합 위해 평가 결과 중간값에서는 카드뮴과 납 모두 안전한 수준이었다. 그러나 경구 노출은 카드뮴과 납 모두 95th 노출 집단에서 안전 기준을 초과하였으며, 카드뮴은 흡기 노출 또한 안전 기준을 초과하였다. 거주 지역의 차이는 경로 별 노출량의 차이를 보이지 않았다. 특별한 차이는 발견되지 않았다. 다른 남성은 여성에 비해 높은 경구, 흡기 노출을 보였다. 10대는 높은 호흡률과 체중 대비 높은 섭취량으로 다른 연령대에 비해 중금속에 높게 노출되었다. 카드뮴은 가임기 여성에게 더 높게 노출되었으며, 납은 비가임기 여성에게서 더 높은 노출량을 보였다. 결과적으로 카드뮴과 납의 관리는 식품 중 오염량을 중심으로 관리하는 것이 바람직하나 카드뮴의 경우 담배로 인한 카드뮴의 흡기 노출 또한 기준치를 초과하였으므로, 이에 대한 지속적 연구가 요구된다 본 연구는 기존 연구와 달리 환경 전반에 걸친 노출량 추정을 실시하였다. 또한 경로 별 다른 독성값을 적용하여 위해 평가를 실시하였다는 점에서 의의를 가진다. 다만, 개인 별 모니터링 자료의 한계로 많은 가정을 사용하였으며, 이를 극복하기 위한 추가적인 조사 연구가 요구된다. Heavy metals, like cadmium or lead, are ubiquitous and known to be hazardous. Thus, aggregated risk assessment is necessary to try and prevent unpredictable hazards. In this study, estimation of cadmium and lead exposure via different mediums, including food, water, air, cigarettes, cosmetics, and female hygiene products, was conducted for 10,733 subjects enrolled in the ‘7th Korea National Health and Nutrition Examination Survey’. Dietary exposure was estimated from 24hr recall data. The type of water was classified into the following 3 categories: tap, bottled, and public water. Daily life pattern based on career and age was applied towards estimating respiratory exposure. The frequency and volume of cosmetic usage were randomly applied based on sex and age data. It was assumed that women of childbearing age were using female hygiene products. Aggregated risk assessment for non-carcinogenic toxicity was carried out using ‘Aggregate Risk Index’ and ‘Total Exposure Hazard Index’. To estimating the risk of cancer, method of calculating ‘Excess cancer risk’ method was used. From the analysis, food was identified as the major route for cadmium and lead exposure. Smoking was also associated with high cadmium exposure. Interestingly, estimated lead exposure from cosmetics was higher than inhalational lead exposure. Based on the aggregate risk assessment, the levels of oral and inhalational exposure of cadmium in the 95th percentile exposure group were hazardous. However, for lead, only the level of oral exposure in the 95th percentile exposure group was a public health concern. Sex, age, smoking status, and income affected the exposure levels. In conclusion, food was the main source of cadmium and lead exposure. Hence, the levels of heavy metals in foods should be strictly managed for public health and safety. Other exposure sources, such as toys and medicines, should also be researched to avoid unpredictable hazards.

인간유방암세포인 MCF-7 세포주에서 카드뮴 및 비소의 독성유발에 관한 연구

최은희 숙명여자대학교 교육대학원 2007 국내석사

카드뮴 및 비소는 다양한 세포와 장기에서 독성을 유발시킨다는 연구보고가 있으며, 인체와 동물에서 많은 독성연구가 진행 중에 있다. 그러나 카드뮴 및 비소에 대한 독성기전과 에스트로겐 수용체와의 상관성에 대해서는 아직까지 명확히 밝혀지지 않았다. 따라서 본 연구에서는 에스트로겐 수용체를 함유하는 세포인 MCF-7 세포를 이용하여 카드뮴 및 비소에 대한 독성영향 및 에스트로겐 수용체와의 상관성을 조사하고자 하였다. 카드뮴 및 비소에 대한 세포독성 평가를 위해 MCF-7 세포에 대한 IC50수치를 조사한 결과 카드뮴(55.54 μM)과 비소(123.02 μM)간의 차이를 나타냈으며, DAPI 염색, DNA fragmentation 및 FACS 분석을 통해 세포사가 농도 의존적으로 증가 되는 것을 확인하였다. 카드뮴 및 비소 처리 시 ERE luciferase 활성을 측정한 결과 카드뮴이 50 μM에서 에스트로겐 활성을 나타낸 것에 반하여, 비소의 경우는 활성을 나타내지 않았다. 카드뮴 및 비소에 의해 유도된 독성유발과 관련된 유전자 발현 변화를 조사한 결과 두 가지 중금속 모두에서 산화적 스트레스 작용 관련 유전자(heme oxygenase 1, selenoprotein, thioredoxin 2, heat shock protein, methllothionein) 발현이 공통적으로 증가하였다. 비교할만한 점은 비소를 처리한 경우에는 세포성장 및 신호전잘 관련 유전자(Insulin-like growth factor 1 receptor, WNT, ARNT, NFκB)가 증가하였다는 것이다. 카드뮴 및 비소에 의해 c-Jun N-terminal kinase(JNK) 및 JNK에 의존적인 AP-1 전사인자(c-Jun, c-Fos) 단백질 발현이 농도 의존적으로 증가 되었다. NFκB 단백질 발현은 카드뮴 처리 시 변화를 보이지 않았으나 비소 50 μM 처리 시 약 2 배 증가하였다. 카드뮴에 대한 항산화제의 세포독성 경감에 관한 연구 결과 MCF-7 세포에 카드뮴 50 μM 처리 시 세포사 유발을 나타냈으나 selenium (Se), butylated hydroxyanisole(BHA), glutathione(GSH) 및 N-acetyl-L-cysteine(NAC)와 같은 항산화제에 의해 세포사 유발 감소를 나타냈으며, 세포 생존율도 회복되었다. 비소의 경우에는 GSH만이 세포독성이 회복되었다. 카드뮴 및 비소에 의해 유도된 세포사 및 JNK, c-Jun, c-Fos 단백질 발현 증가는 항산화제에 의해 회복 되어 짐을 확인하였다. 본 연구 결과 에스트로겐 수용체를 함유한 세포에서 카드뮴 및 비소에 의해 유도된 세포사는 JNK/AP-1 기전을 통해 유도 되어지는 것으로 사료 되며, 카드뮴은 에스트로겐 수용체 발현에 의존적으로 세포사를 유도하는 것으로 사료된다. 또한, 항산화제와 에스트로겐 수용체 길항제를 동시에 처리할 경우 카드뮴에 유도된 세포가 경감효과가 관찰되었다. 따라서 에스트로겐 수용체 함유세포에서의 카드뮴 독성은 항산화 물질의 보충과 함께 에스트로겐 수용체의 활성화를 저해함으로써 보다 세포 독성을 효과적으로 경감될 수 있을 것으로 사료된다. 특히, 비소는 에스트로겐 수용체에 비의존적이었으며, 세포사 유도에 따라 WNT 및 ARNT 단백질 발현량을 증감시켰지만 카드뮴 처리 시 변화가 없었다. 따라서 비소에 의해 유도된 세포사는 카드뮴의 에스트로겐 수용체 의존적 세포사 유도와는 다르게 WNT 및 ARNT에 의존적 유발 가능성을 제시하였다. It is reported that cadmium and arsenic are causing toxicity in internal organs and various cells. Many researches on toxicity are going on through human and animal bodies. However, it didn't become clear about the relation between an estrogen receptor(ER) and toxic electromotive. that is why I decided to research about relations between ER and toxic effect on Cadmium and Arsenic using MCF-7 cell that includes ER. As a result on numeral value of MCF to estimate cell-toxicity of Cadmium and Arsenic, there was a difference between Cadmium(55.54 μM) and Arsenic(123.02 μM) and I could see the death of cells get increased depending on density by DAPI dyeing, DNA fragmentation and FACS analysis. I got a result on activity of ERE luciferase when treating Cadmium and Arsenic, which is that Arsenic is not active while Cadmium is active in 50μM. Through studying toxic induction cause by Cadmium and Arsenic and a change relevant to DNA revelation, I could see that both heavy metals got increased DNA revelation related to oxidation stress action in common. (heme oxygenase 1, selenoprotein, thioredoxin 2, heat shock protein, methllothionein) A bit distinguished difference is that Insulin-like growth factor 1 receptor, WNT, ARNT, NFκBincreased in a case of treating Arsenic. Protein revelation of c-Jun N-terminal kinase(JNK) and AP-1(c-Jun, c-Fos) depending on JNK got increased by Cadmium and Arsenic more density-dependently. NFκBprotein revelition didn't change be treatment of Cadmium but it doubled by treatment of Arsenic. a consequence taken by research on reduction cell-toxicity of anti-oxidator toward Cadmium is that the death of cell was inducted when cells got treated by Cadmium 50 μM. Also, the death of cells was decreased by anti-oxidator such as selenium (Se), butylated hydroxyanisole(BHA), glutathione(GSH) and N-acetyl-L-cysteine(NAC) and recovered survival rate of cells. In a case of Arsenic, only GSH was recovered cell-toxicity. The death of cells caused by cadmium and Arsenic and an increase of JNK, c-Jun, c-Fos protein induction are recovered by anti-oxidator. In conclusion, the death of cells caused by Cadimium and Arsenic in cells including ER inducted by JNK/AP-1 and Cadmium induct the death of cells depending on revelation of ER. Futhermore, cells inducted by Cadmium are reducted when anti-oxidator and ER antagonizers are treated at the same time. Therefore, cadmium toxicity in cells including ER hinders activity of ER supplementing anti-oxdators, which make the reduction of cell-toxicity effectively. Especially, Arsenic was not dependent on ER and make WNT and ARNT protein revelation rate higher but didn't changed when treated by Cadmium. Therefore, the death of cells increased or decreased by Arsenic present the possibility of depending induction on WNT and ARTN differently form Cadmium's that is depending on ER.

카드뮴에 노출된 붕어의 메탈로치오닌 유전자 발현 및 조직학적 변화에 관한 연구

남성숙 연세대학교 대학원 2003 국내박사

급속한 공업화와 인구의 도시집중 및 소비증가 등으로 인하여 여러 형태의 다양한 오염물질이 생태계 및 인체에 심각한 영향을 미치게 되었다(Shroeder., 1977, Elinder G., 1986). 특히, 카드뮴, 납, 수은 및 크롬 등 중금속에 의한 생태계 악영향은 그 산업화 과정에 필연적으로 나타나는 환경오염의 결과로서 최근에는 그 위해성에 대한 우려가 날로 증가하고 있는 실정이다. 하천 생태계에 서식하는 생물 중 어류는 미량의 카드뮴에 노출될 경우에도 조직 손상, 척추 변형, 호흡기관 병변 등의 독성학적 영향을 받아 결국 치사에 이르게 된다 (Sorensen, 1991). 하천 생태계에 배출된 카드뮴은 생물농축의 경로를 따라 더욱 높은 농도로 인체에 노출되게 되며 따라서 하천의 오염농도에 의한 생물체의 영향을 평가하는 데는 한계가 있으며 본질적으로는 생태계 및 인체에 미치는 영향을 생물학적으로 평가할 수 있는 생체내 지표의 개발이 필요한 실정이다. 이는 기존의 화학적 분석방법만으로는 오염수준의 고저만을 평가할 수 있을 뿐 오염된 수준이 정확히 인체에 미치는 독성학적 영향을 평가하는 데는 한계가 있기 때문이다. 이러한 문제를 인식하고 본 연구에서는 중금속에 특이적으로 유도되며 이에 결합하는 메탈로치오닌 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 이용하여 중금속 오염을 평가할 수 있는 생물학적 지표를 개발하고자 하였다. 아울러 조직학적 병변과 유전자지표의 변화를 상호 비교함으로써 각 생물학적 지표의 특성을 분석, 이를 상호 보완할 수 있는 방법론을 모색하고자 하였다. 이를 위해 본 연구에서는 우선 crucian carp (Carassius auratus) cDNA 염기 서열과 genomic DNA의 염기서열을 확인하고 이를 바탕으로 PCR 방법에 의한 유전자 발현의 평가기법을 확립하고자 하였다. 기존의 어류 메탈로치오닌 염기서열을 바탕으로 적정 primer를 합성한 후 이를 이용하여 증폭, 클로닝하여 붕어 메탈로치오닌 cDNA와 gDNA의 전체 염기서열을 확인한 결과 405bp의 gDNA 유전자 염기서열과 183bp에 해당하는 cDNA 염기서열을 확인하였으며 cDNA 서열을 바탕으로 60개의 아미노산 1차구조를 확인하였다. gDNA의 구조를 분석한 결과 3개의 exon과 2개의 intron 구조로 이루어졌으며, 이중 exon 1, 2, 3은 각 각 25, 66, 92bp로 구성되어 있음을 알 수 있었다. 붕어 메탈로치오닌 단백질은 기존의 메탈로치오닌과 마찬가지로 Cystein이 풍부한 펩타이드 구조를 이루고 있었으며 6개의 Cys-X-Cys 형태로 배열된 총 20개의 cystein을 확인하였다. 메탈로치오닌 유전자 발현을 평가하기 위해서는 먼저 붕어의 메탈로치오닌 cDNA 염기서열을 기본으로 적정 PCR 프라이머를 합성한 후 RT-PCR법을 이용하였다. 즉, 메탈로치오닌 유도량을 측정하기 위해 붕어를 25일 동안 0.01, 0.1, 0.5mg/L 농도의 카드뮴에 노출시키고 간, 신장, 아가미 조직으로부터 RNA를 추출한 후 RT-PCR을 수행, 얻어진 cDNA를 가지고 합성한 primer쌍을 이용하여 PCR을 실시한 후 그 산물을 전기영동하여 최종적으로 메탈로치오닌 유전자의 발현을 확인, 비교하였다. 그 결과 아가미가 청정조건에서는 간이나 신장과 달리 매우 낮은 농도 수준으로 발현되고 카드뮴 노출시 간이나 신장과 비교하여 아가미는 메탈로치오닌 mRNA 유도에 있어 가장 민감한 조직으로 확인되었다. 한편, 아가미에서 카드뮴함량은 중금속농도와 노출기간동안 증가한 반면, 메탈로치오닌 mRNA 농도는 1일 후에 급격하게 증가하였고 시간이 지남에 따라 점점 감소하였다. 아가미에 있어서 메탈로치오닌 mRNA 유도는 카드뮴 축적량과 정확히 일치되지는 않는 것으로 나타났다. 붕어의 아가미에 있어서 조직학적 변화와 카드뮴 축적량과의 상관성을 확인하기 위해 0.01, 0.1, 0.5㎎/L의 카드뮴 농도에서 25일간 노출 후 조직을 적출하여 H-E 비교염색과 AB-PAS 반응염색을 시켰다. 조직학적 변화도 점액세포의 산성화, 새판 상피세포의 비후, 이차세엽의 비대, 핵응축 등이 나타났다. 이는 보편적으로 나타나는 어류 아가미 조직에서의 조직병리학적 변화와 같음을 알 수 있었다. 카드뮴을 단독 오염원으로 사용하여 아가미의 조직학적 변화와 조직내 축적 정도와의 상관관계를 살펴보면, 노출 농도별 노출 시간이 경과함에 따라 아가미에 축적되는 양은 증가함을 알 수 있었으며 노출농도가 서로 다를 지라도 아가미에 축적된 카드뮴의 양이 유사할 경우에는 조직학적 변화 양상도 유사하게 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 또한 아가미 점액세포의 산성화는 카드뮴 축적 양이 5㎍/g 이상에서 나타나는 조직병리학적 증상으로 확인되었는데 이와 같이 조직학적 변화와 카드뮴 축적량과의 상관성을 이용하면 카드뮴 오염지역에 서식하고 있는 붕어에서 아가미의 조직학적 변화를 관찰해 봄으로써 그 지역의 카드뮴 오염정도를 예측할 수 있을 것으로 사료된다. 그리고 아가미 조직내 축적된 카드뮴의 농도에 따른 조직병변과 메탈로치오닌 유전자의 발현과의 상관관계를 살펴보면, 붕어의 경우 조직학적 병변이 나타나지 않는 저농도에서는 메탈로치오닌이 민감하게 발현됨을 확인할 수 있었으므로, RT-PCR 기법과 같은 분자생물학적인 방법이 조직병리학적 변화 양상보다 환경오염원을 보다 민감하게 모니터링 할 수 있는 방법이라 사료되나 카드뮴 축적량과 메탈로치오닌 발현량과는 상호연관이 없는 것으로 나타났으므로, 카드뮴 축적량이 비슷할 경우, 조직학적 변화양상도 비슷하게 나타난 결과를 볼 때, 메탈로치오닌 유전자의 발현과 조직병리학적 변화의 두 지표는 오염지역이나 오염농도에 따라 상호보완적이라 할 수 있겠다. 이로써 본 연구 결과는 메탈로치오닌 유전자의 발현정도와 조직병변 및 생물농축과의 상관관계를 통해 카드뮴이 생태계에 미치는 영향을 보다 민감하게 평가할 수 있는 분자생물학적 방법을 확립하였고, 조직병리학적 병변과 유전자 지표 발현과의 상호보완관계를 확인하였다. Metallothioneins (MTs) are a class of inducible metal-binding proteins characterized by low molecular mass (6000-10,000 Da) and lay a major role in detoxification of heavy metals. They are known to be induced by heavy metals in various organs of different species and represent a potential biomarker of aquatic contamination of heavy metals. In this work, cloning and sequencing of a metallothionein gene in crucian carp (Carassius auratus) were done and sensitivities of metallothionein gene expressions in the different tissues of crucian carp to cadmium exposure were compared. Metallothionein gene, lacking 5 promoter region, is 405 bp long and has a tripartite structure consisting of three exons and two introns. The putative open reading frame (ORF) encodes cysteine rich (20 cysteins) polypeptide of 60 amino acids containing 6 Cys-X-Cys motifs, typically found in this protein family. It was found that metallothionin mRNA of gills was not expressed in non-treated fish whereas those of liver and kidneys were detected in the same group by RT-PCR technique using appropriate primers based on the DNA sequence. mRNAs were induced after one-day exposure of cadmium in all the tissues but the expression was most sensitive in gills. In the comparative study of the metallothinein mRNA induction with the histopathological changes of gills during the exposure period of 25 days, any distinct histopathological changes in gills were not observed in one day-cadmium treated fish in which metallothionein mRNA was induced. However, the mRNA levels were decreased after one day as the cumulative cadmium concentration was increased during the rest of exposure period. These results suggested that metallothionein gene expression in gills of crucian carp, Carassius auratus, is a good biomarker to monitor the cadmium contamination on freshwater fish where histological changes are not shown.

카드뮴 투여시 흰쥐 간장에서 증가하는 중금속 결합단백질의 정제 및 성상에 관한 연구

오철 한양대학교 1992 국내석사

Effect of Cadmium on Immune System and Enzyme Activities in BALB/c Mice : 카드뮴이 마우스의 면역계 및 효소활성에 미치는 영향

윤창용 전북대학교 대학원 1995 국내박사

본 연구는 카드뮴(CdCl₂)에 장기간 노출시 생체면역계 및 효소활성에 미치는 영향을 평가하기 위하여 실시되었다. 카드뮴이 면역계에 미치는 영향의 평가는 BALB/c 마우스를 대상으로 0(대조군), 25(A군), 50(B군), 100(C군), 200(D군) ppm의 카드뮴이 첨가된 음료를 6-7주간 자유급수시킨후, 비장내 Th 세포 및 Ts 세포의 분포, 복강대식세포의 탐식능, 비장세포의 Con A 및 LPS자극에 의한 증식능, 면양적혈구에 대한 항체생산능 등을 측정하여 실시하였다. 한편, 카드뮴이 효소활성에 미치는 영향의 평가는 간 및 신장의 카드뮴 축적 정도에 따른 LDH와 SOD의 활성 변화를 측정하여 실시하였다. 체중 중가율은 대조군에서는 28.46±13.35%이었으나, A, B, C 및 D군에서는 각각 29.58±9.73%, 28.71±3.84%, 20.25±8.13% 및 17.74±9.87%로 나타났다. 비장지수(mg/g)는 대조군이 4.34±0.23이었으며, A, B, C 및 D군은 각각 4.20±0.54, 4.80±0.87, 4.25±0.32 및 4.40±0.32이었다. 또한 총비장세포수는 대조군에 비해 A, B, C 및 D군에서 각각 15.57±8.49%, 35.92±8.67, 19.34±13.17% 및 22.91±15.25% 증가하였다. 총 CD₄^+ 세포수(×10^7)는 대조군이 9.15±2.24인데 비하여 A, B, C 및 D군은 각각 10.40±2.04, 12.04±3.08, 10.20±3.16 및 10.80±1.48이었으며, 총 CD_8^+ 세포수(×10^7)는 대조군이 2.32±0.56, 각 처리군에서는 2.54±0.27, 3.12±0.80, 2.25±0.70 및 2.24±0.28이었다. 한편, CD₄^+/CD_8^+ 비율은 B군(4.17±0.81)을 제외한 모든 실험군에서 대조군(3.97±0.02)에 비해 유의하게 증가하였다(p<0.001). 카드뮴 처리군의 SRBC에 대한 복강대식세포의 탐식능은 A 및 B군에서는 대조군에 비하여 유의하게 높았으나(p<0.05 및 p<0.01), C 및 D군에서는 대조군과 유사하였다. 비장림프구의 Con A 및 LPS자극에 의한 증식반응은 LPS로 자극시는 카드뮴 농도에 비례하여 억제되었다. 그러나 Con A로 자극시는 고농도카드뮴 존재하에서는 억제되었으나 저농도(10^-7 - 10^-6 M)에서는 증가된 양상을 보였다. 카드뮴에 의한 비장세포의 세포독성은 10^-4M에서 높았다. 1차 면역동물 비장세포중 용혈반형성 세포수(×10³)는 대조군(452.73±96.69)에 비하여 모든 실험군에서 유의하게 감소하였다(p<0.01). 그러나 2차 면역동물 비장세포중 용혈반형성 세포수(×10³)는 대조군(187.57±53.99)에 비하여 실험군에서 다소 증가하였다. 2차 면역반응에서의 SRBC에 대한 총항체가는 대조군에 비하여 실험군에서 증가하는 경향을 보였으며, IgG 항체반응은 B군을 제외하고 모든 실험군에서 증가하였다. 혈청내 IgG₁ 및 IgE농도는 대조군에 비하여 모든 실험군에서 증가하였는데, 특히 IgG₁의 증가가 저명하였다. 간 및 신장에서의 카드뮴 축적도는 투여량이 증가될수록 높았으며, 특히 신장에서 더욱 높았다. 간장과 신장의 lactate dehydrogenase(LDH) 활성치는, 신장의 경우 농도가 증가할수록 활성치도 증가하였으나 간에서는 C군까지는 농도에 비례하여 활성치도 증가하였다가 D군에서는 A군 수준으로 회복되었다. Superoxide dismutase(SOD)활성은 A군의 간장에서 유의한 상승치를 보인 것을 제외하고는 대조군의 간 및 신장의 활성치와 유사한 결과를 보였다. 이상의 결과는 카드뮴이 농도에 따라서 생체내의 세포성면역에서 중요한 역할을 담당하는 대식세포와 T세포아군의 기능 또는 분포도 등을 변화시킴으로써 항체생산능을 포함하는 면역계 및 LDH와 SOD와 같은 효소계의 활성에 영향을 미칠 수 있음을 시사한다. This study was designed to investigate the effects of Cadmiun(Cd) feeding on the water consumption, body weight, spleen index, number of splenocytes including total CD₄^+ and CD^+_8 cells, phagocytosis of macrophages, cytotoxicity against splenocytes, mitogen-induced proliferation of splenocytes, PFC-response, Ig production, Cd-accumulation in liver and kidney, and enzyme activities such as LDH and SOD in liver and kidney in BALB/c mice. Mice were fed ad libitum with one of 4 doses ranging from 25-200 ppm of Cd for 6-7 weeks. Water consumption and gain of body weight were not influenced at low concentrations of Cd, but reduced at high concentrations of Cd. There was no difference in spleen index between Cd-fed groups and control group with exception of increasing index of 50ppm Cd-fed group. Both total splenocytes and CD₄^+ cells were somewhat increased in all Cd-groups as compared with control. While total CD^+_8 cells in Cd-fed groups were slightly increased at low concentrations of Cd but decreased at high concentrations of Cd resulting increment of CD₄^+/ CD^+_8 ratio in those groups. Phagocytosis of macrophages was also increased in low Cd-groups. Strong cytotoxic effects of Cd was shown at the concentration of 10^-4M. While proliferation responses of LPS-activated splenocytes were decreased by Cd, in a dose dependent fashion, but that of Con A-activated cells was slightly increased at the concentrations of 10^-7M-M^-10M of Cd. Primary Ig-responses and Ig M-PFC responses were significantly decreased, but secondary antibody response and Ig-PFC responses were slightly increased. Cd accumulations in liver and kidney were increased in a dose dependent fashion. And also, this pattern was more conspicous in kidney than that in liver. LDH activities of liver and kidney were increased in dose dependent fashion except for that of liver in high Cd-group which was similar to that of low Cd-group. SOD activities of Cd exposed liver and kidney of Cd-fed mice were similar to those of controls except for elevation of SOD activity of liver in low-Cd group. Taken together, it was shown that Cd might affect humoral immune responses by modifying the distribution and function of cells playing in the cellular immune responses. And also, it was indicated that Cd could modulate the activities of various enzymes such as LDH and SOD.

카드뮴이 마우스 뇌에서 아연의 항상성에 관여하는 유전자 발현에 미치는 영향

남상훈 順天鄕大學校 大學院 2005 국내석사

본 연구는 카드뮴을 마우스 복강에 투여하여 혈중 및 조직 중의 카드뮴 함량을 측정하고, 뇌에서 MT-Ⅰ및 MT-Ⅱ의 발현에 미치는 영향을 관찰함으로써 카드뮴의 중추신경계에 대한 독성작용 기전을 규명하고 카드뮴의 독성과 아연의 항상성의 관련성을 규명하고자 연구를 수행하였다. 카드뮴(CdCl2)을 마우스 복강에 농도별(0, 2, 4, 8mg/kg)로 2ml씩 투여하고 4시간 후에 경추이탈시킨 뒤에 혈액채취와 조직(간, 신장, 뇌)을 카드뮴 함량 측정용과 유전자 발현 측정용으로 분리하여 적출하였다. 혈중 카드뮴의 함량은 대조군에서는 거의 존재하지 않았고, 8mg/kg 투여군에서 256.9±16.7㎍/㎗로 카드뮴의 투여량에 비례하여 증가되었다. 신장 및 간에서의 카드뮴의 함량은 대조군에서는 거의 존재하지 않았고, 8mg/kg 투여군에서 각각 6.18±0.20㎍/g와 9.25±2.06㎍/g으로 카드뮴의 투여량에 비례하여 용량 의존적으로 증가하였다. 두 기관은 카드뮴의 주된 축적기관으로 알려져 있는데, 본 연구에서도 카드뮴이 용량 의존적으로 축적되는 것으로 관찰되었다. 뇌에서의 카드뮴의 함량은 대조군에서 0.04±0.01㎍/g이었으며, Cd 8mg/kg 투여군은 0.36±0.02㎍/g으로 카드뮴 투여량에 용량 의존적으로 증가되었다. 카드뮴은 마우스 간과 신장에서 MT-Ⅰ및 MT-Ⅱ 유전자 발현을 전사단계에서 증가시키고, 세포내 아연의 유출자로 작용하는 ZnT-1은 발현이 감소하였다. 마우스 뇌내에서 카드뮴은 용량 의존적으로 MT-Ⅰ의 발현을 증가시켰으나, ZnT-1의 발현은 억제하였다. 따라서, 카드뮴에 의해 발현이 증가된 MT-Ⅰ및 MT-Ⅱ가 아연을 섭취함으로써 세포내 자유 아연의 감소를 초래하고 결국 아연 유출자인 ZnT-1은 발현이 감소되는 것으로 판단된다.

카드뮴에 의해 변화된 Arabidopsis thaliana 유전체에 대한 RAPD 패턴 분석 연구

이주희 한국교원대학교 교육대학원 2009 국내석사

Cadmium not only cause disease, but also the inhibition of plant growth. It is very harmful heavy metal to human health which can interfere with metabolism of the cells. Cadmium can affect the structure and function of DNA. Therefore it can induce the changes of genomic stability. In this study, the changes of genomic stabilty induced by cadmium stress was analyzed using RAPD in Arabidopsis thaliana. The growth rate of root was measured after growing Arabidopsis thaliana on Murashige and Skoog(MS) medium for 7 days, which was transferred to MS medium containing 0-6mg/L of cadmium and cultured more for 3 or 7 days. DNA was extracted from the plants, which were treated by cadmium for 7 days, and then used for RAPD analysis. The higher concentration and longer treatment of cadmium showed the more decoloration of leaves and severe inhibition of root growth. Using 9 different primers, it was found that there are much changes in RAPD pattern from Arabidopsis thaliana treated by cadmium. Without cadmium treatment, primer OPB7 showed the highest number of DNA bands and primer OPB1 showed the least number of bands. With cadmium treatment, primer OPB10 showed the most high number of new bands. In the lowest concentration of 0.75mg/L, every primer showed the most of original bands and has only small changes. The highest number of original bands disappeared from the genome of plants treated by cadmium of 1.5 mg/L. There are biggest changes in RAPD pattern showing most number of appearnce of new bands and disappearnce of original bands from the plant treated by 3.0mg/L of cadmium. It means this treatment of cadmium induced the most changes of genomic stability. In conclusion, it was found that genomic stability can be changed by cadmium treatment in Arabidopsis thaliana. The different primer showed different pattern of RAPD at different concentration of cadmium treatment. Therefore RAPD analysis will be useful tool to check the changes of genomic stability induced harmful heavy metals. 카드뮴은 유기체에 노출되면 질병의 원인이 될 뿐만 아니라 식물의 생장을 저해하고 세포의 대사 작용을 방해하므로 사람과 식물 건강에 아주 해로운 중금속이다. 카드뮴은 DNA의 구조와 기능에 영향을 미쳐 genome의 안정성에 변화를 유발한다. 이 연구에서는 애기장대(Arabidopsis thaliana)가 카드뮴 스트레스에 의해 어떤 영향을 받는지 RAPD를 이용해 genome의 전반적인 stability 변화를 보고자 하였다. Murashige and Skoog(MS) 배지에서 7일 키운 애기장대의 유식물을 0-6.0mg/L의 카드뮴이 처리된 배지에 옮겨 3일과 7일 더 배양시킨 개체들의 성장정도를 관찰하고, 7일 처리된 개체들의 DNA를 추출하여 RAPD를 수행하였다. 카드뮴의 농도가 높고, 카드뮴 처리 배지에서 배양시간이 길수록 잎의 탈색정도가 심해지고, 뿌리의 생장속도가 느려졌다. 카드뮴 배지에서 7일 배양한 애기장대의 유식물에서 추출한 genomic DNA를 9종류의 primer를 이용해 RAPD를 실시한 결과 RAPD 패턴의 많은 변화를 확인하였다. 정상적인 MS배지에서는 primer OPB7이 가장 많은 수의 밴드를 나타냈고 primer OPB1이 가장 작은 수의 밴드를 나타냈다. 카드뮴의 농도별 배지에서는 primer OPB10이 가장 많은 수의 새로운 밴드를 나타냈다. 카드뮴처리 농도별 배지에서는, 가장 낮은 농도인 0.75mg/L에서 모든 primer가 대부분 원래 있었던 밴드를 유지하면서 조금씩의 변화를 보였다. 1.5mg/L 농도의 카드뮴이 처리된 배지에서 생장한 개체의 genome에서 변화가 심하게 나타나는데 가장 많은 수의 밴드가 사라졌다. 카드뮴 농도 3.0mg/L에서는 새롭게 출현하고 사라지는 밴드들이 가장 활발하게 나타남으로서 genome 안정성에 가장 큰 변화가 일어남을 확인할 수 있었다. 본 연구 결과 애기장대의 성장에 방해가 되는 농도의 카드뮴 처리에 의해 genomic stability에 큰 변화가 생기는 것을 확인할 수 있었다. 그리고 사용된 primer의 종류에 따라 RAPD의 stability 양상이 달랐다. 이런 결과는 RAPD를카드뮴의 농도에 따른 애기장대의 genome stability의 변화를 측정하는 생물학적 마커로 사용할 수 있을 것이다.

카드뮴에 의해 유도 발현되는 유전자의 탐색 및 동정

신혜진 세종대학교 대학원 2003 국내석사

중금속인 카드뮴은 산업·환경오염 물질로 인간이나 동물의 신장, 간, 폐를 포함하는 다양한 기관에 병변을 초래한다. 카드뮴은 1993년 국제발암학회인 IARC에서 암유발원으로 분류하였고, 호흡기를 통해 폐에 흡수되면 폐기종이나 폐암을 유발하는 것으로 보고되고 있다. 특히, 폐는 호흡기관으로 카드뮴의 독성 노출에 가장 민감한 1차 기관이다. 이에 본 연구 논문에서는 카드뮴의 독성 기전을 분석하기 위하여 카드뮴에 의해 발현이 유도되는 유전자를 탐색하고자 한다. 먼저 카드뮴에 의한 세포 독성 효과를 사람 말초 혈액 단핵 세포구(PBMCs)와 사람의 폐 정상세포(WI-38), 암세포(A549)를 이용하여 분석하였다. 카드뮴은 폐 세포에서 DNA 단편과 염색체 응축을 동반하는 세포 고사(Apoptosis) 현상을 유발하였다. 이때 발현이 증가되는 유전자를 분석하기 위하여 사람 말초 혈액 단핵 세포구 카드뮴에 노출시킨 후 PCR-selected suppression subtractive hybridization (SSH) 기술을 사용하였으며, 그 결과 29개의 유전자를 확인할 수 있었다. 이들 유전자는 MIF, LPPAT-a, Enolase-1a, VEGF, Bax, Nor-1 등을 포함하며 염증 반응과 세포 생존·증식 그리고 세포고사에 관여하는 것으로 알려지고 있다. 밝혀진 유전자 중에 Nor-1은 Nurr1과 함께 고아 핵 수용체인 Nur77 그룹(subfamily)에 속하며, 세포 고사 과정에서 중요한 역할을 한다고 보고되고 있다. 따라서 Nur77 그룹 단백질이 폐 카드뮴 유도 세포고사에 미치는 영향을 분석하였다. Nur77은 전사 수준과 단백질 수준에서 증가되는 것을 RT-PCR과 Western Blot으로 확인하였다. 또한 이때 Nur77의 발현은 PKA 신호 전달 과정의 영향을 받는 것을 확인하였다. 마지막으로 카드뮴 독성 효과를 쥐(wister rats)를 이용하여 in vivo에서 확인하였을 때, 폐 조직에서 세포고사가 일어남을 TUNEL 분석방법으로 알 수 있었다. 말초 혈액 단핵 세포구와 폐 조직을 분리하여 Nur77의 발현이 전사 수준과 단백질 수준에서 증가함을 RT-PCR과 면역조직염색 방법으로 알 수 있었다. 따라서 SSH 방법으로 탐색된 유전자들의 발현양상이 세포 수준과 동물 모델에서 재현된다는 것을 알 수 있으며, 본 연구 결과로 얻어진 유전자들로 카드뮴 유도 폐 독성의 기전을 밝히고 더 나아가 카드뮴 독성 지표로 활용할 수 있을 것으로 사료된다. The heavy metal cadmium is a xenobiotic toxicant of environmental and occupational concern and it has been classified as a human carcinogen. Cadmium is industrial and environmental pollutant that affects adversely a number of organs in humans and other mammals, including the kidneys, liver, lungs, pancreas, testis, and placenta. The lungs, which are the primary organs involved in the respiratory organs of systemic cadmium, are especially sensitive to the toxic effects of cadmium. Inhalation of cadmium has been implicated in the development of emphysema and pulmonary fibrosis, supporting a role of cadmium in human lung cancer. In the present study, I was investigated cytotoxic effects of cadmium on PBMCs and lung cell lines. A significant cytolethality was observed in PBMCs and lung cell lines, WI-38 and A549 by cadmium exposure in a time-and concentration-dependent manner when measured by MTT assays. Cadmium induced morphological change, chromosomal condensation and DNA fragmentation in the lung cell lines. Next, I aimed to identify the genes that are induced after cadmium exposure to investigate the mechanism of cadmium toxicity. For this purpose, I employed the polymerase chain reaction-based suppression subtractive hybridization technique. I identified 29 different cadmium-inducible genes in human peripheral mononuclear cells. These genes included are macrophage migration inhibitory factor, lysophosphatidic acid acyltransferasea, enolase-1a, VEGF, Bax, and neuron-derived orphan receptor-1, which are known to be associated with inflammation, cell survival, proliferation and apoptosis. Induction of these genes by cadmium treatment was further confirmed by semi-quantitative reverse-transcription polymerase chain reaction. One of those genes, the Nor-1 is a member of the Nur77 (NGFI-B) and Nur-related factor 1 (Nurr1) constitute the orphan nuclear receptor subfamily of transcription factors. I found that these genes were induced after cadmium exposure in normal human lung fibroblast cell line, WI-38. Following CdAc (20 mM) treatment for 6 h, RT-PCR and Western blot analysis demonstrated that cadmium transiently induced Nur77 transcripts and protein level. Notably, protein kinase inhibitor H-89 and PD98059 strongly inhibited the induction of cadmium-mediated Nur77 gene expression in A549 cells. In addition, the reporter containing Nur77 binding sequence was activated by 2.5-fold after exposure to CdAc. Finally, we found that Nur77 induction has also been observed in vivo after treatment of wistar rats with apoptotic doses (5.5 mg/kg body wt) of Cadmium. However dominant negative Nur77 expression prevented apoptosis induced by cadmium, supporting a role for Nur77 in exposure to CdAc leads apoptosis of lung cells which may cause pathological changes in the tissues. These study would provide a molecular mechanism of cadmium-induced lung carcinogenesis as well as a valuable tool to develop biomarker for cadmium toxicity.

카드뮴이 흰쥐 뇌의 유전자 발현에 미치는 영향

정창근 인제대학교 대학원 2003 국내박사

목 적 : 흰쥐의 뇌에서 카드뮴의 신경독성 기전과 관련된 유전자들을 조사하여 카드뮴의 뇌신경독성 연구에 필요한 기초 자료를 제공하고자 실시하였다. 방 법 : 실험동물은 카드뮴 폭로력이 없는 Sprague-Dawley 수컷 흰쥐(350±25g)를 25마리를 사용하였으며, 카드뮴 투여량은 참고문헌과 No-Observed-Adverse-Effect-Level(NOAEL) 및 Lowest-observed-Adverse-Effect-Level(LOAEL)을 참고하여 cDNA array는 3.0 mg/kg B.W. 농도로 10일간, 카드뮴 농도별 유전자발현 분석은 0(대조군), 0.1, 0.3, 1.0 mg/kg B.W으로 10일간 투여하였다. 혈액과 뇌조직의 카드뮴 농도는 원자흡광광도계로 분석하였다. cDNA Array는 Atlas Rat 1.2 array Ⅱ와 Toxicology array 1.2(Clontech, Palo Alto, CA)를 사용하였다. 카드뮴 농도에 따른 유전자 발현은 Northern blot hybridization 방법으로 분석하였으며, 이들 중 저농도의 카드뮴 투여군에서 유의한 유전자 발현의 변화를 보이는 일부 유전자는 뇌 전체에 대하여 in situ hybridization을 시행하여 발현분포를 조사하였다. 자료 분석은 SAS 프로그램(version 8.1)을 사용하였다. 결 과 : 조사된 총 2,352개의 유전자들 중 Rat Toxicology array 1.2 kit에서 424개, 그리고 Atlas Rat 1.2 array Ⅱ kit에서 247개를 합하여 671개 유전자의 발현이 확인 되었으며, 대조군과 비교하여 카드뮴 투여군에서 2배 이상의 유의한 차이를 보인 유전자는 Rat Toxicology array 1.2 kit에서 32개, Atlas Rat 1.2 array Ⅱ kit에서 31개를 합하여 63개 유전자였다. 이들 중 카드뮴 투여군에서 발현이 증가된 유전자는 35개였고 감소된 유전자는 28개였다. 그리고 neural adhesion molecule F3, neuroligin2, neuroligin3, element DNA binding protein 1(CREBP1) 등 41개 유전자는 지금까지 카드뮴에 의한 흰쥐 뇌의 신경독성기전과의 관련성이 보고 되지 않은 유전자들이었다. 37개 유전자에 대하여 카드뮴 투여농도별 발현을 분석한 결과 0.1 mg/kg B.W/day 투여군에서 heat shock 27 kDa protein(HSP27), neurodegeneration-associated protein 1(Neurodap 1) 유전자는 통계적으로 유의하게 증가 되었으며, melatonin receptor la(Mella), Kinesin family member 3C(KIF3C), novel kinesin-related protein(KIFID)유전자는 통계적으로 유의하게 감소되었다. 그리고 흰쥐 뇌에서 이 유전자들의 주요 발현부위는 기저핵을 비롯하여 해마, 피질, 선조체등이었다. 결 론 : 이 연구에서 최초로 확인된 카드뮴 대사와 관련된 37개의 유전자는 카드뮴의 뇌 신경독성 기전을 연구하는데 새로운 정보를 제공 할 수 있을 것이다. HSP27, Neurodap 1, Mella, KIF3C, KIFID 유전자는 카드뮴에 의한 뇌신경계 독성기전연구를 위한 표지유전자(gene-marker)개발에 활용될 수 있을 것이다. Objectives : This study was aimed at investigating the gene expression profile in basal ganglia of cadmium exposed rat based on cDNA array analysis. Methods : For cDNA array analysis, Sprague-Dawley male rats(350±25g) were intraperitoneally injected with 3.0 mg/kg./day of Cdcl_(2) (0.3 ml) for 10 days. For dose-related gene expression analysis rats were intraperitoneally injected with 0.1, 0.3, 1.0 mg/kg/day of CdCl_(2). for 10 days. Control rats were injected with equal volume of saline. Cadmium concentration was analyzed by atomic absorption spectrophotometer For cDNA array, RNA samples were extracted from basal ganglia and reverse-transcribed in the presence of [α^(32)P]-dATP. Membrane sets of the Atlas Rat 1.2 array Ⅱ and Toxicology array 1.2(Clontech, Palo Alto, CA) were hybridized with cDNA probe sets. RT-PCR was employed to validate the relative gene expression patterns obtained from the cDNA array. Northern blot and In situ hybridization methods were employed to assess the dose-related and site specific gene expression, respectively. Results : Among the 2352 cDNAs, 671 genes were detected in both array sets and 63 genes of 38 classes showed significant(more than two fold) changes in expression. Thirty five of these genes were up-regulated and twenty eight were down-regulated in the cadmium exposed group. The forty one genes including neural adhesion molecule F3, neuroligin2, neuroligin3, element DNA-binding proteinl and nuclear factor 1-Xl were reported for the first time related to the cadmium-induced neurotoxicity in the rat basal ganglia. According to the dose-related gene expression analysis, heat shock 27 KDa protein(HSP27), neurodegeneration-associated protein 1(Neurodap 1) genes were significantly up-regulated and melatonin receptor la(Mella), Kinesin family member 3C(KIF3D), novel kinesin-related protein(KIFID) genes were significantly down-regulated even in the low-dose of cadmium exposed group(0.1 mg/kg B.W/day). In situ hybridization data showed that numerous positive-signals of Mella, KIF3C, KIFID genes were localized to the basal ganglia, hippocampus, cortex and striatum. Conclusions : Forty one genes detected for the first time in this study were closely related to the cadmium-induced neurotoxicity in the rat basal ganglia and study of these genes can give some more useful informations about the cadmium-induced neurotoxicity. HSP27, Neurodapl, Mella, KIF3C and KIF1D genes may be useful as a gene marker for the study of the cadmium-induced neurotoxicity because these genes showed dramatic changes of mRNA levels in response to the low dose of cadmium exposure.

총알고둥(Littorina brevicula)의 카드뮴 및 아연 생물농축에 관한 연구와 Zinc-binding protein의 분리

한수정 이화여자대학교 대학원 2001 국내석사

카드뮴과 아연에 각각 그리고 동시에 노출한 총알고둥(Littorina brevicula)에서 중금속의 생체내 축적, 제거 및 세포내 분포 양상을 조사하였다. 총알고둥을 카드뮴 400 mg/L 또는 아연 3000 mg/L에 각각 90일간 노출하였을 경우, 각 중금속의 축적량은 노출기간에 따라 증가하였으며, 70일 이후에는 더 이상 축적량이 증가하지 않았다. 카드뮴과 아연을 동시에 노출하였을 경우에는 각각의 중금속에 노출하였을 경우에 비해 아연의 축적량은 증가하였으나, 카드뮴의 축적량은 감소하였다. 노출실험에 이어 수행한 42일간의 청장실험 결과, 카드뮴은 체외로 제거되지 않았으나, 아연은 제거되었다. 특히 카드뮴과 아연에 동시 노출한 총알고둥의 경우에 아연은 더 신속히 제거되었다. 총알고둥을 카드뮴과 아연에 각각 70일 동안 노출한 후, 체내로 흡수된 카드뮴의 약 60 % 가 soluble fraction에 분포하고 있었으며, 아연의 75 % 는 insoluble fraction에 분포하고 있었다. 이러한 경향은 카드뮴과 아연의 동시 노출시에도 유사하게 나타났다. 카드뮴과 아연은 soluble part내의 리간드(ligand)와의 결합 양상에서도 차이를 나타냈는데, 카드뮴의 대부분은 약 6.5kDa크기의 MBP-1(Metal-Binding Protein-1)과 결합하고 있었으며, 아연은 HMW(High molecular weight fraction, >60kDa), MBP-1, MBP-2, LMW( Low molecular weight fraction, <1kDa )에 고루 분포하는 것으로 나타났다. 또한 총알고둥을 아연에 노출하였을 경우, 체내로 흡수된 아연과 결합하는 Zn-binding protein 을 분리하였다. Gel-filtration chromatography 와 Ion-exchange chromatography 를 거쳐 SDS-PAGE gel 상에서 apparent molecular mass 18 kDa 을 나타내는 새로운 Zn-binding protein을 분리하였다. Accumulation, elimination and subcellular distribution of heavy metals in Littorina brevicula exposed to cadmium and zinc, both alone and in combination were investigated. When L. brevicula was exposed to CdCl₂ 400 mg/L and ZnSO₄ 3000 mg/L separately for 90days, each of the metal body burden in the whole soft parts increased in proportion to time of exposure until 70days. But it dosen't increase after 70days. When the winkles were exposed to cadmium and zinc simultaneously, zinc body burden increased and cadmium body burden decreased as compared with when they were exposed to each of the metal. We also found that cadmium accumulated in the winkles was not depurated for 42days, but zinc accumulated in them was depurated. Especially, zinc was depurated faster when they had been exposed to mixture of cadmium and zinc. After the winkles had been exposed to cadmium and zinc separately for 70days, cadmium was mainly associated with the soluble fraction(about 60% of the total body burden), while most zinc was associated with insoluble fraction(about 75% of the total). And these trends of metal partitioning did not alter when exposed to metal mixture. When the soluble fraction applied to gel-filtration chromatography column, the distribution pattern of cadmium and zinc which was associated with protein or ligands was different each other. Most cadmium in the soluble fraction was bound to MBP-1(Metal-binding protein, about 6.5kDa), while zinc was distributed evenly to HMW(High molecualar weight fraction, >60kDa), MBP-1, MBP-2(about 5kDa), LMW(Low molecular weight fraction, <1kDa). Also we isolated Zn-binding protein in L. brevicula exposed to zinc for 100days. After gel-filtration chromatography and ion-exchange chromatography, Zn-binding protein showing apparent molecular mass 18kDa on the SDS-PAGE gel was isolated.