생쥐에서 키토산의 조직학적·세포유전학적 안전성 및 방사성수은(203HgCl₂) 흡착 효과

김영호 朝鮮大學校 大學院 2002 국내박사

The purpose of this study was to evaluate the histological and cytogenetic toxicity of chitosan that was a deacetylated derivative of chitin. Also, the effects of chitosan on the excretion of radiomercury (^(203)HgCl_(2)) and suppression of chromosome aberration caused by radiomercury were determined. The frequency of micronuclei occurrence was observed after administrating 0.01, 0.1, and 1% chitosanoligosaccharide for 7, 60, and 180 days ad libitum. The frequency of the micronucleus Occurrence not associated with the intake periods and concentrations (p>0.05). After administrating the frequency of chromosomal aberration was observed after administrating 0.01, 0.1, and 1% chitosan oligosaccharide to mice, in F_(1), F_(2), F_(3) generations and adults. The frequency of the chromosomal aberration Occurrence was not associated with the intake periods and concentrations (P>0.05). After treated with the 0.1 % (1 mg/㎖) chitosanoligosaccharide was supplied for 90, 365 days ad libitum The blood components did not changed (P>0.05). For the evaluation of chitosan safety, the ultrastructural changes of the liver in F_(1), F_(2), F_(3) generations and adults were observed with an electromicroscope (EM) after administrating 0.1% (1 mg/㎖) chitosanoligosaccharide to rats ad libitum. In case of F_(2) and 90-day treatment gropus, the endoplasmic reticulum (ER) was extended and ribosomes dropped from the ER. Other groups did not changed under the EM. The chelation capacity of the radiomercry between non-phos phorylated chitosan and phosphorylated chitosan was evaluated according to the times, degree of deacetylation (DAC), pH and phosphorus contents. The phosphorylated chitosan showed higher chelation efficiency on radiomercury than that of non-phophory lated chitosan (P<0.0l). In spite of different times, DAC and pH, the phophorylated chito san was no specific differences in absorption efficiency with DAC and phosphorus content (P>0.05). And, the non-phosphorylated chitosan was higher chelation efficiency on radiomercury according to increased DAC and times (P<0.01) After contaminated radiomercury (0.005 μCi/b.w(g)) through oral, intraperitoneal and intravenous injection, the phophorylated chitosan and chitosanoligosaccharide was fed through the same route as above. Only the feces of the oral contaminated was effective (P<0.01) For the observation of suppression effect on radiomercury transfer through milk, the mother mice were orally contaminated with radiomercury (0.005 μCi/b.w(g)), and then 1% chitosanoligo saccharide was orally injected. The chitosanoligosaccharide significantly reduced the milk transfer of radiomercury (P<0.05). For the observation of suppression effect on the chromosomal aberration, 0.1, 0.5, 1% chitosanoligosaccharide was orally pretreated for 30 days ad libitum. And, mice were orally contaminated with 0.005 μCi/b.w(g) radiomercury. The chitosan oligosaccharide significantly reduced the chromosomal aberration caused by radiomercury (P<0.05). It was concluded that the chitosanoligosaccharide was a nontoxic material in parts of histological and cytogenetic safety. And, the chitosanoligosaccharide effectively excreted radiomercury by feces.

탈모생쥐 모델(C57BL/6N mice와 Hairless mice)의 성장주기별 털의 생성 및 탈모와 관련된 인자들에 대한 연구

이문원 又石大學校 大學院 2004 국내석사

C57BL/6N 생쥐와 hairless 생쥐에서 털의 성장주기별로 일어나는 비만세포 수의 변화 및 neuropeptide들의 면역조직화학적 변화를 관찰하고 성장주기별로 일어나는 B림프구와 T림프구 및 T림프구의 아형에 관한 면역반응을 관찰함으로써 털의 성장주기별로 일어나는 탈모와 관련된 인자(factor)들을 관찰한 바 다음과 같은 결론을 얻었다. 1. C57BL/6N 생쥐의 toluidin blue에 염색된 비만세포의 수는 출생후 1일째부터 35일째까지 점차 감소하는 경향을 보였으나. 21일째 탈모가 일어난 부위에서는 증가하였다. 2. C57BL/6N 생쥐의 면역조직화학 염색법에 의한 neuropeptide(substance P, CGRP, CRF, CRF-receptor 그리고 CRF-binding protein)의 염색강도에 있어서는 1, 3, 8일째에는 대체적으로 염색강도는 미약하였으나 35일째에는 매우 강하게 염색되었다. 또한 21일째 탈모생쥐와 29일째 탈모후 발모생쥐를 비교한 바 21일째 탈모생쥐에서 강하게 염색되었다. 3. C57BL/6N 생쥐의 비장내 B/T림프구의 분포는 생후 3일째부터 35일째까지 증가하는 경향을 보였으나 생후 21째의 탈모군(no pigment)에서는 감소하는 경향을 보였다. 또한 비장 T림프구 중의 CD4/CD8 양성세포의 비율은 생후 3일째, 8일째, 35일째로 성장과 더불어 CD4/CD8 양성세포의 비율이 증가하는 경향을 보였으며, 생후 21째의 탈모군(no pigment)에서는 29일째의 탈모군(pigment)비하여 특히 CD4 양성세포인 T_(H)림프구가 현저하게 감소하였다. 4. Hairless 생쥐의 toluidin blue에 염색된 비만세포의 수는 출생후 3일째부터 7일째까지는 큰 변화가 없었으나 13일째부터 21일째까지 비만세포의 수가 현저히 증가하는 경향이었으며 56일째의 비만세포는 탈과립된 비만세포를 많이 관찰할 수 있었다. 5. Hairless 생쥐의 면역조직화학 염색법에 의한 neuropeptide (substance P, CGRP, RF)의 염색강도는 발모가 일어나는 3, 7, 13일째에는 미약하게 염색되었으나 탈모가 일어나기 시작하는 17일째부터 완전탈모가 일어난 21일에서 56일째로 성장하면서 매우 강하게 염색되었다. 6. Hairless 생쥐에서의 비장내 B/T림프구의 분포는 생후 13일째에 B/T림프구 모두 최대치를 보였다가 탈모가 시작되는 그후부터 시간이 경과함에 따라 점차로 감소하였다. 또한 비장 T림프구중의 CD4/CD8 양성세포의 비율도 역시 생후 13일째(발모시기)에 최대치를 나타내었다. 이상의 실험결과로 탈모 및 발모와 관련된 인자들은 비만세포 수의 변화, neuropeptide(substance P, CGRP, CRF)의 면역염색 강도 및 면역반응과 복합적인 관계가 있을 것으로 사료된다.

2-세포기 생쥐 배아의 동결보존 전의 평형온도와 시간이 동결보존 후의 결과에 미치는 영향

고희은 인제대학교 대학원 2003 국내석사

목 적: 최근 인간 배아의 동결 및 해빙이 동결보존액으로 1,2-propanediol(PROH)를 사용함으로써 성공적으로 이루어지고 있다. 배아를PROH에 노출 시 평형온도 조절의 중요성이 보고된 바 있다. 본 실험은 2-세포기 생쥐 배아를 PROH에 노출 시 평형온도와 노출 시간에 따른 생쥐 배아의 발생에 미치는 영향을 알아보고, 2-세포기 생쥐 배아의 동결 전에 동결보존액에서의 적정 노출 온도와 시간을 알아보고자 한다. 방 법: 5-6주령의 ICR계통의 암컷 생쥐로부터 2-세포기 배아를 획득하여 15 M PROH를 포함하는 인산완충용액(phosphate buffered saline, PBS)에 37℃, 상온(22-24℃), 4℃에서 각각 0분(대조군), 10분, 30분씩 노출시킨 후 1, 0.5, 0 M PROH를 포함하는 PBS에 각 실험군의 배아를 순서대로 각각 5분씩 두어 PROH를 완전히 제거한 후 0.4% 소혈청 알부민(bovine serum albumin, BSA)이 포함된 Ham's F-10에서 배양하여 배아의 발생률을 비교 분석하였다. 한편, 상온과 4℃에서 15 M PROH를 포함하는 동결보존액에 2-세포기 생쥐배아를 각각 10분씩 노출시킨 후 동결-해빙 하여 배아의 발생률을 비교 분석하였다. 결 과: 37℃ PROH에서의 노출군은 대조군에 비해 배아 발생률이 유의하게 저해되었고(0분:54.8%, 10분 8.3%, 30분. 54%, p=0.047, 0.038), 상온 노출군에서는 대조군에 비해 노출시간이 길어질수록 배아 발생률이 감소하였으나 유의한 차이는 없었다(0분:47.2%, 10분 28.3% 30분: 23.7%). 한편 상온과 4℃에서 각각 동결보존 전에 PROH에 노출 후 동결-해빙 하였을 때 배아의 발생률은 대조군에 비해 낮았으나 유의한 차이는 없었고(대조군: 57.1%, 상온: 25.7%, 4℃ : 30.8%) 4℃ 노출군이 상온 노출군에 비해 배아 발생률이 높게 나타났으나 유의한 차이는 없었다. 결 론: 이상의 결과로 미루어 2-세포기 생쥐 배아를 PROH에 노출할 때 평형온도와 시간에 좌우되어 발생률의 차이를 나타냈으며, 상온과 4℃에서 2-세포기 생쥐 배아를 PROH에 10분간 노출시킨 후 동결-해빙하였을 때 배아의 발생률에 있어서 유의한 차이를 보이지 않았다. Objective One-cell human zygotes have been successfully frozen and thawed using l,2-propanediol(PROH) during freezing and thawing. This study was performed to assess the effect of equilibration temperature and time on cryopreservation of 2-cell mouse embryos by investigating the equilibration temperature and time during initial PROH exposure prior to cryopreservation Materials and Methods: The late 2-cell mouse embryos were obtained from 5-6 week old ICR mice and were exposed to 1.5 M PROH in phosphate-buffered saline(PROH-PBS) at 37℃, room temperature(22-24℃), and 4℃ for 30 min The PROH was washed off the 2-cell mouse embyos by incubating them for 5 min each in 1, 0.5, and 0 M PROH-PBS in the order named. The 2-cell mouse embryos were subsequently cultured in Ham's F-10 medium and embryo development was assessed at 24, 48, and 96 hours. Results: Incubation of 2-cell mouse embryos at 37℃ for 30 min significantly impaired embryo development to blastocysts. Embryo development after exposure to PROH at 37℃ for 10 min was 8.3%(P=0.047) and embryo development for 30 min was 5.4%(P=0.038). Incubation of 2-cell mouse embryos at room temperature or 4℃ for up to 30 min did not significantly reduce embryo development. Cryosurvival of 2-cell mouse embryos exposed to PROH at room temperature or 4℃ was similar. Conclusion: These findings suggested that pronanediol is toxic to 2-cell mouse embryos in a temperature- and time-dependent fashion. Cryopreservation of 2-cell mouse embryos after exposure at 4℃ appears to be no better than after exposure at room temperature

ORF 서열 및 UTR에 의한 Cyclin B의 번역 조절 기작 연구

김보람 인제대학교 일반대학원 2019 국내석사

Cyclin B는 Mitotic/Meiotic Promoting Factor(MPF)의 주요 구성 요소 중 하나로, 난핵포(Germinal Vesicle, GV) 단계의 난자세포에서 번역과 분해에 의해 단백질의 양이 조절된다. 생쥐에서는 3가지 종류의 Cyclin B(B1, B2, B3)가 발현되며 난자의 성숙과 관련된 것은 Cyclin B1과 Cyclin B2이다. 생쥐의 Cyclin B1 단백질은 GV 난자세포에서 낮은 수준으로 발현되며, 세포주기가 재개됨에 따라 발현 수준이 증가한다. 반면 Cyclin B2 단백질은 GV 상태부터 높은 수준으로 발현된다. 또한, Cyclin B1은 다른 생물종에서는 3ʹ UTR에 의해 서로 다르게 조절된다. 본 연구에서는 생쥐 Cyclin B1과 Cyclin B2의 발현 양상 차이를 조사하고, Cyclin B1 단백질의 발현이 생쥐와 제브라피쉬에서 어떤 기작으로 조절되는지 조사하였다. HEK293T 세포에서 생쥐 Cyclin B1의 3ʹ UTR을 포함하는 리포터 유전자는 Cyclin B2 3ʹ UTR를 포함하는 리포터의 발현보다 높았다. 이러한 차이점은 각 유전자의 3ʹ UTR 서열을 교환한 Cyclin B1과 Cyclin B2 단백질의 발현에서는 발견되지 않았다. 생쥐와 제브라피쉬의 Cyclin B1 유전자를 HEK293T 세포에 형질주입 하였을 때, 생쥐 Cyclin B1은 정상적으로 발현되나 제브라피쉬 Cyclin B1은 발현되지 않았다. 제브라피쉬 Cyclin B1의 3ʹ UTR 서열을 생쥐 Cyclin B1의 3ʹ UTR 서열로 치환한 경우 단백질이 발현되었다. 3ʹ UTR, 5ʹ UTR 혹은 ORF 서열을 포함하는 리포터 유전자를 이용하여 HEK293T 세포와 생쥐 난자세포에서 발현 조절 기작을 확인하였다. Cyclin B1 ORF는 HEK293T 세포와 생쥐 MI 난자세포에서 발현을 음성적으로 조절한다. GV 난자세포에서는 5ʹ UTR에 의해 리포터 유전자의 발현이 증가하는 효과가 나타났으며, ORF 서열과 함께 존재할 때 상승효과가 나타났다. HEK293T 세포에서 리포터 유전자는 Cyclin B2의 5ʹ UTR에 의해 양성조절 되고, ORF 서열에 의해서는 음성조절 되는 것을 확인하였다. 결론적으로, Cyclin B 단백질의 번역은 3ʹ UTR 뿐만 아니라 5ʹ UTR과 ORF 서열에 의해서도 조절된다. Cyclin B is a major component of Mitotic/Meiotic Promoting Factor(MPF) and its amount is regulated by translation and degradation in the Germinal Vesicle (GV; prophase I) stage oocyte. Three types of Cyclin B(B1, B2 and B3) are expressed in mice, and Cyclin B1 and Cyclin B2 are involved in the maturation of oocytes. The mouse Cyclin B1 protein is expressed at a low level in mouse GV oocytes and the protein levels increase after meiotic resumption. On the other hand, Cyclin B2 protein is expressed at a high level from GV state. In addition, also it is known that Cyclin B is regulated differently in different species by its 3ʹ UTR. In this study, I investigated the difference in expression between mouse Cyclin B1 and Cyclin B2 and checked the regulational mechanism of Cyclin B1 expression by the 3ʹ UTR from mouse or zebrafish Cyclin B1. Expression of reporter gene which contains 3ʹ UTR of mouse Cyclin B1 is higher than that of mouse Cyclin B2 in HEK293T cells. These differences were not found in the expression of the Cyclin B1 and Cyclin B2 proteins, which exchanged the 3ʹ UTR sequence of each gene. When mouse or zebrafish Cyclin B1 which contains its Cyclin B1 3ʹ UTR was transfected into HEK293T cell, mouse Cyclin B1 was expressed normally, but zebrafish Cyclin B1 was not detected. Only when the 3ʹ UTR of zebrafish Cyclin B1 was replaced with that of mouse, protein was well expressed. Using several reporter constructs that contain 3ʹ UTR, 5ʹ UTR or ORF of Cyclin B, the translational regulation of reporter genes was checked in HEK293T cell or mouse oocyte. The ORF element of mouse Cyclin B1 negatively regulates the expression of reporter in HEK293T cells and in mouse MI oocytes. In GV oocytes, the 5ʹ UTR of mouse Cyclin B1 increases the expression of reporter and it shows synergistic effect with Cyclin B1 ORF element. The 5ʹ UTR of mouse Cyclin B2 enhances the expression of reporter protein in HEK293T cells. In contrast, Cyclin B2 ORF blocked the expression of the reporter. In conclusion, the translation of Cyclin B is controlled not only by 3ʹ UTR but also 5ʹ UTR and ORF.

생쥐와 사람난자의 노화가 前核形成과 Cytoskeleton에 미치는 影響

오종훈 建國大學校 大學院 2000 국내박사

These studies were performed to determine the pronuclear formative pattern in the post-ovulatory aged oocytes in mouse and human after parthenogenetic activation by exposure to calcium ionophore or ethanol. Especially, in human oocytes, intra-cytoplasmic sperm injection (ICSI) was adopted for oocyte activation. In addition, the cytoskeleton consisted of microtubule and microfilament has been known to be played as a central role at meiotic and mitotic processes in the mammalian oocyte. Therefore, the influence of cytochalacin B, an agent that interferences with microfilament, and taxol, an agent that stabilizes microtubules, on the cytoskeleton of mouse oocytes was also assessed. Finally in order to examine the cause of pronuclear (PN) formative changes in aged oocytes in mouse and human, cytoskeletal organizations in their oocytes before and after treatment with artificial activation were investigated. The results obtained in these studies were summarized as follows : Ⅰ. Optimal conditions for parthenogenetic activation in mouse and human oocyte 1) To identify the optimal conditions for parthenogenetic activation in mouse and human oocytes, two agents were assessed. The activating rates of mouse oocytes after treatment with Ca-ionophore were very low as 10~20% at any concentrations. However, when mouse oocytes were treated at 6% ethanol for 5 minutes, activation rate was 83.3 % and the most (64%) of activated oocytes was normally developed to eggs with one pronucleus. 2) To find the time of collecting oocytes from oviducts of mouse, activation was induced at 12, 14, 16 or 18 hours after hCG injection and the higher activation rates (64.2~66.0%) of oocytes collected at 16~18 hours after hCG injection were documented compare to those of other oocytes (p<0.05). 3) In contrast with mouse oocytes, human oocytes were much less sensitive to ethanol. Thereafter, the most effect of parthenogenetic activation (53.5%) was shown in human oocytes treated with 10 μM calcium ionophore for 5 minutes. Ⅱ. The effect of aged oocytes on pronuclear formation 1. The effect of ageing on pronuclear formation in mouse oocytes 1) The mouse oocytes were recovered at 16 h post-hCG, induced the in vitro ageing until 36 h post-hCG, and examined the pattern of pronuclear formation every 4 hours. The percentages of embryos with one and two pronuclears (PN) from the oocytes recovered at 16 h after hCG were 83.3 and 14.2%, respectively. These rates were not changed until 24 h post-hCG but percentages of one and two PN from oocytes collected at 28 h post-hCG were 39.3 and 29.5% which showed the decrease in 1PN rate with increasing of 2PN rate compared to those in oocytes collected earlier. 2) In the experiment to induce oocyte ageing in vivo, the percentages of 1PN and 2PN formation were 80 and 20%, respectively, in oocytes recovered at 16 h post-hCG and 28.3 and 52.2%, respectively, in oocytes collected at 28 h post-hCG. These results were very similar to the data from the experiment to induce oocyte ageing in vitro. However, the changes in ageing effectiveness were obviously greater and faster in oocytes to induce ageing in vivo than in vitro. 3) The proportions of pronuclear formation in oocytes, which recovered at 16 h and 30 h post-hCG, 4 h after artificial activation were 69.6 and 69.2%, respectively. Thus, these data indicated there was no effects of ageing in oocytes on the timing of pronuclear formation. 4) Of mouse oocytes at 24 h after induction of activation, the proportions of development to the 4 cell stages was higher in aged oocytes than these in fresh oocytes. 2. Effect of ageing on pronuclear formation in human oocytes 1) When pronucleus pattern in human oocytes after exposure to calcium ionophore was observed at 65, 75, 85 and 95 h after injection of hCG, the percentages of oocytes with one PN were 54.2, 38.5, 20.7 and 32.0%, respectively, and those of oocytes with two PN were 12.5, 26.9, 44.8 and 48.0%, respectively. these results showed the decrease in 1PN rates with ageing in oocytes which were very similar as those in mouse ones. 2) In the experiment to examine the pattern of pronuclear formation in oocytes activated by direct intra-cytoplasmic sperm injection, the proportions of oocytes with normal 2PN were 84.6 and 80.9% in oocytes recovered at 60 and 64 h post-hCG, respectively. However, the rates of 2PN and 3PN were 57.1 and 38.1%, respectively in oocytes collected at 72 h post-hCG, decrease in 2PN with increase in 3PN. Ⅲ. Effects of cytochalacin B and taxol on pronuclear formation 1) When the young (16 h post-hCG) oocytes after activation by ethanol were treated with cytochalacin B (CB) or taxol (Tx) for 1 h, the rates (39.1% and 36.4%, respectively) of oocytes with 1PN were very lower (p<0.05) than those in control (only ethanol treatment, 73.7%). In addition, in the group of CB and Tx treatments, incidences of oocytes with 2PN (52.2 and 40.9%) were higher than those (26.3%) in control (p<0.05). These results indicated that CB and Tx treatments increased the frequency of mouse oocytes with 2PN. 2) In group of aged (30 h post-hCG) oocytes, treatments of CB and Tx were not affected patterns of pronucleus formation compared with control. 3) In the group of aged oocytes, the developmental speed of oocytes treated with CB or Tx after activation was slightly faster than in young eggs. 4) In the investigation of pronuclear formation in normal and aged oocytes treated with CB and Tx for 1 h at 0, 1, 2 and 3 h after activation, incidence of 1PN in normal oocytes at 0 and 1 h after activation was decreased but that of 2PN was increased. However, the pattern of pronuclear formation longer than 2 h after activation showed no differences compared to those in the control. Ⅳ. Cytoskeletal changes in aged mouse and human oocytes 1. Changes in cytoskeletal elements of aged mouse oocytes 1) In most young oocytes (82.9%) at 16 h post-hCG, the chromosomes were overlaid in microfilament rich domain in the cell cortex, showing the significant higher than those (24.4%) in aged oocytes. However, in 51.2% of aged oocytes at 30 h post-hCG, chromosomes were located outside of the microfilament rich domain or moved from cortex to the center of the cell. 2) When microtubules of young oocytes after activation were stained, the percentage of oocytes with rotated meiotic spindle for PB extrusion or with 2nd PB was 73.3%. However, 56.7% of aged oocytes after treatment with ethanol showed the meiotic spindles moved to the center of cell or not rotated and 30% of aged oocytes showed the normal development. 2. Changes in cytoskeletal elements of aged human oocytes 1) In the experiment with human oocytes stained microtubule, the percentage of oocytes at 60 h post-hCG that meiotic spindles were positioned in periphery of the cell or formed normally was 70.8%. But the rate of abnormal eggs that meiotic spindles were moved to center or disrupted was higher (p<0.05) in aged oocytes at 84 h post-hCG (36.0%) than those (12.5%) in the younger ones. 2) Since the human oocytes used in this study were once adopted to the IVF program and thus judged to be unfertilized by morphological features, 8.0%-8.3% of those oocytes were actually penetrated by spermatozoon and showed the state of premature chromosome condensation (PCC). Taken together, these results suggest that the abnormal changes of cytoskeleton, which are important during meiosis and mitosis in the most of mammalian oocytes, by oocyte ageing may elevate frequency of aneuploid oocytes in mammals. The abnormality presumably prevents the extrusion of polar body and thus shows abnormal fertilization and development, such as a formation of pronuclear from unextruded polar body. 본 연구에서는 생쥐와 사람난자를 공시하여, 정상적으로 수정되어야 할 시기에 수정되지 않고 노화되었을 경우, 난자가 어떠한 생리적, 형태적 변화를 겪게 되는 지를 조사하였다. 생쥐난자의 경우 단위발생을 유도하기 위하여 ethanol 처리를 실시한 다음, 체내 및 체외에서 노화 정도에 따른 전핵형성 양상을 조사하였고, 사람난자의 경우에는 정자직접주입법과 calcium ionophore 처리법에 의해 체외에서 노화된 난자의 전핵 형성양상을 관찰하였다. 동시에 난자의 성숙이나, 수정 및 전핵 형성, 그리고 난자의 분열과정에 관여하는 cytoskeleton의 작용에 영향을 미치는 cytochalacin B와 taxol을 처리하여 노화된 난자에 미치는 영향을 검토함으로서, 노화난자에서 관찰되는 비정상적 수정의 원인을 규명하고자 하였다. 본 연구에서 얻어진 결과를 요약하면 아래와 같다. Ⅰ. 생쥐 및 사람난자의 단위 발생 최적조건 1) 생쥐난자의 인위적 활성화를 위하여 calcium ionophore와 ethanol을 상이한 농도로 각각 5분간씩 처리한 결과, calcium ionophore 처리군은 농도에 관계없이 10 ~ 20%의 활성율을 보였으나, ethanol 처리군의 활성율은 83.3%이었고, 전핵 형성양상도 정상적이었다. 그러나 9, 12% ethanol 처리군의 활성율은 높았으나 비정상적인 전핵 형성이 많았다. 2) 생쥐난자의 채란 적기를 결정하기 위하여 hCG 투여 후 12, 14, 16 및 18시간째에 난자를 채취하여 활성화를 유도한 결과, hCG 투여 후 16 ~ 18 시간째에 채취한 난자의 활성이 64.2 ~ 66.0%로서 유의하게 높았다 (p<0.05). 3) Calcium ionophore와 ethanol을 사람난자에 처리한 결과, 10μM의 calcium ionophore를 5분간 처리한 군의 활성율이 53.5%로서 가장 높았다. Ⅱ. 난자의 노화가 전핵형성에 미치는 영향 1. 생쥐난자의 노화가 전핵형성에 미치는 영향 1) 생쥐난자를 hCG 투여 후 16시간째에 회수하여 체외에서 노화를 유도하면서 4시간 간격으로 전핵 형성양상을 조사 한 결과, hCG 투여 후 16시간째에 난자는 1PN과 2PN의 비율이 각각 83.3%와 14.3%였다. 이러한 성적은 hCG 투여 후 24시간째까지는 차이가 없었으나, 28시간째의 난자는 1PN과 2PN의 비율이 각각 39.3%와 29.5%로, 초기에 비하여 1PN은 감소하고, 2PN은 유의하게 증가하였다 (p<0.05). 2) 체내에서 노화를 유도한 생쥐난자의 경우에도, hCG 투여 후 16시간째와 28시간째에 회수한 난자의 1PN과 2PN 비율은 각각 80%와 20%, 28.3%와 52.2%로서 노화와 더불어 1PN의 비율은 감소하고, 2PN의 비율은 유의하게 증가하여 (p<0.05), 체외에서의 결과와 유사한 경향을 보였다. 그러나 변화의 정도는 체내 노화난자의 경우가 더욱 현저하여 노화는 체내에서 더욱 빠르게 진행되는 것으로 판단되었다. 3) 인위적으로 activation을 유도한 생쥐난자의 전핵형성 속도를 확인한 결과, hCG 투여 후 16시간째와 30시간째에 회수된 난자가 활성화 후 4시간째에 전핵을 형성한 비율은 각각 69.6%와 68.2%로, 노화의 정도가 전핵형성속도에 영향을 미치지는 않는 것으로 나타났다. 4) 생쥐난자를 공시하여 인위적으로 활성화를 유도한 후 24시간째의 배 발달율을 확인한 결과, 4세포기로 발달하는 비율은 신선한 난자보다 노화된 난자가 다소 높았다. 2. 사람난자의 노화가 전핵형성에 미치는 영향 1) hCG 투여 후 65, 75, 85 및 95시간째의 사람난자를 calcium ionophore로 처리하여 전핵 형성양상을 조사한 결과, 1PN은 각각 54.2, 38.5, 20.7 및 32.0%였고, 2PN은 각각 12.5, 26.9, 44.8 및 48.0%로, hCG 투여 후 시간의 경과와 더불어 1PN은 감소하였는데, 이는 생쥐난자의 경우와 유사한 결과였다. 2) 정자직접주입법에 의하여 사람난자의 전핵형성양상을 조사한 결과, hCG 투여 후 60시간과 66시간째 난자의 2PN 비율은 각각 84.6%와 80.9%로서 정상적이었으나, 72시간째 난자의 2PN과 3PN 비율은 각각 57.1%와 38.1%로서, 2PN이 감소하고, 3PN이 증가하는 양상을 보였다. Ⅲ. Cytochalacin B와 taxol 처리의 영향 1) hCG 투여 후 16시간째의 생쥐난자를 cytochalacin B와 taxol로 처리한 결과, 1PN은 각각 39.1%와 36.4%로 ethanol 처리군의 73.7%에 비하여 유의하게 감소하였고, 2PN의 비율은 각각 52.2%와 40.9%로서, ethanol 처리군의 26.3%에 비하여 유의하게 증가하여 (p<0.05), CB와 Tx이 생쥐난자에 있어서 1PN의 형성을 억제하고, 2PN의 형성을 증가시키는 것으로 나타났다. 2) hCG 투여 후 30시간째의 노화 생쥐난자에게 CB와 Tx를 처리한 결과, 전핵형성에 있어서 대조군과 처리군간에 차이가 없었다. 3) 활성화 이후, 정상적인 난자와 노화된 난자에 CB와 Tx를 처리하여 전핵이 형성된 난자의 발달 상태를 조사한 결과, 정상적인 난자보다 노화된 난자의 발달속도가 다소 빨랐다. 4) 정상적인 난자와 노화된 난자를 활성화 유도 후 0, 1, 2 및 3시간째에 CB와 Tx을 1시간 동안 처리한 결과, 정상적인 난자군에서는 활성화 직후와 1시간째에 대조군보다 1PN의 발생이 억제되었고, 2PN의 발생이 증가하였다. 그러나 2시간 이후에는 대조군과 유사한 성적을 보였다. Ⅳ. 노화에 수반되는 cytoskeleton의 변화 1. 생쥐난자의 cytoskeleton 1) hCG 투여 후 16시간째 난자의 경우 방추사는 미세섬유가 풍부한 영역에 위치하고 있는 비율이 82.9%인데 대해, 노화 난자의 그것은 24.4%로 유의하게 감소한 반면 (p<0.01), 방추사는 미세섬유가 풍부한 영역을 벗어났거나, 세포질의 중심부로 이동한 비정상적인 난자의 비율은 51.2%로 유의하게 증가하였다 (p<0.05). 2) 활성화가 유기된 생쥐난자의 미세소관을 염색한 결과, 정상 난자의 경우 제2극체의 방출을 위해 방추사가 회전되었거나, 제2극체를 방출한 난자의 비율이 73.3%이었으나, 노화된 난자의 경우 정상적인 상태의 난자는 30.0%이었고, 방추사가 회전되지 않았거나 세포질의 중심부로 이동한 비정상적인 난자의 비율은 56.7%로 유의차가 있었다 (p<0.05). 2. 사람난자의 cytoskeleton 1) hCG 투여 후 60시간째 난자의 경우 방추사의 위치나 형태가 정상적인 것은 70.8%인데 대해, hCG 투여 후 84시간째의 노화된 난자의 그것은 44.0%였고, 방추사가 세포질의 중심부로 이동하거나 방추사가 깨어지고, 혹은 염색체가 파편화된 난자의 비율은 36.0%로 유의하게 증가하였다 (p<0.05). 2) 사람난자는 체외수정에 공시되었던 난자를 대상으로 하였기 때문에, 형태상으로 미 수정란으로 판정되었던 난자 중에서 실제로는 정자가 침입하였으나 활성화되지 못하고 premature chromosome condensation (PCC)상태로 남아있는 난자의 비율이 8.0 ~ 8.3%였다. 이상의 결과를 종합하여 볼 때 생쥐나 사람난자 다같이 난자가 노화되면 감수분열 과정에서 중요한 역할을 담당하는 cytoskeleton이 비정상적으로 변성되고, 이것이 원인이 되어 방출되어야 할 극체가 세포내에 남아 전핵을 형성하는 등 비정상적인 수정과 발생을 보이는 것으로 판단된다.

卵胞液이 생쥐 및 人間受精卵의 體外發生에 미치는 影響

윤혜균 建國大學校 大學院 1994 국내석사

본 연구는 포유동물 수정란의 체외배양에 있어서 배양액 첨가제인 단백질원으로 난포액의 사용 가능성을 알아보고, 또한 가장 효율적인 난포액 선별방법을 모색 하고자 실시하였다. 첫번째 실험에서는 난포액과 제대혈청의 성분을 분석 비교하고, 난포액과 제대혈청을 첨가한 배양액에서 생쥐수정란의 발생을 비교하였다. 두번째 실험에서 난포액을 성숙난자를 포함한 난포액과 미성숙난자를 포함한 난포액으로 구분하여 그 특성과 생쥐수정란의 발생을 비교하였으며, 세번째 실험에서는 인간 체외수정의 결과에 따라 난포액을 구분한 뒤 분류된 4군에서 배양된 생쥐수정란의 발생을 비교하였다. 또한 다정자침입이 일어난 인간수정란을 BSA, 제대혈청 및 난포액을 첨가한 배양액에서 체외배양하여 그 발생율을 비교하였다. 결과는 다음과 같다. 1. 난포액과 제대혈청의 단백질, 비단백유기물, 호르몬 및 대사물질을 비교한 결과 단백질 및 대사물질의 함량은 유사하였으나, 지질성분은 제대혈청에서, 호르몬 성분은 난포액에서 현저히 높았다. 2. 난포액과 제대혈청을 첨가제로 사용하여 생쥐 1세포기 수정란의 발생에 미치는 영향을 비교한 결과 배반포기까지의 발생율은 각각 88.3와 79.3%로서 난포액 첨가군에서 유의하게 높았으나, 부화배반포는 54.8와 51.6%로서 유사한 발생율을 보였다. Egg cylinder와 somite stage까지의 발달율은 난포액군에서 높았다 (P<0.05). 3. 성숙난포액과 미성숙난포액의 단백질 및 steroid hormone의 함량을 비교한 결과, 성숙난포액의 총 단백함량, albumin 및 estradiol의 농도가 유의하게 높게 나타났다. 4. 성숙난자를 포함한 난포액과 미성숙난자를 포함한 난포액을 첨가제로 이용하여 생쥐 1세포기 및 2세포기의 수정란을 배양한 결과, 미성숙난포액 첨가군에서 대조군과 성숙난포액 첨가군에 비하여 낮은 발생율을 보였다 (P<0.01). 5. 인간수정란의 발생상태와 임신 여부에 따라 난포액을 4군으로 분류하여 생쥐 2세포기 수정란의 발생을 비교한 결과, Good grade이면서 임신된 난포액 첨가군에서 Poor grade이거나 임신이 되지 않은 난포액 첨가군에 비하여 유의하게 높은 발생율을 보였다. 6. 난포액, 제대혈청 및 BSA를 첨가한 배양액에서 인간 수정란을 배양한 결과 BSA첨가군이 난포액 첨가군에 비하여 낮은 발생율을 보였다 (P<0.05). These experiments were carried out to investigate the effects of human follicular fluid (hFF) as a protein supplement on development of mammalian embryo as well as to find out ways toward effective use of hFF. In the first experiment, the composition of hFF and human fetal cord serum (hFCS ) were analysed. Then the rates of in vitro development of mouse embryo were examined after adding hFF or hFCS to culture medium T6. In the second experiment, classified follicular fluid containing mature oocytes (M-hFF) and follicular fluid containing immature oocytes (Im-hFF), and compared the rates of in vitro development of mouse embryo cultured in M-hFF or Im-hFF to culture medium T6. In the third experiment, in accordance of the results of human IVF, hFF has been divided into 4 groups ; hFF from pregnant patients who have good-grade embryo, hFF from patients have good-grade embryo and were not pregnant, hFF from pregnant patients who have poor-grade embryo and hFF from patients who have poor-grade embryo and were not pregnant. Then, using those hFF as a supplement, the development of preimplantation mouse embryos in vitro were compared. Finally, the rates of in vitro development of human embryos were examined in presense of BSA, hFCS or hFF as a source of protein. The results obtained are summarized as follows ; 1. The concentrations of proteins, lipids, hormones and metabolites in hFCS and hFF were analysed. There were no significant difference in total protein, albumin and metabolites concentrations. However, lipids were significantly lower and hormones were significantly higher in hFF compared to hFCS. 2. The developmental rates of the embryos to blastocyst stage were significantly higher In T6 + hFF (88.3%) than T6+ hFCS (79.3%). Meanwhile, there were no significant difference between two groups in hatching rates (54.8% : 51.6%). The rates of the blastocyst developed to egg cylinder and somite stage were higher in T6 + hFF than T6 + hFCS (P<0.05). These result suggested that viability of embryos cultured in hFF was higher than those in hFCS. 3. Total protein, albumin and estradiol concentrations were significantly higher in M-hFF compared to Im-hFF, and the developmental rates of the embryos to blastocyst stage cultured in Im-hFF were lower than those in M-hFF and the basic medium (P<0.01). 4. The developmental rates of the embryos to blastocyst and hatching blastocyst stage in presense of hFF from pregnant patients, who have good grade embryos, were significantly higher than those hFF from patients who have poor grade embryos or were not pregnant. 5. The developmental rates of human embryos cultured in Ham's F10 + hFF were higher than those in the Ham's F10 + BSA (P<0.05).

세피아테린 환원효소 녹아웃 생쥐에서 테트라히드로비오테린 생합성의 분석

金度亨 仁濟大學校 大學院 2008 국내석사

테트라히드로비오테린 (tetrahydrobiopterin, BH4)는 방향족아미노산 수산화효소들, 일산화질소 합성효소들, glyceryl-ether monooxygenase의 필수적인 조효소이다. BH4의 적당한 수준은 간에서는 페닐알라닌 대사, 뇌에서는 신경전달물질의 합성과 밀접한 관련이 있다. 세피아테린 환원효소 (sepiapterin reductase, SR)는 BH4 생합성의 마지막 단계를 촉매하는 효소이다. 최근 보고된 SR 결핍 환자는 신경전달물질의 생합성 저하로 고통을 겪고 있으나 고페닐알라닌증은 보이지 않는다. 이 환자들과는 대조적으로 SR 녹아웃 생쥐는 신경전달물질의 저하뿐만 아니라 고페닐알라닌증을 보인다. SR 유전자 치환에 따른 생리적 변화가 사람과 생쥐 각각에서 다르게 나타나는 이유를 알아보기 위하여, SR 녹아웃 생쥐의 간과 뇌에서 BH4 생합성을 비교 연구 하였다. GTP cyclohydrolase Ⅰ (GTPCH)의 효소활성은 녹아웃 생쥐의 간과 뇌에서 유사한 감소를 보였다. 그러나 6-pyruvoyltetrahydropterin synthase (PTPS)의 활성은 정상 생쥐에 비해 간에서 4.6 %감소하였으며, 뇌에서는 15.6% 감소를 보였다. 이러한 결과는 녹아웃 생쥐의 간에서 정상의 3% 수준에 해당하는 낮은 BH4 생합성이 PTPS에 기인하는 것임을 보여준다. 녹아웃 생쥐의 Western blot 분석을 실시한 결과 SR 단백질은 녹아웃 생쥐에서 전혀 발견되지 않았음에도 불구하고 녹아웃 생쥐의 BH4의 수준은 정상의 30% 수준이었다. 이러한 결과는 SR이 결핍되어도 carbonyl reductase에 의해 BH4 생합성이 이루어짐을 증명한다. 일산화질소 합성효소(nitric oxide synthase, NOS의 활성은 간보다 뇌에서 월등히 높게 나타났다. 녹아웃 생쥐의 뇌에서 NOS 활성은 절반정도 감소하였으나 BH4를 첨가하면 회복됨을 보여주었다. 이는 BH4가 뇌에서 NOS의 조효소로서의 역할이 중요함을 추정케 한다. 마지막으로 이상하게도 헤테로 녹아웃 생쥐에서 BH4의 수준은 정상 생쥐와 유사함에도 불구하고, GTPCH, PTPS, dihydropteridine reductase, NOS의 활성은 절반 정도 수준으로 감소하였다. 이러한 연구결과들은 앞으로 사람에서 SR 결핍으로 인한 생리적 변화들을 이해하는데 중요한 정보들을 제공해줄 것이다. Tetrahydrobiopterin(BH4) is an essential cofactor for aromatic amino acid hydroxylases, nitric oxide synthases, and glyceryl-ether monooxygenase. A proper level of BH4 is closely associated with neurotransmitter synthesis and phenylalanine metabolism in brain and liver, respectively. Sepiapterin reductase(SR) is an enzyme catalyzing the final step of BH4 biosynthesis. Recently SR deficient patients were reported to suffer from insufficient neurotransmitter synthesis but not hyperphenylalaninemia. In contrast to human patients, SR knockout mouse was shown to exhibit hyperphenylalaninemia as well as diminished levels of neurotransmitters. In order to understand the different physiological consequences in the livers between human and mouse, the BH4 biosynthesis in SR knockout mouse were comparatively investigated in the liver and brain. The enzymatic activities of GTP cyclohydrolase Ⅰ (GTPCH) were similarly decreased in the liver and brain of the KO homo(-/-) mouse. However, 6-pyruvoyltetrahydropterin synthase(PTPS) activity was decreased to 4.6% of normal in the liver, while to 15.6% in the brain, implicating PTPS was responsible for the remarkably low level of BH4 in the homo liver(3% of normal). BH4 level was determined to be 30% of normal in the homo brain, in spite of the complete absence of SR protein in the homo mouse as demonstrated by Western blot analysis. The result therefore supported the putative role of carbonyl reductase involvement in BH4 synthesis in the absence of SR. NOS activity was determined to be significantly higher in the brain than liver. NOS activity in the homo brain was also decreased to a half level of normal but recovered much when BH4 was supplemented to the assay, suggesting that BH4 may have an important role as a NOS cofactor in the brain. Finally, it was strange to find that the enzyme activities of GTPCH, PTPS, dihydropteridine reductase, and NOS in the hetero(+/-) mouse were also decreased by a half levels compared to normal, although BH4 levels were similar. The results may provide valuable information for understanding the physiological consequences of SR deficiency in human.

장시간 탈진운동 시 골격근 수축 및 에너지대사에서 AQP3의 역할

김미자 동아대학교 대학원 2013 국내박사

장시간 탈진운동 시 골격근 수축 및 에너지대사에서 AQP3의 역할 A Role of AQP3 in Skeletal Muscle Contraction and Energy Metabolism a Single Bout of Exhaustive Exercise 체육학과 김 미 자 지도교수 김 영 준 Aquaporin(AQP) 3은 세포막을 통한 수분 및 글리세롤의 이동을 선택적으로 촉진시키는 막단백질이다. 골격근에서는 AQP4가 주된 수분통로로 골격근 수축에 중요한 역할을 담당한다고 알려져 있다. AQP3도 골격근에서 발현된다는 보고는 있지만 아직 정확한 세포내 분포와 기능에 대해서는 전혀 알려진 바가 없다. AQP3은 AQP4와는 달리 글리세롤의 세포막 이동을 촉진시키므로 골격근 내 지방을 분해하여 운동에너지원의 일부로 사용하는 지속적 운동 시 근육조직에서 글리세롤의 유출 장애로 운동 수행능력을 제한할 가능성이 높다. 이에 본 연구는 AQP3 유전자결핍 생쥐에서 장시간 중강도 탈진운동을 실시하여 운동 수행능력의 차이를 조사하고 글리세롤과 관련된 운동에너지원의 혈장 및 조직 내 농도 변화를 분석하였다. AQP3 유전자결핍생쥐와 야생형생쥐 각각 16마리를 대상으로 트레드밀을 이용하여 10° 경사에서 최대 12 m/min 속도까지 증가시키면서 탈진할 때까지 장시간운동을 실시하였다. AQP3 유전자결핍생쥐의 조직학적 차이와 AQP3 단백의 세포내 위치를 알아보기 위해 뒤넙다리근, 긴발가락폄근 및 가자미근을 적출하여 면역조직화학 및 형광염색을 실시하였고, 장시간 탈진운동 후 운동에너지원의 변화를 분석하기 위해 혈장 및 조직 내 포도당, 당원, 중성지방 및 글리세롤 농도를 측정하였다. AQP3 유전자결핍생쥐는 야생형생쥐에 비해 뒤넙다리근의 직경과 무게가 야생형생쥐에 비해 감소되어 있었으나, 조직학적 차이는 관찰되지 않았다. AQP3은 골격근세포의 세포막 혹은 세포간격에 비연속적인 형태로 발현되었으며, AQP1 및 AQP4의 발현 부위와는 겹쳐지지 않았다. 장시간 탈진운동 시 운동지속시간은 AQP3 유전자결핍생쥐가 야생형생쥐에 비해서 현저히 낮았다. 운동수행 전 간, 근육 및 혈장 내 포도당, 당원, 중성지방 및 글리세롤 농도는 모두 AQP3 유전자결핍생쥐에서 야생형생쥐에 비해 유의하게 감소되어 있었으나, 근육 내 중성지방 농도는 오히려 증가되어 있었다. 장시간 탈진운동 후 혈장과 근육의 포도당 농도, 근육의 당원 함량 및 간과 혈중의 중성지방 함량은 감소하고, 간과 혈장 글리세롤 농도는 증가하였으나, 두 실험군간 유의한 차이는 없었다. 그러나 장시간 탈진운동 후 간의 당원함량과 근육 내 글리세롤 농도가 야생형생쥐에서는 감소된 반면, AQP3 유전자결핍생쥐는 오히려 증가되었다. 이상의 결과를 종합하면 골격근에서 AQP3은 지구성 운동 시 골격근 내 지방의 분해로 생성되는 글리세롤의 유출을 촉진시킴으로써 간에서 글리세롤을 이용한 당신생과정을 통해 지속적인 운동에너지원의 공급에 기여하여 운동 수행능력에 영향을 주는 것으로 사료된다. 주요어 : Aquaporin-3(AQP3), 글리세롤, 골격근, 장시간 탈진운동, 유전자결핍생쥐, 근육 내 지방

Myostatin(MSTN) 유전자 제거 상향 Wnt/β-catenin 신호통로 골대사에 영향을 줌으로써 제2형 당뇨병 생쥐 골다공증 개선

청징웨이 경기대학교 대학원 2023 국내박사

Background:Myostatin (MSTN) is a member of the transforming growth factor-β (TGF-β) superfamily and is a secreted protein highly produced by skeletal muscle that negatively regulates its growth and development. MSTN also plays a role in regulatingglucose and lipid metabolism.Previous studies have shown that people with type 2 diabetes mellitus(T2DM) and insulin resistance have elevated serum and skeletal muscle MSTN levels.The expression of MSTN in skeletal muscle of T2DM mice increased. After receiving MSTN antibody injection, the fasting and postprandial blood glucose levels improved. The available evidences show that MSTN can affect the body's glucose uptake and utilization and participate in the occurrence of insulin resistance. However, the molecular mechanism of MSTN involved in regulating T2DM insulin resistance is not clear.In this study, based on the MSTN knockout (KO) mice constructed by CRISPR/Cas9 gene editing, a high-fat diet combined with low-dose streptozotocin (STZ) was used to construct a T2DM animal model. The body composition, muscle strength, fatigue resistance, glucose regulation and histopathological changes in skeletal muscle were observed, and the expression levels of proteins on insulin signaling pathway were measured to explore the effect and mechanism of MSTN on bone metabolism and bone microstructure in mice with T2DM. Objective:To analyze effects ofMSTN on insulin resistance and insulinsignalingpathway in skeletal muscle of mice with T2DM.Methods:MSTN knockout heterozygous C57BL/6N mice were constructed by CRISPR/Cas9 gene editing techniques. We acquired finally male mice consisting of 12 wild type mice, 12 heterozygous mice and 12 homozygous mice through breeding and PCR. All animals were randomly assigned to 2 groups including 6 groups in totaland 6 in each group: WT group, MSTN(+/-) group, MSTN(-/-) group, WT+DM group, MSTN(+/-)+DM group and MSTN(-/-)+DM group.The first three groups were fed 6-week standard chow and the rest were fed 6-week high-fat diet for combined with small-dosestreptozocin (STZ) injection to structure models of T2DM. After measuring fasting plasma glucose (FPG) to evaluate animal models, all mice were measured body weight (BW), body length (BL), abdominal circumference (AC), gastrocnemius muscle weight (BMW), abdominal adipose weight (VAW) and calculated ratios (GMW/BW, VAW/BW) to evaluate the changes of body composition. All animals were measured gripping force and rotating time to exhaustion to evaluate muscle strengthand fatigue resistance. All groups were measured fasting serum insulin (FIns), tolerance test (GTT), insulin tolerance test (ITT) and calculated insulin sensitivity index (ISI), homeostasis model assessment-insulin resistance index (HOMA-IR) and area under curve (AUC)to evaluate directly and indirectlyinsulin sensitivity, insulin resistance and regulation of bloodsugar.HE staining analyzed the muscle fiber morphology and cross-sectional area in gastrocnemius muscles. Western blot (WB) quantified expressions of MSTN, InsR, IRS1, p-IRS1, PI3K, p-PI3K, Akt, p-Akt, GLUT4, GSK3β andp-GSK3βon the insulinsignaling pathway in gastrocnemius muscles. Measurement data among multiple groups were conducted using one-way analysis of variance (ANOVA)by SPSS software. Images of HE stainingandWBwereanalyzedsemiquantitativelybyImage Jsoftware.Graphs were produced usingGraphPad Prism software. Results:1. The levels of serum PINP and CTX in wt+dm group, MSTN + / - DM group and mstn-/- + DM group were higher than those in WT group, MSTN + / - group and mstn-/- (p<0.05). The levels of serum PINP and CTX in WT group, MSTN + / - group and mstn-/- group decreased successively (p<0.05); The levels of serum PINP and CTX in wt+dm group, mstn+/- +dm group and mstn-/- +dm group decreased successively (p<0.05).2. In WT group, MSTN + / - group and mstn-/- group, the trabeculae were continuous, the structure was intact, and the bone cortex was smooth. The number of trabeculae in mstn-/- group increased significantly; In wt+dm group and mstn+/- +dm group, the number of trabeculae decreased, trabeculae were broken, and the edge of bone cortex was rough, while in mstn-/- +dm group, the number of trabeculae was significantly increased and the continuity was significantly improved.3.ALP calcium cobalt staining showed that the dark brown precipitates in the cytoplasm of wt+dm group, MSTN + / - DM group and mstn-/- + DM group were more than WT group, MSTN + / - group and mstn-/- group, respectively. Dark brown precipitates in the cytoplasm of WT group, MSTN + / - group and mstn-/- group decreased in turn; Dark brown precipitates in the cytoplasm of wt+dm group, mstn+/- +dm group and mstn-/- +dm group decreased in turn.4. Trap staining showed that the purplish red precipitates in the cytoplasm of wt+dm group, MSTN + / - DM group and mstn-/- + DM group were more than WT group, MSTN + / - group and mstn-/- group, respectively. The purplish red precipitates in the cytoplasm of WT group, MSTN + / - group and mstn-/- group decreased in turn; The purplish red precipitates in the cytoplasm of wt+dm group, mstn+/- +dm group and mstn-/- +dm group decreased in turn. However, the change of osteoclast activity after MSTN gene knockout is more obvious than that of osteoblasts.5.Wt+dm group, mstn+/+dm group, mstn-//+dm group bone tissue Wnt β- The expression of catenin was lower than that of WT group, MSTN + / - group and mstn-/- group (p<0.05), GSK-3 β The expression was higher than that of WT group, MSTN + / - group and mstn-/- group (p<0.05). Wnt of bone tissue in mstn-/- group β- The expression of catenin was higher than that of WT group and MSTN + / - group, GSK-3 β The expression was lower than that of WT group and MSTN + / - group (p<0.05); Wnt of bone tissue in mstn-/-+dm group β- The expression of catenin was higher than that of wt+dm group, mstn+/+dm group and GSK-3 β The expression was lower than that in wt+dm group and mstn+/+dm group (p<0.05); Wt group and MSTN + / - group, wt+dm group and MSTN + / - DM group bone tissue Wnt, GSK-3 β, β- There was no significant difference in the expression of catenin (p>0.05). Conclusion:1. Inhibition of Mstn gene expression can improve bone formation and bone resorption caused by T2DM, but mainly inhibit excessive bone resorption, and the degree of change is related to the expression of Mstn. 2. Inhibition of Mstn gene expression in T2DM mice can improve bone microstructure and increase bone strength, and the degree of change is related to the expression of Mstn. 3. Inhibition of Mstn gene expression in T2DM mice can up-regulate the Wnt/β-catenin signaling pathway in bone tissue, and the degree of change is related to the expression of Mstn. 연구배경:제2형 당뇨병(T2DM)의 발병률은 해마다 증가하고 있으며 인류 건강에 큰 위협이 되고 있다. 제2형 당뇨병(T2DM) 발병 시 골대사가 비정상적으로 작동하고 골다공증 발생 위험이 높아진다. 그러나 구체적인 분자 메커니즘이 아직 밝혀지지 않았다. 마이오스타틴(myostatin, Mstn)는 전환성장인자 TGF-베타그룹(TGF-β family)에 속한 단백질로 골격근의 발생과 성장을 억제하는 분비형 단백질이다. Mstn는 근육의 이화작용을 시킬 수 있을 뿐만 아니라 골대사를 조절하는 역할도 하고 있는 것으로 나타났다.따라서 Mstn는 T2DM 골다공증의 발생과 관련될 수 있다고 추측할 수 있다. 본 연구에서는 Mstn 유전자 녹아웃 마우스를 연구 대상으로 고지방 식이와 저용량 스트렙토조토신으로 유도된 제2형 당뇨병(T2DM) 동물 모델을 이용하여 Mstn는 T2DM 골대사에 미치는 영향 및 분자 메커니즘을 탐구하고 당뇨병 골다공증의 치료에 새로운 방향과 대안을 모색한다. 연구목적:Myostatin(MSTN) 유전자 제거 제2형 당뇨병(type 2 diabetic mellitus, T2DM) 생쥐의 골 대사 및 골 미세구조에 미치는 영향과 메커니즘을 탐구한다.연구방법:수컷 생쥐 야생형(WT) 12마리, 이형 접합형(Mstn+/-) 12마리, 동형 접합형(Mstn-/-) 12마리를 각각 2개의 그룹 한 그룹당 6마리로 나누어, WT그룹, Mstn+/-그룹, Mstn-/-그룹, WT+DM그룹, Mstn+/-+DM그룹, Mstn-/-+DM그룹으로 분류한다. 앞에 3개의 그룹에게 일반 식단을 제공하고 뒤에 3개의 그룹에게 고지방 식이와 저용량 스트렙토조토신을 급여하여 T2DM 모델을 구축한다.생쥐 모델 6개 그룹을 만든 뒤 ELISA방법으로 혈청 P1NP(type I procollagen N-terminal propeptide, 골형성표지자), CTX(type I collagencross-linked C-telopeptide, 골흡수표지자) 수치를 측정하고, 마이크로-CT를 이용하여 왼쪽 경골의 골밀도(bone mineral density, BMD), 골 부피분율(bone volume/total volume, BV/TV), 골소주 개수(trabecular number, Tb.N), 골소주 두께(trabecular thickness, Tb.Th), 골소주 가격(trabecular separation, Tb.Sp), 구조적 모델 지수(structure model index, SMI)를 분석한다. 그리고, 알칼리성 인산분해효소 (alkaline phosphatase, ALP)ATPase 염색법으로 골조직 조골세포의 활성도를 확인하고, 타르타르산염 저항성 인산분해효소 (tartrate resistant acid phosphatase, TRAP) 염색법으로 골조직 파골세포의 활성도를 확인한다. 또한, 면역조직화학법을 통해 골조직 Wnt, 글리코겐 합성효소 키나아제 3β (glycogen synthase kinase-3β, GSK-3β), 베타 카테닌(β-catenin)의 발현을 측정한다.연구결과:WT그룹과 비교하면 WT+DM그룹의 혈청 PINP, CTX 수치, Tb.Sp, SMI 및 골조직 중의 조골세포와 파골세포의 활성, 그리고 GSK-3β의 발현은 모두 증가하고, BMD, BV/TV, Tb.N, Tb.Th 및 골조직 Wnt, β-catenin의 발현은 모두 감소한 것으로 나타났다. WT그룹, Mstn+/-그룹과 비교하면 Mstn-/-그룹의 BMD, BV/TV, Tb.N, Tb.Th 및 골조직 Wnt, β-catenin의 발현은 모두 증가하고, 혈청 PINP, CTX 수치, Tb.Sp, SMI 및 골조직 중의 조골세포와 파골세포의 활성, GSK-3β의 발현은 모두 감소한 것으로 나타났다. WT+DM그룹, Mstn+/-+DM그룹과 비교하면 Mstn-/-+DM그룹의 BMD, BV/TV, Tb.N, Tb.Th 및 골조직 Wnt, β-catenin의 발현은 모두 증가하고, 혈청 PINP, CTX 수치, Tb.Sp, SMI 및 골조직 중의 조골세포와 파골세포의 활성, GSK-3β의 발현은 모두 감소했다. 1. WT+DM그룹, Mstn+/-+DM그룹, Mstn-/-+DM그룹의 혈청 PINP, CTX수치는 각각 WT그룹, Mstn+/-그룹, Mstn-/-그룹보다 높은 것으로 확인됐다 (P<0.05). WT그룹, Mstn+/-그룹, Mstn-/-그룹의 혈청 PINP, CTX 수치는 순차적으로 감소하고 (P<0.05), WT+DM 그룹, Mstn+/-+DM그룹, Mstn-/-+DM그룹의 혈청 PINP, CTX 수치는 순차적으로 감소한 것으로 나타났다 (P<0.05). 2. WT그룹, Mstn+/-그룹, Mstn-/-그룹은 골소주의 연속성, 구조가 완전하고 골피질이 매끄러우며, 그 중에 Mstn-/-그룹의 골소주 개수가 현저히 증가했다. WT+DM그룹, Mstn+/-+DM그룹은 골소주 개수가 감소하고 골소주가 파열되며 골피질의 가장자리가 거친 반면 Mstn-/-+DM그룹은 골소주 개수가 현저히 증가하고, 연속성도 확실히 많이 개선되었다. 3. 알칼리성 인산분해효소(ALP) ATPase 염색 결과에 따르면 WT+DM그룹, Mstn+/-+DM그룹, Mstn-/-+DM그룹은 WT그룹, Mstn+/-그룹, Mstn-/-그룹보다 세포질 내에 흑갈색의 침전물이 더 많은 것으로 나타났다. WT그룹, Mstn+/-그룹, Mstn-/-그룹은 세포질 내에 흑갈색의 침전물이 순차적으로 감소하고, WT+DM그룹, Mstn+/-+DM그룹, Mstn-/-+DM그룹은 세포질 내에 흑갈색의 침전물이 순차적으로 감소했다. 4. 타르타르산염 저항성 인산분해효소(TRAP) 염색 결과에 따르면 WT+DM그룹, Mstn+/-+DM그룹, Mstn-/-+DM그룹은 WT그룹, Mstn+/-그룹, Mstn-/-그룹보다 세포질 내에 자홍색의 침전물이 더 많은 것으로 나타났다. WT그룹, Mstn+/-그룹, Mstn-/-그룹은 세포질 내에 자홍색의 침전물이 순차적으로 감소하고, WT+DM그룹, Mstn+/-+DM그룹, Mstn-/-+DM그룹은 세포질 내에 자홍색의 침전물이 순차적으로 감소했다. 그러나 마이오스타틴 (Mstn) 녹아웃 후 파골세포의 활성은 조골세포의 활성보다 변화가 뚜렷하게 진행된다는 것을 보여주었다. 5. WT+DM그룹, Mstn+/-+DM그룹, Mstn-/-+DM그룹의 골조직 Wnt, β-catenin 발현은 각각 WT그룹, Mstn+/-그룹, Mstn-/-그룹보다 낮고 (P<0.05), GSK-3β 발현은 각각 WT그룹, Mstn+/-그룹 , Mstn-/-그룹 보다 높은 것으로 나타났다 (P<0.05). Mstn-/-그룹의 골조직 Wnt, β-catenin 발현은 WT그룹, Mstn+/-그룹보다 높고, GSK-3β 발현은 WT그룹, Mstn+/-그룹 보다 낮다 (P<0.05). Mstn-/-+DM그룹의 골조직 Wnt, β-catenin 발현은 WT+DM그룹, Mstn+/-+DM그룹보다 높고 (P<0.05), GSK-3β 발현은 WT+DM그룹, Mstn+/-+DM그룹보다 낮은 것으로 나타났다 (P<0.05). WT그룹과 Mstn+/-그룹, WT+DM그룹과 Mstn+/-+DM그룹의 골조직 Wnt, GSK-3β, β-catenin 발현 관련 비교 및 차이는 통계학적으로 의미가 없다 (P<0.05). 결론:1. 마이오스타틴(Mstn) 유전자의 발현을 억제하면 제2형 당뇨병(T2DM)으로 인한 골흡수를 억제하고, 골형성을 촉진시키는 효과를 볼 수 있다. 그 중에 과도한 골흡수를 억제하는 것을 주요 기능으로 하고, 변화 정도는 또한 마이오스타틴(Mstn) 발현량과 관련이 있는 것으로 밝혔다. 2. 제2형 당뇨병(T2DM) 생쥐의 마이오스타틴(Mstn) 유전자 발현을 억제하면 골 미세구조를 개선하고 골강도를 증가시킬 수 있으며 변화 정도는 또한 마이오스타틴(Mstn) 발현량과 관련되어 있다. 3. 제2형 당뇨병(T2DM) 생쥐에게 마이오스타틴(Mstn) 유전자 발현을 억제하면 골조직 Wnt/β-catenin 신호 전달 경로를 상향 조절할 수 있다. 또한, 변화 정도는 마이오스타틴 (Mstn) 발현량과 관련이 있는 것으로 나타났다.

생쥐의 부정소에서 정자성숙의 조절에 관한 연구

윤현수 한양대학교 1990 국내박사