Role of microtubule acetylation in myofibroblast differentiation : implication in breast cancer development

유은애 중앙대학교 대학원 2018 국내박사

정상 섬유아세포는 면역세포에서 분비되는 성장인자인 TGF-β1에 의해 근섬유아세포로 분화하여 상처치유에 중요한 역할을 한다. 그러나 만성적인 면역반응이 발생할 경우, 근섬유아세포는 지속적으로 조직 내 stroma에 존재하게 되며, 과도한 ECM의 변형을 유발하여 섬유증 및 암 발달을 촉진한다. 비록 생체 내 환경 기계적 경도는 매우 다양하지만 많은 연구자는 근섬유아세포 분화 기작을 연구하면서 기계적 경도의 중요성은 간과하며, 실제 근섬유아세포 분화가 발생하는 연성 환경에서의 분화 기작 연구는 미비한 상태이다. 본 연구자는 미세소관 번역 후 수식화 과정 중 미세소관 아세틸화가 연성환경에서 근섬유아세포로 분화를 유도하는데 필수적인 역할을 하는 것을 확인하였다. TGF-β1는 경성 환경에서 세포의 긴장성 섬유와 점 접촉 부착을 증가시키는 반면, 연성환경에서는 세포의 확장 및 미세소관 아세틸화를 촉진하는 것을 확인하였다. 연성환경에서 근섬유아세포 분화 기작에서 미세소관 아세틸화의 기능을 알아보기 위하여 미세소관 아세틸전이효소인 α-Tat1을 결손 시킨 세포주를 제작하였다. α-Tat1 결손 섬유아세포는 TGF-β1에 의한 근섬유아세포 분화 정도가 억제되며, 세포의 수축력 또한 감소되었다. RNA 염기서열 분석법을 이용하여, 정상세포와 α-Tat1 결손 세포주에서 TGF-β1에 의해 증가 또는 감소하는 유전자를 분석한 결과, 근섬유아세포 분화와 관련된 주요 유전자가 저해되어 있음을 확인하였다. 이러한 유전자들은 TGF-β1의 하위 신호 전달자인 YAP과 Smad2에 의해 조절되며, α-Tat1 결손 세포에 YAP 활성형 돌연변이를 과발현 시켰을 때, 유전자 발현 및 세포의 수축력이 회복되는 것을 확인하였다. 또한, 미세소관 아세틸화는 모터 단백질인 다이네인과 함께 YAP의 핵 이동을 촉진하는 것을 확인하였다. 종합적으로, 연성환경에서 근섬유아세포 발달은 TGF-β1에 의한 미세소관 아세틸화에 의한 YAP의 핵으로 이동이 중요하게 작용하며, 근섬유아세포로 분화를 유도할 가능성을 제시하였다. 또한 TGF-β1은 SPIN90 (Spin90)의 발현을 감소시키며, 정상 섬유아세포와 비교하였을 때 암 미세환경에 존재하는 근섬유아세포에서 SPIN90 발현이 두드러지게 감소하였다. 더불어 Spin90 결손 세포주는 근섬유아세포의 특징을 가지고 있으며, 이와 함께 미세소관 아세틸화가 상당히 증가하여있음을 확인하였다. α-Tat1/Spin90 이중 결손 세포주는 근섬유아세포의 표적 유전자 발현 및 수축력을 감소시켰다. 본 연구자는 formin 단백질 계열인 mDia2의 발현을 저해한 경우 Spin90 결손 세포에서 증가해 있는 미세소관 아세틸화를 감소시키며, 이는 정상 섬유아세포에 비해 mDia2와 APC의 결합이 증가함으로써 미세소관의 아세틸화를 촉진한다는 것을 확인하였다. 유방암 환자의 조직의 stroma에서 SPIN90과 미세소관 아세틸화 발현을 분석한 결과, SPIN90의 발현이 감소된 섬유아세포에서 미세소관 아세틸화가 증가 하는 것을 확인하였으며, 이는 생체 외 실험 결과를 뒷받침 한다. 종합적으로 본 연구자는 초기 암 미세환경(연성환경)에서 TGF-β1에 의한 근섬유아세포 분화의 새로운 기작을 발견하였으며, 이는 향후 암 미세환경 조절을 통한 암 치료제 개발에 필수적인 단서를 제공할 것으로 기대된다. Acquisition of myofibroblastic phenotype of stromal cells under pathological condition is a critical process for the pathogenesis of fibrotic disease and cancer progression. Although the mechanical properties of extracellular matrices (ECM) under the pathological conditions are variable, most research on myofibroblast differentiation has been carried out on the conventional culture dish. In this dissertation, I show that the microtubule acetylation induced by TGF-β1 is a critical factor for initiation of myofibroblast differentiation under soft ECM conditions resembling early pathological conditions. Inhibition of α-tubulin acetylation by the genetic disruption of α-Tat1, α-tubulin acetyltransferase 1, using CRISPR/Cas9 system in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) resulted in the decrease of alpha-smooth muscle actin (α-SMA; encoded by Acta2) and 3D collagen gel contractility. Comparison of transcriptome analysis with RNA sequencing results obtained from WT and α-Tat1 KO MEF under soft ECM conditions indicated that microtubule acetylation is responsible for the bulk of gene expression corresponding to myofibroblast differentiation such as Tagln, Cyr61, Ctgf, Postn, Cxcr6 and so on. Mechanistically, acetylated microtubules are sufficient for dynein dependent nuclear translocation of YAP coactivator, via enforced acetylated-microtubule-dynein complex. Blockade of dynein activity with overexpression of dynamitin or pharmacological inhibitor, EHNA significantly reduced nuclear translocation of YAP and expression of myofibroblast marker genes on soft ECM conditions. Collectively, these findings demonstrate that the signalling axis for TGF-β1/acetylated-microtubule/dynein-based nuclear translocation of YAP is critical for the acquisition of myofibroblastic phenotype on soft ECM environment and it rendered to advantage for development pathogenesis. Also, I found that downregulation of SPIN90 was remarkably observed in breast cancer stroma compared with normal stroma. Knockout of Spin90 in fibroblasts facilitated acetylated-α-tubulin which is induced recruitment of mDia2 and APC complex to microtubules. This increased α-tubulin acetylation in Spin90 KO MEFs promoted nuclear localization of YAP, which upregulated expression of myofibroblast marker genes on soft matrices. Depletion of Spin90 enhanced tumor progression, and blockade of microtubule acetylation in CAF significantly inhibited tumor growth of mice. In this dissertation, I found that TGF-β1 induced Spin90 downregulation results in microtubule acetylation, which is a key step in CAF activation in low stiffness stroma.

centrobin의 미세소관 안정화 기능 조절기전 연구 : Regulation of the microtubule stabilizing activity of centrobin

박준현 서울대학교 대학원 2013 국내박사

세포골격의 주요구성 성분 중 하나인 미세소관은 튜불린 이합체가 붙었다가 떨어짐을 반복하며 역동적으로 변화하는 구조로 되어있다. 미세소관의 역동성은 다양한 미세소관 결합 단백질들에 의해 조절되는데, 그것들은 대부분 미세소관을 안정화 또는 불안정화하는데 관여한다. centrobin은 새로 생긴 중심립에 존재하며 중심립 복제에 필요한 단백질로 동정되었지만 미세소관 안정화에 관여한다는 일련의 증거들이 보고되었다. 또한, centrobin은 서로 다른 두 인산화효소, NEK2와 PLK1의 기질임이 보고되었다. PLK1에 의한 centrobin의 인산화가 정상적인 방추사의 형성에 중요하다고 알려졌으나, NEK2에 의한 centrobin의 인산화의 기능이 무엇인지에 대해서는 아직 명확히 밝혀지지 않았다. 따라서, 본 연구를 통해 NEK2에 의해 조절되는 centrobin의 기능을 밝히고자 했고, 몇 가지 중요한 생물학적 현상들을 발견하였다. 첫 번째, centrobin이 세포질 내에서 작은 과립형태로 존재하며 간기세포의 미세소관 그물구조와 결합하고 있음을 발견하였다. 나아가 때때로 그것들이 안정화된 미세소관을 따라 크고 길쭉한 형태의 입자를 형성함을 관찰하였다. 이러한 결과는 centrobin이 미세소관의 안정화에 관여함을 뒷받침한다. 두 번째, centrobin이 결여된 세포들은 심각하게 손상된 미세소관을 가지고 있으며, 세포가 바닥에 퍼지거나 이동 또는 증식하는 능력이 감소하게 된다. 반대로, centrobin의 인산화효소로 알려진 NEK2의 경우, 세포 내에서 발현을 감소시켰을 때, 세포의 퍼짐 현상과 이동 또는 증식 능력이 현저히 증가한다. 나아가, centrobin의 발현이 감소되었을 때 간기세포의 미세소관 안정화가 감소하는 반면 NEK2의 발현을 감속시켰을 때는 증가하는 것을 관찰하였다. 이러한 결과는 centrobin이 미세소관 안정화를 통해 세포내의 다양한 활동들에 영향을 미치며 NEK2가 이 과정을 조절할 것 임을 시사한다. 세 번째, 세포 내 또는 세포 외에서의 인산화 반응을 통해 36번째 세린을 포함한 centrobin의 4개의 아미노산 서열이 NEK2에 의한 인산화에 중요함을 확인하였다. NEK2에 의해 인산화가 되지 않는 centrobin을 세포 내에서 안정적으로 발현시켰을 때, 미세소관의 안정화와 세포의 퍼짐 현상과 이동능력이 증가함을 관찰하였다. 그러나 PLK1에 의한 인산화는 이러한 현상에 영향을 미치지 않음을 관찰하였다. 이는 NEK2가 인산화를 통해 간기세포에서의 centrobin의 기능을 특이적으로 조절함을 의미한다. 종합적으로, 이러한 결과들은 NEK2가 centrobin 인산화를 통해 미세소관의 안정화를 조절하며 이것이 세포의 퍼짐이나 이동, 증식 등의 활동에 영향을 미침을 의미한다. 따라서, 본 연구는 centrobin이 새로운 형태의 미세소관 결합 단백질이며 NEK2에 의한 centrobin의 인산화가 간기세포의 미세소관 안정화를 조절하는 중요 경로임을 시사한다.

Naegleria gruberi의 분화특이적 mRNA localization에 관여하는 세포골격 단백질에 관한 연구

한지웅 연세대학교 대학원 2001 국내박사

Naegleria gruberi 아메바는 특정한 조건하에서 2시간 내에 1쌍의 편모를 가진 유선형의 편모충으로 분화하는 진핵 단세포 생물이다. 이 분화과정동안 아메바에서는 존재하지 않았던 미세소관계 세포기관인 기저체, 편모, 세포골격 미세소관 등이 순차적으로 형성되며, 이를 위해서 분화특이적인 유전자의 일시적인 발현 뿐아니라 발현된 mRNA의 세포내 분포를 조절하는 현상(mRNA localization)이 일어난다(Han J. W., J. H. Park, M. Kim, and J. Lee. 1997, J. Cell Biol. 137:871-879). N. gruberi 아메바의 편모충으로의 분화과정 동안 일어나는 mRNA localization에 관여하는 세포골격 단백질의 기능을 밝히기 위한 실험들을 수행한 결과, 미세소관이 아닌 actin으로 구성된 미세섬유가 mRNA localization에 관여하는 것을 알수 있었다. 또한, actin은 분화과정 동안 세포내에 특정한 위치로 재분포하여 새로운 actin 구조를 형성하며, 이 재분포를 통해 mRNA를 localization 시키는 것으로 보인다. 이 actin 구조의 재분포는 cycloheximide를 처리하여 단백질 합성을 억제시켜도 일어나는 현상으로, 분화특이적 mRNA가 특정위치로 이동하기 이전에 actin 구조가 형성하는 것으로 보인다. 이 actin의 재분포에 myosin II가 관여하며, myosin은 분화과정 동안 actin 구조와 동일한 위치에 존재하였다. Actin과 myosin의 구조와 기능을 cytoch alasin D와 BDM을 처리하여 억제시킨 실험을 통해, actin과 myosin이 미세소관 순차적 형성 및 미세소관 구조의 유지에 중요한 역할을 담당함을 알 수 있었다. 즉, actin과 myosin의 구조 및 기능이 억제되면 세포의 분화와 더불어 미세소관의 순차적인 형성도 억제되었으며, 이미 형성된 세포내의 미세소관 세포골격도 파괴되었다. 또한 편모의 형성, 길이결정 및 유지에 actin과 myosin의 작용에 의해 결정됨을 억제시약을 처리한 실험을 통해 알 수 있었다. 이와 같은 실험 결과를 통해, N. gruberi의 actin과 myosin은 분화특이적 mRNA localization 뿐 아니라 미세소관 구조의 형성과 유지에 매우 중요한 역할을 담당하고 있다는 것을 알 수 있었다. Amorphous Naegleria gruberi amoeba undergoes a rapid and synchronous differentiation into a regular shaped flagellate with one pair of flagella within 2 hours. During this differentiation, N. gruberi sequentially forms microtubule-based organelles: basal bodies, flagella, and cytoskeletal microtubules. For this de novo formation of microtubule systems, several mRNAs (α-, β-tubulin and flagellar calmodulin) of N. gruberi are transiently transcribed and co-localized at a specific site in the cytoplasm during the differentiation (Han, et al., 1997. J. Cell Biol. 137:871-879). Inhibition of the co-localization of these mRNAs inhibits the formation of flagella and differentiation. To explore the mechanism that regulates this mRNA localization, I examined the effects of cytochalasin D, an inhibitor of actin filament, and colchicine, a well-known microtubule toxin, on the mRNA localization and differentiation. As a result, only cytochalasin D treatment has an inhibitory effect on the mRNA localization and differentiation. This data suggest that actin-based structure, not microtubule, might be involved in the mRNAs localization of N. gruberi. The mRNA localization accompanies the reorganization of actin. During the differentiation, the actin cytoskeleton of N. gruberi is reorganized to transiently form a new actin-based structure. The temporal and spatial formation of this actin structure is identical to that of the reported localization of tubulin mRNA, and actin structure was co-localized with tubulin mRNA in the cytoplasm. In addition, myosin, possibly myosin type II, is co-localized with this actin structure during the differentiation. This results show that myosin might have the possible role in the reorganization of actin. Even if both treatment of cytochalasin D and 2,3-butanedione monoxime (BDM; a myosin ATPase-specific inhibitor) inhibit the formation of the microtubule system, the inhibitory effects of these two drugs are different. Cytochalasin D treatment results in the formation of long irregular cytoskeletal microtubule, but does not have a significant effect on the length of flagella. On the contrary, BDM treatment results in the formation of short microtubules in the cytoplasm and shortens the formed flagella. These data suggest that actin and myosin play key roles in the mRNA localization, and in the formation and maintenance of microtubules during the differentiation of N. gruberi.

SJ 화합물인 SJ8002와 SJ8029의 in vitro 에서 미세소관 형성과 파괴에 미치는 영향에 관한 연구

이종한 연세대학교 대학원 2002 국내석사

본 연구에서는 다양한 인간 세포주에 처리해 본 결과 미세소관을 파괴하고, 형성을 억제하는 것으로 알려져 있는 SJ화합물 중 SJ8002와 SJ8029를 이용하여 이들 화합물이 in vitro 상에서 tubulin의 중합화 및 미세소관 파괴에 대한 영향과 이들 화합물의 tubulin 결합 부위를 밝혀 이들의 작용기작을 밝히고자하였다. 먼저 in vitro 상에서 tubulin 중합억제 효과를 순화시킨 tubulin과 MAPs가 들어있는 tubulin을 이용하여 확인해본 결과 SJ8002와 SJ8029는 모두 tubulin의 중합화를 농도 의존적으로 억제하였다. 그리고 SJ8002가 보다 더 효과적인 것을 확인 하였다. 그러나 MAPs의 존재 시 이들 화합물의 효과는 크게 감소하는 것이 확인되었다. 또한 taxol로 안정화된 미세소관에 대해서는 tubulin의 중합화 억제효과가 더 뛰어난 SJ8002는 안정화된 미세소관을 파괴하나 SJ8029는 안정화된 미세소관을 파괴하지 못하였다. SJ화합물과 형광으로 표지된 colchicine과의 tubulin결합을 경쟁시킨 실험 결과 SJ8002는 약 40% colchicine과 경쟁이 유도되는 반면SJ8029는 전혀 경쟁이 일어나지 않았다. SJ 화합물과 형광으로 표지된 vinblastine과의 tubulin결합을 경쟁시킨 실험 결과 SJ8002는 vinblastine과 경쟁이 일어나지 않는 반면 SJ8029는 vinblastine과 경쟁이 유도되었다. 또한 tubulin의 thiol기에 대한 SJ8002의 영향을 확인한 실험에서 SJ8002는 thiol기 분자들 존재하에서 tubulin의 중합화 억제 효과 및 taxol로 안정화된 미세소관에 대한 파괴효과가 감소하였다. 결론적으로 SJ8002는 tubulin의 colchicine binding 부위와 tubulin의 thiol기와 상호작용하여 미세소관의 형성을 억제하거나 형성된 미세소관을 파괴하는 반면 SJ8029는vinblastine 결합부위와 결합하여 미세소관의 형성을 억제한다. 또한 SJ8029는 SJ8002와 SJ8026를 결합시킨 화합물로 tubulin과의 결합은 SJ8026의 화학구조부분을 통해 이루어지는 것으로 사료된다. SJ compounds induce the depolymerization of microtubules and the inhibition of formation of microtubules in various human cell types. In this study, I have investigated the effect and the action mechanism of two SJ compounds, SJ8002 and SJ8029, on the polymerization and the depolymerization of microtubules in vitro. First, I have examined the inhibitory effect of SJ8002 and SJ8029 on the polymerization of puretubulin or MAPs-enriched tubulin in vitro. SJ8002 and SJ8029 inhibited polymerization of pure tubulin depending on concentration. However, This inhibitory effects reduced in the presence of MAPs. SJ8002 also depolymerized microtubules stabilized with taxol. But SJ8029 did not. In the colchicine binding site competition assay, SJ8002 competed with colchicine by 40% but SJ8029 had no effect on the binding of colchicine. The vinblastine binding site competition is that SJ8002 did not compete with vinblastine but SJ8029 competed out the binding of vinblastine. The inhibitory effect of SJ8002 was reduced when the compounds were preincubated with sulfhydryl rich molecules. The presence of sulfhydryl rich molecules reduced the inhibitory effect of tubulin polymerization and the depolymerization effect of taxol-stabilized-microtubules. In conclusion, SJ8002 reacts with colchicine binding site and sulfhydryl groups on tubulin, and hence inhibits the formation of microtubules and depolymerizes taxol-stabilized microtubules. However, SJ8029 reacts with vinblastine binding site and hence inhibits the formation of microtubules. It means SJ8029 reacts on tubulin in the structure region of SJ8026 because SJ8029 was composed of SJ8002 and SJ8029.

Study on eribulin-induced MDA-MB-231 breast cancer cell death through microtubule acetylation-endoplasmic reticulum dynamics

송성은 중앙대학교 대학원 2022 국내석사

Eribulin is a newly developed anticancer drug for patients who do not respond to first-line or second-line anticancer therapy. However, most breast cancer cells acquire resistance to eribulin after a series of treatments. The aim of this study is to identify the signaling pathway induced by eribulin to provide clues for overcoming resistance to it. Treatment with eribulin in MDA-MB-231 breast cancer cells showed an increase of microtubule (MT) acetylation accompanied by morphological changes of endoplasmic reticulum (ER) and phosphorylation of inositol-requiring enzyme 1α (p-IRE1α), a sensor of ER stress, while eribulin-resistant (EriR) cells downregulated MT acetylation. Silencing of α-tubulin N-acetyltransferase 1 (ATAT1), a major acetyltransferase of MT, decreased p-IRE1α upon eribulin stimulation. Real-time microscopy showed that the eribulin inhibited MT dynamics which in turn induced abnormal shape of tubular ER, resulting in increase of cell death. But inhibition of p-IRE1α using KIRA6, inhibitor of IRE1α, did not affect eribulin-induced cell death. Interestingly, the combinational treatment of eribulin in IC50 with tubacin, a MT acetylation inducer, in EriR cells restored the MT dynamics and increased the abnormality rate of ER shape and the level p-IRE1α, thereby subsequently increasing the cell death. Taken together, these findings suggest that MT acetylation which cause abnormal ER is a potential target for treatment of eribulin-resistance breast cancer cells. 에리불린은 미세소관의 성장을 억제하는 항암제로서, 다른 화학항암제 치료에 실패한 재발성 유방암 환자들에게 주로 사용되는 약물로 알려져 있다. 그럼에도 불구하고 일부 암세포는 에리불린에 대한 저항성을 보이기도 하는데 이러한 에리불린 저항성 세포에 대한 치료방법은 현재까지 잘 연구되어 있지 않다. 본 연구에서는 에리불린에 의해 유도되는 신호전달 경로를 규명하고 이를 통해 에리불린 저항성 극복에 대한 새로운 방안을 제시하고자 한다. 먼저, 삼중 음성 유방암 세포주인 MDA-MB-231에 에리불린을 처리한 후 실시간 현미경을 통해 미세소관 다이나믹스를 관찰한 결과, 미세소관의 유동성이 대조군에 비하여 유의미하게 감소되는 것을 확인하였다. 이때, 미세소관의 전사후조절인 아세틸화가 증가하고 이와 동시에 세포 사멸이 일어나는 것을 확인하였다. 또한, 에리불린에 의한 미세소관 아세틸화 증가와 함께 정상적인 관 모양의 소포체가 비정상적으로 응집되거나 시트 모양을 형성하는 것이 관찰되었으며, 소포체 스트레스의 센서인 Inositol-requiring enzyme1 α (IRE1α) 의 인산화가 특이적으로 증가됨을 확인할 수 있었다. 반면, 에리불린 저항성 세포에서는 미세소관 아세틸화가 감소되어 있으며, 에리불린을 처리하여도 미세소관 다이나믹스가 변하지 않고 IRE1α 인산화 또한 관찰되지 않았다. 이에, 미세소관 아세틸화의 감소가 에리불린의 저항성에 관여하는지 확인하기 위해 미세소관 아세틸기 전이효소인 ATAT1의 발현이 저해된 세포주를 제작하였다. 제작된 ATAT1 발현 저해 세포주는 대조군에 비하여 에리불린에 대하여 저항성을 보였고, 에리불린을 처리하였을 때 미세소관 다이나믹스나 비정상적인 소포체 모양의 변화 및 IRE1α 인산화 증가 또한 관찰되지 않았다. 이에 기반하여 미세소관 아세틸화를 증가시키면 에리불린에 대한 저항성이 극복되는지 알아보기 위해 에리불린 저항성 세포에 에리불린과 함께 미세소관 아세틸화를 증가시키는 tubacin을 동시 처리하여 세포 사멸을 관찰하였다. 그 결과, 에리불린 저항성 세포에서 에리불린만 처리하였을 때와는 달리 에리불린과 tubacin을 동시에 처리했을 때 미세소관 다이나믹스가 감소하였고, 비정상적인 모양을 가진 소포체의 변화 및 IRE1α 인산화가 증가되었으며, 에리불린 저항성 세포의 세포 사멸 또한 유도되었다. 한편, IRE1α 인산화 저해제를 처리하여 에리불린에 의한 IRE1α 인산화 만을 억제한 경우에는 에리불린에 의한 세포 사멸이 저해되지 않았다. 종합하여, 이러한 결과들은 에리불린에 의해 유도되는 미세소관 아세틸화가 비정상적인 소포체의 변화 및 IRE1α 인산화를 증가시키고 궁극적으로 세포 사멸을 유도한다는 것을 증명하였다. 더불어서, 본 연구결과는 에리불린에 대하여 저항성을 갖는 유방암 환자들에게 미세소관 아세틸화의 조절이 저항성 극복을 위한 새로운 전략이 될 수 있음을 제시하고 있다.

미세소관 중합반응에 미치는 1H-[1,2,4]Oxadiazolo[4,3-a]quinoxalin-1-one의 효과

김채두 연세대학교 대학원 2009 국내석사

1H-[1,2,4]oxadiazolo[4,3-a]quinoxalin-1-one (ODQ)은 GTP를 cGMP로 전환시키는 효소인 soluble guanylyl cyclase (sGC)를 억제하는데, 이는 ODQ가 sGC의 heme iron을 산화시킴으로서 이루어진다. 그런데 최근 ODQ가 sGC의 봉쇄 작용과 무관하게 신경세포의 신경돌기 생성 및 성장을 억제하며 암세포의 증식을 억제하여 세포사를 유발함을 확인하였다. 세포 분열과 신경세포돌기의 성장에 미세소관이 공통적으로 관여하므로 ODQ가 미세소관의 중합반응에 어떤 영향을 미치는지 확인하고자 하였다.ODQ는 HeLe cell에서 G0/G1 기의 세포 수를 감소시키고 G2/M 기의 세포 수를 크게 증가시켰으며, 이는 ODQ가 G2/M 기에서 세포 주기를 정지시켰음을 의미하였다. 또한 Western blot 분석 방법을 통해 ODQ가 중합된 미세소관의 양을 감소시키고 융해된 미세소관의 양을 증가시킴을 확인하였는데 이는 ODQ가 미세소관의 중합반응을 억제하고 융해를 촉진함을 나타낸다. 이러한 ODQ의 효과는 정제된 상용 미세소관에서도 관찰되어 ODQ의 효과가 미세소관에 직접 작용한 결과임을 확인할 수 있었다. ODQ의 이러한 작용은 heme을 포함한 단백질을 환원시키는 것으로 알려진 dithionite 뿐 아니라 단백질의 SH 기를 환원시키는 DTT에 의해서도 억제되었으며, Atomic Absorption Spectrophotometry를 이용하여 철의 함량을 측정해 본 결과 본 연구에 사용된 미세소관에는 철이 함유되어 있지 않은 것으로 확인되어 ODQ의 미세소관 중합 억제 작용은 tubulin의 SH 기를 산화하여 나타나는 효과임을 확인할 수 있었다.결론적으로 ODQ는 tubulin을 직접 산화시킴으로써 미세소관의 중합을 억제하고 이로 인해 세포 주기를 G2/M 기에서 정지시킴을 확인하였다.1H-[1,2,4] oxadiazolo[4,3-a]quinoxalin-1-one (ODQ) is a well known inhibitor of soluble guanylyl cyclase (sGC) and it causes a slow, irreversible oxidation of the sGC heme iron. Previously, ODQ was shown to inhibit neurite outgrowth in neuronally differentiated PC12 cells and induce apoptosis in various cancer cells in a sGC-independent manner. Because microtubule is involved in the neurite outgrowth and cell division, I investigated the effect of ODQ on the microtubule network in HeLa cells.Exposure of cells to 50-100 μM ODQ decreased the population of cells in the G0/G1 phase and increased that in the G2/M phase, suggesting the arrest of cell cycle at G2/M phase by ODQ. Western blot analysis revealed that treatment of HeLa cells with ODQ increased the proportion of unpolymerized tubulin and decreased that of polymerized tubulin, suggesting that ODQ caused to disassemble the microtubule network. The effect of ODQ on microtubule network was reversed by dithionite. In addition, ODQ was also shown to depolymerize purified tubulin in vitro and the addition of reducing agents, such as dithionite and DTT, restored the polymerization activity of tubulin. In addition to this, I have found that microtubule used in this study does not contain heme iron, indicating that ODQ induced the oxidation of SH residue of tubulin, which may be responsible for the inhibition of microtubule polymerization.In conclusion, these results suggest that ODQ arrests cells in G2/M phase probably by direct depolymerization of microtubules resulting from tubulin oxidation.

The effect of glucocorticoid-induced dysfunction on mitochondrial trafficking and mitophagy in neuronal amyloidogenesis

최지은 서울대학교 대학원 2021 국내박사

Upon stress, the stress response system with activation of hypothalamus-pituitary-adrenal gland (HPA) axis is initiated in the hypothalamus and descends to the pituitary via corticotrophin-releasing hormone (CRH). Glucocorticoid is then released from the adrenal cortex stimulated by adrenocorticotropic hormone (ACTH) from pituitary. Stress-induced levels of glucocorticoid is a major etiology of early features of neurodegenerative diseases including microtubule destabilization and mitophagy suppression. Then, neurons suffer from synaptic abnormalities due to failure to transport and eliminate dysfunctional mitochondria, resulting in impairment of memory formation. Therefore, present study aimed to 1) investigate the effect of glucocorticoid on microtubule destabilization and mitophagy suppression, and 2) demonstrate how chronic glucocorticoid exposure affects memory formation and Alzheimer’s disease (AD). Results were as followings: 1. Microtubule destabilization is an early pathological feature that culminates in neurodegeneration. Therefore, the effect of glucocorticoid on microtubule instability and subsequent cognitive impairment was investigated using male ICR mice and human neuroblastoma SH-SY5Y cells. The mice group exposed to corticosterone showed reduced trafficking of α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionic acid receptor (AMPAR) 1/2 and mitochondria, which are necessary for memory establishment, into the synapse due to microtubule destabilization. In SH-SY5Y cells, cortisol also decreased microtubule stability represented by reduced acetylated α-tubulin to tyrosinated α-tubulin ratio (A/T ratio), depending on the mitochondrial glucocorticoid receptor (GR)-mediated pathway. Cortisol translocated the Hsp70-bound GR into mitochondria which thereafter promoted interaction between GR and B-cell lymphoma 2 (Bcl-2). Increased ER-mitochondria connectivity via GR-Bcl-2 coupling led to mitochondrial Ca2+ influx, activating mTOR. Subsequent autophagy inhibition by mTOR phosphorylation increased SCG10 protein levels via reducing ubiquitination of SCG10, eventually inducing microtubule destabilization. Thus, failure of trafficking AMPAR1/2 and mitochondria into the cell terminus occurred by kinesin-1 detachment from microtubules, which is responsible for transporting organelles towards periphery. However, the mice exposed to pretreatment of microtubule stabilizer paclitaxel showed the restored translocation of AMPAR1/2 or mitochondria into synapses and improved memory function compared to corticosterone-treated mice. In conclusion, glucocorticoid enhances ER-mitochondria coupling which evokes elevated SCG10 and microtubule destabilization dependent on mitochondrial GR. This eventually leads to memory impairment through failure of AMPAR1/2 or mitochondria transport into cell periphery. [Cell Death Dis, 2018. 14(9): 1137] 2. Stress-induced glucocorticoid disturbs mitochondrial bioenergetics and dynamics; however, instead of being removed via mitophagy, the damaged mitochondria accumulate. Therefore, the role of glucocorticoid in mitophagy inhibition and subsequent synaptic defects in hippocampal neurons, SH-SY5Y cells, and ICR mice was presented. I observed that glucocorticoid decreased both synaptic density and vesicle recycling due to suppressed mitophagy. Screening data revealed that glucocorticoid downregulated BNIP3-like (BNIP3L)/NIX, resulting in the reduction of mitochondrial respiration function and synaptic density. Notably, I found that GR binds directly to the promoter of PPARGC1A by glucocorticoid, downregulating its expression and nuclear translocation. Peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha (PGC1α) downregulation selectively decreased NIX-dependent mitophagy. Consistent with these results, a corticosterone-exposed mouse showed that NIX enhancer pre-treatment led to elevated mitophagy and synaptic density in hippocampus, followed by recovered spatial memory task. Taken together, glucocorticoid inhibits mitophagy via downregulating NIX and that NIX activation represents a new target protein for restoring synapse function [Nat Commun, 2021. 12(1):487]. 3. Glucocorticoid has been widely accepted to induce AD, but the nongenomic effect of glucocorticoid on amyloidosis has yet to be studied. Here, the effect of the nongenomic pathway induced by glucocorticoid on amyloid precursor protein (APP) processing enzymes as well as Aβ production was examined using male ICR mice and human neuroblastoma SK-N-MC cells. Mice groups exposed to restraint stress or intracerebroventricular (i.c.v.) injection of Aβ showed impaired cognition, decreased intracellular GR level, but elevated level of membrane GR (mGR). In this respect, I identified the mGR dependent pathway evoked by glucocorticoid using impermeable cortisol conjugated to BSA (cortisol-BSA) on SK-N-MC cells. Cortisol-BSA augmented the expression of beta-site amyloid precursor protein cleaving enzyme 1 (BACE1), the level of C-terminal fragment β of APP (C99) and Aβ production, all of which were maintained even after blocking intracellular GR. I also found that cortisol-BSA enhanced the interaction between mGR and Gαs which co-localized in the lipid raft. The subsequently activated cAMP-response element binding protein (CREB) by cortisol-BSA bound to the cAMP-response element (CRE) site of the BACE1 promoter increasing its expression, which was downregulated by inhibiting CREB-binding protein (CBP). Consistently, blocking CBP attenuated cognitive impairment and Aβ production induced by corticosterone treatment or i.c.v. injection of Aβ more efficiently than inhibiting intracellular GR in mice. In conclusion, glucocorticoid couples mGR with Gαs and triggers cAMP-PKA-CREB axis dependent on the lipid raft to stimulate BACE1 upregulation and Aβ generation. [J Neurosci, 2017. 37(35):8459-8476] In conclusion, present study demonstrated that 1) the ER-mitochondria interaction is a key mediator linking microtubule destabilization and glucocorticoid-induced memory impairment, 2) GR-PGC1α-NIX axis is important in basal mitophagy suppression and subsequent synaptic dysfunction, and 3) mGR-mediated amyloidogenesis is enhanced under chronic glucocorticoid exposure dependent on PKA-CREB pathway. 스트레스 환경에서 시상하부-뇌하수체-부신 (HPA)축이 활성화 되면서 시상하부는 코르티코트로핀 방출 호르몬 (CRH)을 통해 뇌하수체를 자극시켜 부신피질자극호르몬 (ACTH) 분비를 유도한다. ACTH는 부신 피질의 당질코르티코이드 분비를 촉진한다. 스트레스 환경에서 분비되는 당질코르티코이드는 신경 퇴화의 초기 주요 병인인 미세소관 불안정화 및 미토콘드리아 기능 장애를 유발한다. 당질코르티코이드 분비가 지속되면 시냅스 기능 이상 및 인지기능 장애와 같은 신경퇴행성질환의 병변 및 임상증상이 발현된다. 따라서 이 연구의 목적은 1) 미세소관 불안정화 및 미토콘드리아 자가 탐식 억제에 대한 당질코르티코이드의 효과를 조사하고, 2) 만성 당질코르티코이드 노출이 인지 장애 및 알츠하이머 질환 발병에 미치는 영향을 밝히는 것이다. 결과는 아래와 같다. 1. 미세소관 불안정화는 신경퇴행성 변화의 초기 병리학적 특징이다. 따라서 수컷 ICR 마우스와 인간 신경모세포종 SH-SY5Y 세포를 사용하여 당질코르티코이드가 미세소관 불안정화를 유발하는지 확인하였다. 코르티코스테론에 노출된 마우스에서 기억력 형성에 기여하는 AMPA 수용체 및 미토콘드리아의 시냅스로의 이동이 감소되었다. SH-SY5Y 세포에서 코티솔은 미토콘드리아 당질코르티코이드 수용체 (Glucocorticoid receptor, GR) 매개 경로를 통해 미세소관을 불안정화 시켰고, GR과 Bcl-2의 결합을 촉진하였다. GR과 Bcl-2의 상호작용 증가는 소포체와 미토콘드리아의 연결을 촉진시켰으며, 이는 미토콘드리아 내 Ca2+ 유입시켰다. 순차적으로 자가탐식 억제조절자인 mTOR가 활성화 되었으며, 이로 인하여 미세소관 불안정화 조절인자인 SCG10의 선택적 유비퀴틴화가 감소되었다. 이에 따른 SCG10 단백질 발현 증가는 미세소관 불안정화를 일으켰고, AMPA 수용체와 미토콘드리아를 세포 말단으로 이동시키는 운동단백질인 kinesin-1이 미세소관에서 분리되었다. 하지만 미세소관 안정제 (Paclitaxel) 전처리 마우스의 해마 뉴런 시냅스 내 AMPA 수용체 및 미토콘드리아 숫자가 대조군 수준으로 회복되었고, 인지기능 또한 정상이었다. 따라서 당질코르티코이드는 소포체와 미토콘드리아 결합을 증가시켜 미세소관의 불안정화를 유발하였고, 이는 AMPA 수용체와 미토콘드리아가 세포 말단으로의 이동을 억제함으로써 마우스에서 기억장애를 일으켰다. 2. 스트레스에 노출 시 분비된 당질코르티코이드에 의해 손상된 미토콘드리아는 미토콘드리아 자가 탐식을 통해 제거되지 않고 축적되었다. 따라서 이 연구에서는 당질코르티코이드가 마우스 해마 뉴런과 SH-SY5Y 세포 내 미토콘드리아 자가 탐식을 억제하는 기전을 밝혔다. 당질코르티코이드는 미토콘드리아 자가 탐식 억제를 통해 해마 뉴런 내 시냅스 밀도와 시냅스 소포 재흡수를 감소시켰다. 당질코르티코이드는 미토콘드리아 자가 탐식 조절 단백질인 NIX의 발현을 선택적으로 감소시켜 신경 세포의 미토콘드리아 호흡 기능과 시냅스 항상성을 떨어뜨렸다. 특히, GR이 당질코르티코이드 처리에 의해 미토콘드리아 에너지 대사에 관여하는 단백질인 PGC1α의 프로모터에 직접 결합하여 PGC1α의 발현 및 핵으로의 이동을 억제하였다. PGC1α의 감소는 NIX 의존적 미토콘드리아 자가 탐식을 선택적으로 감소시켰다. 또한 NIX 발현 활성제 전처리 시 마우스 해마 내 코르티코스테론에 의한 미토콘드리아 자가 탐식 억제 및 시냅스 밀도 감소 효과가 완화되었다. 따라서 당질코르티코이드는 NIX 의존적 미토콘드리아 자가 탐식 억제를 통해 시냅스 및 인지 기능 이상을 일으켰다. 3. 당질코르티코이드는 알츠하이머 질환을 유발한다고 알려져 있지만, 비고전적 경로 매개 아밀로이드 베타 생성 기전에 대해서는 연구되지 않았다. 따라서 이 연구에서는 당질코르티코이드에 의해 유도된 비고전적 경로가 수컷 ICR 마우스와 인간 신경모세포종 SK-N-MC세포 내 아밀로이드 베타 생성 효소인 BACE1 발현과 아밀로이드 베타 생성에 미치는 영향을 확인하였다. 스트레스 또는 아밀로이드 베타 뇌실 내 주사에 노출 된 마우스는 인지장애, 세포 내 GR 수준 감소, 세포막 GR 수준 증가를 보였다. BSA에 결합한 코티솔에 노출된 SK-N-MC세포에서 BACE1의 발현 및 C99 수준이 증가되었다. BSA에 결합한 코티솔은 지질 뗏목에 존재하는 세포막 GR과 Gαs와의 상호작용을 증가시켰다. 이에 따라 BSA에 결합한 코티솔에 의해 활성화 된 전사인자 CREB은 BACE1 프로모터의 CRE 부위에 CREB결합 단백질인 CBP와 함께 결합하여 BACE1 발현을 증가시켰다. CREB과 CBP 결합을 억제 시 코르티코스테론 또는 뇌실 내 아밀로이드 베타 주사에 노출 된 마우스에서 아밀로이드 베타 생성이 감소되었다. 따라서 당질코르티코이드는 세포막 GR을 Gαs와 결합시키고 지질뗏목 의존성 cAMP-PKA-CREB 축을 활성화 시켜 BACE1 발현 및 아밀로이드 베타 생성을 증가시켰다. 결론적으로 1) 당질코르티코이드에 의한 소포체-미토콘드리아 상호작용이 미세소관 불안정화와 인지기능 장애를 유발하는 핵심 요소이고, 2) GR-PGC1α-NIX 축이 미토콘드리아 자가 탐식 억제 및 시냅스 기능 장애를 유발함을 확인하였다. 3) 당질코르티코이드 만성 노출은 세포막 GR을 매개로 하여 아밀로이드 베타 생성을 증가시켜 마우스에서 알츠하이머 질환 발병을 촉진하였다. 이러한 연구 결과는 소포체-미토콘드리아 연접과 미토콘드리아 자가 탐식 기능 조절을 통한 스트레스성 신경 퇴행성 질환 및 알츠하이머 질환 발병 기전에 대한 기초자료를 제시함으로써 향후 관련 치료제 개발에 활용될 수 있을 것이다.

Naegleria gruberi에서 편모와 세포 내 미세소관 형성 기작에 대한 연구

서미라 연세대학교 대학원 2002 국내박사

N. gruberi가 분화하는 동안 새로이 편모와 기저체가 형성될 때에 두 개의 단백질인 N-γ TRP (Naegleria γ-tubulin-related protein)와 N-PRP (Naegleria pericentrin-related protein)의 세포 내 분포에 관하여 각 단백질을 인식하는 항체를 이용하여 조사하였다. 분화 시작 후 N-γ TRP와 N-PRP는 세포 내에 같은 부위로 concentration 되었다. Concentrated N-γ TRP와 N-PRP를 가지고 있는 세포는 tubulin이 막 합성되기 시작하나 아직 눈에 보이는 미세소관은 관찰되지 않는 40분에 68%로 가장 많았다. 세포 내에 합성된 tubulin이 관찰되기 시작하는 분화후 60분에는 Concentrated N-γ TRP가 있는 부위에 tubulin spot이 함께 존재하고 있음이 확인되었고, 이 tubulin이 다량 존재하고 있는 부위로부터 편모가 형성되기 시작하였다. 세포가 길게 신장된 편모를 가지게 되는 분화 후반기에는 Concentrated N-γ TRP와 N-PRP가 편모가 있는 반대 방향으로 이동하여 사라짐이 관찰되었다. 이런 N-γ TRP의 일시적인 concentration은 F-actin 구조의 형성과 동시에 일어나며, 이 때 N-γ TRP와 α-tubulin mRNA도 형성된 F-actin spot에 함께 존재하였다. N-γ TRP와 N-PRP의 concentration 및 F-actin spot의 형성은 미세소관의 형성 없이 일어나며, cytochalasin D에 의해 억제되었다. 이상의 결과는 N-γ TRP와 N-PRP가 세포의 어느 한 부분으로 concentration 되는 것이 actin filaments에 의해 일어나며 새롭게 형성되는 tubulin의 assembly에 필요한 미세소관 nucleation site를 제공할 가능성을 암시한다. 편모 형성 기작 연구 과정에서 N. gruberi에서 두 개의 새로운 유전자인 NBP-1과 NBP-2 (NBP; Naegleria basal body protein)를 클로닝하였다. NBP-1 유전자는 coding region이 6261 bp 이었으며 2087개의 아미노산으로 이루어진 단백질은 암호화하고 NBP-1의 계산된 분자량은 241.3 kDa 이었다. NBP-2 유전자는 coding region이 5856 bp 이었으며 1952개의 아미노산으로 이루어진 단백질을 암호화하고 NBP-2의 계산된 분자량은 199.7 kDa 이었다. NBP-1과 NBP-2는 86%의 염기서열 유사성과 87%의 아미노산 서열 유사성을 보였다. NBP-1과 NBP-2는 각각 14개와 12개의 EGF-repeat domains를 가지며, N-terminal 부위에 여러 개의 N-glycosylation site를 갖는다. 두 개의 NBP 유전자의 발현은 분화시 매우 유사한 양상을 보인다. 두 개의 NBP 유전자의 공통적인 아미노산 부위를 인식하는 peptide 항체는 약 300 kDa 크기의 단백질을 인식하였으며, 분화하는 세포를 immunostaining 한 결과 NBP 단백질이 N. gruberi의 기저체나 그 근처에 위치함을 알 수 있었다. N-glycosylation 억제제인 tunicamycin을 처리하면 NBP peptide 항체는 기존의 단백질 (약 300 kDa)외에 220 kDa의 새로운 단백질을 인식하였고, 일부 N. gruberi가 정상적으로 분화하지 못했으며, 정상적으로 분화하지 못한 세포에서는 NBP의 concentration, 세포 내 미세소관의 정상적인 배열, 그리고 편모의 생성이 억제되었다. 이상의 결과는 NBP가 새로운 기저체 단백질임을 제시하고, 이들의 기능에 N-glycosylation이 중요한 기능을 수행할 가능성이 있음을 제시한다. The distribution of two proteins in Naegleria gruberi, N-γ TRP (Naegleria γ-tubulin-related protein) and N-PRP (Naegleria pericentrin-related protein), was examined during the de novo formation of basal bodies and flagella that occurs during the differentiation of N. gruberi. After the initiation of differentiation, N-γ TRP and N-PRP began to concentrate at the same site within cells. The percentage of cells with a concentrated region of N-γ TRP and N-PRP was maximal (68%) at 40 min when the synthesis of tubulin had just started but no assembled microtubules were visible. When concentrated tubulin became visible (60 min), the region of concentrated N-γ TRP and N-PRP was co-localized with the tubulin spot and then flagella began to elongate from the region of concentrated tubulin. When cells had elongated flagella, the concentrated N-γ TRP and N-PRP were translocated to the opposite end of the flagellated cells and disappeared. The transient concentration of N-γ TRP coincided with the transient formation of an F-actin spot at which N-γ TRP and α-tubulin mRNA were co-localized. The concentration of N-γ TRP and formation of the F-actin spot occurred without the formation of microtubules but were inhibited by cytochalasin D. These observations suggest that the regional concentration of N-γ TRP and N-PRP is mediated by actin filaments and might provide a site of microtubule nucleation for the assembly of newly synthesized tubulins into basal bodies and flagella. Two noble genes (NBP-1 and NBP-2, Naegleria basal body protein 1 and 2) were cloned and characterized from N. gruberi. The ORF of NBP-1 is 6261 bp long and encodes a protein of 2087 amino acids. The calculated molecular weight of NBP-1 is 214.3 kDa. The ORF of NBP-2 is 5856 bp long and encodes a protein of 1952 amino acids. The calculated molecular weight of NBP-2 is 199.7 kDa. NBP-1 and NBP-2 share 86% of nucleotide sequence homology and 87% amino acid sequence homology and contain multiple copies of EGF-like domains and possible N-glycosylation sites. Northern blot analysis with specific DNA probes showed that the two genes were expressed similarly during differentiation of N. gruberi. An polyclonal antiserum raised against a conserved region of the two protein recognized a protein with estimated molecular mass of ∼300 kDa. In situ immunostaining of differentiating cells with the antiserum showed that the proteins are concentrated at the basal body of N. gruberi. When tunicamycin (final conc., 3 ㎍/㎖) was added at the beginning of differentiation, the polyclonal antiserum against NBP recognized proteins with estimated molecular mass of ∼300 kDa and ∼220 kDa. And addition of tunicamycin at initiation partially inhibited both the formation of flagella and cytoskeletal microtubles and concentration of NBP. These results suggested that the NBP proteins might be novel basal body proteins and N-glycosylation of NBP proteins might be important to NBP function.

Study on the role of intracellular vesicle transport in the progression of degenerative diseases

정장호 중앙대학교 대학원 2021 국내박사

Degenerative diseases including malignant tumors and Alzheimer’s disease (AD) are caused by the dysfunction of sophisticated intra and extracellular signaling systems related to cell growth and secretion. In particular, abnormal regulation of the endocytic pathways is reported to be closely associated with degenerative diseases. The endocytic pathway is required not only for internalization of external cellular factors into cells, but also with various cellular functions, including membrane protein homeostasis and regulation of receptor-mediate signaling. However, the molecular mechanisms by which cells regulate the signaling pathways resulting from vesicle generation and trafficking in pathogenic condition remained to be elucidated. In this dissertation, I identified spindle pole body component 25 (SPC25, encoding SPC25) and adaptor related protein complex 1 subunit sigma 1 (AP1S1, encoding AP1S1) as novel key genes that enhance malignant phenotypes in stiff extracellular matrix (ECM) conditions using transcriptome analysis, and demonstrated that an increase of SPC25 enhances proliferation in stiff matrix in part I. To identify genes that are required for promoting the malignant properties in lung cancer under the stiff matrix condition, I performed comparative analysis of transcriptome using The Cancer Genome Atlas lung adenocarcinoma (TCGA LUAD) data with microarray data from H1299 cultured on different matrices of different stiffnesses. As a result, 4 genes were identified: SPC25, AP1S1, dual specificity protein phosphatase 23 (DUSP23), and tweety family member 3 (TTYH3). Of them, knockdown (KD) of SPC25 by lentiviral short hairpin RNA (shRNA) system inhibited the increase of cellular proliferation in stiff matrix conditions compared with that in soft matrix conditions, which caused G2/M arrest due to chromosome misalignment in the metaphase of the cell cycle. Thus, these results demonstrate that overexpression of SPC25 in a stiff matrix facilitates cell proliferation via proper alignment of chromosomes during metaphase in the cell cycle. In part II, I found that AP1S1 promotes epidermal growth factor receptor (EGFR) signaling in stiff matrix conditions by enhancing EGFR trafficking. In the AP1S1 knockout (KO) cells using the CRISPR/Cas9 system did not show a difference in cell proliferation, whereas the invasion ability of KO cells was profoundly decreased compared to that of control cells in 2D Transwell and 3D spheroid culture systems. To obtain the molecular insight into the function of AP1S1 in cancer invasion, I searched for the binding partner using BioGRID public database system, resulting in identification of EGFR as an interacting protein of AP1S1. The interaction of AP1S1 with EGFR was confirmed by immunoprecipitation. In AP1S1 KO cells, epidermal growth factor (EGF)-induced EGFR endocytosis was decreased overall. Moreover, phosphorylation of AKT, a well-known downstream signaling of the EGFR, also diminished with downregulation of PIP3 level in AP1S1 KO cells. Interestingly, expression of EGFR in AP1S1 KO cells decreased, while the level of transcripts of EGFR was not significantly changed compared to mock cells. Given the cellular role of AP1S1, these results indicate that the upregulation of AP1S1 in stiff matrix conditions likely promotes EGFR trafficking between trans-Golgi networks after internalization of EGFR upon EGF stimulation, which enhances the robust activation of EGF signaling. In part III, I revealed that movement of lysosome toward peripheral area through microtubule acetylation under an oxidative stress condition is critical for amyloid precursor protein (APP) processing and amyloid beta 42 (A42) secretion. AD is a most common neurodegenerative disorder of dementia. AD is characterized by the overproduction and accumulation of A which is a major constituent of senile plaques. Increased oxidative damage is an early event in AD. I demonstrated that induction of oxidative stress by H2O2 treatment increased microtubule acetylation and secretion of Aβ42, respectively in H4-APPInd/Swe [V642F (“Indiana”)/K595N/M596 (“Swedish”)] and 293T-APP Ind/Swe cell lines. Downregulation of alpha-tubulin N-acetyltransferase (ATAT1, encoding αTAT1) by shRNA was shown to decrease the processing of APP digestion and Aβ42 secretion. In addition, SP600125, a c-Jun N-terminal kinases (JNKs) inhibitor and knockdown (KD) of JNK1 (encoding JNK1), prevented reactive oxygen species (ROS)-induced acetylated microtubule formation. Also, interaction of αTAT1 with JNK1 was enhanced by H2O2 treatment, indicating that JNK1 signaling induced by ROS is critical for Asecretion via microtubule acetylation. Furthermore, I evaluated relationship between microtubule acetylation and APP containing vesicle trafficking for Aβ42 secretion. An increase of microtubule acetylation induced by H2O2, Taxol or Tubacin promoted the movement of lysosomal vesicles containing lysosomal-associated membrane protein 1 (Lamp1) toward the peripheral region, while the amount and distribution of early endosomes judged by early endosomes antigen 1 (EEA1) did not change. The distribution of lysosomal vesicles at peripheral areas disappeared in ATAT1 KD cells. I also found that the treatment of erythro-9-(2-hydroxy-3-nonyl) adenine (EHNA), a dynein ATPase inhibitor, increased the lysosome distribution in peripheral regions irrespective of the ROS stimulation. In addition, APP processing and Aβ42 secretion also increased upon the EHNA treatment. Conversely, cells that downregulated ADP ribosylation factor like GTPase 8B (ARL8B), adaptor molecule between lysosomes and kinesins, did not show the vesicle movement to peripheral region and inhibited Aβ42 secretion along with APP processing. I also found that Lamp1 localized at the cell surface was increased in H2O2 or EHNA-treated cells, whereas ATAT1 KD blocked this process. Taken together, these results demonstrated that ROS-induced microtubule acetylation by JNK1 facilitated peripheral distribution of lysosome, thereby enhancing APP processing and Aβ42 secretion via lysosomal exocytosis. 세포는 세포외부의 다양한 요소를 인지하고 반응한다. 이러한 요소에는 세포외 기질의 경도와 같은 물리적요소, hypoxia와 같은 화학적 요소, 다양한 성장인자와 사이토카인과 같은 생물학적 요소, 등 다양한 외부 요인들이 존재한다. 세포의 외부인자 인지 및 반응의 대부분은 세포막 단백질에서 일어나며, 이러한 세포막 단백질의 항상성 유지와 수용체의 하위 단백질 신호전달을 조절하는 소포 이동은 세포 내 다양한 생리학적 기능을 하는데 매우 중요한 기작이다. 본 박사학위 논문에서는 암과 알츠하이머 질병에서 물리적 경도와 산화 스트레스 환경의 따른 세포내 소포 이동 변화와 이에 따른 질병발달에 미치는 영향을 연구하였다. 먼저 암미세환경의 구성물 중 하나인 세포외 기질의 물리적 경도의 변화에 따라 암발달을 촉진하는 유전자를 동정하기 위해 정상 폐조직의 연성환경과 폐암조직의 경성환경조건에서 배양한 H1299 세포의 유전자 발현을 microarray를 통해 분석하였다. 그 후 서로 다른 경도에서 변화하는 유전자를 동정한 뒤, TCGA LUAD 데이터로부터 동정해낸 암 또는 정상조직에서 변화하는 유전자와 비교분석을 통해 104개의 유전자를 동정하였다. 이 후, KM plot을 통한 암 예후분석과 qPCR을 통해 최종적으로 4개의(SPC25, AP1S1, DUSP23, TTYH3) 유전자를 선별하였고 이중 SPC25와 AP1S1을 연구하여 각각 part I과 part II에서 정리하였다. Part I에서는 앞선 유전자의 동정과정 및 경도 의존적인 세포의 증식작용에서 SPC25의 기능을 연구하였다. 먼저 shRNA를 활용하여 SPC25 발현 저해 세포주를 제작하였다. 정상세포에서는 경도가 증가함에 따라 세포의 증식이 증가하는 반면 SPC25 발현 저해 세포주에서는 이러한 경도 의존적 세포증식이 일어나지 않는 것을 확인하였다. 또한 SPC25 발현 저해 세포주에서는 세포분열 중기 염색체의 비정상적인 배치가 일어남을 통해 G2/M 단계에서의 cell cycle arrest가 일어남을 확인하였다. 결론적으로 경도의존적 SPC25의 발현증가는 세포증식을 유발하는 것을 확인하였다. Part II에서는 part I에서 최종 선별유전자 중 하나인 AP1S1을 연구하였다. 추가적인 생물정보학적 분석을 통해 AP1S1이 다양한 고형암에서 유전자 및 단백질의 발현이 증가됨을 확인하였다. 이후 CRISPR/Cas9 시스템을 활용하여 AP1S1 결손세포를 제작하였다. AP1S1의 결손은 H1299와 A549의 세포 침윤작용이 감소시킴을 확인하였다. 뿐만 아니라 AP1S1의 과발현은 정상세포의 암화를 유발하지는 못하였지만 암화가 일어난 세포의 침윤작용을 증가시켰다. BioGRID라는 웹기반 프로그램을 통해 AP1S1과 상호작용하는 단백질을 동정하였고 이 중, EGFR을 최종적으로 선별한 후 immunoprecipitation을 통해 상호 작용함을 최종적으로 확인하였다. AP1S1 결손세포는 EGF에 의해 유도되는 EGFR의 하위신호 전달 단백질인 pAKT의 발현 및, PIP3의 생성정도와 이를 인지하고 세포막으로 이동하는 AKT의 PH도메인의 세포막 이동이 정상세포에 비해 모두 감소하였다. 뿐만 아니라 EGF-TRITC를 통해 EGFR의 endocytic vesicle의 양이 감소함을 확인하였다. 마지막으로 AP1S1 결손세포에서 EGFR의 mRNA의 양은 크게 감소하지 않는 반면 EGFR의 단백질 발현이 감소하는 것을 확인하였다. 이를 통해 최종적으로 경도의존적 AP1S1의 발현은 EGFR 단백질의 세포막 이동을 조절하여 하위단백질 신호전달을 증가시켜 세포 침윤작용을 조절함을 확인하였다. Part III에서는 알츠하이머 모델 세포에서 산화 스트레스가 A42의 분비에 미치는 영향을 연구하였다. 산화 스트레스를 유발하기 위해 ROS형성을 위한 H2O2를 H4-APPInd/Swe과발현 세포주에 처리하였고 ROS에 의한 미세소관의 아세틸화와 A42의 분비 및 APP processing이 각각 증가함을 확인하였다. 미세소관의 아세틸화가 억제되는 ATAT1 발현 저해 세포주에서는 ROS에 의한 A42분비 및 APP processing이 감소하였다. JNK 저해제인 SP600125을 처리하거나 JNK1의 발현을 억제하였을 때 ROS에 의한 미세소관의 아세틸화가 감소되었고 마지막으로 JNK1과 αTAT1의 상호작용을 immunoprecipitation을 통해 확인함으로써 JNK1이 ROS에 의한 미세소관의 아세틸화를 유발한다는 것을 증명하였다. 미세소관의 아세틸화가 ROS 의존적 A42분비 및 APP processing에 미치는 영향을 알아보기 위해 APP processing에 중요한 endosome의 변화를 확인해본 결과, lysosome의 세포내 분포가 ROS에 의해 핵 주위에서 세포막 주변으로 이동하며 이러한 이동이 ATAT1 발현 저해 세포주에서는 일어나지 않았다. 이 후 dynein의 저해제인 EHNA를 처리하였을 때 lysosome의 세포막 주변 분포가 증가하며 A42의 분비 및 APP processing이 H2O2의 처리여부와는 상관없이 증가하였고 반대로 kinesin과 lysosome을 연결하는 ARL8B의 발현 저해는 H2O2의 처리했음에도 불구하고 lysosome의 핵 주위 분포증가를 야기하며, A42분비 및 APP processing을 감소시켰다. 이는 lysosome의 세포막주위 분포의 변화가 A42분비 및 APP processing을 증가시킴을 의미한다. 마지막으로 세포막에 존재하는 Lamp1이 ROS와 EHNA의해 증가하며 ATAT1 발현저해 세포주에서는 감소함을 확인함으로써 ROS에 의한 lysosome의 세포막 주위 분포는 lysosomal exocytosis를 촉진함을 증명하였다. 결론적으로, 본 연구에서는 산화적 스트레스 환경에서 JNK1의 활성에 의한 미세소관 아세틸화는 lysosome의 세포막 주위 분포를 증가시켜 lysosomal exocytosis에 의한 A42분비 및 APP processing을 촉진함을 증명하였으며, 이는 신경 염증에 의한 초기 알츠하이머 병을 유발 기전일 것으로 사료된다.

급성 신손상 후 신장 세뇨관 세포의 미세소관 아세틸화의 연구

김지현 경북대학교 대학원 2016 국내석사

미세소관(microtubule)을 구성하는 튜블린(tubulin)의 아세틸화(acetylation)와 같은 번역 후 변형(post-translational modification)은 세포의 분화, 분열 및 이동에 관여하여 미세소관의 역동성에 중요한 역할을 한다. 허혈/재관류(ischemia/reperfusion)는 세포의 미세소관에 손상을 일으켜, 세포의 구조 및 기능적 장애를 유발한다. 하지만 아직까지 허혈/재관류에 의한 콩팥세뇨관세포의 손상과 회복 과정과 튜불린의 아세틸화가 어떠한 관련이 있는지 보고되지 않고 있다. 따라서 본 연구에서는 신장의 허혈/재관류 손상과 회복 과정에 있어서 미세소관의 안정화에 중요한 아세틸화와 이를 조절하는 단백질의 발현 변화를 조사하였다. 8주령 수컷 생쥐의 양쪽 신장의 혈류를 30분 동안 차단하여 허혈을 유도하였고, 대조군은 혈류를 차단하지 않았다. 허혈 후 0시간, 1시간 30분, 4시간, 1, 3, 5, 9일에 신장을 취하여 실험을 진행하였다. 허혈 후 24시간 째에 acetylated-ɑ-tubulin(ac-ɑ-tubuin)의 발현은 가장 많이 감소하였다가 서서히 회복하였다. α-tubulin양은 대조군과 유의한 차이가 없었다. 대조군 콩팥에서 ac-α-tubulin은 근위세뇨관과 원위세뇨관보다 집합관에서 가장 많이 발현하였으며, 사구체의 혈관사이세포와 족세포에서 또한 강하게 발현하였다. 허혈 후 24시간째에서는 대조군에 비해, 근위세뇨관, 원위세뇨관과 족세포에서 ac-α-tubulin 발현이 감소하였다. 신장의 섬유화가 일어나는 허혈 후 9일 째에는 ac-α-tubulin의 발현은 근위세뇨관, 족세포와 간질 세포에서 허혈 후 24시간째 보다 증가하였다. 튜불린을 아세틸화시키는 α-tubulin acetyltransferase-1(αTAT1)은 허혈 후 감소하여 9일째 까지도 전혀 회복되지 않았다. 탈아세틸화에 관여하는 HDAC6의 발현은 세뇨관 세포가 손상을 가장 많이 받는 허혈 후 24시간에는 모든 세뇨관에서 현저히 증가하였다가 서서히 9일 째까지 감소하였다. 이 결과들은 tubulin acetylation이 허혈/재관류에 의한 신장 세뇨관 세포의 손상과 회복과정에 중요한 역할을 함을 보여주고 있다. Acetylation of tubulin is known to play an important role in the stabilization of microtubules. Kidney ischemia/reperfusion (I/R) is a major cause of acute renal failure. I/R causes damage to the cytoskeleton in the tubular epithelial cells. However the involvement of microtubule stability in kidney I/R injury has not been reported. Here, we investigated the tubulin acetylation in kidney tubular epithelial cells after I/R injury using western blotting and immunohistochemical staining. Mice were subjected to either 30 min of ischemia or sham-operation. Kidneys were harvested at various times after ischemia. Acetylated-α-tubulin expression dramatically decreased 24 hours after ischemia and then gradually increased over time. However, total α-tubulin expression was not significantly changed after I/R. In normal kidney, immun-reactivities of kidney epithelial cell to acetylated α-tubulin antibody were different in tubules; the orders were the collecting duct, the distal tubules and the proximal tubule. Twenty-four hours after ischemia, acetylated α-tubulin expression increased in the proximal tubule and the distal tubule with strong expression in the nuclei of the tubular cells. In the glomerulus, acetylated α-tubulin was also observed and the expression was very strong in the podocyte and Bowman's capsule. Twenty-four hours after ischemia, acetylated ɑ-tubulin expression in the podocyte was lower than that of normal cells. Nine days after ischemia, acetylated α-tubulin expression in the podocyte and interstitial cell increased. Expression of ɑ-tubulin acetyltransferase-1 (ɑTAT1), an enzyme involved in acetylation of ɑ-tubulin, continuously decreased after ischemia. Histone deacetylase 6 (HDAC6), an enzyme involved in deacetylation of tubulin, also significantly increased after ischemia and slowly decresase. In conclusion, acetylation of tubulin is tightly associated with kidney I/R injury and repair, ndication that post-translational modification plays an important role in AKI and CKD.