Pentoxifylline이 생쥐 정상 정자의 체외수정 및 초기 배아의 성장 발달에 미치는 영향에 관한 연구

김향미 梨花女子大學校 1996 국내박사

최근 정자 상태가 과소정자증이거나, 운동성이 아주 저하되어 수정이 안되는 남성불임의 치료에 대한 관심이 높아지게 되었고, 정자의 운동성을 증가 시키는 약물의 사용이 늘어나게 되었다. 체외에서 정자의 운동성을 증가 시키는 여러 가지 약물들이 보고되었으며, 그 중 methylxanthine계통의 약물이 정자의 대사 및 운동성을 증가 시킨다고 보고되었다. 이러한 약물의 사용으로 정자의 운동성이 증가되고, 첨체반응을 증가 시키는 효과가 있으므로, 사람의 아기 프로그램에서 수정을 촉진시키기 위해 흔히 사용되고 있다. 그러나 이러한 약물의 약리적인 작용과 독성이 초기배아 발달과 성장에 어떠한 영향을 미치는지, 또한 체외수정 시술 시에 사용될 수정 및 초기 배아의 발달, 착상 후의 배아 발달에 미치는 영향에 대해서는 아직 많은 연구가 되어있지 않은 상태이다. 따라서 본 연구에서는 생쥐 제 1대 잡종(C57BL x BCA)을 과배란 유도 후 획득된 난자의 체외수정 시술 시에 pentoxifylline(이하 PTX로 약함)으로 생식능력이 확인된 정상 정자를 처리하여 정자의 세척 유무에 따라서 남아 있는 PTX가 생쥐 난자의 체외수정 및 초기 배아의 성장발달에 미치는 영향을 비교 분석하였으며, 소량의 PTX를 생쥐 1-세포기 배아 및 2-세포기 배아의 배양 시 노출시켜 초기 배아의 발생에 미치는 영향을 비교분석하여 아래와 같은 결과를 얻었다. 1. 0, 3.6, 7.2 mM PTX 처리 후 세척한 정상정자를 이용하여 체외수정 시킨 결과, 수정률은 각각 92.5%, 48.8%, 36.8%로 3.6, 7.2mM PTX로 처리한 군에서 유의하게 수정률이 낮았지만, 부화 배반포로 성장 발달률은 각각 93.9%, 85.0%, 95.2%로 세균간에 유의한 차이는 없었다. 2. 0, 3.6, 7.2mM PTX처리 후 희석한 정상정자를 이용하여 체외수정 시킨 결과, 수정률은 각각 58.6%, 5.4%, 9.4%로 3.6, 7.2mM PTX로 처리한 군에서 유의하게 수정률이 낮았지만, 부화 배반포로의 성정 발달률은 각각 88.2%, 100%, 100%로 세 군간에 유의한 차이는 없었다. 3. 0, 3.6, 7.2mM PTX 처리 후 세척과 희석을 하지 않은 정상정자를 이용하여 체외수정 시킨 결과, 수정율은 각각 61.2%, 5.7%, 3.8%로 3.6, 7.2 mM PTX로 처리한 군에서 유의하게 수정률이 낮았으며, 부화배반포로의 성장발달률 또한 각각 73.3%, 0%, 0%로 3.6, 7.2mM PTX로 처리한 군에서 유의하게 낮았다. 4. 1-세포기 생쥐배아를 PTX의 농도 0, 5, 10, 50μM인 배양액에서 배양한 결과 부화 배반포로의 성장 발달률은 각각 87.5%, 86.0%, 90.0%, 82.0%로 PTX의 농도에 따른 성장발달률은 유의한 차이는 없었다. 5. 2-세포기 생쥐배아를 PTX의 농도 0, 5, 10, 50μM인 배양액에서 배양한 결과 부화 배반포로의 성장 발달률은 각각 90.5%, 85.7%, 88.9%, 93.7%로 PTX의 농도에 따른 성장발달률은 유의한 차이는 없었다. 체외수정 시술시에 수정능력을 향상시키기 위하여 사용되는 PTX는 생쥐의 체외수정을 위한 정상 정자의 배양시에 노출된 후 세척된 경우에 수정이 유의하게 저하되었으나 배아의 성장 발달에는 영향을 미치지 않았다. 또한 PTX 처리 후 희석하여 즉 PTX가 잔존하여 있는 경우에는 수정률이 유의하게 저하되었으나, 배아의 성장 발달에는 영향을 미치지 않았다. 또한 PTX에 지속적으로 노출된 경우에는 수정의 현저한 저하 및 성장 발달은 전혀되지 않았다. 결론적으로 정상정자에서는 PTX의 사용을 금해야 하며, 체외수정 시술시에 정자의 수정능력을 증가시키기 위하여 PTX가 사용되는 경우에는 적응증이 되는 경우에만 선별하여 사용되어야 하고, 철저한 세척을 통하여 약물을 완전히 저게하는 것이 난자의 수정 및 배아의 성장 발달에 영향을 미치지 않을 것이다. This study was carried out to investigate the effect of pentoxifylline on in vitro fertilization and development of preimplantation stage of mouse embryos. F1 hybrid mice was superovulated with PMSG/hCG and mouse oocytes were recruited. After the normal perms were incubated with PTX before in vitro fertilization, it was observed whether the fertilization and embryo development was affected or not by the sperm preparation (washing, dilution and no washing or no dilution). And after 1-cell and 2-cell stage of mouse embryos were incubated with PTX, the development to hatching blastocyst was also observed. When in vitro fertilization was revealed by using the washed normal sperms after 0, 3.6 and 7.2mM PTX incubation, the fertilization rates were 92.5%, 48.8% 36.8%, respectively. So 3.6 and 7.2mM groups presented significantly low fertilization rate, but the developmental rated were 93.9%, 85.5%, respectively. Therefore, there were no significant difference between each group. When in vitro fertilization was revealed by using the diluted normal sperms after 0, 3.6 and 7.2mM PTX incubation the fertilization rates were 58.6%, 5.4% 9.4% respectively. So 3.6 and 7.2mM groups presented significantly low fertilization rate. The developmental rates were 88.2%, 100%, 100%. And there were no significant difference between each group. When in vitro fertilization was revealed by using the not washed and not diluted normal sperms after 0, 3.6 and 7.2mM PTX incubation, the fertilization rates were 61.2%, 5.7%, 3.8% respectively. 3.6 and 7.2mM group presented significantly low fertilization rate. The developmental rates were 73.3% 0%, 0%, respectively. So 3.6, 7.2mM group presented significantly low developmental rate. After 1-cell stage of mouse embryos were incubated in 0, 5, 10, 50 M of PTX, the developmental rates were not significantly different among them. After 2-cell stage of mouse embryos were incubated in 0, 5, 10, 50 M of PTX, the developmental rates were not significantly different among them. In conclusion, when PTX is used in vitro fertilization program with normal sperms, it may affect the fertilization and embryo development in high concentration. And if PTX concentration is very low, the developmental rate would not be affected. So PTX must not be used to normal sperms and where use of PTX is indicated, it is recommended that remainder PTX must be removed as completely as possible.

Studies on the in vitro maturation and fertilization of equine oocytes : 馬における體外受精に關する硏究

최용호 Gifu University 1996 해외박사

도축장유래의 난소로부터 채취된 미성숙난자는 체외에서 성숙, 수정 및 발육을 거쳐 정상적인 개체로 될 수 있음이 소를 비롯한 가축에서 입증되었다. 그러나, 말에 있어서는 연구에 필요한 말 난자의 부족과 정자의 체외수정능획득을 위한 적절한 방법이 미확립된고로 30%이하의 낮은 수정률이 보고되었으며, 체외성숙유래의 체외수정란에서 출생한 망아지의 보고는 아직까지 없으며, 현재까지 보고된 것으로는 체내에서 성숙된 난자를 이용하여 체외수정된 난으로부터 단지 1두의 망아지가 1991년에 보고되었을 뿐이다. 따라서 본 연구에서는 한정된 도축장유래의 말 난소로부터 다량의 난자를 회수하는 방법 및 회수된 난자의 체외성숙률을 조사하였으며, 또한 여러 화학물질의 정자의 체외수정능획득 유기여부를 검토하였고, micromanipulation기법으로 microfertilization의 유용성을 검토하였다. 말 난자는 주사기를 이용한 난포흡입법과 5mm 간격으로 잘게 써는 slicing을 이용하였다. 난포흡입법으로는 1개의 난소당 1.8개의 난자를, slicing으로는 4.1개의 난자를 회수하였다. 회수된 직후 난자의 핵을 검사한 결과, germinal vesicle은 난포흡입법에서 채취된 난자중에서 난구세포가 긴밀하고 세포질이 구형인 군(A)은 97%, 난구세로가 긴밀하고 세포질이 반형인 군(B)은 66%, 난구세포가 확장된 군(C)은 48%, 기타(D) 50%였다. 반면에 slicing에서 채취된 난자중에서는 A, B, C, D 순서대로 91, 80, 52, 50%였다. 따라서 A, B군을 체외성숙실험에 이용하였다. 두가지 회수방법에 의해 채취된 난자을 혈청을 함유한 TCM199배지에서 경시적으로 체외성숙률을 검토한 결과, 양군에서 16-24시간에 유의적으로 증가한 후 32시간에 가장 높은 수치를 나타냈다. 계절번식동물인 말의 계절에 따른 난소에서의 난자의 회수률을 검사한 결과, 봄에는 5.8, 여름에는 3.6, 가을에는 4.0, 겨울에는 5.1개였다. 또한 품종에 따른 난자의 회수률에는 유의적인 차이가 있었으나 연령에는 관계가 없었다. 체외성숙률은 품종, drop내의 난자수, 혈청, 가스조건등에 영향을 받지는 않았으나 도살된 후 난소의 보관시간에는 유의적인 차이가 있었다. 동결융해한 말 정자를 여러 가지 화학물질(heparin, hypotaurine, caffeine, ionophore A23187)을 이용하여 체외에서 수정능획득을 유기한 후 체외수정실험에 이용하였다. 수정시에 정자의 운동성은 10-18%였으며, 첨체반응률은 0.1μM ionophore의 1분 처리를 제외하고 40%이상이였다. 32시간 체외에서 성숙 배양한 난자를 이용하여 체외수정 실험을 한 결과, 투명대가 부착된 난자에서는 극히 낮은 수정률을 나타냈으나, 투명대를 제거한 군에서는 0.1μM ionophore의 1분처리가 가장 높은 수정률을 나타냈다. 또한 난자를 다량의 난구세포가 부착된 군, 2-3층의 난구세포가 부착된군, 난구세포를 제거한 군, 투명대를 제거한 군으로 분류하여 체외수정 실험을 한 결과, 난구세포의 양과 관계없이 투명대가 부착된 군의 체외수정률은 극히 낮았다. 말의 체외수정에 있어서 정자의 투명대 통과가 쉽게 되지 않음이 입증됐다. 따라서, microfertilization의 한방법인 투명대부분절개와 이것을 개량한 투명대부분제거의 방법을 이용하여 정자의 투명대통과의 난관을 극복하려고 시도하였다. 현미경조작의 성공률은 90%였으며, 수정률은 투명대를 부분제거한 군이 부분절개한 군에 비해 유의적으로 높은 수치를 나타냈다. 투명대를 부분제거한 군의 정자침입은 배우자를 공배양후 2.5시간에 시작되었으며, 10시간에 처음으로 난자세포질에서 웅성전핵이 관찰되었다. 또한 수정란을 체외배양한 결과, 44세포까지 발육하였다. 체외수정률에 미치는 그외의 요인으로서 숫말의 개체차(3두)와 암말의 품종(2종)에 관해서 검토하였다. 숫말의 정자의 운동성은 5-17%였으며, 첨체반응률은 59-63%였으나, 수정률에는 숫말의 개체차에 따라 현저한 유의사가 있었다. 그러나, 암말의 품종에 따른 수정률에는 차이가 없었다. 이상의 결과로부터 다음과 같은 결과를 얻었다. 말의 있어서 slicing의 부족한 난자의 수를 증가시키는 효과적인 방법의 하나이며, 난포흡입법에서 채취된 난자와 동일하게 체외에서 성숙하는 능력을 가지고 있으며, 암말의 품종이 난자의 회수률에 영향을 미치고 도살후 난소의 보관시간이 체외성숙률에 미치는 요인등으로 나타났다. 또한 체외수정률이 낮은 말에서는 투명대를 부분제거함으로써 수정란을 보다 효율적으로 생산할 수 있으며, 수정률에는 숫말의 개체차가 현저한 것으로 시사됐다.

돼지 난자의 체외수정시 Adenosine di-phosphate(ADP)첨가가 배발달에 미치는 영향

이향흔 대구대학교 2002 국내석사

본 연구는 돼지 난포란을 NCSU 23, TCM-199 배양액으로 체외성숙 후, 동결정액을 이용하여 체외수정용 배양액에 ADP 첨��체외수정율, 다정자 침입율, 배발달율 및 배반포의 세포 수에 미치는 영향을 조사한 것으로 그 결과를 요약하면 다음과 같다. 1. 미성숙 난포란을 NCSU 23, TCM-199 배양액으로 체외성숙 시 성숙율은 NCSU 23 43.0%, TCM-199 53.4%로 유의차가 인정되지 않았다(P<0.05). 2. NCSU 23, TCM-199 배양액으로 체외성숙 후 체외수정 시 cafteine, caffeine+ADP, ADP 첨가에 따른 정상수정 및 다정자 침입율에는 유의차가 나타나지 않았으나, NCSU 23 배양액에서의 정상 수정율(45.8%)이 TCM-199 배양액의 수정율(33.3%)보다 높게 나타났다(P<0.05). 3, NCSU 23, TCM-199 배양액으로 체외성숙 후 체외수정 시 caffeine, caffeine+ADP, ADP 첨가에 따른 배발달율은 유의차가 나타나지 않았지만, NCSU 23 배양액에서의 수정율(71.1%)보다는 TCM-199 배양액에서의 수정율(87.3%)이 높게 나타났다(P<0.05). 4. 체외수정 시 ADP를 0, 0.1, 1㎍/㎖ 농도별로 첨가한 결과 배발달율이 17.4%, 23.7% 및 24.3%로 농도가 높을수록 배발달율이 증가하였다. 5. Caffeine의 농도와 ADP의 농도에 따른 배발달율을 조사하기 위해, caffeine 0.5, 1mM의 농도와 ADP 0, 1, 10, 20㎍/㎖의 농도에 따른 배발달율을 조사한 결과 caffeine과 ADP가 배발달에 영향을 미치지 않았다. 6. in vivo 수정란과 in vitro 수정란을 6일간 체외배양하여 배반포의 세포수를 조사한 결과 in vivo 수정란과 in vitro 수정란간에는 유의차가 나타났으며(P<0.05), 체외수정 시 caffeine, caffeine+ADP, ADP 첨가에 따른 배반포의 ICM, 총 세포 수에는 차이가 나타나지 않았으나, TE 세포 수는 NCSU 23 배양액의 caffeine 첨�맙【�가장 높게 나타났다 (P<0.05). This study was conducted to investigate the effect of ADP with mTBM in supporting of in vitro fertilization on porcine oocytes. The result of the examination were as follows: 1. When the immature oocytes with NCSU 23(43.0%) and TCM-199 (53.4%) media of in vitro maturation for 42~44h., no differences were detected in the maturation rate. 2. When the matured oocytes were fertilized in vitro in mTBM additived caffeine, caffeine and ADP, ADP, no differences were detected in the 2PN and polyspermy. But, sub-total 2PN is NCSU 23 (45.89%) medium higher than TCM-199 (33.3%) medium. 3. When the fertilized in vitro in mTBM additived caffeine, caffeine and ADP, ADP after matured oocytes in NCSU 23 and TCM-199 media no differences were detected in the blastocyst rate, but sub-total fertilized rate is in TCM-199(87.3%) medium higher than NCSU 23(71.7%) medium. 4. When the matured oocytes were fertilized in vitro in mTBM additived ADP concentration (0, 0.1, 1μg/mℓ) no differences were detected in the blastocyst rate, but blastocyst rate is 1 μg / mℓ (24.3%) higher than Opg/m4(17.4%) 5. When the matured oocytes were fertilized in vitro in mTBM additived with caffeine 0.5, 1mM and ADP 0, 1, 10, 20 μg / mℓ concentration, no differences were detected in the blastocyst rate. 6. After in vitro culture for 6 days, the ICM, TE and Total cells number were in vivo fertilized group higher than in vitro fertilized groups (P<0.05). But no differences were detected in the developmental rate and ICM, total cells number of porcine embryos additived with caffeine, caffeine and ADP, ADP in fertilization media. But, TE cells number is NCSU 23(32.7±2.1%) medium in caffeine additived group higher than in other groups.

한우 미성숙 난포란의 체외성숙, 체외수정 및 체외 배발달에 관한 연구

김은국 전남대학교 대학원 2000 국내석사

본 연구는 배양액에 hormone과 혈청 및 항산화제를 첨가시 한우 미성숙 난포란의 체외성숙과 정자의 수정능획득, 체외수정율, 그리고 수정란의 체외 배발달율에 미치는 효과를 조사하였다. 채취된 난포란의 등급별 분류 성적에서 A, B 등급인 난포란의 수는 Holstein 종에서 한우보다 약간 높았고, 난구세포의 확장 정도는 체외성숙 배양액에 PMSG, HCG 등의 호르몬을 첨가한 구에서 81.9 %∼87.6 %로 첨가하지 않은 구의 74.5 %∼81.7 % 보다 높았다. 체외수정율과 다정자 침입율은 배양액 내 FCS를 첨가 했을 때 각각 53.8 %∼55.0 %와 13.6 %∼14.2 %로 BSA나 bFF를 첨가했을때 보다 약간 높았고, 배양액내 FSH-LH 및 PMSG-HCG 첨가시 체외수정율과 다정자 침입율은 81.0 %∼81.6 %와 14.7 %∼16.1 % 및 72.9 %∼77.8 %와 14.3 %∼17.1 %로 처리구간에 큰 차이는 없었다. 정자의 수정능 획득 처리방법 중 heparin과 bFF 처리시 수정율은 각각 70.9 %와 66.2 %였고 웅성전핵 형성율은 48.8 %와 50.0 %로 대조구에 비해 유의적으로 높았다(P<0.05). 체외배발달 성적은 체외수정 후 난구세포가 부착된 수정란이 그렇지않은 것에 비하여 체외배발달율이 높게 나타났고, 체외발달배양액 중 CR_(1aa)(57.8 %)와 m-SOF(61.1 %)가 난할율은 좋았지만 유의적인 차이는 보이지 않았다(P<0.05). CR_(1aa)와 m-SOF 배양액에 FCS와 BSA를 첨가하여 배양한 결과 20 %의 FCS와 1 %의 BSA를 첨가한 구가 10 %의 FCS 와 0.4 %의 BSA 첨가구 보다 난할율 및 상실배와 배반포배 발달율이 높았다. 체외수정 후 1-2 세포기 체외수정란을 항산화제(α-tocopherol, L-ascorbic acid, cysteamine and selenium)가 첨가된 체외발달 배양액(CR_(1aa))에 옮겨 168시간동안 체외배양 시킨 결과 난할율에서는 유의적인 차이가 없었으나, α-tocopherol 2.5 μM 첨가시 11.0% 상실배와 6.0% 배반포배 발달율로 가장 좋은 성적을 나타냈고, L-ascorbic acid 첨가 배양시 4세포기 난할율은 항산화제 첨가구에서 46.7∼53.7%로 대조구 43.1%보다 유의적으로 높았다(P<0.05). 또 상실배발달율에 있어서는 첨가구가 약간 높은 발달율을 보였으나 유의성은 인정되지 않았고, 배반포배 발달율블 50 μM 첨가구에서 7.5%를 보임으로서 유의적인 차이가 나타났다(P<0.05). cysteamine을 첨가했을 경우 100 μM 첨가구에서 좋은 발달율을 보였는데, 4세포기 발달율이 50.0∼61.8%로 대조구 50.0%보다 높았고, 상실배 발달율 에서도 대조구보다 유의적으로 높은 발달율을 보였다(P<0.05). selenium을 첨가했을 경우에도 다른 항산화제 첨가결과와 마찬가지로 대조구보다 높은 발달율을 보였는데, 200 μM 첨가구에서 9.4%의 배반포배 발달율을 보임으로서 대조구에 비해 높은 발달율을 보였다(P<0.05). 따라서 소 미성숙 난포란의 체외성숙 및 수정, 체외배양을 효과적으로 하기 위해서는 난포란을 등급별로 구분하여 호르몬 및 혈청을 첨가한 배양액에서 체외 성숙 및 수정을 시킨 후 적정량의 항산화제를 첨가한 체외배양액에서 배양하는 것이 체외수정란의 체외발생능 정지현상(in vitro cell block)을 극복하여 체외 발달율을 높일 수 있으리라 사료된다. These studies were carried out to investigate the effects of hormones, serum, anti-oxidants addition and composition of culture media(FCS, BSA and bFF) on the in vitro maturation, sperm capacitation, sperm penetration, polyspermy and in vitro developmental rates of follicular oocytes of the korean native cattles. The Holstein oocytes classified as grade A and B wre higher than korean nateve cattle. And the cumulus cell expantion rate of oocytes cultured in TCM-199 and Ham's F-10 medium supplemented with 10 % FCS and hormones were higher(81.9 %∼87.6 %) than non-treated groups(74.5 %∼81.7 %). The fertilization and poly-spermy rate of in vitro maturation oocytes, cultured in TCM-199 and Ham's F-10 medium supplemented with 10 % FCS, 1 % BSA and 10 % bFF were 53.8 %∼55.0 %, 51.4 %∼52.6 %, 47.0 %∼50.0 % and 13.6 % 142 %, 10.0 %∼11.1 %, 10.0 % respectively. The FSH-LH treatment was the highest fertilization and poly-spermy rate in medium containing of PMSG-HCG. The fertilization and male pronuclear formation rate of follicular oocytes, fertilized with capacitated spermatozoas by heparin and bFF methods were 70.9 %, 66.2 % and 48.8 %, 50.0 % respectively. And the fertilization and male pronuclear formation rate were higher method of heparin than other methods. When the in vitro fertilized oocytes were co-cultured with cumulus cells, the development rate to be morula and blastocyst was 22.7 % and the rates were higher than of without cumulus cells, 78 %(P<0.05). The embryos developed rate to morula and blastocyste stages in TCM-199, Ham's F-10, CR_(1aa) and m-SOF medium containing 10 % FCS were 20.0 %, 17.8 %, 23.1 %, and 23.6 %. The embryos developed rate of oocytes cultured in CR_(1aa) and m-SOF were higher than those of oocytes cultured in TCM-199 and Ham's F-10. The embryos developed from IVM, IVF were cultured in different culture medium with 20 %, 10 % FCS or 0.4 %, 1 % BSA in CR_(1aa) and m-SOF. The higher developmental rates of IVM, IVF embryos developed beyond morula and blastocyte stages were obtained in cultuer medium with 20 % FCS group(22.9 %∼22.9 %) than those of 10 % FCS group(15.4 %∼17.1 %), 1 % BSA group(16.7 %∼20.0 %) and 0.4 % BSA group(14.3 %∼15.2 %, P<0.05). The cleavage rate of fertilized oocytes in CR_(1aa) containing α-tocopherol, L-ascorbic, cysteamine and selenium were no significantly control group. However the fertilized oocytes were cultured for 168 hrs in culture medium with 2.5 μM α-tocopherol, the morulae and blastocyst rate were significantly higher than control group(P<0.05). When the oocytes were cultured with L-ascorbic acid, the 4cell development rate were 46.7%∼53.7%. The morulae rate were no significantly and the blastocysts rate were significantly higher than control group(P<0.05). When the oocytes were cultured with 100 μM cysteamine, the 4cell development rate were significantly higher(50.0%∼61.8%) than control group(50.0%, P<0.05). Morulae and blastocyst rate were higher than control group. The blastocysts development rate of oocytes cultured with 200 μM selenium were 9.4%. There were significantly higher than control group(3.3%, P<0.05). Addition of 2.5 μM α-tocopherol, 50 μM L-ascorbic acid, 100 μM cysteamine and 200 μM selenium to the culture medium increase the incidence of embryos developed to the morulae and blastocyst. The present results indicated that the in vitro maturation and culture medium supplemented with hormones, serum and anti-oxidant can increase the proportion of maturation, fertilization and developed into morula and blastocysts stage embryos.

생쥐卵子의 核成熟과 透明帶硬化가 體外受精과 胚發生에 미치는 影響

이상진 建國大學校 大學院 1990 국내박사

本 硏究에서는 ICR 系統의 생쥐로 부터 排卵直後의 성숙한 卵子와 卵巢內 未成熟 卵子를 채취하여 固定, 染色한 다음, 核成熟度, 體外受精率 및 胚發達率을 검토하는 한편, 卵子의 體外培養時 발생하는 透明帶 硬化現狀의 原因을 파악하고, 이를 극복하기 위한 방법으로 透明帶 硬化環狀을 억제하는 peroxidase inhibitors와 tyrosine analog를 培養液에 첨가하여 그 효과를 분석함과 동시에 zona drilling 技法을 활용하여 體外受精의 효율을 증진시키고자 시도하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 1. 體外受精用 卵子의 一般的 特性 1) 排卵은 hCG 주사후 11-13시간째에 일어나기 시작하여 14시간째에는 모든 생쥐에서 排卵이 유도되었으며, 排卵된 卵子의 核成熟度는 metapse Ⅰ, anaphase Ⅰ, telophase Ⅰ 및 metaphase Ⅱ의 상태였고, 주로 metaphase Ⅰ과 metaphase Ⅱ 단계의 卵子가 대부분이었다. 또 metaphase Ⅰ의 核狀을 가진 卵子는 시간의 경과와 더블어 성숙하는 경향을 보였다. 2) 受精能을 획득한 精巢上體尾部의 精子로 hCG 투여후 12, 13, 14 및 15시간째에 채취한 卵子를 體外受精시킨 결과, 受精率은 각각 77.4, 76.1, 76.9 및 68.1%이였으나, 채취 시간이 hCG투여 20시간까지 지연될수록 受精率은 감소하는 경향을 보였으며, 受精이 되지않는 卵子의 核狀은 주로 metaphase Ⅰ(2.4-31.1%)과 metaphase Ⅱ(32.0-38.8%) 단계가 대부분이었다. 3) 排卵된 卵子를 체외에서 0, 3, 6, 9 및 12시간 동안 培養했을 때의 體外受精率은 卵丘細胞가 부착된 것은 각각 70.4, 65.0, 57.1, 65.1 및 20.5%였고, 卵丘細胞가 제거된 것은 각각 67.5, 46.2, 43.6, 34.8 및 22.3%로써, 卵丘細胞가 부착된 것이 양호했으며, 兩者 다같이 培養시간이 연장됨에 따라 體外受精率은 감소하는 경향을 보였다. 즉 體外培養 3, 6, 및 9시간째의 體外受精率은 0시간째의 그것과 유사하였으나, 培養 12시간째는 有意하게 낮아졌다(P<0.01). 4) 체외에서 0시간 동안 培養된 다음, 受精된 卵子가 胚盤胞期로 발달하는 比率은 卵丘細胞가 부착된 것은 43.5%였고, 卵丘細胞가 제거된 것은 34.0%로써, 前者가 後者보다 양호하였으나, 有意差는 인정되지 않았다. 그러나 培養時間을 6시간과 9시간으로 연장했을 때에는 卵丘細胞가 부착된 것이 제거된 것보다 有意하게 높았다(P<0.01). 2. 卵子의 核成熟과 體外受精 1) 排卵된 卵子를 供試하여 卵丘細胞가 體外受精에 미치는 영향을 검토한 결과, 卵丘細胞를 제거하지 않은 卵子의 體外受精率은 52.4%인데 대하여 卵丘細胞를 제거한 卵子의 그것은 49.8%로 兩者사이에 有意差가 인정되지 않았다. 또 第 1 極體를 가진 成熟卵子와 그것을 가지지 많은 未成熟 卵子의 體外受精率은 平均 50.0%와 45.7%로 兩者사이에는 역시 有意差가 없었다. 2) 체외에서 성숙된 卵巢內 卵母細胞의 核狀은 GV, condensing GV, prometaphase Ⅰ, metaphase Ⅰ, anaphase Ⅰ, telophase Ⅰ, chromatin mass, prometaphase Ⅱ 및 metaphase Ⅱ等이었으며, 이들 중, metaphase Ⅰ의 核狀은 培養 3시간째 부터 나타나기 시작하여 8시간째에는 30.0%로 증가하였다. metaphase Ⅱ의 核狀은 培養 10시간째 부터 나타나기 시작하여 12시간부터 17시간사이에는 32.8-53.7%로 증가하였다. 3) 卵丘細胞를 제거한 다음, 체외에서 성숙시킨 卵巢內 卵母細胞는 培養 3시간째부터 metaphase Ⅰ의 核狀이 나타나기 시작하여 培養 17시간째에는 3.6-46.7%로 차츰 증가하다가 그후 다시 감소하는 경향을 나타내었고, metaphase Ⅱ의 核狀은 培養 10시간째 부터 관찰되기 시작하여 17시간째에는 38.6%로 시간의 경과와 더불어 계속 증가하였다. 또 hCG 투여후 12시간 까지 매 時間別로 卵巢內 卵母細胞를 회수하여 체내에서 성숙한 卵母細胞의 核狀을 관찰한 결과, metaphase Ⅰ은 6시간째 부터 나타나기 시작하여 12시간째에는 4.5-31.5%로 증가하였고, metaphase Ⅱ 단계의 卵子는 9시간째 부터 나타나기 시작하여 12시간째는 56.1%에 달했다. 4) hCG 투여후 매 2시간 간격으로 卵子를 채취하여 즉시 授精시킨 다음, 培養 5시간째에 회수하여 受精 여부를 관찰한 결과, 모든 核狀의 卵子에서 精子의 침입이 확인되었으며, hCG 투여후 0, 2, 4, 6, 8 및 10시간째에 채취된 卵子의 精子侵入率은 각각 13.3, 16.7, 22.4, 16.1, 26.8 및 47.5%로 hCG 투여후 卵子 채취까지의 시간이 지연될수록 精子 侵入率도 점차 증가하였다. 5) HCG 주사후 7, 8, 9 및 10시간째에 회수된 卵子를 체외에서 授精시틴후 1시간째에 회수하여 培養한 결과, 受精된 卵子가 2-細胞期로 발달하는 比率은 각각 29.6, 30.7, 36.0 및 47.7%였으며, 胚盤胞로의 發達率은 각각 4.2, 11.1, 8.3 및 11.5%로써, hCG 투여후 卵子를 회수하기 까지의 시간이 연장될수록 體外發生率은 높아지는 경향을 보였다. 6) hCG 주사후 10시간째에 회수된 排卵直前의 卵母細胞틀 0, 2, 4 및 6시간 동안 前培養 처리를 실시한 결과, 第 2 減數分烈의 中期까지 성숙한 卵子의 比率은 각각 15.8, 36.4, 47.5 및 66.7%로 前培養 시간이 길어질수록 증가하는 경향을 보였으며, 특히 前培萎 6시간째에 회수된 卵子의 66.7%는 排卵卵子의 62.3%보다도 오히려 양호하였다. 7) hCG 주사후 10시간째에 회수한 排卵直前의 卵母細胞를 0, 2, 4 및 6시간 동안 前培養 處理를 실시한 다음, 體外受精을 유도한 결과, 卵丘細胞가 제거되지 않은 卵子의 경우는 각각 41.0, 58.7, 68.7 및 75.6%였고, 卵丘細胞가 제거된 裸化卵子의 경우는 각각 50.0, 45.1, 37.8 및 39.2%로써, 특히 卵丘細胞가 부착된 卵子의 授精率은 前培養 시간의 연장과 더불어 증가했으나, 裸化卵子의 경우는 이와는 반대 경향을 보였다. 또 이렇게 受精된 卵子를 체외에서 培養할 결과, 桑實胚와 胚盤胞까지 발달하는 比率은 卵丘細胞가 제거되지 않은 경우는 각각 48.4, 57.1, 57.5 및 65.5%와 28.1, 39.3, 42.5 및 44.0%었고, 裸化卵子의 경우는 각각 23.4, 32.6, 35.6 및 34.5%와 12.5, 32.6, 24.4 및 15.5%로저, 受精率의 경우와 마찬가지로 卵丘細胞의 긍정적 효과가 인정되었다. 8) PMSG 투여후 채취한 卵巢內 卵母細胞를 채외에서 15-17시간 동안 培養한 다음 體外受精을 유도한 결과, 卵丘細胞가 부착된 卵子의 體外受精率은 31.7%였고, 卵丘細胞가 제거된 卵子의 그것은 22.2%로써, 排卵된 卵子를 供試한 對照區의 76.9% 보다는 有意하게 낮았으나(P<0.05), 卵丘細胞의 有·無에 따른 차이는 인정되지 않았다. 또 이렇게 受精된 受精卵이 체외에서 발달하는 比率은 각각 17.1%와 3.3%로써, 排卵된 卵子의 54.2%보다 有意하게(P<0.01) 낮았다. 3. 透明帶 硬化現狀과 體外受精 1) 未受精卵, 授精後 受精에 실패한 老化卵子 및 前核期 受精卵의 透明帶의 溶解에 소요되는 시간은(t_(50))는 각각 10.0±4.9, 20.2±5.8 및 32.2±5.9분으로써, 溶解速度는 未受精卵이 가장 빨랐고, 이어 受精에 실패한 老化卵子였으며, 前核期 受精卵이 가장 늦었다. 2) 排卵된 卵子를 체외에서 0, 3, 6, 9 및 12시간 동안 培養했을 때, 透明帶 溶解에 소요되는 시간은 卵丘細胞가 부착된 卵子는 각각 13.8±6.2, 11.0±4.5, 20.7±3.1 및 28.0±3.0분이었고, 卵丘細胞가 제거된 卵子의 그것은 각각 22.3±3.5, 21.0±4.1, 30.0±1.0 및 33.5±3.5분으로써, 兩者 다같이 培養시간이 길어질수록 溶解速度는 떨어졌다. 그리고 total hardening은 卵子細胞가 부착된 卵子의 경우, 培養 6시간째 까지는 인정되지 않았으나, 9시간째 부터 나타나기 시작했고, 卵丘細胞가 제거된 卵子의 경우는 透明帶 硬化現狀이 더욱 신속하게 그리고 현저하게 나타났다. 3) PMSG 처리후, 46-48시간째에 회수한 卵巢內 卵母細胞물 체외에서 0, 5, 10 및 15시간 동안 培養한 결과, 透明帶 溶解에 소요되는 시간은 卵丘細胞가 부착된 卵母細胞는 각각 3.0±2.5, 10.5±4.5, 18.3±5.7 및 24.5±1.5분이었고, 卵丘細胞가 제거된 卵母細胞는 각각 3.0±2.5, 14.0±1.6, 26.2±3.3 및 32.0±4.1분으로써, 卵丘細胞의 有·無에 관계없이 體外成熟 시간이 연장될수록 溶解速度는 떨어졌고, 특히 卵益細胞가 제거된 卵子의 경우가 현저했는데 이는 卵丘細胞가 透明帶 硬化現狀을 억제하기 때문인 것으로 생각된다. 4) Ca-ionophore를 처리한 다음, 1, 2 및 3시간 동안 培養한 卵子의 透明帶 溶解에 소요되는 시간은 각각 25.0±1.9, 31.6±4.2 및 40.5±4.5분이었고, DMSO 處理卵子의 그것은 각각 9.7±3.7, 10.8±1.5 및 15.5±1.8분으로써, Ca-ionophore의 處理에 의해 有意하게 透明帶 硬化現狀이 유기되었다. 5) Ca-ionophore(20μM) 培養液에 peroxidase inhibitors인 phenylhyrazine, glycine ethyl ester, sodium sulfite 및 sodium azide를 첨가한 결과, 透明帶 硬化現狀의 抑制效果가 가장 높은 것은 glycine ethyl ester였고, 이어 sodium sulfite였으며, phenylhydrazine과 sodium azide가 가장 낮았다. 또 Ca-ionophore로 처리된 卵子에 tyramine(12.5mM)을 첨가하여 2시간 동안 培養한 결과, 透明帶 硬化現狀이 억제되었으며, 그 抑制效率은 14.3%였다. 6) 培養液에 外因性 peroxidase인 horseradishperoxidase를 첨가한 결과, 透明帶 溶解에 소요되는 시간이 연장되는 것으로 보아 透明帶 硬化現狀을 일으키는 原因物質은 ovoperoxidase라고 판단되었다. 7) Peroxidase inhibitors와 tyrosine analog를 體外受精用 培養液에 첨가한 결과, glycine ethyl ester, sodium sulfite 및 sodium azide 等과 같은 inhibitors 添加區에서는 受精에 供試된 모든 卵子가 퇴행하였고, phenylhydrazine과 tyramine添加區의 受精率은 각각 62.3%와 88.2%로써 透明帶 硬化現狀의 실질적인 抑制效果가 인정되었다. 그러나 이러한 효과도 體外成熟 卵巢內 卵母細胞에 대해서는 인정되지 않는 점으로 보아 受精卵 혹은 單位發生卵의 경우와는 달리 體外成熟 卵巢內 卵母細胞의 透明帶 硬化現狀에는 ovoperoxidase가 관여하지 않는 것으로 생각된다. 4. Zona Drilling과 醴外受精 1) 體外受精에 있어서 精子濃度를 10^(6), 10^(5), 10^(4), 및 10^(3)/ml로 조정했을 때의 體外受精率은 zona drilling 처리를 실시하지 많은 卵子의 경우는 각각 58.0, 52.0, 12.0 및 8.0 %였고, Drilling 處理를 실시한 卵子는 각각 86.0, 81.0, 70.0 및 50 %로 모든 精子濃度에서 處理區의 성적이 對照區의 그것보다 有意하게 높았다(P<0.01). 특히 處理區의 경우, 精子濃度가 가장 낮은 10^(3)/ml에서도 50% 이상의 높은 受精率이 얻어졌다. 그러나 多精子 侵入率은 精子濃度에 관계없이 對照區와 處理區 다같이 10%이하였다. 또 精子濃度別로 受精된 卵子가 胚盤胞로 발달하는 比率은 處理區는 각각 51.4, 40.5, 23.3 및 17.4%인데 비해 對照區의 그것은 각각 35.7, 26.3, 0 및 0%로 處理區의 성적이 양호하였다. 2) PMSG을 처리한 후, 46-48시간째에 채취한 卵巢內 卵母細胞물 체외에서 15-17시간 동안 성숙시킨 다음, 卵丘細胞를 제거하고, zona driling處理를 실시하여 受精된 卵子의 體外發生을 조사한 걸과, 對照區의 體外受精率은 31.7%인데 비해 zona drilling 處理區의 그것은 51.4%로써, 有意(P<0.05)하게 높았다. 處理卵子中에서도 第 1 極體를 가진 成熟卵의 體外受精奉率은 58.3%인데 대해 第 1 極體를 가지지 않은 未成熟卵의 그것은 23.3%로써, 成熟卵의 受精率이 未成熟卵의 그것보다 有意하게 높았다(P<0.05). 또 zona drilling된 卵子가 受精後, 2-細胞期 까지 발달하는 比率은 第 1 極體를 가진 成熟卵의 경우는 60.0%인데 비해 第 1 極體를 가지지 않은 未成熟卵의 그것은 45.2%로써, 兩區間에 有意차는 인정되지 않았다. 그러나 第 1 極體의 有·無에 관계없이 zona drilling處理後 受精된 卵子가 2-細胞期로 발달하는 比率은 平均 57.5%로 對照區의 84.3%보다 有意하게 낮았다(P<0.01). 또 桑實胚와 胚盤胞期로 발달하는 卵子의 比率은 處理區의 경우, 각각 23.8%와 19.0%로써, 對照區의 22.9%와 17.1%와는 有意差가 인정되지 않았다. 3) hCG 주사후 14-16시간째에 회수된 排卵卵子를 體外受精시킨 후, 受精에 실패한 卵子을 zona drilling한 다음, 再授精을 실시한 결과, 體外受精率은 83.5%로써, 對照區의 34.7%보다 有意하게 높았으나(P<0.01), 受精된 卵子가 胚盤胞로 발달하는 比率은 18.6%로써, 對照區의 27.3%보다 낮았다. These experiments were carried out to investigate whether the nuclear maturation and zona hardening of oocytes affect in vitro fertilization and whether the application of zona drilling elevate tile rate of in vitro fertilization of oocytes recovered from ICR strained mice. The rates of nuclear maturation, in vitro fertilization, and embryonic development were examined in the ovulated mature and the ovarian immature oocytes after fixing and staining them. In addition, it was investigated to explain the phenomena and causes of zona hardening which occurred in cultured oocytes in a chemically defined medium. Finally, to study the effect of micromanipulation and acid tyrode's solution, the rates of in vitro fertilization and embryonic development of oocytes were examined after zona drilling and after adding peroxidase inhibitors and tyrosine analogues to culture medium. The results from these experiments are summarized as follows : 1. Physiological characteristics of mouse oocytes for in vitro fertilization. 1) Ovulation began at 11-l3hr and occured in all mice at 14hr after hCG injection. In the nuclear maturation of recovered oocytes, most of them were at metaphase Ⅰ and metaphase Ⅱ stages and the rest were at anaphase Ⅰ and terophase Ⅰ stages, indicating that oocytes at metaphase Ⅰ were further developed with de laying the oocyte recovery. 2) When oocytes were inseminated with capacitated epididymal spermatozoa, the rates of in vitro fertilization of oocytes recovered at 12, 13, 14, and 15hr after hCG injection were 77.4, 76.1, 76.9, and 68.1%, respectively, showing the declined rates with delaying the time of oocyte recovery to 20hr after hCG injection. Most of unfertilized oocytes were at the stages of metaphase Ⅰ (2.4-31.1%) and metaphase Ⅱ (32.0-38.8%). 3) The rates of in vitro fertilization of oocytes cultured for 0, 3, 5, 9, and 12hr were 70.4, 65.0, 57.1, 65.1, and 20.5%, respectively, in cumulus-intact oocytes and 67.5, 46.2, 43.5, 34.8, and 22.3%, respectively, in cumulus-free oocytes, showing the higher rates in cumulus-intact oocytes and the declined rates with increasing the time of culture regardless of the presence or absence of cumulus eel Is. In fact, the fertilization rates were no differences between the cultured oocytes for 3-9hr and for Ohr(control) hut the rates of cultured oocytes for 12hr were significantly decreased comparing to those of control (P<0.01). 4) The embryonic developmental rates of fertilized oocytes without preincubation to blastocysts were 43.5% in cumulus-intact oocytes, and 34.0% in cumulus-free oocytes. These rates were slightly higher in cumulus-intact oocytes than in cumulus-free oocytes but were no significant differences. However, in 1.he cultured oocytes for 6 and 9hr, the rates of cumulus-intact oocytes were significantly higher than those of cumulus-free oocytes (P<0.01). 2. The nuclear saturation and in vitro fertilization of oocytes. 1) In the experiment to investigate the effect of cumulus cells on in vitro fertilization, the fertilization rates were 52.4% in cumulus-intact oocytes and 49.8% in cumulus-free oocytes, showing no significant effect of cumulus cells. Similarily, there were no significant differences between the rates, 50.0%, of mature oocytes with first polar body and 45.7% of immature oocytes without first polar body. 2) The stages of nuclear maturation of ovarian oocytes matured in vitro were germinal vesicle(GV), condensing GV, prometaphase Ⅰ, metaphase Ⅰ, anaphase Ⅰ, terophase Ⅰ, chromatin mass, prometaphase Ⅱ, and metaphase Ⅱ. The oocytes at metaphase Ⅰ appearing at 3hr of culture increased to 80% of examined oocytes at 8hr of culture, while the oocytes at metaphase Ⅱ appearing at 10hr of culture increased to 32.8-53.7% at 12hr of culture. 3) Of the ovarian oocytes matured in vitro without cumulus cells, the metaphase Ⅰ oocytes appearing at 3hr of culture gradually increased to 3.5-46.7% of examined oocytes at 17hr of culture and then decreased. The metaphase Ⅱ oocytes appearing at 10hr of culture increased to 38.6% at 17hr of culture, In the nuclear maturation of ovarian oocytes recovered every hours for 12hr after hCG injection, the oocytes at metaphase Ⅰ appearing at 6hr of culture increased to 4.5-31.8% at 12hr, while the oocytes at metaphase Ⅱ appearing at 9hr increased to 56.1% at 12hr. 4) In the fertilization of oocytes inseminated with spermatozoa and incubated for 5hr, the sperm penetrated oocytes were found at every stages of nuclear maturation. The peneration rates of oocytes recovered at 0, 2, 4, 6, 8, and 10hr after hCG injection were 13.3, 16.7, 22.4, 16.1, 26.8, and 47.5%, respectively, shooing the increased rates with delaying the time of oocyte recovery. 5) Of fertilized egg of oocytes recovered at 7, 8, 9, and 10hr after hCG injection, inseminated, and cultured for 1hr, the developmental rates to 2-cells were 29.6, 30.7, 36.0, and 47.7%, and to blastocysts were 4.2, 11.1, 8.3, and 11.5%, respectively, according to the tire of oocyte recovery. These results suggested that the developmental rates were increased with delaying the time of oocyte recovery after hCG injection. 6) Of preovulatory oocytes recovered 10hr after hCG injection and preincubated for 0, 2, 4, and 6hr, the oocytes at metaphase Ⅱ were 15.8, 36.4, 47.5, and 65.7%, respectively, shoring the more metaphase Ⅱ oocytes among them preincubated for longer time. Especially, the oocytes preincubated for 6hrs were 66.7% at metaphase Ⅱ more than 62.3% of the ovulated oocytes. 7) Of preovulatory oocytes recovered 10 after hCG injection and preincubated for 0, 2, 4, and 6hr, the rates of in vitro fertilization were 41.0, 58.7, 68.7, and 75.6%, respectively in cumulus-intact oocytes and 50.0, 45.1, 37.8, and 39.2%, respectively in cumulus-free oocytes. These data indicated that the rates were improved with increasing the incubation time in cumulus-intact oocytes but decreased in cumulus-free oocytes. Moreover, the embryonic developmental rates of these fertilized oocytes to morula and to blastocysts were 48.4, 57.1, 57.5, and 65.5%, and 28.1, 39.3, 42.5, and 44.0%, respectively in cumulus-intact oocytes, and 23.4, 32.6, 35.6, and 34.5%, and 12.5, 32.6, 24.4, and 15.5%, respectively in cumulus-free oocytes. As shown in the fertilization rates, the positive effect of cumulus eel Is was observed. 8) Of ovarian oocytes recovered after PMSG infection and preincubated for 15-l7hr, the rates of in vitro fertilization were 31.7% in cumulus-intact oocytes and 22.2% in cumulus-free oocytes, respectively. These rates were significantly lower than 75.9% of ovulated oocytes(P<0.05) but not different between the cumulus intact and free oocytes. Their embryonic developmental rates to blastocysts were 17.1 and 3.3% in the cumulus intact and free oocytes, respectively, showing the significant lower rates than 54.2% of ovulated oocytes(P<0.01). 3. Zona hardening and in vitro fertilization. 1) The time for zona lysis(t_(50)) of unfertilized oocytes, unfertilized oocytes at first insemination, and zygotes were 10.0, 20.2, and 32.2min., respectively, shoring the fast lysis occured in unfertilized oocytes. 2) T_(50) of ovulated oocytes incubated for 0, 3, 6, 9, and 12hr were 13.8, 11.0, 20.7, and 28.0min., respectively in cumulus-intact oocytes, and were 22.3, 21.0, 30.0, and 33.5min., respectively in cumulus-free oocytes. These results showed the longer oocytes incubated, the greater t_(50) were, regardless of the presence or absence of cumulus cells. In addition, total hardening was not observed at 6hr but at 9hr of culture in cumulus-intact oocytes. This phenomenon appeared obviously at the shorter times of culture in cumulus-intact oocytes compared to cumulus-free oocytes. 3) Of ovarian oocytes recovered 46-48hr after PMSG injection and incubated for 0, 5, 10, and 15hr, t_(50) were 3.0, 10.5, 18.3. and 24.5 nin., respectively in cumulus-intact oocytes and 3.0, 14.0, 26.2, and 32.0min., respectively in cumulus-free oocytes, shoring the greater t_(50) with increasing the incubation time of oocytes. T_(50) in cumulus-free ooeytes were apparently greater than those in cumulus-intact oocytes, shoring that cumulus cells prevented zona hardening. 4) Of incubated oocytes for 1, 2, and 3hr after Ca-ionophore treatment, t_(50) were 25.0, 31.6, and 40.5min., respectively. T_(50) of those oocytes after DMSO were 9,7, 10.8, and 15.5min., respectively. These data were shown that Ca-ionophore induced zona hardening more effectively than DMSO. 5) In the experiment to study the effects of reroxidase inhibitors, i.e. phenylhydrazine, glycine ethyl ester, sodium sulfite, and sodium azide on zona hardening of ionophore treated oocytes, glycine ethyl ester were the most effective to block zona hardening and sodium sulfite was followed, while phenylhydrazine and sodium azide had a little effect. In addition, the inhibition of zona hardening of Ca-ionophore treated oocytes by 2hr incubation with tyramine(12.5mM) was observed and its rate was 14.3%. 6) Addition of exogeneous peroxidase, horseradishperoxidase to culture media increased the t_(50) of oocytes, indicating that the ovoperoxidase is a inducing factor of zona hardening. 7) In the experiment to examine the effect of peroxidase inhibitors and tyrosine analogue on in titre fertilization, the treated oocytes with glycine ethyl ester, sodium sulfite, or sodium azide were degenerated, while the treated oocytes with penylhydrazine or tyramine were fertilized in vitro at 62.3 and 88.2%, respectively, showing that tyrosine analogue inhibited the zona hardening. However, they had no significant effect on oocytes matured in vitro. Therefore, ovoperoxidase may not be involved in zona Hardening of in vitro matured oocytes but in zona hardening of embryos or parthenogenetic oocytes. 4. Zona drilling and in vitro fertilozation. 1) The fertilization rates of oocytes inseminated with different concentrations 10^(6), 10^(5), 10^(4), and 10^(3)/ml of sperm were 55.0, 52.0, 12.0, and 8.0%, respectively without zona drilling and 86.0, 81.0, 70.0, and 54.0%, respectively with zona drilling, shoring the significantly higher rates after zona drilling(P<0.01). Remarkably, the rates of zona drilled oocytes were more than 50% at the lowest concentration, 10^(3)/ml of sperm. The polyspermy rates of intact and zona drilled oocytes were similarly less than 10% regardless of sperm concentration. The embryonic developmental rates of fertilized oocytes to blastocysts were 51.4, 40.5, 23.3, and 17.4%, respectively in zona drilled oocytes and 35.7, 26.3, 0, and 0%, respectively In intact oocytes according to sperm concentrations. 2) The fertilization rates were 51.4% in oocytes recovered 4G-48hr after PMSG injection, removed cumulus cells, drilled zona pallucida, and then inseminated with sperm. These rates were significantly higher than the rates, 31.7% of untreated oocytes(P<0.05). Among the treated oocytes, the fertilization rates of oocytes with first polar body were 58.3%, while the rates of immature oocytes without first polar body were 46.2%, showing the significantly higher rates in the treated oocytes. There were no significant differences in the developmental rates to 2-cells between oocytes with and without first polar body, showing the rates, 60.0% and 46.2, respectively. However, the mean of these rates of zona drilled oocytes was 57.5% and showed the significantly lower rate than the rates, 84.3% in the untreated oocytes. Furthermore, there were no significant differences in the developmental rates to molura and blastocysts between 23.8 and 19.0%, respectively in the treated oocytes and 22.9 and 17.1%, respectively in the untreated oocytes. 3) Unfertilized oocytes at first insemination among recovered oocytes 14-16hr after hCG injection were reinseminated after zona drilling. The fertilization rates of these oocytes were 83.5% and showed the significantly higher rates than the rates 34.7% in the untreated oocytes(P<0.01). However, the developmental rates of these oocytes to blastocysts were 18.6%, and showed the lower rates compared to control (27.3%).

顆粒膜細胞와 蛋白質分解酵素가 牛卵胞卵의 體外受精과 發達에 미치는 影響

박태균 建國大學校 大學院 1990 국내석사

本 硏究에서는 蛋白分解酪素와 顆粒膜細胞가 牛卵胞卵의 體外成熟, 體外愛情 및 體外胚達端에 미치는 影響을 조사하여 다음과 같은 結果를 얻었다. 1. 蛋白質分解酵素인 Plasmin(2000ng/ml), Trypsin(10ng/ml), 및 Thrombin (10,000ng/ml) 을 添加하여 牛卵胞卵을 培養한 結果, Metaphase Ⅱ 단계에까지 도달한 卵胞卵의 比率은 각각 76.1%, 75.0 %및74. 0 %로 對照區의 72.1 %와는 有意差가 없었다. 2. plasmin (2000ng/ml), Trypsin(10ng/ml) 및 Thrombin(10,000ng/ml), 添加區의 體外受精率은 각각 58.3% , 65.1% 및 55.4%로 對照區의 42.4 % 보다는 양호한 成績을 나타내었다. 특히 Trypsin 添加區는 對照區와 有意差가 인정되었다(P<0.05). 3. 受精卵의 體外培養을 실시한 結果, 2細胞期까지 發達한 胚의 비율은 Plasmin. Trypsin 및 Thrombin 添加區의 경우 각각 42.1%, 39.5% 및 33.3%로 對照區의 20.5%와는 有意差가 認定되었고 (P<0.05), 桑實麗期까지 發達한 麗의 比率은 각각 2.6%, 7.0% 및 2.8%로서 對照區의 2.3 %와는 有意差가 認定되지 않았다. 4. 牛卵胞卵을 顆粒膜細胞와 共同培養하였을때의 核成熟 즉 第二減數分裂 中期까지 성숙한 卵子의 比率은 83.1%였으며 對照區의 그것은 80.3%로서 양구간에 有意差는 인정되지 않았다. 5. 顆粒膜細胞와 共同培養된 卵子의 體外受精率은 76.9 %로서 對照區의 66.7%보다 다소 양호하였다. 그러나 양구간의 有意差는 認定되지 않았다. 6. 顆粒膜細胞와 共同培養한 受精卵의 發達은 2∼8 細胞期의 初期胚에서는 對照區와 有意差가 없었지만 16細胞期와 桑實胚期까지 發達한 比率은 共同培養區는 각각 34.2와 34.2%였으며 對照區는 각각 20.8%와 16.7%로 두구간에는 有意差가 認定되었다.(P<0.05). These experiments were carried out to investigate the effect of proteolytic enzymes and a co-culture with granulosa cells on in vitro maturation, fertilization and development of bovine follicular oocytes. The bovine ovaries were obtained at a slaughter house and the follicular oocytes were recovered by aspirating the follicular fluid from the visible follicles of diameter 2-6mm. Bovine oocytes were matured in vitro for 24-26hr and then fertilized in vitro using epididymal spermatozoa capacitated by preincubation for 2-3hr in BO solution containing BSA(5mg/ml) and and caffein(25mM). Eight hours after insemination, some oocytes were transferred to TCM-199 supplemented with plasmin, trypsin or/and thrombin and the others were cultured in a co-culture system with granulosa cells. The results obtained in these experiments were summarized as follows : 1. The maturation rates of the follicular oocytes cultured in the TCM-199 medium supplement with plasmin, trypsin or/and thrombin were 76.1, 75.0 and 74.0%, respectively. 2. The fertilization rates of the follicular oocytes supplemented with plasmin, trypsin or/and thrombin were 58.3, 65.1 and 55.4%, respectively. Greatest fertilization rate was observed in the medium supplemented with trypsin. 3. The rates of embryos developed to 2-cell stage in the TCM-199 medium supplemented with plasmin, trypsin, or/and thrombin were 42.1, 39.5 and 33.3%, respectively. Those values were significantly higher than 20.5% of the basic medium (P<0.05) 4. The rates of maturation of the follicular oocytes cultured in a co-culture system with granulosa cells were 83.1%. 5. The rates of fertilization of the follicular oocytes cultured in a co-culture system with granulosa cells were 76.9%. 6. The rates of embryos co-cultured with granulosa cells developed to 2-, 4-, 8-, 16-cell and morula stages were 65.8, 57.9, 39.5, 34.2 and 34.2%, respectively. The values for 16- and morula stages were significantly higher than those of the embryos cultured in the basic medium(P<0.05).

Study on freezing of boar semen and in vitro fertilization of porcine oocyte : 돼지의 동결정액과 체외수정에 관한 연구

이영주 Graduate School of Chungnam National University 2003 국내박사

본 연구는 희석액의 조성, 동결속도, 융해시간과 융해온도가 동결-융해 정자의 첨체형태와 운동성에 미치는 영향을 조사하기 위하여 실시하였다. 또한, 본 연구는 돼지 난포란의 체외성숙 배양배지에 cysteamine 첨가가 체외성숙, 체외수정 및 배양에 미치는 영향, 그리고 체외성숙된 돼지 난포란에 있어서 주입정자농도, 정자처리방법 그리고 배양배지가 체외수정 및 배양에 미치는 영향을 조사하기 위하여 실시하였다. 본 연구의 결과들을 요약하면 다음과 같다. 1. 희석액 조성이 정자의 첨체형태와 운동성에 미치는 영향 N-acetyl-D-glucosamine, 계면활성제 (Orvus ES Paste: OEP), 난황, 글리세롤 농도, 그리고 글리세롤 평형시간이 돼지의 스트로 동결정액 제조시 정자에 미치는 영향을 구명하기 위하여 수행하였다. 그리고 LEN 희석액과 LEY 희석액을 이용한 동결정액에 있어서 융해 후 보존시간이 정자의 첨체 형태와 운동성에 미치는 영향을 조사하였다. 1) 1차 희석액에 0.025 또는 0.05% N-acetyl-D-glucosamine 처리시 동결-융해 후 최고의 정상 첨체비율과 운동성을 보였다. 그러나 2차 희석액에 N-acetyl-D-glucosamine을 처리한 것과 처리하지 않은 것 사이에는 유의적인 차이가 없었다. 2) 1차 희석액에 0.05% N-acetyl-D-glucosamine을 첨가하였을 경우 최적의 OEP 최종농도는 0.5%이었다. 3) 0.05% N-acetyl-D-glucosamine을 처리한 희석액에 있어서 최적의 난황 함량은 20%였으며, 난황이 주요 동해 방지제임이 증명되었다. 4) N-acetyl-D-glucosamine을 0.05% 첨가한 희석액에서 최적의 glycerol 최종농도는 2%였으며, glycerol 평형시 간은 3시간이었다. 5) LEN 희석액과 LEY 희석액을 이용한 동결정액에 있어서 융해 후 보존시간이 정자의 정상첨체율과 운동성에 미치는 영향에 있어서 보존시간에 따른 융해 후 운동성은 LEN 희석액과 LEY 희석액간의 유의적인 차이는 없었다. 그리고 0.5시간 보존하였을 때 LEN 희석액의 정상 첨체율이 LEY 희석액의 정상첨체율보다 높게 나타났다. 그러나, 2, 3 그리고 4시간 보존에서는 LEN과 LEY 희석액간의 유의적인 차이는 나타나지 않았다. 2. 동결속도, 융해시간 그리고 융해온도가 정자의 첨체형태와 운동성에 미치는 영향 융해온도는 각각 4, 22, 37, 45, 52, 62, 72 그리고 84℃였고, 각각 융해온도에 따른 융해시간은 12분 31초, 1분 52초, 1분 3초, 43초, 40초, 35초, 30초 그리고 15초였다. 1) 액체질소 상단 5.0 cm (20℃/min) 부터 17.0 cm (1℃/min) 사이에서 동결한 스트로에 있어서 융해 후 정자의 운동성은 유의적인 차이가 나타나지 않았다. 그러나 액체질소 상단 5 cm에서 동결한 스트로는 상단 17 cm에서 동결한 스트로보다 더 높은 정자의 정상첨체율을 보였다. 2) 52℃에서 40 또는 45초간 융해하였을 때 정자의 운동성과 정상첨체율이 가장 높았다. 융해된 정액의 온도는 각각 20.7℃와 26.4℃이었다. 3) 4℃ 융해온도를 제외하고 융해온도가 19-20℃가 되도록 융해한 결과, 융해된 정액의 온도는 융해 후 정자의 운동성과 정상첨체율에 중요한 영향을 미쳤다. 3. 돼지 난포란의 체외성숙시 cysteamine 첨가가 체외성숙, 체외수정 및 배양에 미치는 영향 돼지 난포란의 체외성숙시 cysteamine 첨가가 미치는 영향을 조사하기 위하여 mTCM-199 성숙배지에 처음 성숙 22 시간동안 150 μM cysteamine을 첨가하거나 첨가하지 않고 성숙시켰다. 그리고 성숙 22시간 후 호르몬이 첨가되지 않은 mTCM-199 성숙배지에 150 μM cysteamine을 첨가하거나 첨가하지 않고 성숙을 계속하였다. 1) Cysteamine이 첨가된 성숙배지에서 성숙시킨 난포란이 cysteamine이 첨가되지 않은 성숙배지에서 성숙시킨 난포란보다 GVBD와 metaphase Ⅱ 생성율이 높았다. 2) Cysteamine이 첨가된 성숙배지에서 성숙시킨 난포란이 cysteamine이 첨가되지 않은 성숙배지에서 성숙시킨 난포란보다 체외수정 결과 정자침투율과 웅성전핵형성율이 높았다. 3) Cysteamine이 첨가된 성숙배지에서 성숙시킨 난포란이 cysteamine이 첨가되지 않은 성숙배지에서 성숙시킨 난포란보다 난할율과 배반포 발생율이 높았다. 4. 체외성숙된 돼지 난포란의 체외수정과 배발달에 미치는 주입정자농도, 정자처리방법 그리고 배양배지의 영향 체외성숙된 돼지 난포란의 체외수정과 배발달에 미치는 주입정자농도, 정자처리방법 그리고 배양배지의 영향을 조사하기 위하여 0.2×10^(7), 2×10^(7), 20×10^(7) 그리고 200×10^(7)/ml의 정자농도로 체외수정 하였다. 난모세포의 수정은 처리하지 않은 정자와 BTS, mTLP-PVA 그리고 mTBM으로 처리한 정자이었다. 배양배지는 NCSU-23, HEPES buffered NCSU-23, PZM-3 그리고 PZM-4를 이용하여 배양하였다. 1) 0.2×10^(7)/ml에서 2×10^(7)/ml로 주입정자농도가 증가함에 따라 정자침투율도 유의적으로 증가하였다. 또한, 20×10^(7) 그리고 200×10^(7)/ml로 주입정자농도가 증가함에 따라 정자침투율이 각각 62.1과 69.9%로 증가하였다. 그러나 두 농도간의 유의적인 차이는 없었다. 비슷한 현상이 다정자 침입과 웅성전핵형성율에서도 나타났다. 난포란당 평균 침입정자수는 20×10^(7)/ml부터 유의적으로 증가하였다. 2) 난할율은 0.2×10^(7)/ml의 주입정자농도가 2×10^(7), 20×10^(7) 그리고 200×10^(7)/ml 보다 유의적으로 더 낮았다. 배반포 형성율에서도 비슷한 경향이 나타났다. 3) 각각 처리된 정자는 배양시간이 경과함에 따라 운동성이 급격하게 감소하였다 (배양개시시 정자의 운동성은 42.9-50.0%이었으며 배양종료시인 6시간 후 정자의 운동성은 15.0-29.3%이었다). mTLP-PVA와 mTBM으로 처리한 정자를 이용하여 체외수정시킨 난포란에서 각각 정자침투율 51.7과 53.9%, 다정자침입율 2.5와 4.1% 그리고 웅성전핵형성율 43.3과 43.9%를 보였다. 정자침투율과 웅성전핵형성율은 BTS, mTLP-PVA 그리고 mTBM으로 처리한 정자가 처리하지 않은 정자보다 높았다. 4) 난할율은 BTs, mTLP-PVA 그리고 mTBM으로 처리한 정자가 처리하지 않은 정자를 이용하였을 때보다 높았다. 그리고 분할된 수정란으로부터의 배반포 발생율은 mTLP-PVA로 처리된 정자로 수정하였을 때 다른 정자 처리를 이용한 것보다 가장 높았다. 5) 배반포 발생율과 배반포당 세포수는 HEPES buffered NCSU-23에서 배양되었을 때가 NCSU-23, PZM-3 그리고 PZM-4에서 배양되었을 때보다 높았다. 결론적으로, 돼지 동결정액에 있어서 1차 희석액에 0.05% N-acetyl-D-glucosamine이 첨가된 LEN 희석액은 정자의 첨체형태와 운동성에 유익한 효과를 나타내었다. 5 ml 스트로 동결정액의 융해에 있어서 22℃에서 84℃까지의 융해온도는 융해 후 정자의 생존능력에 중요하지 않지만 융해직 후 정액의 온도는 중요하였다. 돼지 난포란의 성숙배양에 있어서 처음 성숙배양 22시간 동안 mTCM-199 배지에 호르몬과 150 μM cysteamine을 첨가하였을 때 metaphase Ⅱ 생성율, 정자침입율, 웅성전핵형성율 그리고 배반포 형성율을 향상시켰다. 정자주입농도가 2×10^(7)/ml로 주입하였을 때 난할율과 배반포 형성율이 가장 좋았다. 동결-융해된 정자를 mTLP-PVA로 처리하여 체외수정 시켰을 때 정자침입율, 웅성전핵형성율 그리고 배반포 형성율이 가장 좋았다. 또한 돼지 수정란의 배양에 있어서 HEPES buffered NCSU-23에서 배양하였을 때 가장 좋은 결과를 보였다. This study were conducted to investigate the effects of diluent components, freezing rate, thawing time and thawing temperature on acrosome morphology and motility of frozen-thawed boar sperm. Also, this study was carried out to obtain informations about the effects of cysteamine addition on pig oocyte maturation and the effects of sperm concentrations, sperm washing treatments and culture media for in vitro fertilization and culture of in vitro matured pig oocytes, Results of these studies were as follows; 1. Effects of diluent components on acrosome morphology and motility These experiments were carried out to investigate the effects of N-acetyl-D-glucosamine, and to obtain additional informations about the effects of Orvus ES Paste (OEP), egg yolk, glycero1 concentration, glycero1 equilibration time and comparison of incubation time between LEY and LEN diluent in the freezing of boar sperm in the maxi-straw. 1) The highest post-thaw NAR acrosome and motility were obtained with 0.025 or 0.05% N-acetyl-D-glucosamine concentration in the first diluent. However, there were no differences among the diluents with or without N-acetyl-D-glucosamine at the second dilution. 2) When the 0.05% N-acetyl-D-glucosamine was supplemented in the first diluent, the optimum final OEP content was 0.5%. 3) The optimum content of egg yolk in the diluent with 0.05% N-acetyl-D-glucosamine concentration was 20% and egg yolk was the main cryoprotective agent. 4) The optimum final glycerol concentration in the diluent with 0.05% N-acetyl-D-glucosamine was 2% and the optimum glycerol equilibration time was 3 h. 5) There were no differences between LEN and LEY diluents on post-thaw sperm motility according to incubation time. The LEN diluent was higher NAR acrosome than the LEY diluent at 0.5 h incubation. However, there were no differences between the LEN and LEY diluents on post-thaw NAR acrosome at 2, 3 and 4 h incubations. 2. Effects of freezing rate, thawing time and thawing temperature on acrosome morphology and motility Aluminum rack distances from liquid nitrogen surface for sperm freezing were 5, 11 and 17 cm. Submersion times were 30, 35, 40, 50 and 55 sec at 52℃. Thawing temperatures were 4, 22, 37, 45, 52, 72 and 84℃ and thawing times were 12 min 31 sec, 1 min 52 sec, 1 min 3 sec, 40 sec, 35 sec, 30 sec and 15 sec, respectively. 1) The straws frozen from 5.0 cm (20℃/min) to 17.0 cm (1℃/min) above the liquid nitrogen surface did not show any significant differences on post-thaw sperm motility. However, the straws frozen above 5.0 cm from the liquid nitrogen surface were higher NAR acrosome than those frozen above 17.0 cm. 2) The post-thaw percentages of motile sperm and acrosomes with a normal apical ridge (NAR) at the initial microscopic examination were significantly higher (P<0.05) in the 5 ml straws submerged for 40 or 45 sec in 52℃ water bath than in any other duration of submersion. The mean sample temperatures of straws after 40 or 45 sec submersion were 20.7 or 26.4℃. 3) The 5 ml straws were thawed to be reached at 19-20℃ sample temperature at different combinations of temperatures and times except at 4℃ thawing temperatures. The sample temperatures of 5 ml straw during thawing were very important on post-thaw sperm motility and NAR acrosome. 3. Effects of cysteamine addition on maturation, IVF and culture of pig oocytes These experiments were carried out to investigate the effects of cysteamine addition during in vitro maturation in mTCM-199. Oocytes were matured for the first 22 h in mTCM-199 media supplemented with or without 150 μM cysteamine. They then were matured for an additional 22 h in those without hormones supplemented with or without 150 μM cysteamine. 1) When cumulus-oocyte complexes (COCs) were matured in the mTCM-199 media supplemented with cysteamine, the rates of GVBD and maturation (metaphase Ⅱ) were enhanced in comparison to the media without the addition of cysteamine. 2) When COCs were matured in the mTCM-199 media supplemented with cysteamine, the rates of sperm penetration and male pronucleus formation after in vitro fertilization were enhanced in comparison to the media without the addition of cysteamine. 3) When COCs were matured in the mTCM-199 medium supplemented with cysteamine, the rates of cleavage and blastocyst formation were enhanced in comparison to the media without the addition of cysteamine. 4. Effects of sperm concentrations, sperm washing treatments and culture media on in vitro fertilization and developmental ability of pig oocytes These experiments were carried out to investigate the effects of sperm concentrations, sperm washing treatments and culture media on in vitro fertilization and developmental ability of in vitro matured pig oocytes. Sperm concentrations were 0.2×10^(7), 2×10^(7), 20×10^(7) and 200×10^(7)/ml, respectively. Oocytes were inseminated with untreated (unwashed and nonpreincubated) or treated sperm (washed two times in BTS, mTLP-PVA and mTBM solution, respectively and nonpreincubated) with 2×10^(7)/ml sperm concentration. Culture media were NCSU-23, HEPES buffered (25 mM) NCSU-23, PZM-3 and PZM-4, respectively. 1) Increasing the sperm concentration from 0.2×10^(7) to 2×10^(7)/ml significantly increased the penetration rate. Also, increasing the sperm concentration from 20×10^(7) to 200×10^(7)/ml increased the penetration rate from 62.1 to 69.9%, respectively, with no differences between these two concentrations. A similar pattern was observed for polyspermic penetration and male pronucleus formation. The mean number of sperm per oocyte significantly increased from 20×10^(7)/ml sperm concentration. 2) The rates of cleaved oocytes at 0.2×10^(7)/ml sperm concentration was significantly lower than those at 2×10^(7), 20×10^(7) and 200×10^(7)/ml sperm concentrations. A similar pattern was observed for blastocyst formation. 3) Sperm motility reduced dramatically during culture in each treatment (about 42.9-50.0% at the start of culture to 15.0-29.3% at 6 h of culture). Oocyte inseminated with sperm washed by the mTLP-PVA and mTBM washing media showed 51.7 and 53.9% sperm penetration, 2.5 and 4.1% polyspermy, and 43.3 and 43.9% male pronuclear formation, respectively. Sperm penetration and male pronuclear formation were higher in the BTS, mTLP-PVA and mTBM washing treatments than the unwashed treatment (P<0.05). 4) The percentage of cleaved oocytes was higher in the BTs, mTLP-PVA and mTBM washing treatments than the unwashed treatment, and the percentage of blastocysts from cleaved oocytes was higher in the mTLP-PVA washing treatment than the unwashed, BTS washing and mTBM washing treatments. 5) The percentage of blastocyst formation and the cell numbers per blastocyst were significantly higher in the HEPES buffered NCSU-23 culture medium than in the NCSU-23, PZM-3 and PZM-4 culture medium. In conclusion, the LEN diluent containing 0.05% N-acetyl-D-glucosamine in the first diluent for boar sperm freezing had a beneficial effect on acrosome morphology and motility. The temperature of water bath from 22 to 84℃ was not important for post-thaw sperm survival in the LEN diluent of 5 ml straw but the sample temperature of the thawed semen was very important. When the oocytes were matured for the first 22 h in mTCM-199 media supplemented with 150 μM cysteamine, the rates of metaphase Ⅱ, sperm penetration, male pronucleus and blastocyst formation were higher compared with the media without addition of cysteamine. The sperm concentration of 2×10^(7)/ml and the washing of frozen-thawed sperm with mTLP-PVA medium before in vitro fertilization of oocytes in mTBM medium were very important to improve the blastocyst formation of oocytes. Also, HEPES buffered NCSU-23 medium has been the most successful for the culture of pig embryos.

체외 수정 시술을 시행하는 여성에서 항인지질 항체가 체외 수정 시술의 결과에 미치는 영향

박은주 울산대학교 대학원 2001 국내석사

최근 항인지질항체와 불임증과의 관련성에 대한 가능성이 제시되면서 , 항인지질항체가 체외수정시술의 결과에도 영향을 미칠 것으로 추측되고 있다. 항인지질항체는 인지질 또는 인지질 결합단백질에 작용하는 자가항체의 일종으로서, 이러한 항인지질항체는 습관성 유산, 자궁내 태아 발육지연, 태반 조기 박리, 임신성 고혈압 및 사산 등과 같은 여러 가지 임신의 합병증들과 관련되어 있는 것으로 알려져 있다. 임상적으로 가장 잘 알려지고 연구된 항인지질항체는 두 가지를 들 수 있는데, anticardiolipin antibodies와 lupus ant icoagulant of다 . 본 연구는 체외수정시술을 시행하는 환자에서 항인지질항체의 존재가 체외수정시술의 결과에 어떠한 영향을 미치는 가를 알아보기 위해 시행되었다. 그 방법으로 체외수정시술을 하는 여성 중 무작위로 54명의 여성에게 항인지질항체, 즉 anticardiolipin antibodies IgG, IgM과 lupus anticoagulant를 검사하여 양성을 보인 9명의 환자를 연구 대상군으로 하고, 음성인 45명을 대조군으로 하여 연구를 시행하였다. Anticardiolipinant ibodies lgG, IgM과 lupus anticoagulant 검사는 각각 표준화된 효소면역법 (enzyme linked immunosorbent assays, ELISA)과 dilute Russell's viper venom time (dRWT) test를 이용하였다. 모든 환자들에게 있어 과배란 유도는 성선자극호르몬 유리호르몬 효능제(gonadotropin-releasing hormone agonist , GnRH-a ) 장기투여법이 사용되었다. 연구군과 대조군에 포함된 환자들간의 평균 연령 , 평균 불임 기간, 호르몬 수치등을 비롯한 임상적 특성의 비교에 있어서 통계학적으로 유의한 차이를 보이지 않았다. 또한, 연구군과 대조군 간의 불임의 원인에 있어서 유의한 차이는 없었다. 그리고, 외인성 성선자극호르몬의 투여 용량 및 투여 기간, hCG 투여 당일의 혈중 estradiol치 , 질식초음파 상 관찰되는 평균 직경이 14mm이상되는 난포의 수, 그리고 자궁내막의 두께 등과 같은 과배란 유도에 대한 임상적 반응의 비교에 있어서도 두 군간에 통계학적으로 유의한 차이는 없었다. 획득된 난자 수, 난자의 수정률, 동결보존된 수정란의 수, 그리고 해당 주기에서 이식된 배아의 수 등에 있어서도 연구군과 대조군간에 통계적으로 유사한 결과를 보였다. 시술 주기당 임상적 임신율은 연구군의 경우 25.0%로 대조군좌 14.9%에 비하여 다소 높은 임신율을 보였으나, 통계학적 유의성은 발견되지 않았다. 시술 주기당 생화학적 임신율은 연구군의 경우 8.3%로 대조군의 9.7%와 유사한 결과를 보였다. 임신 진행률,다태아 출산율에 있어서도 양군간 유의한 차이를 보이지 않았다. 그러나 임상적 임신당 유산율에 있어서는 연구군의 경우 66.7% (4/6)로 대조군의 29.4%(5/l7)에 비하여 유의하게 높았으며, 임상적 임신당 분만율에 있어서는 연구군의 경우 16.7% (1/6)로 대조군의 58.8% (10/17)에 비하여 유의하게 낮았다. 결론적으로, 항인지질충체는 체외수정시술의 결과에 커다란 영향을 미치지 알는 것으로 판단되나, 임신이 된 경우에 있어서는 유산에 대한 위험 인자로 작용할 가 능성이 높다. 따라서, 비록 항인지질항체가 체외수정시술의 결과를 예측하는 인자로 사용되기에는 연관성이 부족할지라도, 습관성 유산에서의 역할과 같이 체외수정시 술을 통해 임상적 임신이 되었을 때 유산이 발생할 가능성은 더 높을 수 있으므로, 체외수정시술 전 항인지질항체의 검사는 임상적 의미가 있을 것으로 생각되며 , 이에 따라 항인지질항체가 양성인 경우 유산의 가능성을 염두에 두고 주의 깊은 추적 관찰과 치료가 필요하리라고 사료된다. The present study was designed to investigate if antiphospholipid antibodies (aPL) could affect the pregnancy outcome in women undergoing in vitro fertitization and embryo transfer (IVF-ET) . From January 1997 to June 2001, 9 women with aPL who underwent IVF-ET were studied. Forty_five women without aPL who underwent IYF-ET served as control. Anticardiolipin antibody (aCL) IgG, IgM, lupus anticoagulant (LA) were assayed with use of standardized enzyme linked Immunosorbent assays (ELISA) and dilute Russell's viper venom time (dRVVT) test . Long protocol of gonadotropin-releasing hormone agonist (GnRH-a) was used for control led ovarian hyperstimulation (COH) In all patients. There were no significant differences between study and control groups in patient characteristics such as age, infertility duration, hormonal profile, the cause of infertility and the number of previous IVF attempts. There were also no significant differences between two groups with respect to the clinical response to COH and IVF results such as number of retrieved oocytes, fertilization rate, number of embryos frozen and number of embryos transferred. The clinical pregnancy rate per cycle seemed to be higher in the study group than in the control group (25.0% vs 14.9%,). however, the difference was not statisticalIy significant. Miscarriage rate per clinical pregnancy was significantIy higher in the study group at 67.0% (4/6) compared with 29.4%(5/17) in the control group. Delivery rate per clinical pregnancy was significantIy lower in the study group at 16.7% (1/6) compared with 58.8% (5/17) in the control group. In conclusion, women with aPL referred for IVF-ET may not appear to influence on IVF outcome except miscarriage rate per clinical pregnancy.

인간 배아 생산을 위한 하이브리드 마우스 체외수정 조건 확립에 관한 연구

이단비 대구대학교 2016 국내석사

본 연구는 B6D2F1/CrljOri(모계: C57BL/6NCrIBR. 부계: DBA/2CrIBR) 교잡종 마우스를 이용하여 체외수정 및 체외 발달에서 최적의 조건을 찾기 위해 4가지로 설계하여 실시하였다. 1. 정소상체미부의 수송온도(4℃ vs. 37℃)가 정자의 생존율과 난자의 발생능력에 미치는 영향은 다음과 같다. 1) 정자의 생존율(59.0%±0.1 vs. 47.6%±0.1), 체외 수정율(90.7%±0.1 vs. 90.7%±0.1), 발달율(90.0%±0.1 vs. 90.0%±0.1) 및 포배아 형성율(53.1%±0.2 vs. 52.3%±0.2)은 두 군 간에 유의적인 차이가 없었다(NS). 그러나 투명대 탈출율은 4℃군이 37℃군 보다 (47.8%±0.1 vs. 25.6%±0.2) 유의하게 높았다(p < .05). 2) 포배아의 세포수를 살펴보면, % ICM(/total cells)은 4℃군이 37℃군(27.0%±0.1 vs. 18.3%±0.1) 보다 유의하게 높았다(p < .05). 그러나 총 세포 수(72.7±31.6 vs. 62.0±36.6), ICM 세포 수(17.0±7.8 vs. 14.6±8.6), TE 세포 수(55.8±29.8 vs. 64.0±24.4), ICM:TE 비(1:4.2±4.1 vs. 1:6.4±7.2)는 두군 간에 유의한 차이가 없었다. 2. 난구세포의 유무(COC vs. O)가 난자의 발생능력에 미치는 영향은 다음과 같다. 1) 체외 수정율(94.4%±0.1 vs. 86.7%±0.1)과 발달율(94.4%±0.1 vs. 84.4%±0.2) 및 투명대 탈출율(52.0%±0.1 vs. 51.4%±0.1)은 두군 간에 유의적인 차이가 없었다. 그러나 포배아 형성율은 COC군이 O군(61.1%±0.1 vs. 42.2%±0.1) 보다 유의하게 높았다(p < .05). 2) 포배아의 세포수를 살펴보면, 총 세포 수(85.3±29.5 vs. 60.6±35.2)와 ICM 세포 수(15.8±8.3 vs. 10.9±9.3)는 COC군이 O군보다 유의하게 높았다(p < .05). 그러나 TE 세포 수(69.6±28.0 vs. 49.6±33.4), % ICM(20.5%±0.1 vs. 20.6%±0.2), ICM:TE 비(1:6.5±6.6 vs. 1:6.9±5.5)는 두군 간에 유의한 차이가 없었다. 3. 오일의 종류(OVOIL vs. OIL)가 난자의 발생능력에 미치는 영향은 다음과 같다. 1) 난구세포의 확장율(82.0%±0.2 vs 78.0%±0.1), 체외 수정율(92.0%±0.1 vs. 88.0%±0.1), 발달율(91.0%±0.1 vs. 87.0%±0.2), 포배아 형성율(56.0%±0.1 vs. 57.0%±0.1) 및 투명대 탈출율(41.4%±0.2 vs. 24.0%±0.1)은 두군 간에 유의차가 없었다. 그러나 난자의 성숙율은 OVOIL군이 OIL군(96.0%±0.1 vs. 87.0%±0.1) 보다 유의하게 높았다(p < .05). 2) 포배아의 세포수를 살펴보면, 총 세포 수(83.9±26.1 vs. 56.9±23.9), ICM 세포 수(15.7±8.8 vs. 6.3±3.5), TE 세포 수(68.3±25.7 vs. 50.7±24.1), % ICM(21.6%±0.1 vs. 12.7%±0.1) 및 ICM:TE 비(1:6.2±6.5 vs. 1:10.3±7.0)는 OVOIL군이 OIL군 보다 유의하게 높았다(p < .05). 4. 배양액 용량(25 ㎕ vs. 50 ㎕ vs. 100 ㎕)이 난자의 발생능력에 미치는 영향은 다음과 같다. 1) 체외 수정율(82.7%±0.1 vs. 91.8%±0.1 vs. 90.1%±0.1), 발달율(79.1%±0.1 vs. 90.1%±0.1 vs. 87.3%±0.1) 및 투명대 탈출율(50.0%±0.4 vs. 43.4%±0.3 vs. 36.6%±0.2)은 실험군간 유의한 차이가 없었다. 그러나 포배아 형성율(33.6%±0.1 vs. 50.0%±0.1 vs. 48.2%±0.2)은 25 ㎕군 보다 50 ㎕군과 100 ㎕ 군이 유의하게 높았다(p < .05). 2) 포배아의 세포 수를 살펴보면, 총 세포 수 (73.7±35.1 vs. 71.1±31.9 vs. 75.6±35.6), ICM 세포 수 (16.7±12.2 vs. 14.5±10.7 vs. 12.0±8.2), TE 세포 수 (57.5±30.7 vs. 56.5±28.9 vs. 63.4±33.1), % ICM(22.9%±0.1 vs. 21.0%±0.1 vs. 17.9%±0.1) 및 ICM:TE 비(1:4.3±2.5 vs. 1:6.2±5.6 vs. 1:6.9±7.8)는 실험군 간에 유의차가 없었다. 결론적으로, 정소상체미부의 수송온도는 4℃, 수정 시 난자는 COC 상태, 오일은 OVOIL로 하고, 배양액 용량 50 ㎕ 또는 100 ㎕로 했을 때 난자와 배아의 발생능력이 가장 우수하였다. 본 실험 결과는 인간 체외 수정술에서 최적의 배양 환경을 간접적으로 알아보기 위해 실시하였으며, 응용이 가능할 것으로 사료된다. In the present study, 4 different study designs were tested in order to find optimal conditions for in vitro fertilization and in vitro development utilizing a hybrid mice model, B6D2F1/CrljOri (Maternal line: C57BL/6NCrIBR, Paternal line: DBA/2CrIBR). 1. Effects of transfer temperature of epididymis on survival rate of semen and development ability of oocyte 1) No significant differences were noted in the survival rate of semen (59.0% ± 0.1 vs. 47.6% ± 0.1), in vitro fertilization rate (90.7% ± 0.1 vs. 90.7% ± 0.1), developmental rate (90.0% ± 0.1 vs. 90.0% ± 0.1), and blastulation rate (53.1% ± 0.2 vs. 52.3% ± 0.2) between groups. However, the zona hatched rate of blastocysts (47.8% ± 0.1 vs. 25.6% ± 0.2) was significantly higher in the 4°C group compared to those of the 37°C group (p<0.05). 2) Looking at the cell number in the embryo, % ICM(27.0%±0.1 vs. 18.3%±0.1) was significantly higher in the group of 4°C compared to the 37°C (p<0.05). However there were no differences in total cell numbers (72.7 ± 31.6 vs. 62.0 ± 36.6), ICM cell numbers (17.0 ± 7.8 vs. 14.6 ± 8.6), TE cell numbers (55.8 ± 29.8 vs. 64.0 ± 24.4), and ICM:TE ratio (1:4.2 ± 4.1 vs. 1:6.4 ± 7.2) between two groups. 2. Effects of cumulus cells (COC vs. O) on the oogenesis 1) No significant differences were noted on in vitro fertilization rate (94.4% ± 0.1 vs. 86.7% ± 0.1), clevage rate (94.4% ± 0.1 vs. 84.4% ± 0.2), and zona hatched rate (52.0% ± 0.1 vs. 51.4% ± 0.1) between groups. But blastulation rate (61.1% ± 0.1 vs. 42.2%) was higher in the COC group compared to the O group (P<0.05). 2) Looking at the cell number in the embryo, the total cell numbers (85.3 ± 29.5 vs. 60.6 ± 35.2) and ICM cell numbers (15.8 ± 8.3 vs. 10.9 ± 9.3) were higher in the COC group compared to the O group (P<0.05).But no further difference was not shown between two groups in the TC cell numbers (69.6 ± 28.0 vs. 49.6 ± 33.4), % ICM (20.5% ± 0.1 vs. 20.6% ± 0.2), and ICM:TE ratio (1:6.5 ± 6.6 vs. 1:6.9 ± 5.5). 3. Effect of types of oil (OVOIL vs. OIL) on the oogenesis 1) The expansion rate of cumulus cells (82.0% ± 0.2 vs 78.0% ± 0.1), in vitro fertilization rate (92.0% ± 0.1 vs. 88.0% ± 0.1), clevage rate (91.0% ± 0.1 vs. 87.0% ± 0.2), blastulation rate (56.0%±0.1 vs. 57.0%±0.1), and zona hatched rate (41.4% ± 0.2 vs. 24.0% ± 0.1) were not different between experimental groups. However, the OVOIL group showed higher maturation rate compared to that of the OIL group (96.0% ± 0.1 vs. 87.0% ± 0.1; P<0.05). 2) In the blastocysts cell numbers, the total cell numbers (83.9 ± 26.1 vs. 56.9 ± 23.9), ICM cell numbers (15.7 ± 8.8 vs. 6.3 ± 3.5), TE cell numbers (68.3 ± 25.7 vs. 50.7 ± 24.1), % ICM (21.6% ± 0.1 vs. 12.7% ± 0.1), and ICM:TE ratio (1:6.2±6.5 vs. 1:10.3±7.0) were significantly higher in the OVOIL group than the OIL group (p<0.05 for all). 4. Effect of culture media volume (25 μL vs. 50 μL vs. 100 μL) on the oogenesis 1) No differences were shown in in vitro fertilization rate (82.7% ± 0.1 vs. 91.8% ± 0.1 vs. 90.1% ± 0.1), clevage rate (79.1% ± 0.1 vs. 90.1% ± 0.1 vs. 87.3% ± 0.1), and zona hatched rate (50.0% ± 0.4 vs. 43.4% ± 0.3 vs. 36.6% ± 0.2) amongst tested groups. However, blastulation rate(33.6%±0.1 vs. 50.0%±0.1 vs. 48.2%±0.2) was found to be the higher in the 50 μL group and 100 μL group compared to that of 25 μL group (p<0.05). 2) Looking at the cell number in the embryo, the total cell numbers (73.7 ± 35.1 vs. 71.1 ± 31.9 vs. 75.6 ± 35.6), ICM cell numbers (16.7 ± 12.2 vs. 14.5 ± 10.7 vs. 12.0 ± 8.2), TE cell numbers (57.5 ± 30.7 vs. 56.5 ± 28.9 vs. 63.4 ± 33.1), % ICM (22.9% ± 0.1 vs. 21.0% ± 0.1 vs. 17.9% ± 0.1) and ICM:TE ratio (1:4.3 ± 2.5 vs. 1:6.2 ± 5.6 vs. 1:6.9 ± 7.8) were not different between groups. Taken altogether, it is expected to achieve the best developmental ability of embryos in which following conditions are given: 1) the transfer temperature of epididymis: 4°C, 2) cumulus cell-oocyte complex condition, 3) OVOIL, 4) the culture medium volume: either 50 μL or 100 μL. These experiments were carried out in order to determine optimal culture conditions for in vitro fertilization and human embryo culture. In future, therefore, it is expected that results herein might be applied for in vitro culture of human embryos.

미성숙 돼지 난포란의 체외성숙과 액상정액을 이용한 체외수정에 관한 연구

李斗秀 忠南大學校 大學院 2004 국내석사

The present study was carried out to investigate the effects of the maturation media such as a modified TCM-199 (mTCM-199) medium, modified Waymouth MB 752/1 (mWaymouth MB 752/1) medium or NCSU-23 medium on penetrability of pig oocytes by liquid boar sperm. Oocytes (30∼40) were transferred into each well of a Nunc 4-well multidish containing 0.5 ml maturation medium. The sperm-rich portion of ejaculates with greater than 90% motile sperm were used in the experiment. The semen was cooled 22 to 24℃ over 2 h period. The semen was diluted with Beltsville Thawing Solution (BTS) extender at room temperature to give 2×10^(8) sperm/ml in 100 ml plastic bottle. Liquid boar semen of 30 ml in 100 ml plastic bottle was kept at 17℃ for 5 days. The sperm with greater than 70% motility after day 5 of storage were used for in-vitro fertilization (IVF). After 44 h maturation of immature oocytes, cumulus cells were removed and oocytes (30∼40) coincubated for 6 h in 0.5 ml mTCM-199 and mTBM fertilization media with 2×10^(6)/ml sperm concentration. At 6 h after IVF, oocytes were transferred into 0.5 ml mTCM-199 and NCSU-23 culture media for further culture 6 or 42 h. Sperm penetration, polyspermy and male pronuclear formation of oocytes at 12 h after IVF, and developmental ability of oocytes at 48 h after IVF were evaluated. When immature pig oocytes were cultured in mTCM-199, mWaymouth MB 752/1 and NCSU-23 maturation media for 44 h in 5% CO2 in air at 38.5℃, the germinal vesicle breakdown (GVBD) rates of the oocytes were 95.6, 94.1 and 94.9%, respectively, and the maturation rates (metaphase Ⅱ) of oocytes were 92.5, 90.1 and 91.1%, respectively. No differences were observed among the maturation media. The oocytes in combination with NCSU-23 medium for maturation and mTBM medium for IVF increased male pronuclear formation (48.0%) compared to those in combination with mTCM-199 media for maturation and IVF, and mWaymouth MB 752/1 medium for maturation and mTCM-199 medium for IVF. The rates of cleaved embryos (2∼4 cell stage) at 48 h after IVF were 24.1% in combination with mTCM-199 media for maturation, IVF and culture, 43.6% in combination with mWaymouth MB 752/1 medium for maturation and mTCM-199 media for IVF and culture, and 71.2% in combination with NCSU-23 medium for maturation, mTBM medium for IVF and NCSU-23 medium for culture. From the above experiment results, we found out the oocytes matured in vitro were fertilized by liquid boar sperm stored in BTS extender at 17℃ for 5 days. We recommend the simple defined NCSU-23 medium for nuclear maturation, mTBM medium and liquid boar sperm for IVF, and NCSU-23 medium for embryo culture. After 44 h maturation of immature oocytes in 5% CO2 in air at 38.5℃, cumulus cells were removed and oocytes (30∼40) were coincubated for 6 h in 0.5 ml mTBM fertilization medium with five different (1×10^(6), 2×10^(6), 4×10^(6), 6×10^(6), 10×10^(6)/ml) sperm concentrations. At 6 h after IVF, oocytes were transferred into 0.5 ml NCSU-23 culture medium for further culture of 6 h. At 12 h after IVF, sperm penetration, polyspermy and male pronuclear formation of oocytes were evaluated. Oocytes of NCSU-23 maturation medium decreased polyspermy and increased male pronuclear formation compared to those of mTCM-199 and mWaymouth MB 752/1 maturation media. Oocytes matured in NCSU-23 medium and inseminated in mTBM medium with 2∼4×10^(6)/ml sperm concentrations showed 50.8∼50.9% sperm penetration, 13.3∼19.5% polyspermy and 43.9∼45.4% male pronuclear formation. In conclusion, we found out that oocytes matured in NCSU-23 medium and inseminated in mTBM medium showed superior in-vitro fertilization results compared to those matured in mTCM-199 and mWaymouth MB 752/1 maturation media and inseminated in mTBM medium. The optimum sperm concentrations for in-vitro fertilization of oocytes matured in NCSU-23 medium by liquid boar semen stored at 17℃ for 5 days were 2∼4×10^(6)/ml.