변형성장인자-β가 치주인대세포와 치은섬유아세포의 교원질 합성능에 미치는 영향

김미정 경북대학교 1996 국내석사

치주조직의 재생을 유도하기 위한 방법으로 연구되고 있는 폴리펩타이드계 성장인자 중 미분화 중배엽세포의 활성을 조절하는 것으로 알려져 있는 변형성장인자-β를 이용하여 배양된 치주인대세포와 치은섬유아세포에 농도별, 시간별로 주입하여 두 세포의 총단백질, 교원질 합성능을 알아보므로써 변형성장인자-β가 이들 세포의 단백질 합성능에 미치는 영향을 평가하고 각 조건에서 두 세포간의 단백질 합성능을 상호 비교해 보고자 본 실험을 실시하였다. 교정치료를 목적으로 내원한 환자의 제1 소구치 부위의 정상치은을 절제하고, 건강한 제1 소구치를 발거하여 치은섬유아세포와 치주인대세포를 분리, 배양하여 변형성장인자-β을 주입시키지 않는 군을 대조군으로 하고, 변형성장인자-β을 각각 0.5, 1, 2.5, 5, 10 ng/ml 농도로 주입시킨 군을 실험군으로 하여 24시간 배양하여 두 세포군의 단백질 합성능을 측정하였으며, 1, 5 ng/ml 농도를 선택하여 24, 48시간 동안 배양하여 총단백질 및 교원질 합성능을 측정하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 치주인대세포와 치은섬유아세포의 총단백질과 교원질 합성능에 미치는 변형성장인자-β의 효과는 치주인대세포의 총단백질, 비교원성 단백질과 교원질 합성양과 치은섬유아세포의 교원질 합성양은 5 ng/ml 농도까지 농도의존적으로 증가하였으며, 치은섬유아세포의 총단백질과 비교원성 단백질 합성양은 2.5 ng/ml 농도까지 농도의존적으로 증가하였으며, 그 이상의 농도에서 약간 감소하는 경향을 보였다(P < 0.05). 총단백질에 대한 교원질의 상대적인 비율은 치주인대세포에서 농도에 따라 미약하게 감소하는 경향을 나타내었으며 2.5, 5 ng/ml 투여군에서 통계적으로 유의한 차이(P < 0.05)를 보였고, 치은섬유아세포에서는 미약하게 증가하는 경향을 나타내었으나 통계적인 유의성은 없음으로써(P > 0.05) 변형성장인자-β가 주어진 농도에서 교원질의 합성을 특이하게 증가시키는 효과는 없음을 나타내었다. 치주인대세포와 치은섬유아세포에 대한 변형성장인자-β의 효과를 비교하였을 때 치주인대세포에 비해 치은섬유아세포에서 총단백질, 교원질 합성양과 총단백질에 대한 교원질의 상대적 비율이 약간 높게 나타났으며(P < 0.05), 비교원성 단백질의 합성양은 2.5 ng/ml 농도까지는 유사한 경향을 보였으나, 5, 10 ng/ml 투여군에서 치은섬유아세포에서의 비교원성 단백질 합성양이 감소하므로써 총단백질에 대한 교원질의 상대적 비율이 뚜렷이 증가한 양상을 보였다(P < 0.05). 시간경과에 따른 치주인대세포와 치은섬유아세포의 총단백질과 교원질 합성능에 대한 변형성장인자-β의 영향은 두 세포 모두 총단백질, 교원질 및 비교원성 단백질 합성양이 24시간 투여군에 비해 48시간 투여한 군에서 감소하는 경향을 보였으나(P < 0.05), 총단백질에 대한 교원질의 상대적 비율은 48시간 투여군에서 비교원성 단백질의 합성양이 상대적으로 크게 감소하므로써 24시간 투여군에 비해 더 증가된 양상을 보였다(P < 0.05). Transforming growth factor - β is one of the polypeptide growth factors that mediate the activity of mesenchymal cells and regulate wound healing process via cell proliferation, migration and extracellular matrix formation. The purposes of this study is to evalutate the effects of transforming growth factor - β on the protein synthetic activity of human periodontal ligament cells and human gingival fibroblasts. The cells which were prepared were primary cultured gingival fibroblasts and periodontal ligament cells from humans, and the fourth or sixth subpassage were used in the experiments. Cells were seeded and at a confluent state, 0, 0.5, 1, 2.5, 5, 10 ng/ml TGF-β and 2μ Ci/ml [^3H] proline were added to the cells and cultured for 24 hours. Then, 1 and 5 ng/ml concentrations were selected and added to confluent cells and cultured for 24 and 48 hours. They were labeled with 2 μ Ci/ml [^3H] proline for 24 hours and a collagen assay was done by the Peterkofsky and Diegelman method. The results were presented as the mean disintegration per minute (dpm) per well and S.D. of four determinations. The results were as follows : The total protein, collagen and noncollagenous protein synthesis in periodontal ligament cells and gingival fibroblasts were increased dose- dependently by transforming growth factor-β to 2.5 - 5 ng/ml concentration and decreased at 10 ㎍/ml concentration. The percent of collagen was slightly changed according to the concentration of transforming growth factor-β. The effect of transforming growth factor-β was not specific for collagen synthesis since it increased the total, noncollagenous and collagenous protein, simultaneously. In the comparison of protein synthetic activity between the human periodontal ligament cells and human gingival fibroblasts, the human gingival fibroblasts had higher activities than the human periodontal ligament cells at all times and concentrations of TGF-β. In the comparison of protein synthetic activity between the 24 hour effect and the 48 hour effect of TGF-β, the 48 hour cultured cells' synthetic activity decreased more than the 24 hour cultured cells at human periodontal ligament cells and human gingival fibroblasts. In conclusion, TGF- βhas important roles in the stimulation of protein synthesis in human periodontal ligament cells and human gingival fibroblasts. Thus, it may be useful for clinical application in periodontal regenerative procedures.

염기성 섬유아세포성장인자가 치주인대세포와 치은섬유아세포의 증식능에 미치는 영향

조영준 경북대학교 1996 국내석사

미분화중배엽세포에 강력한 유사분열 효과가 있다고 알려진 염기성 섬유아세포 성장인자를 초기배양한 치주인대세포와 치은섬유아세포에 각기 다른 농도와 시간에 따라 주입했을 때 두 세포의 세포증식능에 미치는 영향을 알아보고 각 조건에 따른 두 세포간의 증식능을 상호 비교해 보고자 본 실험을 실시하였다. 교정치료를 목적으로 내원한 환자의 제1 소구치 부위의 정상치은을 절제하고, 건강한 제1 소구치를 발거하여 치은섬유아세포와 치주인대세포를 분리, 배양하여 염기성 섬유아세포 성장인자를 주입시키지 않은 군을 대조군으로 하고, 염기성 섬유아세포성장인자를 각각 0.1, 1, 10, 50, 100ng/ml로 주입시킨 군을 실험군으로 하여 24시간, 48시간, 72시간 동안 배양하였으며, 각 시간별 배양 6시간 전에 10㎕/200㎕의 5-Bromo-2'-deoxy-uridine을 첨가하여 5-Bromo-2'-deoxy-uridine이 DNA내로 편재되는 양으로써 두 세포군의 증식능을 측정하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 치은섬유아세포에 염기성 섬유아세포 성장인자를 주입후 24, 48, 72시간 동안 배양시 각 시간별로 농도 의존형으로 증가하는 경향을 보였으며 24, 48시간 배양시 세포의 증식능은 유사하였으나, 72시간 배양시에는 24, 48시간 배양시에 비해 증식능이 전반적으로 감소하는 경향을 보였다. 24시간 배양시에는 모든 실험군에서, 48시간 동안 배양시에는 1ηg/ml를 제외한 모든 실험군에서, 72시간 배양시에는 1, 10ηg/ml를 제외한 모든 실험군에서 대조군에 비해 통계적으로 유의한 차이(P<0.01, P<0.05)를 나타내었다. 치주인대세포에 염기성 섬유아세포 성장인자를 주입후 24, 48, 72시간 동안 배양시 각 시간별로 50ηg/ml 주입군까지 농도 의존적으로 증가하였다가 100ηg/ml 주입군에서 감소하는 경향을 보였으며, 48시간 배양시까지 증가하다가 72시간 배양시에는 24, 48시간에 비해 증식능이 다소 감소하는 경향을 보였다. 24시간 동안 배양시에는 0.1ηg/ml를 제외한 모든 실험군에서, 48시간 동안 배양시에는 모든 실험군에서, 72시간 동안 배양시에는 0.1, 10ηg/ml를 제외한 모든 실험군에서 대조군에 비해 통계적으로 유의한 차이(P<0.01, P<0.05)를 나타내었다. 치주인대세포와 치은섬유아세포의 증식능을 비교해 보면, 24시간 배양시에 0.1, 1, 100ηg/ml 주입군에서 치주인대세포가 치은섬유아세포보다 조금 더 낮은 경향을 나타내었고, 두 세포 상호간에 0.1, 1ηg/ml 투여한 실험군에서 통계적으로 유의한 차이(P<0.01)를 나타내었다. 48시간 배양시에는 100ηg/ml 주입군을 제외한 모든 실험군에서 치주인대세포가 치은섬유아세포보다 증식능이 더 높은 경향을 나타내었으며, 두 세포 상호간에 10, 50ηg/ml에서 통계적으로 유의한 차이(P<0.01, P<0.05)를 나타내었다. 72시간 배양시에는 10ηg/ml까지 비슷한 경향을 보이다가 50, 100ηg/ml에서 치주인대세포가 치은섬유아세포보다 그 증식능이 더 높은 경향을 나타내었으며, 두 세포 상호간에 1, 10ηg/ml를 제외한 모든 실험군에서 통계적으로 유의한 차이(P<0.01, P<0.05)를 나타내었다. The use of basic fibroblast growth factor which function as potent biologic mediators regulating numerous activities of wound healing has been suggested for the promotion of periodontal regeneration. The mitogenic effects of basic fibroblast growth factor on human periodontal ligament cells and human gingival fibroblasts were evaluated by determining the incorporation of 5-Bromo-2'-deoxy-uridine into DNA of the cells in a dose-dependent manner. The cells which were prepared were the primary cultured gingival fibroblasts and periodontal ligament cells from human the fourth or sixth subpassages were used in the experiments. The cells which were seeded DMEM contain 10' FBS. The added concentrations of basic fibroblast growth factor were 0.1, 1, 10, 50, 100ηg/ml and basic fibroblast growth factor were added to the quiescent cells for 24 hours, 48 hours and 72 hours. They were labeled with10㎕/20㎕ 5-Bromo-2'-deoxy-uridine for the last 6 hours of each culture. The results of the five determinants were presented as mean and S.D.. The results were as follows : The DNA synthetic activity of human gingival fibroblasts was increased dose dependently by basic fibroblast growth factor at 24 hours, 48 hours and 72 hours. The similar mitogenic effects were at the 24 and 48 hours of basic fibroblast growth factor, but the DNA synthetic activity of human gingival fibroblasts generally decreased at 72 hours. The DNA synthetic activity of human periodontal ligament cells was increased dose dependently to 50ηg/ml by basic fibroblast growth factor at 24, 48 and 72 hours, but the DNA synthetic activity decreased at 100ηg/ml of each hour. Generally the maximum mitogenic effects were at the 48 hours application of basic fibroblast growth factor. The DNA synthetic activity of human periodontal ligament cells generally decreased lower at 72 hours than at 24, 48 hours the application of basic fibroblast growth factor. In the comparison of DNA synthetic activity between human gingival fibroblasts and human periodontal ligament cells, human periodontal ligament cells had slightly higher proliferation activity than human gingival fibroblasts for a longer time at the high dosage of the basic fibroblast growth factor. In conclusion, basic fibroblast growth factor have important roles in the stimulation of DNA synthesis in human periodontal ligament cells and human gingival fibroblasts, and thus may be useful for clinical applications in periodontal regenerative procedures.

Titanium plasma sprayed implant에 대한 기계적 표면처리방법이 치은섬유아세포의 전개양상에 미치는 영향

황연희 경북대학교 대학원 1995 국내석사

구강내 매식된 임프란트가 과도한 교합력이나 염증등의 이유로 구강내로 노출되었을 때 세균독소에 이완된 면을 제거하고 평활한 면을 형성하여 주위의 연조직, 경조직에 적합한 상태로 만들어 건강한 상태로 구강내에 유지하기 위해서 임프란트 매식체 표면을 기계적인 표면처리방법으로 처치하여 이러한 방법이 임프란트 표면성분, 치은섬유아세포의 전개양상에 미치는 영향을 알아보고자 본 실험을 실행하였다. IMZ사에서 제작한 직경 10mm, 높이 2mm의 원판 타이타늄을 이용하여 피막되지 않은 타이타늄면과 TPS면을 대조군으로 하고 기계적인 표면처리방법인 low speed stone bur 처치면을 실험군으로 설정한 후 EDX로 타이타늄 표면성분을 분석하였고 주사전자현미경으로 치은섬유아세포의 전개양상을 관찰하였다. EDX에 의한 타이타늄 표면성분분석 결과 모든 실험군에서 titanium peak, 소량의 aluminum이 나타났으며 그외의 성분은 나타나지 않았다. 치은섬유아세포의 전개양상에 대한 주사전자현미경 관찰결과 평활한 타이타늄면에서 접종 30분 후 세사상돌기와 박판엽상으로 확장된 세포가 많이 관찰되며 6시간 후 신장된 치은섬유아세포가 시편에 밀착된 양상을 보였고 24시간 후 치은섬유아세포는 시편의 모든 면을 피개하며 가공시의 평행한 선을 따라 방향성을 띄었다. TPS가 잔존한 stone처치군에서 세포 접종 30분 후 세사상돌기가 적게 관찰되어 평활한 타이타늄면에 비해 초기부착이 늦은 것을 알 수 있었고 6, 24시간후 치은섬유아세포는 거친면으로 인해 시편에 밀착되지 못한 양상을 보였으나 평활한 타이타늄면과 유사하게 세사상돌기로써 인접한 세포와 연결되며 시편의 모든 면을 피개하였다. TPS군에서 치은섬유아세포는 세포 접종 30분후 세사상돌기를 거의 찾아 볼 수 없어 초기부착이 다른군에 비해 늦으며 세포 배양 6, 24시간후에도 시편에 밀착되지 못하고 박판상돌기가 가늘고 길게 돌출되어 여러면에 부착된 양상을 보였으며 세포가 부착되지 않은 TPS면이 관찰되었다. Currently titanium is the material of choice for implant because of its biological acceptance. This high degree of biocompatibility is thought to result, in part, from the protective and stable oxide layer that presumably aids in the bonding of the extracellular matrix at the implant-tissue interface. Endosseous dental implants are interfaced with bone, connective tissue, and ephithelium when implanted into the jaw bone. The soft tissue interface including connective tissue and epithelium is one of the most critical factors in the determination of implant maintenance and prognosis. For maintenance of a failing or failed implants it is essential to treat the implant fixture surface so as to remove bacterial endotoxin and make a surface tolerated by surrounding soft and hard tissue. In this study, the effect of mechanical treatment on TPS on adhesiveness and proliferation of human gingival fibroblast(HGF) and changed surface characteristics were studied. TPS disc manufactured by IMZ Co. was treated with low speed stone bur, rubber point and jetpolisher. Its surface components were analyzed with EDX to evaluate whether the surface characteristics were altered or not. Following results were obtained, pure titanium and TPS (control group), stone polished titanium (experimental group) showed titanium peak and small amout of aluminum, so there was no alteration on surface characteristics. Under the SEM examination, in initial attachment of HGF there was a slight more enhanced in titanium, stone polished titanium than TPS. After 6 hours, the titanium and stone polished titanium group showed HGF were elongated and connected with numerous process. The titanium group showed HGF were more intimately attached on the disc. The HGF of the TPS group attached on the surface by thin and elongated process. After 24 hours, the HGF connected with each other via numerous process and absolutely cover the surface with orientation in the titanium and stone polshed titanium group. The TPS group showed HGF had multiple point contacts with more long and thin lamellopodia but showed a little bare surface on disc.

치은섬유아세포 성장 조절을 위한 LED조사의 최적화조건 탐색

류재록 전남대학교 대학원 2006 국내석사

The purpose of the present study is to investigate the optimal wavelength, frequency and energy density for set up the photobiologic treatment of periodontal disease. To establish the present study, λ scan of 500㎚ to 900㎚ was used to search the optimal wavelength for maximal proliferation of human gingival fibroblasts. Cell proliferation assay was carried out as MTT assay. Light intensity of 0.8 to 3.25 ㎽, frequency of 0 to 584㎐ and 0 to 2hours was applied for investigation of optimal energy density, frequency and applied duration. Finally, 628㎚ with 1 ㎽/㎠ for 1hour of LED irradiation resulted in maximal proliferation of gingival fibroblasts. These results suggest that LED irradiation on gingival fibroblast show different proliferation according to the condition of irradiation, and demonstrate that LED irradiation can control the quantity of cell proliferation. 일반적으로 가시광선(400nm~700nm) 및 적외선(>700nm) 영역의 빛에 의한 생체 세포에의 조사는 세포 활성화를 야기하며, 이는 세포주기의 가속화 및 세포 사멸의 억제 등을 통해 세포 증식을 일으킨다고 알려져 있다. 본 연구는 가시광선영역에서 저출력 광(光) 자극(500mW이하)에 의한 다양한 광(光) 조사 조건에 따라 나타나는 치은섬유아세포 성장 변화를 알아보고 성장량의 최적 조건을 탐색을 통해 광(光) 조사에 따른 치주 질환의 치료모델을 확립하기 위해 시행하였다. 따라서 본 연구에서는 500nm에서 900nm까지의 가시광선 및 적외선 영역의 파장에서 치은섬유아세포의 전(全) 파장스캔(λ scan)으로 흡수 스펙트럼을 조사하였다, 흡수 가능 영역에서 치은섬유아세포 성장량을 MTT를 통해 확인 하였다. 또한 0.8~3.25mW 범위의 광세기, 0~584Hz 범위의 주기 그리고 0~2hr 범위의 조사 시간의 차이에 따라 나타나는 세포의 성장을 MTT를 통해 조사하였다. MTT환원분석결과에서 치은섬유아세포에 628nm파장으로 1㎽/㎠ 에너지세기로 1시간 동안 73Hz 또는 144Hz로 조사했을 때 성장량이 가장 높음을 알 수 있었다. 본 연구는 가시광선 영역에서 치은섬유아세포는 광(光) 조사 조건의 차이에 따라 성장량의 차이를 보였으며, 이는 광(光)조사가 치은섬유아세포의 성장량에 영향을 미칠 수 있음을 시사하였다.

치은섬유아세포의 MMP-2 발현에 대한 Nitric Oxide의 영향

신인식 전남대학교 대학원 2003 국내석사

조직파괴와 치유중 조직 재형성에 중요한 효소인 matrix metalloproteinase (MMP)는 extracellular matrix (ECM)을 분해하는 체내 단백분해효소의 일종으로 치주질환 병소에서 MMP 활성의 증가가 보고되어 있다. 치주염과 같은 염증성 질환에서는 superoxide anion, hydrogen peroxide, nitric oxide (NO), peroxynitrite과 같은 활성산소종(reactive oxygen species)이 증가한다. 만성염증질환에서 MMP와 NO의 영향에 대한 연구중 NO가 류마티스성 관절염 병소의 synovial cell에서 MMP의 증가를 유도하는 중간물질로 작용한다고 보고되었다. 그러나 현재까지 치은섬유아세포에서 NO 및 ROS에 의한 MMP의 발현에 대한 보고는 없다. 본 연구에서는 류마티스성 관절염과 치주질환의 유사성에 착안하여 치주질환에서 ROS와 MMPs의 관계를 알아보고, ROS 중에서도 특히 Nitric Oxide가 MMP-2 발현을 증가시키는데 중요한 매개체가 되는지를 규명하고자 하였다. 인체 치은섬유아세포와 HT1080 (human fibrosarcoma) 세포의 배양중 여러 ROS (hydrogen peroxide, phenazine methosulfate (PMS), peroxynitrite, sodium nitroprusside (SNP)를 첨가하여 MMP-2, -9 효소활성을 gelatin zymography로 평가하였다. 배양세포의 RNA를 분리한 후 RT-PCR에 의한 MMP-2, TIM P-2 mRNA 발현도를 검사하였고, 여러 신호전달억제제를 첨가한 후 MMP-2와 MMP-9 발현을 평가하여 다음의 결과를 얻었다. 1. HT1080 세포는 proMMP-2와 proMMP-9를, 치은섬유아세포는 proMMP-2만 발현하였다. 2. HT1080세포에서는 hydrogen peroxide에 의하여 MMP-9의 발현이 증가하였고, 치은섬유아세포에서는 SNP에 의하여 MMP-2 level이 현저하게 증가되었다. 3. HT1080 세포에서는 FPTI III (Ras inhibitor)와 LY294002 (PI3-kinase inhibitor) 처리시 MMP-2, 9의 발현이 억제되어 Ras/PI3-kinase pathway가 MMPs 발현에 역할을 하였으며 치은섬유아세포에서는 FPTI III 및 PDTC (NF-KB inhibitor) 처리시 SNP 존재와 무관하게 MMP-2가 현저히 감소되어 RAS and/or NF-kB가 NO에 의한 MMP-2 발현에 역할을 하였다. 이상의 실험결과로 보아 ROS, 특히 Nitric Oxide가 Ras and/or NF-kB pathway를 통하여 세포특이적으로 치은섬유아세포의 MMP-2 발현을 증가시키며, 이로서 NO가 치주염에서 염증성 조직파괴와 ECM remodeling 조절에 관여함을 시사한다. Periodontitis are infectious disease characterized by periodontal attachment loss and bone destruction. Various collagens, the predominant extracellular matrix (ECM) components of periodontium which produced by periodontal ligament and gingival fibroblasts, are the main targets of degradation in periodontitis. Among host proteases degrading the extracellular matrix matrix metalloproteinases (MMPs) are highly related to tissue destruction and remodeling events in periodontal diseases. The initial split of gingival and periodontal ligament collagens is a key feature of progressive and active periodontitis lesions or pockets, and this initial leavage is carried out by the host cel-derived MMPs. It has been suggested that increased number and activity of phagocytes in periodontitis lesion results in a high degree of reactive oxygen species (ROS) such as superoxide anion, hydrogen peroxide, nitric oxide, peroxynitrite. There are few reports on the relationship between ROS and MMPs expressions in gingival fibroblast. This study showed that especially nitric oxide could be the critical mediator of periodontal disease progression through control of MMP-2 expression in gingival fibroblast possibly via Ras/NF-kB pathway.

치은섬유아세포와 치주인대세포의 세포성장에 관한 비교

손성배 경북대학교 1991 국내석사

치추질환에 이환된 조직의 재생에 주로 관계하는 치은섬유아세포와 치주인대세포의 성상을 규명하고자, 교정치료를 위하여 내원한 2명의 환자로부터 건강한 치은조직을 포함하여 제1 소구치를 발거하고 치주인대 및 치은 조직을 채취하여 치주인대세포 및 치은섬유아세포를 각각 분리, 계대배양하였다. 실험에 사용될 충분한 수의 세포가 배양되었을 때 세포의 성장특성을 조사하기 위하여 12-Well 형 조직배양접시에 각각 4×10⁴개의 세포를 접종하여 10 일까지 매일 도립위상차 현미경을 이용하여 그 형태를 관찰하고 사진촬영하였으며 Hemocytometer를 이용하여 세포수를 측정하였다. 또 Labarca와 Paigen의 방법에 따라 DNA 양을 측정하였다. 조직을 접종후 세포이주의 시기는 치은섬유아세포가 치주인대세포보다 빠르게 나타났고 전실험 과정동안 증식속도도 빨랐다. 세포의 형태에 있어서 치은섬유아세포군 HGF-1, HGF-2와 치주인대세포 PLC-2는 전형적인 섬유아세포의 양상인 신장된 방추형을 보였고 배양형태상의 차이점은 발견할 수 없었다. 그러나 치주인대세포 PLC-1은 성상형을 띠면서 망상형의 연결양상이 관찰되었으며 완전피개 상태에서는 모든 세포군이 접촉억제현상 없이 중층을 이루었다. 세포의 증식실험에서 치은섬유아세포군 HGF-1, HGF-2와 치주인대세포 PLC-2는 세포를 접종한 후 1일에서는 모든 세포수가 감소하였으나 2 일부터 완만한 증식경향을 보였고, 4 일부터 8 일까지는 급격한 증가양상을 나타냈으며 그 후로는 증가속도가 완만하였다. 그러나 치주인대세포 PLC-1은 세포수의 증가가 실험이 진행되는 전 과정동안 완만하게 진행되었다. DNA 측정결과에서 DNA의 증가양상과 세포수의 증가양상은 유사하게 나타났다. Both periodontal ligament and gingival tissue are known as harbor the cells stimulating the process of periodontal regeneration. For further understanding on the roles and characteristics of both cells in the regenerative process for the destructed periodontal tissue, author compared human periodontal ligament cells ( PLC ) and gingival fibroblasts ( HGF ) in vitro. Both cells were derived from the sane patient and same passage number. Cells derived from periodontal ligament and human gingiva were isolated from both periodontal ligament explants and clinically healthy gingiva of first premolars for orthodontic patients. Growth characteristics of cultured cells were identified by counting the number of cells after seeding 40,000 cells per well at 12--welled tissue culture plate. To the day 10th, the cell proliferation rate was determined by quantifying DNA contents as well as the number of the cells using hemocytometer. The results are as follows: 1. Through all the way of the experiments, faster migration and growth rate were observed in the cells from the explant of gingival tissue than the explant of periodontal ligament. 2. When cells extended from the explants and were subconfluent, HGF-1, HGF-2 and PLC-2 cells showed elongated, spindle-shaped appearance which is typical form of 'fibroblast-like' cells but PLC-1 cells were formed into network-like structure. 3. When cells reached to confluence, each cell populations formed hyperconfluent, multilayered colonies of randomly oriented one and no apparent differences were noticed in he appearence of HGF-1, HGF-2 and PLC-2 cells. 4. On the 1st day after cell plating, all cells were decreased but from the 2nd day cells showed slow growth rate. From the day 4th to 8th, cells showed exponential growth and then maintained slow growth rate. 5. The pattern of growth characteristics identified by both the number of cells and DNA content showed similar.

Effect of aging on expression of nitric oxide and inducible nitric oxide synthase in human gingival fibroblasts : 노화가 사람 치은섬유아세포의 Nitric oxide와 Inducible nitric oxide synthase 발현에 끼치는 영향

지숙 Graduate School of Chosun University 2004 국내박사

치주질환의 진행이 나이에 의해 영향을 받는다는 사실은 알려져 있으나 노화에 따른 치주조직 세포의 기능적인 변화에 관한 사실은 많이 알려져 있지 않다. 노화에 따른 세포의 노화가 치주질환의 진행에 어때한 영향을 끼치는가를 아는 것은 중요하다. 염증 상태에서 nitric oxide(NO)는 조직 파괴에 관여하는 인자로 작용하여 치주질환의 진행에 관여하는 하는 것으로 알려져 있다. 따라서 본 연구는 사람의 치은에서 배양된 치은섬유아세포를 이용하여 세포의 노화에 따른 NO와 이의 합성효소인 inducible nitric oxide synthase(iNOS)의 발현을 알아봄으로써 세포의 노화가 치주질환의 진행에 끼치는 영향에 대해 알아보고자 시행되었다. 10세의 환자와 55세의 환자에서 각각 채취한 치은에서 배양된 세포와 10세의 환자에서 채취한 세포를 계속적인 계대배양을 통해 얻은 실험실 상 노화된 세포를 포함하여 총3 종류의 치은섬유아세포를 실험에 이용하였다. Hot phenol-water extraction을 통해 추출된 Porphyromonas. gingivalis ATCC 33277 lipopolysaccharide(LPS) 와 재조합 IFN-γ를 세포에 적용시켜 Griess assay를 통해 조건화된 배지에서 NO를 측정하였다. 20세와 55세의 환자에서 채취된 치은 조직과 총 3 종류의 배양된 세포에 NOS-Ⅱ 항체를 적용시켜 iNOS 단백질 발현을 관찰하였다. Total RNA를 추출하여 RT-PCR를 통해 iNOS mRNA의 발현을 분석하였다. 치은섬유아세포에서 NO는 자발적으로 발생되었고, 이러한 발현은 젊은 세포보다 노화된 세포에서 강하였다. P. gingivalis LPS와 재조합 IFN-γ는 치은섬유아세포에서 NO의 발현을 증가 시켰고, 이러한 발현은 젊은 세포보다 노화된 세포에서 강하였다. 면역조직화학 염색에서 iNOS 단백질은 젊은 사람과 노화된 사람의 치은 조직 모두에서 치은섬유아세포와 상피의 기저층 세포와 염증세포에서 발현되었으나 노화에 따른 발현의 차이를 구별할 수는 없었다. 세포의 면역염색에서 iNOS 단백질은 노화된 세포에서 강하게 발현되었고 이러한 발현은 LPS와 IFN-γ에 의해 강화되었다. LPS와 IFN-γ의 조건이 주어지지 않은 상태에서 iNOS mRNA는 젊은 세포에서보다 노화된 세포에서 강하게 발현되었다. 이러한 결과를 통해 본 연구는 세포의 노화가 NO와 iNOS 발현을 증가시킴으로서 치주질환의 진행에 영향을 끼칠 수 있음을 제시하고자 한다.

IL-1β가 치은섬유아세포와 치주인대세포의 교원질 합성능에 미치는 영향

이재목 경북대학교 1992 국내석사

치주질환의 진행에서 중요한 기전은 치주조직의 대부분을 구성하는 교원질의 파괴와 백악질과 치조골에 부착되어 있는 교원성 부착의 탈락이다. 이 현장은 직접적 원인으로 세균 및 세균 독성물질이 될 수 있으며, 간접적 원인으로 세균 및 세균의 독성물질에 자극되어 활성화된 숙주세포가 분비하는 Cytokine으로 알려져 있다. Cytokine 중의 하나인 IL-1β는 조직으로 부터 교원효소와 PG 합성을 증가시켜 주로 proteoglycan과 교원질을 파괴하는 것으로 밝혀진 바, 본 실험은 교정치료를 위하여 내원한 환자에서 채취한 조직으로 부터 치은섬유아세포와 치주인대세포를 분리 배양하여 각각 배양된 양 세포에 IL-1β를 주입하여 교원질 합성능을 측정하고 교원질 합성능에 관여하는 PG의 영향을 규명하고자, Indomethacin을 투여하여 실험해 본 결과 다음과 같은 결론을 얻었다. 1. 양 세포의 교원질 합성능과 단백질 합성능에 대한 교원질 합성의 상대적 비율의 비교에서 치주인대세포가 치은섬유아세포보다 높은 양상을 보였고, 비교원성 단백질 합성능에 있어서는 치주인대세포가 치은섬유아세포보다 낮은 양상을 보였다. 2. IL-1β의 농도가 증가할수록 양 세포 공히 모든 합성능에서 감소 양상을 보였다. 3. 치주인대세포에서 Indomthacin 투여 유무에 따른 합성능 측정시 Indomethacin 투여군에서 모든 합성능이 감소 양상을 보였다. 4. 치주인대세포에서 IL-1β의 작용에 대한 Prostaglandin의 영향을 규명하기 위해 Indomethacin을 투여해 본 결과, IL-1β의 농도가 증가함에 따라 모든 합성능에서 큰 변화가 없었다. The degradation of collagenous attachment from the cementum to the alveolar bone in the event that defines destructive periodontitis. Direct etiologies of the above event are bacteria or bacterial toxic materials and indirect etiologies are cytokines that it produce in stimulated host cell by bacteria or bacterial toxic materials. One of these cytokines, IL-1β has various catabolic and inflammatory effects, it induces procollagenase activation and prostaglandin production and degrades proteoglycan and collagen. This study describes the effect of IL- 1β on collagen production and the effect of Indomethacin on IL-1β by Human gingival fibroblast and Periodontal ligament cell in cell derived from explants of human periodontium. The results were as follows : 1. In collagen production activity, the periodontal ligament cell was shown to be greater than the gingival fibroblast 2, As the concentration of IL-1β was increased, the periodontal ligament cell and the gingival fibroblast showed a tendency to decrease in all synthetic activity. 3. On each concentration of IL- lβ, collagen production and percent of collagen were greater in periodontal ligament cell when compared with that of gingival fibroblast 4. When both Indomethacin and IL-1β were injected into the periodontal ligament cell, increasing the concentration of IL-1β, the cell was shown to be unchanging synthetic activity almostly. So, it was thought that IL-1β affected the collagenous and noncollagenous protein production activity in the human gingival fibroblast and the periodontal ligament cell and affected prostaglandin production in periodontal ligament cell

Tetracycline 처리된 차폐막이 치은섬유아세포에 미치는 영향

심재창 전남대학교 대학원 1999 국내석사

임상에서 널리 사용되고 있는 조직 유도 재생술용 차폐막인 e-PTFE 막에 tetracycline을 함유시켜 차폐막에 대한 치은 섬유아세포의 접착도와 활성도를 평가하고자 하였다. 96 well 배양접시에 치은조직에서 분리한 섬유아세포를 분주하고 tetracycline이 함유된 차폐막을 넣어 0일에서 7일간 배양후 치은섬유아세포의 증식능 및 접착도를 평가하였으며 MTT assay를 통해 세포활성도를 측정하였다. 또한 tetracycline 함유 차폐막을 배양액에 미리 노출시켜 차폐막증의 tetracycline을 유리시킨 후 치은섬유아세포를 가하여 차폐막에 부착된 세포의 증식능 및 세포활성도를 측정하여 다음과 같은 결론을 얻었다. 세포 증식능은 시간이 경과함에 따라 대조군과 tetracycline 처리하지 않은 차폐막을 넣어준 군 및 tetracycline처리한 차폐막을 넣어준 군 모두에서 세포수가 증가하였으나, tetracycline을 처리한 차폐막을 넣어준 군은 tetracycline 처리하지 않은 차폐막을 넣어준군에 비하여 세포증식능이 절반정도로 떨어져 있었다. 배양용기 저면에 부착한 세포를 대상으로 한 MTT 분석에서 tetracycline 처리 차폐막을 넣은군은 대조군에 비하여 배양후에는 71%였으나 그 이후에는 79%에서 88%로 세포활성의 억제는 미약하였다. tetracycline 함유 차폐막은 초기에 과량의 tetracycline을 방출하여 차폐막에 부착되는 세포의 수를 줄이나 부착되는 세포에는 세포활성의 억제는 거의 관찰되지 않았으며, 차폐막에 함유된 tetracycline이 감소하게 되면 점차 부착세포수는 증가하였다. 이상의 연구 결과로 볼때 tetracycline이 함유된 차폐막은 치은 섬유아세포의 초기 증식에는 영향을 주지만 세포의 활성에는 영향을 주지 않아서 치은 결체 조직과 tetracycline 처리 차폐막의 정상적인 접합이 형성되고 차폐막이 제 위치에 고정되어 치유 부위의 안정을 꾀할 수 있을 것으로 추정된다. The purpose of this study was to evaluate the effect of tetracycline-treated e-PTFE membrane on the human gingival fibroblast attachment. To evaluate the cell attachment to membrane, the number of gingival fibroblast attached to e-PTFE membrane was counted by hemocytometer. Also the cytotoxic effect of tetracycline-treated e-PTFE membrane on human gingival fibroblast was measured by Wataha's MTT assay. After tetracycline-treated barrier membrane was exposed to culture media for 24 hours, cell attachment to membrane and cytotoxic effect were measured. The results were as follows; As for cell proliferation rate, total cell number increase in both control group and tetracycline-treated e-PTFE membrane in course of time, but the cell numbers were decreased to half in tetracycline-treated barrier membrane as in the control group. In MTT assay, tetracycline-treated e-PTFE membrane showed moderate to weak cytotoxic effect compared to non-treated control. At the beginning, tetracycline-treated, so was barrier membrane released abundant tetracycline and so decreased the number of cell attached barrier membrane, but not almost observed cellular activity inhibition on attached cell and as decreasing tetracycline-treated barrier membrane, the number of attached cell were increased. These results might suggest that tetracycline-treated e-PTFE membrane showed relatively low proliferation rate of attached cells, but weak cytotoxic effect. So it is suggested tetracycline-treated e-PTFE membrane could bind gingival connective tissue normally and the healing site could gain stability.

창상치유과정에서 LED 광조사가 metalloproteinases 유전자 발현에 미치는 영향

김형수 전남대학교 대학원 2007 국내석사

창상 치유과정은 콜라겐 및 비콜라겐성 물질들의 침착과 함께 matrix metalloproteinases (MMPs)와 tissue inhibitors of metalloproteinase (TIMPs)에 의한 세포외기질(extracellular matrix)의 개형(remodeling)이 필요하다. 최근 LED 광 조사는 세포 증식을 가속화 시켜 창상 치유를 돕는다고 알려져 있으나, LED 광 조사에 의한 창상 치유 기전에 대해 알려진 바는 거의 없다. 본 연구는 치은섬유아세포에서 635nm LED 광 조사 후 창상 치유과정에 관여하는 세포외기질의 개형에 필요한 MMPs 및 TIMPs 효소의 발현정도를 알아보기 위해 시행하였다. 치은섬유아세포를 일차배양하고 아라키돈산 (Arachidonic acid, AA)을 처리하여 염증 모델을 만들었다. 이어 LED 광 조사를 시행하였고, cDNA microarray 분석을 시행하였다. 아무 처리도 하지 않은 대조군, 아라키돈산을 처리한 군 그리고 아라키돈산을 처리하고 LED 광 조사를 시행한 군 등 3군으로 나누어 실험을 진행하였다. MMP-1, -2, -3, -10, -11, -14, 16, 17 및 -25 그리고 TIMP-1, -2, -3 및 -4의 발현양의 차이가 있었다. 특히, TIMP-3 유전자는 아라키돈산으로 처리한 염증모델에 비해 LED 광 조사군에서 10배 이상 발현양이 감소하였다. 이상과 같은 결과에서 LEDs 광조사는 MMPs 와 TIMPs의 발현을 변화시켰으며 특히, TIMP-3가 가장 크게 발현 변화를 보였다. 이들의 발현 양상은 LED 광 조사가 치은섬유아세포의 증식과 세포외기질의 개형에 관여하여 창상 치유에 도움을 줄 것으로 추측되었다.